CN114634922A - 一种批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵培养技术领域，公开了一种批发酵提升鸭疫里默氏菌RA1明胶液化酶产量的方法，对血清1型鸭疫里默氏菌进行批发酵法发酵培养，得到发酵液；对发酵液进行离心、沉淀、透析，将回收目标产物采用PBS缓冲液反复冲洗作为明胶酶纯品，明胶酶纯品经明胶液化酶液化实验证明呈阳性，即得明胶液化酶终产物；采用SDS‑PAGE方法对明胶液化酶终产物进行分子量测定。发酵液培养具体包括：菌种复苏：将冰箱保存的血清1型鸭疫里默氏菌RA1融化后，无菌操作法用接种环取菌泥涂布新鲜制备的血平板，并划线培养出单菌落；RA1扩大培养：取RA1单菌落涂布血平板，在平板上长出大量菌丛后，过夜培养；批发酵法培养RA1。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵培养技术领域，尤其涉及一种批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法。
背景技术
目前，鸭疫里默氏菌(Rimerella-anatipestifer，RA)是鸭传染性浆膜炎病的病原体，它侵入机体可引起以纤维素性多发性浆膜炎、脑膜炎为特征的全身性疾病。鸭疫里默氏菌是一种非溶血性，非运动性、革兰氏阴性细小杆菌。随着世界养鸭业的发展，该病已成为全球范围内影响养鸭业的一种重要细菌性疾病。研究发现，RA(血清1型，RA1)能分泌一种液化明胶的蛋白酶(明胶液化酶)，是其致病的重要原因。当前实验室获得该酶主要采用三角烧瓶培养，获得的产量非常有限，因此采用自动化大罐培养显得十分重要。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)采用三角烧瓶小批量培养产量非常低；
(2)不能自动监测发酵过程。
解决以上问题及缺陷的难度为：研究微生物放大培养的生长适应性，通过优化发酵条件和调整参数，找出放大培养获得高产RA1明胶液化酶方法。
解决以上问题及缺陷的意义为：通过工业化发酵罐可以实时监测发酵过程动态变化，获得RA1分泌明胶液化酶的最佳条件，为后续研究其致病机理提供明胶液化酶样品。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法。
本发明是这样实现的，一种批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法包括：
步骤一，对血清1型鸭疫里默氏菌进行批发酵法发酵培养，得到发酵液；
步骤二，明胶酶纯化与制备：对发酵液进行离心、沉淀、透析，将得到的回收目标产物采用PBS缓冲液反复冲洗作为明胶酶纯品；
步骤三，采用SDS-PAGE方法对明胶液化酶终产物进行分子量测定。
进一步，所述步骤一，具体包括：
菌种复苏：冰箱-70℃保存的血清1型鸭疫里默氏菌(RA1)融化后，无菌操作法用接种环取菌泥涂布新鲜制备的巧克力平板，并划线接种后，置培养箱37℃含有5％CO2条件下孵育16-24小时，直至生长出圆润隆起透明的单个菌落，保证菌落的纯净；
RA1扩大培养：取RA1单个菌落涂布巧克力平板，在平板上长出大量菌丛后，转入1000毫升三角烧瓶的液体培养基过夜培养，调整菌液的OD600＝0.6作为发酵种子储备液。该发酵种子液储备液菌体在显微镜下(1000倍油镜)检查菌体饱满，无明显异型性和杂菌；经过血清学检查呈抗体阳性。发酵种子储备液经发酵液放大培养作为发酵种子液；
批发酵法培养RA1：在发酵罐中灌注3.5升发酵培养基，待培养基完全溶解后加入RA1复壮发酵种子液，调整发酵罐参数，发酵24小时后测定发酵液的 pH值，对发酵终点进行判断。
进一步，所述过夜培养包括：转入装有发酵液体培养基的100毫升三角烧瓶过夜培养，调整菌液的OD600＝0.6作为发酵种子液。
进一步，所述培养基完全溶解后调整温度至37.0℃，无菌操作加入1.0％的 RA1复壮发酵种子液。
进一步，所述调整发酵罐参数，包括：
温度参数：维持37.0℃；
溶氧参数：0-4小时溶氧30％，5-12小时20％，13-24小时10％；
搅拌速度参数：0-4小时400rpm，5-12小时200rpm，13-24小时100rpm；
pH参数：0-4小时7.35，5-12小时7.0，13-24小时6.8；
消泡剂用量：0.1％聚氧乙烯氧丙烯甘油；
补糖参数：12-24小时之间补充0.1％葡萄糖。
进一步，步骤二中，所述明胶酶纯化与制备，具体包括：
(1)发酵液采用冷冻离心机离心，丢弃沉淀，回收离心液；
(2)在离心液添加硫酸铵至终浓度60％，静置6小时，12000rmp离心20分钟分离沉淀；
(3)将沉淀置缓冲液中透析过夜，得到的透析液用DEAE-Sepharose Fast Flow，苯基琼脂糖凝胶(phenyl-Sepharose CL-4B)层析与Superdex 75柱层析；
(4)回收目标产物采用PBS缓冲液反复冲洗作为明胶酶纯品，明胶酶纯品经明胶液化酶液化实验证明呈阳性，即得明胶液化酶终产物。
进一步，步骤(1)中，所述离心机以6000rmp，在4℃条件下离心15min。
进一步，步骤(3)中，所述缓冲液采用pH7.5，0.01M的Tris-HCl。
进一步，所述发酵培养基的制备方法包括：
胰化蛋白胨10.0g,酵母提取物5.0g，NaCL 10.0g，维生素B2 50毫克，维生素B6 100毫克，维生素B12 20毫克用1.0N NaOH调节pH值至7.2，用去离子水定容至1.0L，121℃15分钟高压蒸气灭菌备用。
进一步，所述血平板的制备方法包括：
胰化蛋白胨10.0g,酵母提取物5.0g，NaCL 10.0g，用1.0N NaOH调节pH 值至7.2，用去离子水定容至1.0L，121℃15分钟高压蒸气灭菌，冷却到45℃按照每500毫升/5毫升剂量加入新鲜兔血，凝固后备用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
(1)与常规实验室1.0升三角烧瓶发酵相比，批发酵可以获得3.5升发酵液；
(2)与常规制备含量0.22克/升相比，本方法分离获得的RA1明胶液化酶含量达到0.68克/升。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法的实现流程图。
图3是本发明实施例提供的RA1典型光镜和SEM电镜的效果图；RA1典型光学显微镜(a)和SEM(b)电镜。
图4是本发明实施例提供的DEAE-Sepharose Fast Flow纯化效果曲线图。
图5是本发明实施例提供的苯基琼脂糖凝胶(phenyl-Sepharose CL-4B)层析纯化曲线图。
图6是本发明实施例提供的RA1明胶液化酶的液化效果图；RA1明胶酶液氧阴性(a)与阳性(b)。
图7是本发明实施例提供的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法包括：
S101，对血清1型鸭疫里默氏菌进行批发酵法发酵培养，得到发酵液；
S102，明胶酶纯化与制备：对发酵液进行离心、沉淀、透析，将得到的回收目标产物采用PBS缓冲液反复冲洗作为明胶酶纯品；
S103，采用SDS-PAGE方法对明胶液化酶终产物进行分子量测定。
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
1.发酵工艺
1.1菌种复苏
冰箱-70℃保存的血清1型鸭疫里默氏菌(RA1)融化后，无菌操作法用接种环取菌泥涂布新鲜制备的巧克力平板，并划线接种后，置培养箱37℃含有5％CO2条件下孵育16-24小时，直至生长出圆润隆起透明的单个菌落。
1.2RA1扩大培养
取RA1单个菌落涂布巧克力平板，在平板上长出大量菌丛后，转入1000毫升三角烧瓶的液体培养基过夜培养，调整菌液的OD600＝0.6作为发酵种子储备液。该发酵种子液储备液菌体在显微镜下(1000倍油镜)检查菌体饱满，无明显异型性和杂菌；经过血清学检查呈抗体阳性。发酵种子储备液经发酵液放大培养作为发酵种子液。
1.3批发酵法培养RA1
在发酵罐中灌注3.5升发酵培养基，待培养基完全溶解后调整温度至37.0℃，无菌操作加入1.0％的RA1复壮发酵种子液；然后调整发酵罐参数，温度参数：维持37.0℃；溶氧参数:0-4小时溶氧30％，5-12小时20％，13-24小时10％；搅拌速度参数：0-4小时400rpm，5-12小时200rpm，13-24小时100rpm；pH参数： 0-4小时7.35，5-12小时7.0，13-24小时6.8；消泡剂用量:0.01％；补糖参数： 12-24小时之间补充0.1％葡萄糖；发酵终点的判断：发酵24小时后测定发酵液的pH达到6.8终止发酵。
2.明胶酶纯化与制备
发酵液采用冷冻离心机以6000rmp在4℃条件下离心15min，丢弃沉淀，回收离心液。在离心液添加硫酸铵至终浓度60％，静置6小时，12000rmp离心20 分钟分离沉淀，沉淀置pH7.5，0.01M Tris-HCl缓冲液中透析过夜，得到的透析液以此用DEAE-Sepharose FastFlow，透析液采用苯基琼脂糖凝胶 (phenyl-Sepharose CL-4B)层析与Superdex 75柱层析，回收目标产物采用PBS 缓冲液反复冲洗作为明胶酶纯品，明胶酶纯品经明胶液化酶液化实验证明呈阳性，即得明胶液化酶终产物。
3.明胶酶含量即分子量测定
明胶液化酶终产物含量测定按照国标明胶液化酶终产物分子量测定采用 SDS-PAGE方法测定。
发酵培养基制备:胰化蛋白胨10.0g,酵母提取物5.0g，NaCL 10.0g，维生素 B2 50毫克，维生素B6 100毫克，维生素B12 20毫克用1.0N NaOH调节pH值至7.2，用去离子水定容至1.0L，121℃15分钟高压蒸气灭菌备用。
血平板制备:胰化蛋白胨10.0g,酵母提取物5.0g，NaCL 10.0g，用1.0N NaOH调节pH值至7.2，用去离子水定容至1.0L，121℃15分钟高压蒸气灭菌，冷却到45℃按照每500毫升/5毫升剂量加入新鲜兔血，凝固后备用。
图2是本发明实施例提供的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法的实现流程图。
图3是本发明实施例提供的RA1典型光镜和SEM电镜的效果图；RA1典型光学显微镜(a)和SEM(b)电镜。
图4是本发明实施例提供的DEAE-Sepharose Fast Flow纯化曲线图。
图5是本发明实施例提供的苯基琼脂糖凝胶(phenyl-Sepharose CL-4B)层析纯化曲线图。
图6是本发明实施例提供的RA1明胶液化酶的液化效果图；RA1明胶酶液氧阴性(a)与阳性(b)。
图7是本发明实施例提供的SDS-PAGE电泳图。
下面结合实施例对本发明的技术效果作详细的描述。
实施例1发酵培养基制备
胰化蛋白胨10.0克，酵母提取物5.0g,NaCL 10.0克,维生素B2 50毫克,维生素B6100毫克,维生素B12 20毫克，1mM Ca2+，用1.0N NaOH调节pH值至7.2，用去离子水定容至1.0L，121℃15分钟高压蒸气灭菌备用。
实施例2巧克力平板制备
胰化蛋白胨10.0g,酵母提取物5.0g,NaCL 10.0g,用1.0N NaOH调节pH值至 7.2，用去离子水定容至1.0L，121℃15分钟高压蒸气灭菌,冷却到70℃按照每 500毫升/5毫升剂量加入新鲜兔血，凝固后备用。
实施例3PBS(pH7.2)配制
PBS(pH7.2):800ml蒸馏水中溶解8gNaCL,0.2gKCl,1.44gNa2HPO4,0.24g KH2PO4,用HCl调节pH到7.4,加水定容到1升，室温保存备用。
实施例4Tris-配制
用MilliQ H2O将50×TAE(贮存液)稀释成1×TAE(工作液)；50×TAE(贮存液)：121g Tris碱，28.55ml冰乙酸，50ml 0.5mmol/L EDTA(pH8.0)；
实施例5 1.5mol/L，pH 8.8Tris-HCl分离胶缓冲液
称量18.15g Tris，用1mol/L HCl定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；
实施例6 1.0mol/L，pH 6.8Tris-HCl分离胶缓冲液
称量12g Tris，用1mol/L调pH至100ml，棕色瓶避光4℃保存；
实施例7浓度30％聚丙烯酰胺贮液
丙烯酰胺150g，甲叉双丙烯酰胺4g，双蒸水500ml，滤纸过滤，棕色瓶避光4℃保存；
实施例8 10％SDS溶液
10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存；
实施例9 10％AP溶液
称量0.1g AP(过硫酸铵)加水定容至1ml，用前新鲜配制；
实施例10 1×SDS-PAGE电泳缓冲液
25mM Tris(3.0285g/L)，192mM甘氨酸(14.41g/L)，0.1％SDS(1g/L)，pH 8.30；
实施例11蛋白质染色液
考马斯亮蓝R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸，过滤除去杂质；
实施例12脱色液
45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；
实施例13固定液
50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；
实施例14 2×SDS-PAGE上样缓冲液
10％SDS 0.4ml，0.375M Tris-HCl(pH 6.8)0.333ml，甘油0.2ml，1％溴酚兰10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，分装后-20℃保存。
实施例15SDS-PAGE分离胶浓度
实施例16SDS-PAGE浓缩胶浓度配方表
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，其特征在于，所述批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法包括：
步骤一，对血清1型鸭疫里默氏菌进行批发酵法发酵培养，得到发酵液；
步骤二，明胶酶纯化与制备：对发酵液进行离心、沉淀、透析，将得到的回收目标产物采用PBS缓冲液反复冲洗作为明胶酶纯品；
步骤三，采用SDS-PAGE方法对明胶液化酶终产物进行分子量测定。
2.如权利要求1所述的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，其特征在于，所述步骤一，具体包括：
菌种复苏：冰箱-70℃保存的血清1型鸭疫里默氏菌(RA1)融化后，无菌操作法用接种环取菌泥涂布新鲜制备的巧克力平板，并划线接种后，置培养箱37℃含有5％CO2条件下孵育16-24小时，直至生长出圆润隆起透明的单个菌落；
RA1扩大培养：取RA1单个菌落涂布巧克力平板，在平板上长出大量菌丛后，转入1000毫升三角烧瓶的液体培养基过夜培养，调整菌液的OD600＝0.6作为发酵种子储备液。该发酵种子液储备液菌体在显微镜下(1000倍油镜)检查菌体饱满，无明显异型性和杂菌；经过血清学检查呈抗体阳性。发酵种子储备液经发酵液放大培养作为发酵种子液；
批发酵法培养RA1：在发酵罐中灌注3.5升发酵培养基，待培养基完全溶解后加入RA1复壮发酵种子液，调整发酵罐参数，发酵24小时后测定发酵液的pH值，对发酵终点进行判断。
3.如权利要求2所述的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，其特征在于，所述过夜培养包括：转入装有发酵液体培养基的100毫升三角烧瓶过夜培养，调整菌液的OD600＝0.6作为发酵种子液。
4.如权利要求2所述的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，其特征在于，所述培养基完全溶解后调整温度至37.0℃，无菌操作加入1.0％的RA1复壮发酵种子液。
5.如权利要求1所述的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，其特征在于，所述调整发酵罐参数，包括：
温度参数：维持37.0℃；
溶氧参数：0-4小时溶氧30％，5-12小时20％，13-24小时10％；
搅拌速度参数：0-4小时400rpm，5-12小时200rpm，13-24小时100rpm；
pH参数：0-4小时7.35，5-12小时7.0，13-24小时6.8；
消泡剂用量：0.1％聚氧乙烯氧丙烯甘油；
补糖参数：12-24小时之间补充0.1％葡萄糖。
6.如权利要求1所述的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，其特征在于，步骤二中，所述明胶酶纯化与制备，具体包括：
(1)发酵液采用冷冻离心机离心，丢弃沉淀，回收离心液；
(2)在离心液添加硫酸铵至终浓度60％，静置6小时，12000rmp离心20分钟分离沉淀；
(3)将沉淀置缓冲液中透析过夜，得到的透析液以此用DEAE-Sepharose Fast Flow与Superdex 75column层析；
(4)透析液采用苯基琼脂糖凝胶(phenyl-Sepharose CL-4B)层析；
(5)回收目标产物采用PBS缓冲液反复冲洗作为明胶酶纯品，明胶酶纯品经明胶液化酶液化实验证明呈阳性，即得明胶液化酶终产物。
7.如权利要求6所述的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述离心机以6000rmp，在4℃条件下离心15min。
8.如权利要求6所述的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述缓冲液采用pH7.5，0.01M的Tris-HCl。
9.如权利要求2所述的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，其特征在于，所述发酵培养基的制备方法包括：胰化蛋白胨10.0g,酵母提取物5.0g，NaCL 10.0g，维生素B2 50毫克，维生素B6 100毫克，维生素B12 20毫克，1mM Ca2+，用1.0N NaOH调节pH值至7.2，用去离子水定容至1.0L，121℃高压蒸汽灭菌15分钟备用。
10.如权利要求2所述的批发酵提升鸭疫里默氏菌明胶液化酶产量的方法，其特征在于，所述血平板的制备方法包括：胰化蛋白胨10.0g,酵母提取物5.0g，NaCL 10.0g，1mM Ca2 +，用1.0N NaOH调节pH值至7.2，用去离子水定容至1.0L，121℃15分钟高压蒸气灭菌，冷却到45℃按照每500毫升/5毫升剂量加入新鲜兔血，凝固后备用。
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