HUT77468A

HUT77468A - MHC-II-kötő molekulákat és/vagy MHC-II utánzó molekulákat tartalmazó gyógyszerkészítmények

Info

Publication number: HUT77468A
Application number: HU9800269A
Authority: HU
Inventors: Roger Pascal Lauener
Original assignee: Deutsche Om Arzneimittel Gmbh.; Laboratoires Om S.A.
Priority date: 1994-12-23
Filing date: 1995-12-27
Publication date: 1998-05-28
Also published as: WO1996020215A3; PL320922A1; JPH10511652A; CN1171117A; BR9510554A; CZ186897A3; CA2208233A1; SK80697A3; WO1996020215A2; AU4347696A; EP0800534A2

Description

A találmány bizonyos molekulák alkalmazására vonatkozik toxinok, mint például lipopoliszacharidok (LPS) , önmagukban vagy más molekulákkal, például CD14 és LPS kötő proteinekkel (LBP) alkotott komplexek formájában, valamint ezek átvivő molekulái közötti kölcsönhatásba történő beavatkozásra. A találmány továbbá ezen molekulák alkalmazására vonatkozik gyulladásos betegségek, mint például szeptikus sokk megelőzésében és kezelésében.

A lipopoliszacharidok (LPS) a Gram-negatív baktériumok sejtfalának egy alkotórésze. A Gram-negatív baktériumokkal való fertőzés életet veszélyeztető betegségeket okozhat, amit az LPS-nek a fagocitákhoz, mint például monocitákhoz, makrofágokhoz és granulocitákhoz történő fajlagos kötődése okoz, amelyek ezáltal aktiválódnak, és különböző citokinokat, többek között tumor nekrózis faktor-a-t (TNF-a), interleukin 1-t (IL-1), IL-6-t, IL-8-t és más gyulladást közvetítő anyagokat választanak ki. Ezek az anyagok vagy közvetlenül, vagy pedig másodlagos közvetítőanyagok aktiválásával olyan események sorozatát indítják, amelyek a koagulációs rendszer rendellenességeit, értágulást, több szervre kiterjedő rendellenességet és végül szeptikus sokkot eredményeznek [Boné R., Chest 101, 802-808 (1991), Glauser M., Zanetti G., Baumgartner J & Cohen J., Láncét 338, 732-736 (1991)].

A fagocitasejtek jelzett aktiválása, ami többszörös gyulladásközvetítő anyagok kiválasztását eredményezi, általában központi esemény a szisztémás gyulladásos reakció szindrómának (SIRS) nevezett patológiás állapot patogenezisében. A SIRS az LPS által történő aktiválódás mellett különböző más klinikai állapotok, például baktériumos vagy vírusos fertőzések, trauma, égések, hasnyálmirigy-gyulladás, szerv- és szövetátültetéseknél fellépő szerv vagy szövet gazdaszervezet elleni reakciója, illetve gazdaszervezet szerv vagy szövet elleni reakciója, hemofagocitózis és sok más állapot hatására is kifejlődhet. Egy gyulladásos betegség például a toxikus sokk, amelyet Gram-pozitiv baktériumok exotoxinjai, például staphylococcus toxin A okoz. Más exotoxinok, amelyeket szuperantigénként is neveznek, a staphylococcus toxin B és a streptococcus toxinok.

Kimutatták, hogy az LPS a glikozil-foszfatidil-inozit (GPI) által lehorgonyzott monocita antigén CD14-hez kötődik. A CD14 a monociták, makrofágok és granulociták felületén van jelen, de megtalálható oldható formában, GPI-horgony nélkül az egészséges személyek szérumában is. Kimutatták továbbá, hogy az LPS monocitákkal történő aktiválása gátolható antiCD14 monoklonális antitestekkel. Feltételezik tehát, hogy a CD14 az LPS receptoraként szolgál [Wright S.D., Ramos R.A., Robias P.S., Ulevitch R.J. & Mathison, J.C., Science 249,

1431-1433 (1990)] és az LPS hatását közvetíti a citoplazmához. A CD14-negatív sejtek azonban szintén képesek az LPS-re választ adni [Couturier C., Jahns G., Kazatchkine,

M.D. & Haeffner Cavaillon N., Eur. <J. Immunoi., 22, 1461-1466 (1992); Frey E.A., et al, J. Exp. Med. , 176, 1665-1671 (1992); Haziot A., Rong G.W., Silver J. & Goyert S.M., J. Immunoi., 151, 1500-1507 (1993)].

Ezenkívül ismeretessé vált, hogy a CD14 egy glikozil-foszfatidil-inozit (GPI) által horgonyzott molekula, és nem • · ········ rendelkezik transzmembrán és citoplazmás doménekkel [Haziot A., et al., J. Immunoi., 141, 547-552 (1988)]. A CD14 tehát nem tud jelet közvetíteni a citoplazmához. Széles körben elfogadott feltételezés, hogy a GPI által kötött proteinek asszociált transzmembrán molekulákat igényelnek a jel átviteléhez. Az LPS és esetleg más SIRS stimuláló molekulák valóságos átvivő molekuláját még nem azonosították.

A sejtek LPS által történő aktiválásának magyarázatába CD14-től eltérő molekulákat kell bevonni [Tóbiás P.S. & Ulevitch R.J., Immunobiology, 187, 227-232 1993)]. Feltételezik, hogy az LPS vagy a membránhoz kötött, vagy az oldható CD14-gyel és az LPS kötő proteinnel (LBP) komplexet képez. Más, szérumeredetű molekulák szintén részt vehetnek a komplexben. A komplex kölcsönhatásba lép egy a sejt felületén található, eddig még nem azonosított molekulával, ami a sejtek aktiválásához vezet.

A CD14-ről leírták, hogy kulcsszerepet játszik a sejtek Gram-pozitív, valamint Gram-negatív mikroorganizmusok bakteriális buroktermékei által történő aktiválásának iniciálásában [Pugin J., et al. Immunity, 1, 509 (1994)]. E kölcsönhatásban szintén részt vehetnek más membránhoz kötött vagy szérumból származó molekulák a sejtfelületi molekulákkal való kölcsönhatásban, ami a sejtek aktiválásához vezet.

Kísérleteink során úgy találtuk, hogy a nagy hisztokompatibilitási komplex II (MHC-II) molekulák szükségesek a sejtek LPS által történő aktiválásához, receptorként és/vagy jelátvivő elemként szolgálva az LPS molekuláris komplexeihez és a CD14 és LBP molekulákhoz. Emberekben • · • · ·· ··» · • · · · · · · • · · * · *« · · · ········· az MHC humán leukocita antigénként (HLA) ismert. Kimutattuk, hogy az LPS-válaszképesség a sejtek felületén levő MHC-II molekulák expressziójától függ. A Tsuchiya és munkatársai által [Tsuchiya M. et al., Int. J. Cancer, 26, 171-176 (1980)] THP-1 néven leírt sejtvonal egy MHC-II-t kifejező monocita sejtvonal, amelyet a továbbiakban ΤΗΡ-ΐ”⁰* jellel jelölünk. Egy a THP-1^MHC+ sejtvonalból spontán mutációval származtatott másik sejtvonal egy MHC-II-negatív monocita sejtvonal, amelyet a továbbiakban THP-1.6^MHC jellel jelölünk. A THP-1^mhc+ sejtek az LPS-re válaszképpen citokineket választanak ki, míg a THP-1.sejtek nem. A CD14-pozitív, MHC-II-negatív humán perifériás vér mononukleáris sejtek (PBMC) szintén nem válaszolnak az LPS-re. Az MHC-II-expresszálás és az LPS-válaszképesség helyreállítható, ha a THP-1.6^MHC~ sejteket CIITA-val transzfektáljuk, amely egy olyan cDNS, amely egy az MHC molekulák sejtfelületen történő expressziójához esszenciális nukleáris faktort kódol.

Más SIRS ingereknek a sejthez való juttatását szintén közvetíthetik a MHC-II molekulák. Korábban már kimutatták, hogy az endotoxinok szintén kötődnek az MHC-II molekulákhoz a sejtfelületen. Más Gram-pozitív termékek aktivitását legalább részben közvetíti a CD14, és így feltételezhető, hogy ezen termékek CD14-gyel alkotott komplexe szintén kölcsönhatásba lép az MHC-II molekulákkal a sejtek aktiválásához.

A szisztémás gyulladásos reakció szindrómájának megelőzése és/vagy kezelése végezhető tehát úgy, hogy az LPS és más molekulák, mint például a CD14 és LBP komplexe (a továbbiakban CD14/LPS/LBP komplex) és a sejthez kötött MHC-II • ·

közötti kölcsönhatásba beavatkozunk. A találmány értelmében ez a beavatkozás kétféle úton végezhető.

Az egyik módszer szerint a CD14/LPS/LBP komplex sejthez kötött MHC-II-höz való kötődése blokkolható MHC-II kötő molekulákkal, mint például anti-MHC-II-antitestekkel, CD14gyel vagy ezekből származó peptidekkel. Az ilyen típusú molekulák versengenek a CD14/LPS/LBP komplex-szel, és így megakadályozzák, hogy a komplex kötődjön, de az MHC-II-t nem aktiválják. Az MHC-II átvivő funkciója ezáltal blokkolódik.

A másik módszer szerint a keringésben levő LPS vagy CD14/LPS/LBP komplex befogható MHC-II-utánzó molekulákkal. Az oldható MHC-II vagy MHC-II-szerű molekulákhoz kapcsolódó komplexek tovább már nem képesek megkötni a sejthez kötött MHC-II-t. így a sejt aktiválása meggátlódik.

MHC-II-kötő molekula bármely olyan molekula lehet, amely képes blokkolni az LPS vagy a CD14/LPS-komplex MHC-IIhöz való kötődését. Gyakorlatban ilyenek az anti-MHC-II antitestek, mind a monoklonális, mind a poliklonális antitestek, amelyek a sejt cD14/LPS vagy LPS kötőhelyei ellen irányulnak. Az antitest fragmensek szintén alkalmasak MHC-IIkötő molekulákként.

Az MHC-II utánzó molekulák lehetnek akár maguk az oldható MHC-II molekulák, akár bármely más olyan molekulák, amelyek képesek blokkolni az MHC-II kötőhelyet az LPS vagy CD14/LPS komplexen. Az ilyen típusú molekulák lehetnek a teljes MHC-II molekulák vagy azok fragmensei vagy alegységei. Ezenkívül hasznosak lehetnek az olyan peptidek, amelyek képesek kötődni az LPS-hez vagy az LPS/CD14/LBP komplexhez ···· anélkül, hogy aktiválnák az MHC-II-t. Az ilyen peptidek legalább homológok az MHC-II-vel, és olyan alkalmas Daminosavakat tartalmaznak, amelyek a peptidnek antagonisztikus tulajdonságokat biztosítanak. A molekulák lehetnek oldható formában vagy egy hordozó felületéhez kapcsolva.

A leírásunkban nyújtott információk alapján szakember képes azonosítani a megfelelő kötő és/vagy utánzó molekulákat.

Az ilyen típusú molekulák származhatnak bármely alkalmas forrásból, akár emberi, akár más forrásból, és különböző módon állíthatók elő, így például MHC-II-pozitív sejtek tenyészetének felülúszójából vagy sejtlizátumból izolálhatok. Egy különösen előnyös izolálási módszer az immunaffinitás kromatográfia. Alkalmas molekulák előállíthatok továbbá géntechnológiai úton, proteinkémiai módszerrel vagy bármely más alkalmas módszerrel.

A találmány értelmében az említett kétféle molekula használható gyulladásos betegségek, például szeptikus sokk, szerv- vagy szövetátültetéseknél (például csontvelő átültetéseknél) fellépő szerv- vagy szövet gazdaszervezet elleni reakciójánál, átültetett szerv- vagy szövetkilökődési reakciójánál, égésekkor, baleseteknél, hasnyálmirigy fertőzésnél, stb. fellépő gyulladásos betegségek megelőzésére és/vagy kezelésére.

A találmány szerinti készítmények alkalmasak továbbá más olyan gyulladásos reakciók megelőzésére és/vagy kezelésére, amelyek például sebészeti beavatkozás után lépnek fel, mint például kapilláris szivárgás szindróma, allergiás • · ·· betegségek, autoimmun betegségek, mint például a Lupus Erythematodus (LE) és ennek különböző válfajai, szklerodermia és ennek válfajai, eozinofil izomhüvelygyulladás, Sjögren szindróma, sokizomgyulladás, dermatomiozitisz, csomós artéria körüli gyulladás, Wegener-féle granulomatózis, időszakos ütőérgyulladás, reumás többizomgyulladás, stb., reumás rendellenességek, mint például reumás ízületi gyulladás, fiatalkori krónikus ízületi gyulladás, Felty-szindróma, Caplan-szindróma, ízületi merevséggel járó csigolyagyulladás (Marie-Strümpell-Bechterew-betegség), pszoriázis, Reiterszindróma, Behcet-szindróma.

További betegségek, amelyek a találmány szerinti készítményekkel kezelhetők és legalább részben az autoimmun mechanizmusból következnek, többek között a diabétesz mellitusz, Chrohn-betegség, fekélyes vastagbélgyulladás, az emésztőrendszer fekélyei, vesefertőzések, mint például az érgomolyos vesegyulladás és a vesegyulladás, érelmeszesedéses rendellenességek, szklerózis multiplex, Alzheimer-betegség, pajzsmirigy csökkent vagy túlműködése.

A találmány szerinti készítmények alkalmazhatók továbbá egy vagy több humán szervben fellépő, onkológiai rendellenességgel, például leukémiával, vérsejttumorral, karcinómával, fibrómával, szarkómával és a hisztiocitózis különböző típusaival kapcsolatos gyulladásos reakciók esetén.

A találmány szerinti készítmények alkalmazhatók továbbá a vírusos fertőzések, például az AIDS megelőzésére és/vagy kezelésére. Az LPS-stimulálásról ismeretes, hogy fokozza az intracelluláris humán immunhiányos betegségvírus (HÍV) szapo• · ν« ··· · • · · · · · · « · · « * · · • · · ····· · ·

Q «········ rodását. Az LPS általi stimulálás blokkolása a találmány szerinti MHC-II-kötő és/vagy utánzó molekulákkal így megszünteti ezt a replikációs ingert. A találmány szerinti MHC-IIkötő és/vagy utánzó molekulák így alkalmazhatók arra, hogy védőhatást nyújtsanak a HÍV által fertőzött sejteknek oly módon, hogy megakadályozzák a vírus szaporodásának stimulálását a sejtaktiváló ingerek által.

A példákban megadott adatok alapján a sejtek LPS által történő aktiválásának következő modellje képzelhető el. Egyrészt az LPS kötődhet a membránon kötött CD14-hez (mCD14), ami egy a lipopoliszacharid kötőprotein (LBP) által meggyorsított kölcsönhatás [Hailmann E., et al., J. Exp. Med. 179, 269-277 (1994)]. Az LPS komplexe és a GPI által lehorgonyzott mCD14 és esetleg az LBP azután kölcsönhatásba lép a transzmembrán MHC-II molekulákkal, ami egy jelátvitelt eredményez. Ezt a helyzetet mutatja be a 3.A ábra. Másrészt az LPS az LBP-vel együtt kötődhet az oldható CD14-hez (sCD14), amely a szérumban van jelen, és ez a komplex azután kötődhet az MHC-II molekulákhoz a CD14-negatív sejtek felületén, ami a CD14-negatív, de MHC-II-pozitív sejtek aktiválását eredményezi. Ezt a helyzetet mutatja be a 3.B ábra. Bár a CD14 és MHC-II közötti kapcsolatot mutattuk be, a kölcsönhatásban az LBP és LPS szintén részt vehet, ugyanúgy, mint más, még nem azonosított molekulák. Az aktiválási inger a Gram-pozitív baktériumoknak is alkotóeleme lehet, bár ebben az esetben az LBP szerepét még nem határozták meg. Nem zárható ki az a lehetőség, hogy néhány aktiválóinger közvetlenül az MHC-II molekulákra hat, anélkül, hogy komplexet ··* · • · ·»·· képezne a CD14-gyel vagy az LBP-vel. Megállapítottuk, hogy az ingert az MHC-II molekulák közvetítik. így e molekulák blokkolása vagy utánzása megakadályozza az aktiválóinger átvitelét.

A találmány tárgya tehát MHC-II-kötő molekulákat és/vagy MHC-II utánzó molekulákat tartalmazó gyógyszerkészítmények. Az ilyen, hatóanyagként MHC-II-kötő molekulákat és/vagy MHC-II utánzó molekulákat tartalmazó, az MHC-II molekulákat kifejező sejtek, mint például a fagociták számára aktiváló inger, mint az LPS, valamint a sejthez kötött MHC-II molekulák közötti kölcsönhatásba beavatkozó gyógyszerkészítmények lehetnek porok, szuszpenziók, oldatok, permetek, emulziók, infúziók, inhalációs készítmények, kenőcsök vagy krémek, és alkalmazhatók helyileg, intranazálisan, rektálisan, vaginálisan és orálisan, valamint parenterálisan (intravénás, intradermális, intramuszkuláris, intratekális stb. úton) vagy transzdermális vagy inhalációs úton stb. A találmány szerinti készítmények úgy állíthatók elő, hogy a hatóanyagokat farmakológiailag elfogadható vivőanyagokkal és semleges hordozóanyagokkal (például vizes vagy nemvizes oldószerekkel, stabilizálószerekkel, emulgeálószerekkel, detergensekkel, adalékanyagokkal) és kívánt esetben színező és ízesítőanyagokkal kombináljuk (azaz keverjük, oldjuk, stb.). A gyógyszerkészítményben a hatóanyag koncentrációja 0,001 és 100 % között változhat a kezelés és az adagolás módjától függően. Az adagolt dózis szintén függhet az adott alkalmazás módjától, így testtömegkilogrammonként 0,01 pg és 1 mg közötti, előnyösen 0,1 pg és 100 pg közötti lehet.

» · 4 «» U · » » · · « · · » • · · ····· » * , ♦ « · «· w · ·

A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.

1. példa

Bevezetés

Azt a hipotézist, hogy az MHC-II az LPS-t, CD14-t, LBP-t és esetleg más molekulákat magában foglaló komplex számára átvivő és/vagy receptor a fagocitasejtek LPS által történő aktiválásában, úgy vizsgáltuk, hogy összehasonlítottuk az MHC-II-pozitív (HLA-DR) és az MHC-II-negatív sejtvonalak által az LPS-sel végzett stimulálás hatására bekövetkező citokinkiválasztást. A citokinkiválasztás a sejtaktiválás indikátora.

Anyagok és módszerek

A THP-1^MHC+ sejtvonal egy humán eredetű, CD14-negatív, MHC-II-pozitív monocita sejtvonal [Tsuchiya M. et al., int. J. Cancer, 26, 171-176 (1980)] A THP-1.6^mhc~ sejtvonal a

Thp-i”¹¹^ ismételt határhígítással klónozott, MHC-II-negatív spontán mutánsa.

A HLA-DR expressziót úgy hoztuk létre, hogy a THP1.6™°' sejteket CIITA-val (II transzaktivátor; az MHC-IIproteinek expressziójához nélkülözhetetlen magprotein [Steimle V., Otten L.A., Zufferey M. & Mach B., Cell, 75, 135-146 (1993)]) transzfektáltuk, így THP-1.6^MHC‘CIITA-t hoztunk létre.

A HLA-DR és CD18 kifejezését a tHP-1^mhc+ sejtek (vad típus), THP-1.6^mhc_ sejtek (mutáns sejtvonal) és a THP-l.ö^'CIITA sejtek (CIITA-val transzf ektált ΤΗΡ-Ι.β™⁰sejtek) felületén átfolyásos citometriával mértük.

·<·«·* „ * ·

W * « <9 · » · • · * »··· · 9 · ·· ♦··· · ·

Az egyes sejtvonalakat 10⁶ sejt/ml koncentrációban, 10 % FCS-t tartalmazó és 0, 1, 10, 100 ng/ml és 1 pg/ml dózisban LPS-vel stimulált közegben tenyésztettük. 24 óra után a felülúszót összegyűjtöttük, és TNF-α és IL-8 tartalomra nézve ELISA vizsgálatot végeztünk.

Eredmények és diszkusszió

A sejtek életképességét nem veszélyeztette az LPS-kezelés. A sejteknek több mint 95 %-a életképes volt a tripánkék-festés tanúsága szerint.

A CD18 expressziója mindhárom sejtvonalban hasonló volt, a THP-1.6^mhc sejtek azonban a HLA-DR-t szignifikánsan alacsonyabb szinten expresszálták, mint a THP-1^MHC+ sejtek.

A THP-1^mhc+ sejtek LPS-sel végzett stimulálás hatására TNF-α és IL--8 kiválasztással válaszoltak (1. ábra). Ezzel szemben a HLA-DR-negatív THP-1.6^mhc_ sejtvonal LPS-stimulálással nem volt TNF-α, illetve IL-8 kiválasztására indukálható még nagy dózisú LPS alkalmazásával sem. A HLA-DRexpresszió és az LPS-válaszképesség CIITA-val végzett transzfekció után megmaradt. Ebből arra következtettünk, hogy a HLA-DR molekulák expressziója szükséges a monocitasejtek

LPS-sel történő aktiválásához.

2. példa

Bevezetés

Az 1. példa szerinti sejtvonalrendszeren kapott eredményeken alapuló megállapításokat egy ritka öröklődő, a korai gyermekkorban súlyos kombinált immunhiányban megmutatkozó betegségben, az MHC-II-hiányban szenvedő beteg sejtjei alkalmazásával ellenőriztük. A CD14-expresszió nincs érintve

az ilyen betegekben. Az MHC-II hiányos beteg és egy kontroll PBMC-sejtjeit LPS emelkedő dózisának jelenlétében tenyésztettük, és a tenyészetek felülúszóiban mértük a TNF-α és az

IL-1 szintet.

Anyagok és módszerek

Perifériás vér egymagvú sejteket (PBMC) vettünk egy MHC-II-hiányos betegtől és egy egészséges kontrolitól.

A HLA-DR expresszióját a beteg (vonalkázott hisztogram, a 2. ábra bal oldalán) és az egészséges kontroll (szürke hisztogram) PBMC-inek felületén közvetlen immunfluoreszcenciás festéssel és átfolyásos citometriával mértük.

A PBMC-ket a betegtől (vastag vonal) és a kontrolitól (vékony vonal) 10⁶ sejt/ml koncentrációban, 10 % normál humán AB-pozitív szérumot tartalmazó, 0, 1, 10 és 100 ng/ml LPS-sel stimulált tápközegben tenyésztettük. 24 óra után a felülúszókat összegyűjtöttük, és a TNF-ct tartalmat ELISA méréssel határoztuk meg.

Eredmények és diszkusszió

Az egészséges kontroll PBMC-i az LPS-re válaszképpen TNF-a-t és IL-l-t választottak ki, amint vártuk. Az MHC-IIhiányos beteg PBMC-i azonban az LPS-re válaszképpen nem választottak ki szignifikáns szinten citokineket (2. ábra). Látható tehát, hogy az MHC-II molekulák expressziójának szükséglete nem korlátozódott a THP-l””⁰* sejtvonalra.

Az adatok azt mutatják, hogy a membránhoz kötött CD14 se nem szükséges a sejtek LPS-sel történő aktiválásához (THP1^MHC+ sejtek nem expresszálnak CD14-et), se nem elégséges (az ····

MHC-II-hiányos beteg PBMC-i normál szintben expresszálnak

CD14-et).

A fent vázolt kísérletek azonban nem szólnak az oldható

CD14 szerepéről. E kísérletek mindegyikében olyan tápközeget alkalmaztunk, amely oldható CD14-et tartalmazó szérummal volt kiegészítve. A kísérleteket ezért megismételtük oly módon, hogy THP-1^mhc+, ΤΗΡ-Ι.β^' és THP-1. ő^'CIITA sejteket szérummentes tápközegben tenyésztettünk. Az LPS emelkedő dózisaival végzett kezelés nem eredményezett szignifikáns szintben TNF-a kiválasztást.

Az eredmények azt jelzik, hogy az MHC-II-molekulák részvétele kritikus az LPS-válaszképességben. A HLA-DR negatív sejtek LPS-sel végzett stimulálás hatására nem tudtak citokineket kiválasztani. Lehetne úgy érvelni, hogy az LPS-re adott válasz hiánya olyan faktorral kapcsolatos, amely szorosan összefügg az MHC-II-vel és a CIITA szintén szabályozza, mintsemhogy a csökkent LPS-válaszképességet okozó önmagában az MHC-II expresszió hiányával. Az LPS-re adott válasz hiánya azonban nem korlátozódik egyetlen citokin kiválasztására, mivel a TNF-α, valamint az IL-1 és az IL-8 kiválasztása csökkent. Emellett mindezideig nem találtunk az MHC-II-től eltérő, CIITA-val szabályozott molekulát, a széleskörű kutatások ellenére. Végül a beteg betegsége nem a CIITA-val kapcsolatos hiány következménye. A beteg EpsteinBarr vírussal (EBV)-transzformált B-sejtjeinek transzfekciója nem állította helyre az MHC-II molekulák expresszióját.

3. példa

Bevezetés

Az MHC-II molekulák és a CD14 molekulák közötti fizikai kölcsönhatást három különböző módon igazoltuk.

Először az MHC-II-pozitív és MHC-II-negatív sejtvonalak lizátumát MHC-II-re fajlagos, illetve kontroll antitestekkel, továbbá radioaktív CD14-gyel (CD14‘) és radioaktív kontrolimolekulákkal inkubáltuk. Az MHC-II és a CD14* közötti komplexek csak a protein A-agaróz és MHC-II fajlagos antitestek közötti kölcsönhatás által csaphatok ki. A csapadékban nem lehet radioaktivitást kimutatni, ha kontroll molekulát vagy kontroll antitestet alkalmazunk. Ha MHC II nincs jelen, a csapadékban nem található radioaktivitás.

Másodszor az MHC-II-t radioaktív CD14-gyel inkubáltuk. Feltételezhető, hogy MHC-II/CD14* komplexek képződnek. Elméletileg ezek a komplexek kicsaphatok olyan antitestekkel, amelyek fajlagosak egyik vagy mindkét komplexbeli partnerre, valamint protein A-agarózzal.

Harmadszor azt vizsgáltuk, hogy az anti-CD14 antitestek blokkolják-e az MHC-II és a CD14* közötti kölcsönhatást.

A kísérletek elvét a 4. ábra mutatja be.

Módszerek

1. Radioaktív CD14 készítése

Rekombináns CD14-et in vitro transzkripcióval/transzlációval teljes hosszúságú CD14 cDNS-ből készítettünk, amelyet PCR-technikával állítottunk elő, és a nukleotid szekvenciáját azonosítottuk, TNT T7-hez kapcsolt retikulocita lizátum rendszer alkalmazásával a gyártó előírása szerint (Promega, Svájc), ³⁵S-metionin jelenlétében. Kontrollként radioaktívan jelzett luciferázt állítottunk elő ugyanebben a rendszerben in vitro transzkripcióval/transzlációval.

2. Sejtlizátumok készítése

Az úgynevezett 293 sejtek humán adenovírus 5 típusú

DNS-sel transzformált humán embrionális vesesejtek (ATCC CRL 1573); a vad-típusú 293 sejtek nem fejeznek ki MHC-II molekulákat az FACS-analízis tanúsága szerint. Ezeket MHC-II negatív sejtekként alkalmaztuk. A humán MHC-II α, β és invariáns (i) cDNS lánccal transzfektált 293 sejtek Dr. Jacques Neefjes-től származtak (Netherlands Cancer Institute, Amsterdam). Ezek MHC-II-t kifejeznek, és így ezeket MHC-IIpozitív sejtekként alkalmaztuk. Az MHC-II-pozitív és MHC-IInegatív sejtvonalak lizátumát a következőképpen készítettük.

5xl0⁶ sejtet egy Petri-csészében 1 ml lizáló pufferrel lizáltunk (Boehringer Mannheim, sejtjelző és immunkicsapó készlet). 30 perc után a lizált sejteket összegyűjtöttük, és 3x15 másodpercig ultrahanggal kezeltük, majd 30 percig jégen inkubáltuk, és végül centrifugáltuk. A felülúszókat az alábbi módon immunkicsapásnak vetettük alá.

3. Immunkicsapás, 1. kísérlet

Az immunkicsapást a Boehringer Mannheim (Svájc) sejtjelző és immunkicsapó készlet megadott előírása szerint és reagenseivel végeztük. Röviden: a mintákat 50 μΐ protein A-agaróz szuszpenzióval előtisztítottuk. A protein A-agaróz lecentrifugálása után a felülúszókat a következő antitestekkel inkubáltuk: L243 (anti-HLA-DR, ATCC HB 55); 1B5 (anti-MHC-II, Dr. Jacques Neefjes-től, Netherlands Cancer • · ··

Institute, Amsterdam); és anti-CD3 (Pharmingen, San Diego, USA/AMS Biotechnology, Svájc) . Egy óra múlva hozzáadtunk 50 μΐ protein A-agarózt, és a mintákat 3 óra hosszat inkubáltuk, majd hatszor mostuk.

Ezután a csapadékot 30 μΐ pufferben (50 mmol/1 Tris, pH=7,5, 20 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 EDTA, 2 mmol/1 PMSF) szuszpendáltuk, és hozzáadtunk 5 μΐ előbbi in vitro transzkripcióval/transzlációval kapott reakcióelegyet, amely a radioaktivan jelzett CD14-et tartalmazta, a kapott elegyet 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Centrifugálás után a csapadékot kétszer 2 számú mosópufferrel, majd kétszer 3 számú mosópufferrel mostuk (a 2 és 3 számú mosópufferek a Boehringer Mannheim sejtjelző és immunkicsapó készletében találhatók). A csapadékot ezután feloldottuk és standard SDS-PAGE töltőpufferben forraltuk, majd 10 %-os SDS-poliakrilamid-gélen elektroforézisnek vetettük alá, végül autoradiografáltuk.

4. MHC-II molekulák tisztítása

MHC-II molekulákat THP-1 sejtekből extraháltunk és tisztítottunk, Gorga és munkatársai által a J. Bioi. Chem. 262, 16087-16094 (1987) irodalmi helyen ismertetett módon, kisebb módosításokkal. L243-t (anti-HLA-DR, ATCC HB55) protein A-Sepharose 4B oszlopon dimetil-pimelimidáttal történő térhálósítással immobilizáltunk. A THP-1 sejteket jégen 0,1 mmol/1 PMSF-t tartalmazó Tris-HCl pufferben (pH=8,0) lizáltunk. Az ezután következő lépéseket 4 °C-on hajtottuk végre. A lizátumot 3000 g-vel centrifugáltuk, és a csapadékot addig mostuk, míg a felülúszó tiszta nem lett. Az •··· ··

összegyűjtött felülúszókat 160000 g-vel 40 percig centrifugáltuk, majd a csapadékot 4 % végső koncentrációig adagolt Nonidet P40 adagolásával újraoldottuk. 160000 g-vel 2 óra hosszat centrifugáltuk, majd a felülúszót a következő oszlopsorra vittük fel: Sepharose 4B (10 ml), normál nyúlszérum Affigel. 10 (10 ml), protein A-Sepharose 4B (2 ml), L243-Sepharose 4B (12 ml) . Az oszlopokat a következő oldatokkal mostuk: 10 mmol/1 Tris-HCl/0,1 % Nonidet P40, pH=8,0 (5 térfogat); 10 mmol/1 MOPS/140 mmol/1 NaCl/0,1 % dezoxikolát, pH=8,0 (2 térfogat); 10 mmol/1 Tris-HCl/0,1 % dezoxikolát, pH=8,0 (4 térfogat). Az L243 oszlopot lekapcsoltuk a többi oszlopról, és gyorsan eluáltuk 50 mmol/1 glicin és 0,1 % dezoxikolát tartalmú oldattal (pH=ll,5). 10 ml-es frakciókat gyűjtöttünk, a pH-t 7,0 és 8,0 közé állítottuk azonnal az eluálás után 2 mol/l-es glicinoldattal (pH=2,0).

Az eluált HLA-DR molekulákat 30 kDalton küszöbértékű membránokon ultraszűréssel koncentráltuk. 0,1 % dezoxikolátot tartalmazó Tris-HCl-lel (pH=8,0) végzett háromszori mosás után a proteint ugyanilyen pufferben újra hígítottuk.

5. Immunkicsapás, 2. kísérlet

Radioaktívan jelzett CD14-et tartalmazó az in vitro transzkripcióval/transzlációval kapott reakcióelegy 5 ml-ét kevertük 1 μΐ körülbelül 10 ng MHC-II molekulát tartalmazó oldattal, és 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Ezután antitesteket adtunk hozzá, és a mintákat 1 óra hosszat 4 °Con inkubáltuk. 50 μΐ protein A-agaróz hozzáadása után a mintákat további 3 óra hosszat inkubáltuk 4 °C-on. Centrifugálás után a csapadékot kétszer mostuk 2 számú mosópuf19 • ··· • · • · ferrel, majd kétszer 3 számú mosópufferrel (Boehringer Mannheim, Svájc, sejtjelző és immunkicsapó készlet). A csapadékokat ezután feloldottuk és standard SDS-PAGE töltőpufferben forraltuk és 10 %-os SDS-poliakrilamidgélen elektroforézisnek vetettük alá, majd autoradiografáltuk.

6. Immunkicsapás, 3. kísérlet

Mielőtt az immunkicsapó mintákhoz a radioaktívan jelzett CD14-et hozzáadtuk, amint azt az előző kísérletekben ismertettük, a CD14-et tartalmazó oldatot anti-CDl4 antitestek elegyével inkubáltuk 10 percig szobahőmérsékleten. Az antitestelegy a következő anti-CD14 antitestek mindegyikéből 10 pg-ot tartalmazott: RM052 (Immunotech, Svájc); LeuM3 (Beckton & Dickinson, Svájc); MY4 (Coulter, Svájc); Tűk 4 (Dako, Svájc); valamint a következő anti-CD14 hibridómák felülúszójának mindegyikéből 100 μΐ-t: 3C10, 63D3 (mindkettő az ATCC-től beszerezhető). Kontrollként az antitest eleggyel azonos térfogatú PBS-t adtunk 5 pl radioaktívan jelzett CD14et tartalmazó oldathoz.

Az immunkicsapáshoz a következő antitesteket alkalmaztuk: MY4 (anti-CD14) és L243 (anti-MHC-II).

Eredmények

1. kísérlet

MHC-II molekulák és CD14 együttes kicsapásának bemutatása MHC-II-pozitív és MHC-II-negatív sejtek lizátumának alkalmazásával

A kísérlet eredményeit az 5. ábra szemlélteti. A bal oldali panelen az MHC-II-vel transzfektált 293 sejtek (azaz MHC-II α, β és i-lánccal együtt transzfektált sejtek lizá«··· túrnának alkalmazásával kapott kísérleti eredményeket ábrázoltuk, a jobb oldali panelen a vad-típusú, MHC-II-negatív 293 sejtek lizátumának alkalmazásával kapott eredmények láthatók.

Az 1. és 2. vonalon látható nagyon gyenge csíkok, amelyek feltételezhetőleg a radioaktív CD14-nek (1. vonal), illetve a luciferáznak (2. vonal) felelnek meg, nem-specifikusan csapódtak ki a kontroll anti-CD3 antitesttel. A radioaktívan jelzett CD14-nek (CD14*) megfelelő csíkok világosan láthatók a 3. és 5. vonalon; két különböző, MHC-II molekulát felismerő antitest (3. vonal: L243; 5. vonal: 1B5) kicsapta a CD14*-ot. Ezen anti-MHC-II antitestek kicsapó hatása specifikus a CD14-re, mivel a radioaktívan jelzett kontroll protein (luciferáz) szignifikáns mennyiségét nem csapták ki ezek az antitestek (4. és 6. vonal). Az anti-MHCII antitestek CD14-et kicsapó aktivitása az MHC-II molekulák jelenlététől függ, mivel MHC-II molekulák hiányában (7-9. vonal, MHC-II-negatív 293 sejtek lizátumának alkalmazásakor) az anti-MHC-II antitestek nem csaptak ki CD14-et.

2. kísérlet

MHC-II molekulák és CD14 együttes kicsapásának bemutatása immunaffinitás oszlopon tisztított MHC-II molekulákkal

Az eredményeket a 6. ábra szemlélteti. A panel bal oldalán a tisztított MHC-II molekulák jelenlétében végzett immunkicsapási kísérlet eredményeit ábrázoltuk, míg a jobb oldalon a tisztított MHC-II molekulák jelenléte nélkül végzett kísérletek eredményeit, azaz puffért alkalmaztunk negatív kontrollként.

• ·· · ·

Az 1. és 4. vonalon található foltok a kontroll antitesttel (anti-CD3) nem-specifikusan kicsapott CD14-nek felelnek meg. A 3. vonalon egy folt látható, amely az antiCD14 antitesttel kicsapott CD14-nek felel meg. A 2. vonalon a CD14-nek megfelelő folt intenzívebb, mint a 3. vonalon, annak ellenére, hogy ebben a kísérletben a kicsapást anti-MHC-II molekulákkal végeztük. Tisztított MHC-II molekulák hiányában a CD14 erősen kicsapódik anti-CD14 antitestekkel (6. vonal), míg az anti-MHC-II antitesttel végzett CD14 együttes kicsapása nem haladja meg a háttér szintet (5. vonal).

3. kísérlet

A CD14 és az MHC-II molekulák közötti fizikai kölcsönhatás gátolható anti-CD14 antitestekkel

Az eredményeket a 7. ábra szemlélteti. Amint az 1. és 5. vonalon látható, az MY4 anti-CD14 antitest kicsapja az in vitro transzkripcióval/transzlációval készített, radioaktívan jelzett CD14-et, attól függetlenül, hogy MHC-II molekulák vannak-e (1. vonal) vagy nincsenek jelen (kontroll; 5. vonal) . A CD14-et erősen kicsapja az L243, egy anti-MHC-II antitest, feltéve, hogy MHC-II molekulák jelen vannak (2. vonal), azonban MHC-II molekulák hiányában (6. vonal) csak háttér mennyiségű kicsapás történik. Ha a CD14-et először egy anti-CD14 antitestekből álló eleggyel kezeljük, mielőtt az MHC-II molekulákat tartalmazó sejtlizátummal kevernénk, a

CDl4-et az anti-MHC-II antitestek nem tudják kicsapni. A 4. vonal azt mutatja, hogy a puffer (kontroll) nincs hatással a CD14 anti-MHC-II antitestekkel történő együttes kicsapására.

·♦··

A 7. és 8. vonal ugyanazon kísérlet eredményeit mutatja, mint a 3. és 4. vonal, azonban MHC-II molekulák jelenléte nélkül.

4. példa

Bevezetés

Az MHC-II-nek a sejtek aktiválásában játszott szerepe kimutatására in vivő MHC-II-vel kiütött egereket használtunk. Ha az MHC-II szerepet játszik az LPS által történő aktiválási mechanizmusban, az MHC-II-hiányos egerek nem mutatják a szokásos fiziológiai választ az LPS stimulálásra. Hasonló in vitro kísérletet végeztünk ugyanezen egerek vérének alkalmazásával .

Módszerek

Az in vivő kísérlet esetén 100 pg LPS-t (E.coli 0111:B4, steril 0,9 % nátrium-kloriddal hígítva) injektáltunk intravénásán vad-típusú, MHC-II-vel kiütött C57BL/6 és B6Aa°/Aa° jelű egereknek (Hoffmann-La Roche; 16. hivatkozási szám) . Két óra múlva az egereket leöltük és sterilen elvéreztettük. A vért szobahőmérsékleten hagytuk koagulálni, majd 5 percig 13000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A szérumot eltávolítottuk. A TNF-α tartalmat, ami a fagociták aktiválásának jellemzője, a szérumban ELISA módszerrel (Biosource) meghatároztuk. Az eredményeket a 8. ábra szemlélteti .

Az in vitro kísérlethez vad-típusú, MHC-II-pozitív C57BL/6 egerek (fekete kör a 9. ábrán) és B6-Aa°/Aa° egerek (világos négyszög) , amelyekben az MHC-II expresszió hiányzik az MHC-II gén (Aa¹) célzott szétroncsolása után, teljes, heparinnal kezelt vérét 0, 0,1, 1, 10 és 100 ng/ml LPS jelen• · létében inkubáltuk. 4 óra múlva a plazmában ELISA módszerrel (Biosource) mértük a TNF-α szintet. Az eredményeket a 9. ábra szemlélteti.

Az ábrákon látható, hogy a TNF-α kiválasztás magasabb az MHC-II molekulákat expresszáló egerek vagy sejtek esetén.

5. példa

Bevezetés

Az MHC-II-kötő MHC-II utánzó molekulák in vivő hatását a következő módon határoztuk meg.

Módszerek

Vad-típusú C57BL/6 egerek testtömegét egyenként megmértük, és az LPS előzetes kísérletben meghatározott LD₅₀dózisát injektáltuk nekik. Injektálás előtt az egereket a következő kezelésben részesítettük:

1. csoport: testtömegkilogrammonként 1 pg és 1 mg közötti dózisban oldható MHC-II molekulák;

2. csoport: ugyanolyan dózisban anti-MHC-II antitestek;

3. csoport: csak sóoldat (kontrollcsoport).

Kontroliképpen három másik csoport oldható MHC-II molekulát, anti-MHC-II antitestet, illetve sóoldatot kapott

LPS kezelés nélkül.

A túlélést 7 napig figyeltük meg. Az első 48 órában az egereket rendszeres időközönként megfigyeltük, és feljegyeztük a tüneteket. Az egerek egy alcsoportját az LPS által okozott elhullás előtt leöltük és elvéreztettük, és a TNF-a szintet a szérumban ELISA módszerrel meghatároztuk.

• · ··» ·

Eredmények

A mortalitás, valamint a TNF-α szérumbeli szintje szignifikánsan csökkent az egerek azon csoportjaiban, amelyek oldható MHC-II molekulákat, illetve anti-MHC-II antitesteket kaptak. Az MHC-II molekulákkal, illetve anti-MHC-II antitestekkel, de LPS-sel nem kezelt kontrollcsoportok eredményei nem tértek el szignifikánsan a sóoldattal kezelt és LPS-sel nem kezelt egerek eredményeitől.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. MHC-II-kötő molekulák alkalmazása olyan gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek a fagocitákat aktiváló stimulus és a sejtekhez kötött MHC-II molekulák közötti kölcsönhatásba történő beavatkozásra, a fagocitákon belüli ingertovábbítás befolyásolására szolgálnak.
2. MHC-II-kötő molekulák alkalmazása olyan gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek lipopoliszacharidok vagy lipopoliszacharidok más molekulákkal - mint CD14-gyel és lipopoliszacharid-kötő proteinnel - alkotott komplexei és a sejtekhez kötött MHC-II molekulák közötti kölcsönhatásba történő beavatkozásra, a fagocitákon belüli ingertovábbítás befolyásolására szolgálnak.
3. MHC-II-kötő molekulák alkalmazása olyan gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek Gram-pozitív baktériumok termékei vagy Gram-pozitív baktériumok termékeinek más molekulákkal - mint CD14-gyel - alkotott komplexei és a sejtekhez kötött MHC-II molekulák közötti kölcsönhatásba történő beavatkozásra, a fagocitákon belüli ingertovábbítás befolyásolására szolgálnak.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az MHC-II-kötő molekula egy anti-MHC-II antitest vagy annak fragmense vagy származéka, mint humanizált, bispecifikus vagy más módon átalakított molekula.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a gyógyszerkészítmények gyulladásos betegségek, szeptikus sokk, szerv vagy szövet szerv- vagy ··· · szövetátültetés - mint csontvelő-átültetés - után fellépő gazdaszervezet elleni reakciója, szerv- vagy szövetkilökődési reakció, egy vagy több szerv égésekből, balesetekből, hasnyálmirigy-gyulladásból eredő gyulladásos reakciója, mint felnőttkori légzési distressz szindróma (ARDS), egy vagy több szerv sebészeti beavatkozás után fellépő gyulladásos reakciója, mint kapilláris szivárgási szindróma, egy vagy több szervre kiterjedő allergiás betegség, egy vagy több szervben autoimmun betegségekkel, mint Lupus Erythematodes-szel és ennek alváltozataival, eozinofil izomhüvelygyulladással, Sjögren-szindrómával, sokizomgyulladással, dermatomiozitiszszel, artéria körüli csomós gyulladással, Wegener-granulomatózissal, időszakos ütőérgyulladással, reumás többizomgyulladással kapcsolatosan fellépő gyulladásos reakciók, egy vagy több szervben reumás rendellenességekkel, mint reumás ízületi gyulladással, fiatalkori krónikus ízületi gyulladással, Felty-szindrómával, Caplan-szindrómával, ízületi merevséggel járó csigolyagyulladással (Marie-Strümpell-Bechterrew-betegséggel), pszoriázissal, Reiter-szindrómával, Behcet-szindrómával kapcsolatosan fellépő gyulladásos reakciók, egy vagy több szervben legalább részben autoimmun mechanizmusból eredő betegségekkel, mint díabetes mellitus-szal, Crohn-betegséggel, fekélyes vastagbélgyulladással, emésztőrendszer fekélyeivel, vesefertőzésekkel, mint érgomolyos vesegyulladással és vesegyulladással, érelmeszesedéses rendellenességekkel, szklerozis multiplexszel, Alzheimer-betegséggel, a pajzsmirigy csökkent vagy túlműködésével kapcsolatosan fellépő gyulladásos reakciók, egy vagy több szervben onkológiai rend··♦ · ellenességekkel, mint leukémiával, vérsejttumorral, karcinomával, fibrómával, szarkomával és a hisztiocitózis különféle típusaival kapcsolatosan fellépő gyulladásos reakciók, valamint vírusbetegségek, mint AIDS megelőzésére és/vagy kezelésére szolgálnak.