JPH04505558A

JPH04505558A - ＨＩＶ―２及びＳＩＶ型のレトロウイルスのゲノムを増幅するためのオリゴヌクレオチド配列、及び、これらのウイルス感染症をｉｎ―ｖｉｔｒｏ診断するためのかかる配列の使用

Info

Publication number: JPH04505558A
Application number: JP2509746A
Authority: JP
Inventors: ソニゴ，ピエール; ブルシヨ，クリステイアン; クルニヨ，バレリー
Original assignee: アンステイテユ・パストウール; アンステイテユ・ナシオナル・ドウ・ラ・サンテ・エ・ドウ・ラ・ルシエルシユ・メデイカル
Priority date: 1989-06-02
Filing date: 1990-06-05
Publication date: 1992-10-01
Also published as: WO1990015158A1; CA2592555A1; CA2341946C; US6020123A; CA2341946A1; ATE144558T1; EP0404625A3; DK0404625T3; EP0404625A2; FR2647810B1; CA2592555C; DE69028951D1; DE69028951T2; CA2055612C; ES2095241T3; CA2055612A1; EP0404625B1; FR2647810A1; GR3022248T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＩＶ−２及びＳＩＶ型のレトロウィルスのゲノムを増幅するためのオリゴヌクレオチド配列、及び、これらのウィルス感染症をＬｎ−ｖｉｔｒｏ診断するためのかかる配列の使用本発明は特に、ＨＩＶ−２型のヒトの免疫不全レトロウィルスまたはＳＩＶ型のサルの免疫不全レトロウィルスの核酸配列を増幅するためのプライマーとして有用なオリゴヌクレオチド配列に係る。

本発明は特に、ヒト個体のＨＩＶ−２型レトロウイルス感染をｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断する方法におけるこれらの配列の使用に係る。

ＨＩＶ−２と総称されるレトロウィルスの単離及びキャラクタリゼーションは、欧州特許出履第８７／４００，１５１．４号に記載されている。これらのレトロウィルスは、リンパ節障害または後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の症状を有する数人のアフリカ人患者から単離されたものであった。

ＨＩＶ−２型レトロウイルスはＨＩＶ−１型レトロウイルスと同様に、ヒトＴ４リンパ球向性を有し、また、リンパ球内部で増殖するとこれらのリンパ球に細胞変性効果を生じさせる特性を有し、その結果として、全身性及び持続性の多発腺症（ｐｏ　Ｉｙａｄｅｎｏｐｈｔ’ｈｉｅｓ）、またはＡＩＤＳを発病させる。

以前の通称５ＴＬＶ−ＩＩＩに代わる名称５ＩＶ−１で呼ばれることになった別のレトロウィルスは、アカゲザルから単離されたものである（Ｍ、Ｄ、ＤＡＮＩＥＬ他、５ｃｉｅｎｃｅ、２２８．　１２０１（１９８５）；Ｎ。

Ｌ、ＬＥＴＷＩＮ他、５ｃｉｅｎｃｅ、２３０．７１（１９８５）’ＳＴＬＶ− １１１ｍａｃ」）。

ｒＳＴＬＶ−ＩＩＩＡにＪ　（またはＳＩｖＡＧＭ）ト命名された別のレトロウィルスは野性ミドリザルから単離されたものである。しかしながら、アカゲザルに存在するウィルスとは違って、Ｓ　Ｔ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩＩＡ叶が存在してもアフリカミドリザルはＡＩＤＳ型疾患を発病しない。

用語の便宜上、以後の記載ではこれらのウィルスを常に５ＩＶ（サル免疫不全ウィルスの略号）として示し、必要に応じてサルの種類を示す略号、例えばアカゲザルでは「ｍａＣ」、アフリカミドリザルではｒＡＧＭ、を添える。

レトロウィルスＳＩＶ−１ｍａｃの菌株は１９８６年２月７日に受託番号Ｎｏ、ｌ−５２１でＣ，Ｎ、Ｃ，Ｍ、に寄託された。

研究によれば、レトロウィルス５ＩＶ−１は、類似の染着タンパク質と免疫類似性を有するいくつかのタンパク質を含むことが判明した。

レトロウィルスＨＩＶ−２の研究を続けることによって更に、該レトロウィルスのゲノムのＲＮＡの相補的ＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）が得られた。ＨＩＶ−２クラスの代表的なレトロウィルＸ（ＨＩＶ−２ＲＯＤ＞のｃＤＮＡの完全ヌクレオチド配列は、１９８６年２月２１日に参照名ＬＡＶ−２ＲＯＤとして受託番号Ｎｏ、ｌ−５３２ｔ’Ｃ，Ｎ。

Ｃ，Ｍ、に寄託された。

現行のＨＩＶ−２型ウイルス感染のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法では概して、生物体液中、特に被検患者から得られた血清中の抗ＨＩＶ−２抗体の有無を検出するために、該生物体液とＨＩＶ−２の抽出物または抗原とを、該抽出物または抗原と抗体との免疫反応が生じ得る条件下に接触させる。

かかる診断方法は、感度が劣っており、また、特に個体がＨＩＶ−２ウイルスに感染したばかりの場合には間違って陰性の結果を示す恐れもある。

ゲノム増幅技術は、ウィルス性疾患の特に高感度の１ｎｖｉｔｒｏ診断方法の開発に大きく貢献し得る。これらの増幅技術として例えば、１９８６年３月２７日付けの欧州特許出願第８６／３０２．２９８．４号と１９８７年１月９日付けの第８７／３００．２０３．４号に記載のごときｐｃＲ（ポリメラーゼチェーン反応）技術、または、Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏ　ｌｏｇｙ、ｖｏ　１．６．ｐ、１１９７　（１９８８年１０月）に記載の「Ｑβレプリカーゼ」技術、及び、国際特許出願第ＷＯ３９１０１０５０号に記載のＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ）を用いて処理する技術がある。これらの技術は、ウィルスの核酸の検出感度を改良し得るが、特異的合成プライマーを使用する必要がある。

ＨＩＶ−２型ウイルスを研究するための１ライマーの選択は重要な問題である。

実際、ウィルスゲノムのヌクレオチド配列の変異性が大きいので、所与のＨＩＶ −２単離物の既知の配列に適したプライマーは、いくつかのＨＩＶ−２型ウィルス変異体の増殖には成功しないかもしれない。

また、２つの異なるＨＩＶ−２ウイルスの双方が保存しているゲノムの領域からプライマーを選択したときでさえ、プライマーの「十分な機能」が確保されず増幅効率がよくないこともある。

本発明の目的はまさに、ＨＩＶ−２型のすべてのウィルスのゲノムを、診断に用いるために優れた効率で増幅させ得るオリゴヌクレオチド配列（またはプライマー）を提供することである。

本発明のプライマーは、ＨＩＶ−２のグループのウィルス及びＳＩＶ型のウィルスの双方に特異的であり、これらのウィルスのゲノムの変異には影響されない。

本発明の目的は、ＨＩＶ−２またはＳＩＶ型のウィルスのゲノムを増幅するために使用できる約１５〜２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーを提供することである。

本発明の１ライマーの特徴は、そのヌクレオチド配列が、−ＨＩＶ−２ＲＯＤウィルスのゲノムに由来のｃＤＮＡの４０及び６１．９５３７及び９５５８．２４０及び２５９．５４６及び５６９．９０６及び９２７．６１２及び６３３．１８５７及び１８７６．２０７８及び２１０１．６２７５及び６２９９．６８５５及び６８７８．７５４８及び７５７３．７７８２及び７８０５．８４１２及び８４３４．６１及び８２．９５５８及び９５７９位に存在するヌクレオチドによって限定された核酸配列の１つに含まれるヌクレオチド配列または該核酸配列の１つに相補的なヌクレオチド配列から選択されるか、あるいは、−３ＩＶｍａｃ　１４２ウイルスのゲノムに由来のｃＤＮＡの４０及び６１．９５１１及び９５３２．２４０及び２５９．２５６及び２７５．５５１及び５７４．９１１及び９３２．６１７及び６３８．１８６８及び１８８７．２０３５及び２０５８．６２２７及び６２５１．７５５０及び７５６４．７７７６及び７７９９．８４０６及び８４２８．６１及び８２．９５３２及び９５５３位に存在するヌクレオチドによって限定された核酸配列の１つに含まれるヌクレオチド配列または該核酸配列の１つに相補的なヌクレオチド配列から選択され、 −（特に最も長いプライマーの場合には）ＨＩＶ−２ＲＯＤもしくはＳＩＶｍａｃ　１４２に由来の前記核酸配列の１つを含むか、または、該核酸配列の１つに相補的な核酸配列を含み、但し、これらの核酸配列の好ましくは５゛末端側から「突出している」任意の付加的ヌクレオチドが、ＨＩＶ−２ＲＯＤまたはＳｒＶｍａｃ　４４２の完全配列の内部に対応する５′末端の手前に存在する配列と好ましくは一致しており、 −まな、対象となるＣＤＮＡＭは、ＨＩＶ−２ＲＯＤ及びＳＩＶｍａｃ　１４２ウイルスのＲＮＡの相補的値であり、 −このプライマーの配列が前記核酸配列の１つに等しくないときまたはこれらの配列の１つに相補的でないときにも、１０ｍＭのトリス、２０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣＬ及び０．０１％ゼラチンから成る溶液中で５０℃以上の温度で１分間処理するとウィルス）（ＩＶ−２ＲＯＤ及び／またはＳＩＶｍａｃ　１４２に由来の前記核酸配列とハイブリダイズし得る、ことである。

前記のヌクレオチドの番号は、ＨＩＶ−２ＲＯＤのＣＤＮＡに関してはＮａｔｕｒｅ、ｖｏ　１．３２６．ｐ、６６２〜６６９　（１９８７）に収載のＧＵＹＡＤＥＲ他の論文の図２で使用された番号に対応し、ＳＩＶｍａｃ　１４２のｃＤＮＡに関してはＮａｔｕｒｅ、ｖｏｌ、３２８．　ｐ。

５４３〜５４７　（１９８７）に収載のＣＨＡＫＲＡＢＡＲＴＩ　Ｌ、他の論文の図１で使用された番号に対応する。

より詳細には本発明は、５°→３°方向で以下のヌクレオチド連鎖：Ｐ　Ｉ　ＣＡＧＡＡＡＴＡＧＧＧＡＴＡＣＴＴＧＧＧＧＡＡＣＣＰ２　ＧＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＴＴＡＣＡＰ２Ｂ　ＴＧＴＡＡＴＧＡＴＡＣＣＡＡＴＴＡＴＴＣＡＧＧＣＰ４　ＡＧＴＴＣＴＧＣＣＡＣＣＴＧＴＧＣＡＣＴ、Ａ＝ＡＡＧＧＰ６　ＧＧＧＡＴＡＧＴＧＣＡＧＣＡＡＣＡＧＣＡ、Ａ、ＣＡＧで示されるオリゴヌクレオチドプライマーに係る。

上記プライマーは、ＨＩＶ−２ＲＯＤウィルスのｃＤＮＡまたはＳＩＶｍａｃ　１４２ウイルスのｃＤＮＡに由来の以下の核酸配列に等しいかまたは相補的であるニープライマーＬＴＲ１は、一方ではＨＩＶ−２ＲＯＤのｃＤＮＡの４０〜６１位に存在するヌクレオチドを含む核酸配列及び９５３７〜９５５８位に存在するヌクレオチドを含む核酸配列に等しく、他方ではＳＩＶｍａｃ　１４２のｃＤＮＡの４０〜６１位に存在するヌクレオチドを含む核酸配列及び９５１１〜９５３２位に存在するヌクレオチドを含む核酸配列に等しい、一プライマーＬＴＲ２は、一方ではＨＩＶ−２ＲＯＤ及びＳＩＶｍａｃ　１４２のｃＤＮＡの２４０〜２５９位に存在するヌクレオチドを含む核酸配列に相補的であり、他方でＳＩＶｍａｃ　１４２のｃＤＮＡの２５６〜２７５位に存在するヌクレオチドを含む核酸配列に相補的である、−プライマーＧＡＧＩは、ＨＩＶ −２ＲＯＤのｃＤＮＡのヌクレオチド５４６〜５６９を含む核酸配列、及び、ＳＩＶｍａｃ　１４２のｃＤＮＡの５５１〜５７４位に存在するヌクレオチドを含む核酸配列に等しい、−プライ７−ＣＡＧ５は、ＨＩＶ−２ＲＯＤ及びＳＩＶｍａｃ　１４２のｃＤＮＡの９０６〜９２７位及び９１１〜９３２位に夫々存在するヌクレオチドを含む核酸配列に相補的である、一プライマー〇ＡＧ２は、ＨＩＶ２　ＲＯＤ及びＳＩＶｍａｃ　１４２のｃＤＮＡの６１２〜６３３位及び６１７〜６３８位に夫々存在するヌクレオチドを含む核酸配列に等しい、一プライマー〇Ａ０２Ｂは、ＣＡＧ２に等しい前記核酸配列に相補的である、一プライ？−ＰＯＬＩは、ＨＩＶ−２ＲＯＤ及びＳｆＶｍａｃ　１４２のｃＤＮＡの１８５７〜１８７６位及び１８６８〜１８８７位に夫々存在するヌクレオチドを含む核酸配列に等しい、一プライマーＰ１は、ＨＩＶ−２ＲＯＤ及びＳＩＶｍａｃ　１４２のｃＤＮＡの６２７５〜６２９９位及び６２２７〜６２５１位に夫々存在するヌクレオチドを含む核酸配列に等しい、一プライマーＰ２は、ＨＩＶ−２ＲＯＤの６８５５〜６８７８位に存在するヌクレオチドを含む核酸配列に相補的である、一１ライマーＰ２Ｂは、前記Ｐ２に等しい核酸配列に相補的である、一プライ７−Ｐ４は、ＨＩＶ−２ＲＯＤのｃＤＮＡの７５４８〜７５７３位に存在するヌクレオチドを含む核酸配列に相補的であり、ＳＩＶｍａｃ　１４２のｃＤＮＡの７５５０〜７５６４位に存在するヌクレオチドを含む核酸配列に部分的に相補的である、一プライマーＰ６は、ＨＩＶ−２ＲＯＤ及びＳＩＶｍａｃ　１４２のｃＤＮＡの７７８２〜７８０５位及び７７７６〜７７９９位に夫々存在するヌクレオチドを含む核酸配列に等しい、 −プライマ−Ｐ７は、ＨＩＶ−２ＲＯＤ及びＳＩＶｍａｃ　１４２のｃＤＮＡの８４１２〜８４３４位及び８４０６〜８４２８位に夫々存在するヌクレオチドを含む核酸配列に等しい、一１ライマーＰ７Ｂは、前記プライマーＰ７に等しい核酸配列に相補的である、一プライマー２８は、一方ではＨＩＶ−２ＲＯＤのＣＤＮＡの６１〜８２位に存在するヌクレオチドを含む核酸配列及び９５５８〜９５７９位樟存在するヌクレオチドを含む核酸配列に相補的であり、他方ではＳＩＶｍａｃ１４２のｃＤＮＡの６１〜８２位に存在するヌクレオチドを含む核酸配列及び９５３２〜９５５３位に存在するヌクレオチドを含む核酸配列に相補的である。

本発明の目的はまた、上記に定義したプライマーＬＴＲ１、ＬＴＲ２、ＧＡＧＩ、ＣＡＧ５、ＰＯＬＩ、ＰＯＬ２、Ｐｌ、Ｐ４及びＰ８のヌクレオチド構造に相補的なヌクレオチド構造を有するプライマーを提供することである。

本発明はまた、前記に定義したプライマーに比べて、該プライマーの前記のごときハイブリダイゼーション特性を変化させない幾つかの突然変異を含むプライマーに係る。

前記プライマーの構成ヌクレオチドとは異なるが本発明のプライマーのハイブリダイゼーション特性には影響しないヌクレオチドの割合は、通常は０〜１０％であり、２０％未満が好ましい。

核酸配列を増幅させるためにはプライマーの３′側が該核酸配列の所定の鎖と完全にハイブリダイズしなければならないので、許容される突然変異の数は概してプライマーの５′側のほうが３′側よりも多い。

本発明はまた、１９８８年８月１日付けの欧州特許出願第８８／３０７．１０２．９号に記載されているようなＲＮＡのマルチプルコピーの合成によるゲノム増幅方法を実施するために、５″末端でプロモーターに結合した前記のごときプライマーに係る。

本発明の目的は特に、前記のごときプライマーを個体のＨＩＶ−２型ウイルス感染のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法に使用することである。

本発明によるこのｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法は、被検患者から採取された生物サンプル（特に血清のような生物体液）を用いて実施され、主として以下の段階、即ち、−前記生物サンプル中でその有無を検出すべきＨＩＶ−２型ウイルスのゲノムに属する核酸を抽出する段階、及び、前記核酸がＲＮＡの形態のときには二重領核酸を得るために必要に応じて前記核酸を逆転写酵素で処理する段階、並びに、 −・検出すべき二重鎖核酸を変性させ、−重鎖核酸を形成させる変性段階と、・後に定義するハイブリダイゼーション条件下に、上記変性段階で得られた核酸の各鎖を、少なくとも１対の本発明のプライマーと接触させることによって前記鎖とプライマーのすくなとくも１つとをハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション段階と、・重合剤と４つの異なるヌクレオシド三リン酸との存在下に、プライマーとハイブリダイズした鎖に相補的なりＮＡをプライマーから形成し、検出すべき二重鎖核酸を前記変性段階よりも多数形成させる段階（伸長段階）とから成るサイクルを、生物サンプル中でその有無を検出すべき前記核酸配列が検出されるべく十分な割合で得られるまで所定の回数繰り返す段階と、一生物サンプル中でＨＩＶ−２型ウイルスのゲノムに属する核酸の有無を検出する段階とを含む。

本発明のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法は、ＲＮＡを用いて行なってもよく、ウィルスＤＮＡを用いて行なってもよい。

実際、ＨＩＶ−２ウイルスのゲノムは、生物内のウィルスの所在に従ってＲＮＡまたはＤＮＡの形態で存在する。

ウィルスが生物の細胞の内部、特に血液細胞の内部に存在するときは、そのＲＮＡが逆転写酵素によってＤＮＡに転写される。逆に、特に血液中の細胞外媒質に存在するＨＩＶ−２型のウィルスのゲノムは、ＲＮＡの形態に維持される。

生物サンプルの細胞内に含まれたウィルスＤＮＡの抽出段階は、特に、Ｌａｎｃｅｔ、ｐ、５３８〜５４０（１９８８）に収載のＬＡＵＲＥ　Ｆ、他の論文に詳述されている。

例えば、Ｆｉｃｏｌｌ勾配中の遠心によってリンパ球をその他の血液成分から分離する。得られたリンパ球を次に、１０ｍＭのトリスｐＨ８，１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）及び１００μｇ／ｍｌの１０テイナーゼＫから成る溶菌バ・ツファで６０℃で２時間処理する。次いでＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈殿させる。

抽出は、濃縮血清の抽出に関する従来の手順と同様の手順で行なってもよい、その場合にはＲＮＡが得られるので、本発明のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断をＲＮＡの形態のゲノムを有するＨＩＶ−２型ウイルスを含む生物サンプルを用いて行なうときには、−重鎖ＲＮＡを二重ｇＤＮＡに変換する追加の段階が必要である。

このようにＲＮＡからＤＮＡ変換するためには、生物サンプル、特に血清の抽出後に得られたＲＮＡを、製造元（例えばＡｍｅｒｓｈａｍ）の指示通りの条件に従って適当な培地中で逆転写酵素で処理する。

本発明の診断方法の好ましい実施態様では、前記サイクル中の変性段階を９４℃ で１分間行なう。

本発明のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法の前記サイクルのハイブリダイゼーション段階は、サイクルの変性段階で得られた核酸の鎖を少なくとも一対の本発明のプライマーと接触させることによって行なわれるのが有利である。これらのプライマーは、これらの２つの１ライマーの一方が２つの鎖の一方に存在する核酸配列とハイブリダイズし他方が該鎖の相補的鎖に存在する核酸配列とハイブリダイズするように選択されており、前記の２つの相補的鎖が１つの二重鎖核酸配列を再形成すると考えられるときは、（該プライマーとハイブリダイズし得る）前記核酸配列は、５０〜ｔｏ、ｏｏｏ、好ましくは１００〜２．０００の範囲の塩基対によって隔てられている。

異なる複数対の本発明のプライマーを使用すると、ＨＩＶ−２ゲノムの種々の核酸を増幅及び検出し得る。

本発明の範囲内で使用され得る好ましいプライマー対の例は、プライマーＬＴＲＩとＧＡＧ２である。また、ＰｌとＰ２、Ｐ２とＰｌ、ＰｌとＰ８、Ｐ８とＬＴＲ２の対も好ましい０合成されたＤＮＡフラグメントが領域Ｐ１〜Ｐ２、ＬＴＲ１〜Ｐｏ１２、Ｐ２〜Ｐ７、Ｐ７〜Ｐ８、Ｐ８〜ＬＴＲ２をカバーするように使用プライマー対を選択するのが有利である。

サイクルの伸長段階で使用される重合剤としては、ＤＮＡポリメラーゼ、特にＴａｑポリメラーゼがあり、また、「Ｑβレプリカーゼ」技術の原理に従う本発明の１ｎｖｉｔｒｏ診断方法または前出の国際特許出願に記載された技術に従う方法の実施に適したいかなるポリメラーゼも使用し得る。

通常は、本発明のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法の前記サイクルを１０〜６０回、好ましくは４０回繰り返す。

本発明の診断方法のサイクルの伸長段階は７２℃で１分間行なうのが好ましい。

例えば、１μｇのレトロウィルスＤＮＡを検出するためには、１０ｐｍｏｌの各プライマー、１０ｎｍｏｌの各ヌクレオチド三リン酸（ｄＴＮＰ）、ＩＵのＴａｑポリメラーゼを、１０ｍＭのトリス　ｐＨ８，３（２３℃で測定）と２０ｍＭのＫＣＩと２ｍＭのＭ　ｇ　Ｃｌ　２と０．０１％のゼラチンとから成るバッファに入れて最終容量１００μｌにし、９４℃で１分間（変性）、約５５〜６０℃ で１分間（ハイブリダイゼーション）、７２℃で１分間（伸長）から成る熱サイクルを４０回繰り返す。

本発明のｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法の好ましい実施態様では、生物サンプル中のＨＩＶ−２型ウイルスの核酸の有無を検出する段階を、増幅された（１つまたは複数の）核酸配列とハイブリダイズし得る（１つまたは複数の）標識ヌクレオチドプローブを用いて行ない、増幅された（１つまたは複数の）検出すべきヌクレオチド配列とく１つまたは複数の）前記プローブとの間に形成されたハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する。

本発明の目的はまた、上記のごとく定義され特に放射性標識または酵素標識などによって標識されたプライマーを提供し、且つこれらのプライマーを、特に前述のごときｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法でのヌクレオチドプローブとして使用することである。

本発明のプライマーは、サル（アカゲザル、マンガベーザルまたはミドリザル）のＳＩＶ型ウィルス感染の１ｎｖｉｔｒｏ診断方法を実施するためにも使用され得る。この方法も、前述の方法の主要な特徴を有している。

本発明はまた、前記のｆｎ　ｖｉｔｒｏ診断方法に使用するための診断用キットを提供する０本発明の診断用キ・ｙトは例えば、一前記に定義の条件下で、検出すべき核酸配列の鎖の１つとハイブリダイズするプライマーと、該鎖の相補的鎖とハイブリダイズするプライマーとを各々が含む少なくとも一対の本発明のオリゴヌクレオチドブライマーと、−特にＤＮＡポリメラーゼ及び４つの異なるヌクレオチド三リン酸のような増幅処理サイクルを行なうための適当な試薬と、一検出すべく増幅された（１つまたは複数の）核酸配列とハイブリダイズし得る（１つまたは複数の）標識プローブとを含む。

本発明はまた、前記プライマーの合成方法に係る。

本発明はまた、（１つまたは複数の）ペプチド〈またはポリペプチド）を産生ずるために、 −該ペプチドをコードする（及び、好ましくは該配列の翻訳用プロモーターを含む）核酸配列を本発明の一対のプライマーを用いて増幅する段階と。

−前記のごとく増幅された前記核酸配列を適当なベクターに導入し、一前記ベクターによって適当な宿主細胞を形質転換させ、−前記のごとく形質転換された宿主細胞を培養し、該宿主細胞によって産生されたペプチドを回収する処理を含む方法を提供する。

本発明はまた、普遍的遺伝コードによれば前記ヌクレオチド配列（またはプライマー）に対応するポリペプチドに係る。

本発明の目的はまた、前記ペプチドを免疫原性物質とし、特に医薬として許容される医薬ビヒクルに組合わせて医薬組成物で使用することである。

本発明の目的はまた、前記ポリペプチド、特に普遍的遺伝コードによれば前記ヌクレオチド配列（またはプライマー）に対応するポリペプチドの製造方法を提供することである。該方法の特徴は、公知のペプチド合成方法に従って、好ましくはＣ−末端アミノ酸から出発し、連続するアミノアシルを所望の順序で２つずつ順次縮合させるか、または、アミノアシルと複数のアミノアシル残基を適当な順序で含むように予め形成したフラグメントとを縮合させるか、または、上記のごとく予め形成された複数の７ラグメントを縮合させる処理を含み、これらのアミノアシルまたはフラグメントに含まれたすべての反応性官能基のうちでペプチド結合の形成に正当に参加すべき一方のアミン官能基と他方のカルボキシル官能基またはその逆の組み合わせ以外の全部の官能基を、特にカルボキシル官能基の活性化後に保護するように配慮しながら、前記処理をＮ−末端アミノ酸まで順々に継続することである。

例えば、ｒＭｅｔｈｏｄｅ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ」（有機化学の方法）、Ｅ、　Ｗｕ　ｎ　ｓ　ｃ　ｈ編、ｖｏｌ、１５−Ｉ　＆　ＩＩ、ＴＨＩＥＭＥ、５ＴＵＴＴＧＡＲＴ、１９７４にＨｏｕｂｅｎｗｅｙｌが記載している均質溶液中のペプチド合成技術、または、ｒｓｏ　１ｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｊ、ＡＭ、ＣＨＥＭ、ＳＯＣ，４互、２１４９〜２１５４）にＲ，Ｄ、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄが記載している固相ペプチド合成技術を使用し得る。

本発明はまた、前記ヌクレオチド配列（またはプライマー）を製造するために、以下の段階、即ち、−前記ＨＩＶまたはＳＩＶ型のウィルスからＤＮＡａｓｅＩによって単離されたゲノムＤＮＡをインキュベートし、次いでＥＤＴＡを添加し、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５／２４／１）混合物及びエーテルで順次抽出することによって精製し、−前記のごとく抽出されたＤＮＡをＤＴＴの存在下にＥｃｏ　ＲＩメチラーゼで処理し、前記と同様に抽出することによって精製し、 −前記のごとく精製されたＤＮＡを７４　ＤＮＡポリメラーゼ及び大腸菌ＤＮＡリガーゼの存在下に４つのデオキシヌクレオチド三リン酸ｄＡＴＪ　ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰにと共にインキュベートし、次いで前記方法で精製し、一前記のごとく得られた核酸を適当なベクター中でクローニングし、所望の核酸配列を適当なプローブによって回収する段階を含む方法に係る。

本発明のヌクレオチド配列の特に有利な製造方法は以下の段階、即ち、 −Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　４；２７４〜３２５　（１９８６）に記載されたβ−シアンエチルホスホラミジット（β−ｃｙａｎｅｔｈｙｌ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉ　ｄｆ　ｔｅ）の全自動方法を使用してＤＮＡを合成し、 −得られた核酸を適当なベクター中でクローニングし、適当なプローブとのハイブリダイゼーションによって核酸を回収する段階を含む。

本発明のヌクレオチド配列の別の製造方法は、以下の段階、即ち、 −Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｔ、ＵＳＡ。

８０　；　７４６１〜７４６５．（１９８３）に記載の原理に従って、天然ポリペプチドのアミノ酸連鎖と適合性の配列を有し且つ末端に種々の制限部位を有する化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを構築し、 −得られた核酸を適当なベクター中でクローニングし、適当なプローブとのハイブリダイゼーションによって所望の核酸配列を回収する段階を含む。

国際調査報告 −肯−肯１−−−−ｋ　ＰＣＴ／ＰＲ９０１００３９４−一一曙ｌ−−自１輻　ＰＣＴ／ＦＲ９ｏ１００３９４国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＨＩＶ−２ウイルスまたはＳＩＶｍａｃウイルスのゲノム増幅に使用できる約１５〜２５ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドアライマーであって、そのヌクレオチド配列が、 −ＨＩＶ−２　ＲＯＤウイルスのゲノムに由来のｃＤＮＡの４０及び６１、９５３７及び９５５８、２４０及び２５９、５４６及び５６９、９０６及び９２７、６１２及び６３３、１８５７及び１８７６、２０７８及び２１０１、６２７５及び６２９９、６８５５及び６８７８、７５４８及び７５７３、７７８２及び７８０５、８４１２及び８４３４、６１及び８２、９５５８及び９５７９位に存在するヌクレオチドによって限定された核酸配列の１つに含まれるヌクレオチド配列または前記核酸配列の１つに相補的なヌクレオチド配列から選択されるか、あるいは、−ＳＩＶｍａｃ　１４２ウイルスのゲノムに由来のｃＤＮＡの４０及び６１、９５１１及び９５３２、２４０及び２５９、２５６及び２７５、５５１及び５７４、９１１及び９３２、６１７及び６３８、１８６８及び１８８７、２０３５及び２０５８、６２２７及び６２５１、７５５０及び７５６４、７７７６及び７７９９、８４０６及び８４２８、６１及び８２、９５３２及び９５５３位に存在するヌクレオチドによって限定された核酸配列の１つに含まれるヌクレオチド配列または前記核酸配列の１つに相補的なヌクレオチド配列から選択されており、−（特に最も長いプライマーの場合には）ＨＩＶ−２ＲＯＤもしくはＳＩＶｍａｃ　１４２に由来の前記核酸配列の１つを含むか、または、該核酸配列の１つに相補的な核酸配列を含み、但し、これらの核酸配列の好ましくは５′末端側から「突出している」任意の付加的ヌクレオチドが、ＨＩＶ−２　ＲＯＤまたはＳＩＶｍａｃ　１４２の完全配列の内部に対応する５′末端の手前に位置する配列と好ましくは一致しており、 −また、対象となるｃＤＮＡの鎖は、ＨＩＶ−２　ＲＯＤ及びＳＩＶｍａｃ　１４２ウイルスのＲＮＡの相補的鎖であり、 −このプライマーの配列が前記核酸配列の１つに等しくないときまたはこれらの配列の１つに相補的でないときにも、１０ｍＭのトリス、２０ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．０１％ゼラチンから成る溶液中で５０℃以上の温度で１分間処理するとウイルスＨＩＶ−２　ＲＯＤ及び／またはＳＩＶｍａｃ　１４２に由来の前記核酸配列とハイブリダイズし得る、ことを特徴とするオリゴヌクレオチドプライマー。
２．以下のヌクレオチド連鎖：【配列があります】またはそれらの相補的配列で示されることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチドアライマー。
３．請求項１に定義されたようなプライマーのハイブリダイゼーション特性を変化させない突然変異を有することを特徴とする請求項２に記載のオリゴヌクレオチドアライマー。
４．個体のＨＩＶ−２型ウイルス感染をｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断するために、該個体から採取された生物サンブル、特に血清を用い、主として以下の段階、即ち、 −前記生物サンアル中でその有無を検出すべきＨＩＶ−２型ウイルスのゲノムに属する核酸を抽出する段階、及び、前記核酸がＲＮＡの形態のときには二重鎖核酸を得るために必要に応じて前記核酸を逆転写酸素で処理する段階、並びに、 −．特に核酸を９４℃で１分間処理することによって検出すべき二重鎖核酸を変性させ、一本鎖核酸を形成させる変性段階と、請求項１に定義したハイブリダイゼーション条件下に、前記変性段階で得られた核酸の各鎖を、請求項１から３のいずれか一項に記載の少なくとも一対のプライマーと接触させ、前記鎖と請求項１から３のいずれか一項に記載のブライマーの少なくとも１つとをハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション段階と、Ｔａｑポリメラーゼのような重合剤と４つの異なるヌクレオシド三リン酸との存在下に、プライマーとハイブリダイズした鎖に沿ってプライマーを伸長させ、検出すべき二重鎖核酸を前記変性段階よりも多数形成させる段階とから成るサイクルを、好ましくは１０〜６０回繰り返す段階と、 −生物サンブル中でＨＩＶ−２型ウイルスのゲノムに属する核酸の有無を検出する段階とを合むことを特徴とする方法。
５．サイクルのハイブリダイゼーション段階が、前記変性段階で得られた核酸の鎖を請求項１から３のいずれか一項に記載の少なくとも一対のプライマーと接触させることによって行なわれ、該プライマーは、これらの２つのブライマーの一方が２つの鎖の一方に存在する核酸配列とハイブリダイズし他方が該鎖の相補的鎖に存在する核酸配列とハイブリダイズするように選択されており、前記の２つの相補的鎖が１つの二童鎖核酸を再形成すると考えられるときは、（前記プライマーとハイブリダイズし得る）前記核酸配列は、５０〜１０，０００、好ましくは１００〜２，０００個の塩基対によって隔てられていることを特徴とする請求項５に記載の診断方法。
６．使用されるプライマー対は、合成された核酸フラグメントが領域ＬＴＲ１〜Ｐｏ１２、Ｐ１〜Ｐ２、Ｐ２〜Ｐ７、Ｐ７〜Ｐ８、Ｐ８〜ＬＴＲ２をカバーするようなものであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
７．生物サンブル中のＨＩＶ−２型ウイルスの核酸の有無を検出する段階を、増幅された（１つまたは複数の）核酸配列とハイブリダイズし得る（１つまたは複数の）標識ヌクレオチドプローブを用いて行なうこと、及び、増帽された（１つまたは複数の）検出すべきヌクレオチド配列と（１つまたは複数の）前記プローブとの間に形成されたハイブリダイゼーション複合体の有無を検出することを特徴とする請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
８．−請求項１から３のいずれか一項に記載の少なくとも一対のプライマーと、 −特にＤＮＡポリメラーゼ及び４つの異なるヌクレオチド三リン酸のような増幅処理サイクルを行なうための適当な試薬と、 −検出すべく増幅された（１つまたは複数の）核酸配列とハイブリダイズし得る（１つまたは複数の）標識プロープとを含むことを特徴とする請求項４から７のいずれか一項に記載の方法に使用するための診断用キット。
９．−所定のポリペプチドをコードする核酸配列を請求項１から３のいずれか一項に記載の一対のプライマーを用いて増幅する段階と、 −前記のごとく増幅された前記核酸配列を適当なベクターに導入し、 −前記ベクターによって宿主細胞を形質転換させ、−前記ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養し、該宿主細胞によって産生されたポリペプチドを回収する処理を含む所定のポリペプチドの製造方法。
１０．請求項９に記載の方法によって得られた所定のポリペプチドを医薬として許容されるビヒクルと組合わせて含む免疫原性組成物。