CN103656636B - 一种鸭疫里默氏菌荚膜抗原蜂胶疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸭疫里默氏菌荚膜抗原蜂胶疫苗的制备方法，属于兽医传染病学领域。它由鸭疫里默氏菌荚膜抗原与蜂胶制成，其含荚膜蛋白量为1.0~2.0 mg/mL，含蜂胶干物质10~15 mg/mL。它主要通过制备鸭疫里默氏菌荚膜抗原、制备蜂胶佐剂、配制菌苗来获得疫苗，其免疫产生期为10 d，免疫持续期长达90 d。制成的疫苗对鸭、鹅等具有较好安全性，可以诱导机体产生良好的免疫保护。

Description

一种鸭疫里默氏菌荚膜抗原蜂胶疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及一种鸭疫里默氏菌荚膜抗原蜂胶疫苗的制备方法，属于兽医传染病学领域。

背景技术

鸭疫里默氏菌（R. anatipestifer），也称为鸭疫里氏杆菌，是一种革兰氏阴性的小杆菌，属黄杆菌科Riemerella anatipestifer属，可形成荚膜，无芽胞，无鞭毛。鸭疫里默氏菌病是由该菌引起的一种严重危害雏鸭、雏火鸡和雏鹅等多种禽类的高致病性、接触性传染病，1～8周龄的雏禽易感，呈急性或慢性败血症经过，病变以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎为特征，俗称传染性浆膜炎(Infectious Serositis )，导致感染禽死亡、消瘦、胴体品质下降等造成巨大的经济损失。该病于1904年Riemer首次报道在鹅群中发生，于1932年Hendrickson报道在美国纽约长岛的三个鸭场爆发。在我国，1975年邝荣禄等首次在广州发现了该病，1982年郭玉璞等首次成功分离鉴定出该菌。现在该病呈世界性分布，在我国所有集约化养鸭、养鹅地区均有发生，是当前危害水禽养禽业尤其是养鸭业的主要细菌性传染病之一。

多种药物在鸭疫里默氏菌病的防控中起了积极作用，但随着药物的长期应用，鸭疫里默氏菌的耐药性也越来越严重。耐药菌的出现使得药物的防控效果大打折扣，为提高疗效，多种药物超剂量或超疗程应用的情况屡见不鲜，一方面导致水禽产品中的药物残留增加，摄入人体后影响人类的健康；另一方面，水禽场排泄物向周围环境排放，排泄物中的药物残留又成为环境污染物，给生态环境带来不利影响。随着药物治疗的弊端、药物残留及环境问题的日益凸显，随着人们对绿色食品日益迫切的需要，养殖业必须走可持续发展的道路，而免疫接种结合生物安全措施才是最理想的防制方法。

目前国内外应用最多的是灭活苗，值得注意的是，由于鸭疫里默氏菌各血清型之间缺乏交叉保护，应选择与流行菌株相同的血清型来制备灭活菌苗。灭活菌苗的安全性较好，不会引起排毒，但保护效力不如弱毒疫苗，另外，灭活苗必须注射、价格较贵、对水禽的应激也大。弱毒疫苗免疫效果好，在美国和加拿大已广泛应用。但其可发生潜伏感染，并有散毒的危险，国内还未见应用的报道。新型疫苗如基因工程苗等还处在探索阶段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸭疫里默氏菌荚膜抗原蜂胶疫苗的制备方法，通过该方法制得的疫苗能够有效保护鸭疫里默氏菌的攻击，可使目前我国大量水禽生产者减少经济损失、提高养殖效益。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：鸭疫里默氏菌购于国家兽医微生物菌种保藏中心。

其制备方法包括：

 1）培养基的制备：

改良LB培养基：称取胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 5 g，加蒸馏水800 mL，摇匀溶解，用1 M NaOH调pH值为7.5-7.7，补足蒸馏水至1000 mL，10-20磅高压20-30 min，待其自然冷却至室温后加入体积比为2%的新生牛血清，分装，2℃~8℃保存；

改良TSA平板：称取胰蛋白胨大豆琼脂粉4 g，加入100 mL蒸馏水中，煮沸溶解，10-20磅高压20-30 min，待其自然冷却至55-65℃时加入2 mL的新生牛血清，混匀后分装制成平板，2℃~8℃保存；

2）菌种制备：取灭菌注射器吸2.5 mL的改良LB培养基，加入鸭疫里默氏菌菌种冻干瓶中，将溶解的菌种液划线接种于1个改良TSA平板上，置体积分数5%CO₂培养箱中37℃培养24-26 h；挑选圆形微突起、表面光滑奶油状半透明的特征单菌落2~3个，接种于20 mL改良LB培养基中，37℃振荡培养16 -18 h后取出，作为一级种子，2℃~8℃可保存5 d；取一级种子1 mL接种于100 mL改良LB培养基中，37℃振荡培养16 -18 h后取出，作为二级种子，2℃~8℃可保存5 d；

3）荚膜提取：按1%体积比，将二级种子接种于改良LB培养基中，37℃振荡培养16 -18 h后取出，10000 g离心20 -30 min，弃上清，按菌泥湿重每1 g加入20 mL脱膜液，吹打混匀，于55-57℃水浴锅中用电动搅拌器不间断搅拌1-2 h，然后将脱膜液相继用冷水浴、冰水浴，分成小份于冰箱中冷却，直至液体发白但确保不能结冰，10000 g离心50-60 min，取上清，装入透析袋内，紧塞透析管口，悬挂于盛有蒸馏水的透析箱横梁上，2℃~8℃静置，每12 h换水1次，换3-4次水，最后换水12 h后收集透析袋内液体，即为鸭疫里默氏菌荚膜抗原；

4）鸭疫里默氏菌荚膜提原的蛋白浓度测定：用紫外吸收法快速计算荚膜抗原中的蛋白浓度，测定3次，取平均值；

5）荚膜提原蜂胶疫苗的制备：取纯度在80%以上的蜂胶，磨碎，溶解于无水乙醇中，根据要求配成100~150 mg/mL浓度的蜂胶乙醇溶液，将鸭疫里默氏菌荚膜抗原和蜂胶乙醇溶液混合配成混悬液，确保荚膜抗原的终浓度为1.0~2.0 mg/mL，蜂胶干物质含量为10~15 mg/mL，无菌分装于100 mL的疫苗瓶内，密封保存，2℃~8℃保存。

所述的脱膜液配方为NaCl 290 g，十二烷基硫酸钠25 g，加入10000 mL蒸馏水中，10-20磅高压20-30 min，室温保存。

所述方法制得的鸭疫里默氏菌荚膜抗原蜂胶疫苗。

本发明的优点在于： 1、与传统的全菌体灭活疫苗相比，该疫苗仅含有鸭疫里默氏菌最外层的荚膜（其主要成分为蛋白质和多糖），不含有鸭疫里默氏菌内的任何可能导致对禽类有毒性的物质，所以安全性更好。

2、细菌的蛋白成分很多，有的具有免疫原性，大部分不具有免疫原性。全菌体灭活疫苗使用时，众多不具有免疫原性的蛋白会干扰机体对免疫原性蛋白的免疫应答。而该疫苗的抗原成分仅为具有免疫原性的鸭疫里默氏菌的荚膜，免疫机体后不存在杂蛋白的干扰问题。

具体实施方式

实施例1

1、细菌的来源：鸭疫里默氏菌购于国家兽医微生物菌种保藏中心

2、鸭疫里默氏菌荚膜抗原的提取

2.1　培养基的制备：

2.1.1　改良LB培养基：称取胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 5 g，加蒸馏水800 mL，摇匀溶解，用1 M NaOH调pH值为7.6，补足蒸馏水至1000 mL，15磅高压30 min，待其自然冷却至室温后加入体积比为2%的新生牛血清，分装，4℃保存。

2.1.2　改良TSA平板：称取胰蛋白胨大豆琼脂粉（TSA）4 g，加入100 mL蒸馏水中，煮沸溶解，15磅高压3 min，待其自然冷却至60℃左右时加入2 mL的新生牛血清，混匀后分装制成平板，4℃保存。

2.2　菌种制备：取灭菌注射器吸2.5 mL的改良LB培养基，加入菌种冻干瓶中，将溶解的菌种液划线接种于1个改良TSA平板上，置5%CO₂培养箱中37℃培养24 h。挑选圆形微突起、表面光滑奶油状半透明的特征单3个，接种20 mL改良LB培养基中，37℃振荡培养16 h后取出，作为一级种子，4℃可保存5 d。取一级种子1 mL接种于100 mL改良LB培养基中，37℃振荡培养16 h后取出，作为二级种子，4℃可保存5 d。

2.3　荚膜提取：按1%体积比，将二级种子接种于改良LB培养基中，37℃振荡培养16 h后取出，10000 g离心20 min，弃上清，按菌泥湿重每1 g加入脱膜液20 mL（称取NaCl 290 g，十二烷基硫酸钠25 g，加入10000 mL蒸馏水中，15磅高压30 min，室温保存），吹打混匀，于56℃水浴锅中用电动搅拌器不间断搅拌1.5 h。然后将脱膜液相继用冷水浴、冰水浴、分成小份于冰箱中冷却，直至液体发白但确保不能结冰。10000 g离心50 min，取上清，装入透析袋内，紧塞透析管口，悬挂于盛有蒸馏水的透析箱横梁上，4℃静置，每12 h换水1次，共换3次水。最后换水后12 h收集透析袋内液体，即为鸭疫里默氏菌荚膜抗原。

3、鸭疫里默氏菌荚膜提原的蛋白浓度测定：用紫外吸收法快速计算荚膜抗原中的蛋白浓度。设备选择Thermo公司的NanoDrop超微量分光光度计，吸取2 μL荚膜抗原按操作说明书进行。测定3次，取平均值。

4、荚膜提原蜂胶疫苗的制备：取80%纯度的蜂胶，磨碎，溶解于无水乙醇中，根据要求配成适当浓度的蜂胶乙醇溶液，将荚膜抗原和蜂胶乙醇混合配成混悬液，确保荚膜抗原的终浓度为2.0 mg/mL，蜂胶干物质含量为15 mg/mL，无菌分装于100 mL的疫苗瓶内，密封保存，4℃保存。

5、荚膜提原蜂胶疫苗的检验：

5.1　无菌检验：按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》中的规定配制无菌硫乙醇酸盐培养基（每瓶50 mL）、T.G（硫乙醇酸盐）小管、2支G.A（酪胨琼脂）斜面和1支G.P（葡萄糖蛋白胨汤）小管。无菌吸取1 mL疫苗，沿着瓶壁注入50 mL无菌硫乙醇酸盐培养基中，盖好盖子，放入37℃恒温培养箱内，培养3 d。将培养瓶稍倾斜，从瓶中吸取1 ml液体（注意避免油滴，吸取表面上清），然后分别加入2支T.G小管、2支G.A斜面和1支G.P小管，每支0.2 mL，均沿小管壁缓慢加入，注意加好斜面时，轻轻晃动几下，让其铺满斜面。取1支T.G小管、1支G.A斜面和1支G.P小管放置25℃培养；另取1支T.G小管和1支G.A斜面放置37℃培养，均培养5 d后观察，均应无细菌生长。

5.2　安全检验：用5~10日龄健康樱桃谷鸭10羽，各颈部背侧皮下注射疫苗2 mL，观察7 d，观察是否出现疫苗引起的局部或全身不良反应。试验鸭局部会有1或2 d的触痛，3 d后触痛消失。所有试验鸭均不会出现全身不良反应。

5.3　效力检验：采用免疫攻毒法，用7日龄健康易感樱桃谷鸭20羽，其中10羽各颈部背侧皮下注射疫苗1 mL为免疫组，另10羽不处理作为阴性对照，同条件隔离饲养。免疫后14 d，所有鸭每羽皮下注射制苗用活菌，攻菌后观察5 d，记录死亡数并从死亡鸭脑组织中分离细菌。观察期满扑杀所有存活鸭，检查病变，同时见心包炎和肝周炎的存活鸭判为严重病变鸭，与死亡鸭合并计算死亡率。计算对照组的死亡率和免疫组的保护率。对照组的死亡率为80%，免疫组的保护率为80%。

5.4　免疫产生期测定：采用免疫攻毒法，用7日龄健康易感樱桃谷鸭60羽，其中30羽各颈部背侧皮下注射疫苗1 mL为免疫组，另30羽不处理作为阴性对照，同条件隔离饲养。免疫后4 d、7 d、10 d，取免疫组和对照组各10羽鸭，每羽皮下注射制苗用活菌，攻菌后观察5 d，记录死亡数并从死亡鸭脑组织中分离细菌。观察期满扑杀所有存活鸭，检查病变，同时见心包炎和肝周炎的存活鸭判为严重病变鸭，与死亡鸭合并计算死亡率。试验数据见表1，从中可以看出，免疫后10 d，免疫组的保护率为70%，即免疫产生期为10 d。

表1　免疫产生期试验

5.5　免疫持续期测定：采用免疫攻毒法，用7日龄健康易感樱桃谷鸭80羽，其中40羽各颈部背侧皮下注射疫苗1 mL为免疫组，另40羽不处理作为阴性对照，同条件隔离饲养。免疫后70 d、80 d、90 d、100 d，取免疫组和对照组各10羽鸭，每羽皮下注射制苗用活菌，攻菌后观察5 d，记录死亡数并从死亡鸭脑组织中分离细菌。观察期满扑杀所有存活鸭，检查病变，同时见心包炎和肝周炎的存活鸭判为严重病变鸭，与死亡鸭合并计算死亡率。试验数据见表2，从中可以看出，免疫后90 d，免疫组的保护率为80%，免疫后100 d，免疫组的保护率下降为70%，即免疫持续期为90 d。

表2　免疫持续期试验

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1.一种鸭疫里默氏菌荚膜抗原蜂胶疫苗的制备方法，其特征在于：其制备方法包括：

 1）　培养基的制备：

制备改良LB培养基及改良TSA平板；

所述改良LB培养基：称取胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 5 g，加蒸馏水800 mL，摇匀溶解，用1 M NaOH调pH值为7.5-7.7，补足蒸馏水至1000 mL，10-20磅高压20-30 min，待其自然冷却至室温后加入体积比为2%的新生牛血清，分装，2℃~8℃保存；

所述改良TSA平板：称取胰蛋白胨大豆琼脂粉4 g，加入100 mL蒸馏水中，煮沸溶解，10-20磅高压20-30 min，待其自然冷却至55-65℃时加入2 mL的新生牛血清，混匀后分装制成平板，2℃~8℃保存；

2）菌种制备：取灭菌注射器吸2.5 mL的改良LB培养基，加入鸭疫里默氏菌菌种冻干瓶中，将溶解的菌种液划线接种于1个改良TSA平板上，置体积分数5%CO₂培养箱中37℃培养24-26 h；挑选圆形微突起、表面光滑奶油状半透明的特征单菌落2~3个，接种于20 mL改良LB培养基中，37℃振荡培养16 -18 h后取出，作为一级种子，2℃~8℃可保存5 d；取一级种子1 mL接种于100 mL改良LB培养基中，37℃振荡培养16 -18 h后取出，作为二级种子，2℃~8℃可保存5 d；

3）荚膜提取：按1%体积比，将二级种子接种于改良LB培养基中，37℃振荡培养16 -18 h后取出，10000 g离心20 -30 min，弃上清，按菌泥湿重每1 g加入20 mL脱膜液，吹打混匀，于55-57℃水浴锅中用电动搅拌器不间断搅拌1-2 h，然后将脱膜液相继用冷水浴、冰水浴，分成小份于冰箱中冷却，直至液体发白但确保不能结冰，10000 g离心50-60 min，取上清，装入透析袋内，紧塞透析管口，悬挂于盛有蒸馏水的透析箱横梁上，2℃~8℃静置，每12 h换水1次，换3-4次水，最后换水12 h后收集透析袋内液体，即为鸭疫里默氏菌荚膜抗原；

4）鸭疫里默氏菌荚膜提原的蛋白浓度测定：用紫外吸收法快速计算荚膜抗原中的蛋白浓度，测定3次，取平均值；

5）荚膜提原蜂胶疫苗的制备：取纯度在80%以上的蜂胶，磨碎，溶解于无水乙醇中，根据要求配成100~150 mg/mL浓度的蜂胶乙醇溶液，将鸭疫里默氏菌荚膜抗原和蜂胶乙醇溶液混合配成混悬液，确保荚膜抗原的终浓度为1.0~2.0 mg/mL，蜂胶干物质含量为10~15 mg/mL，无菌分装于100 mL的疫苗瓶内，密封保存，2℃~8℃保存；

所述的脱膜液配方为NaCl 290 g，十二烷基硫酸钠25 g，加入10000 mL蒸馏水中，10-20磅高压20-30 min，室温保存。

2.一种如权利要求1所述方法制得的鸭疫里默氏菌荚膜抗原蜂胶疫苗。