ES2677146T3 - Recipientes para la agitación de muestras líquidas y métodos de uso de los mismos - Google Patents
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Abstract
Un método para lisar células en una muestra líquida, comprendiendo dicho método proporcionar líquido en un recipiente que tiene un volumen de menos de 5 ml, el recipiente que comprende una cámara interior con un eje central, una parte superior que comprende una abertura, y una sección transversal esencialmente circular o esencialmente poligonal, en donde la superficie de dicha cámara interior comprende uno o más salientes esencialmente lineares esencialmente paralelos a dicho eje central, en donde dicho líquido comprende partículas rígidas y células; y Agitar dicho líquido en dicho recipiente, en donde dicha agitación es de una fuerza y duración suficientes como para lisar dichas células.
Description
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DESCRIPCION
Recipientes para la agitacion de muestras Kquidas y metodos de uso de los mismos Referencia cruzada con las solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE.UU. num. 61/601.842, presentada el 22 de febrero de 2012.
Antecedentes de la invencion
Los ensayos bioqmmicos y biologicos moleculares estandar a menudo necesitan que una muestra Uquida se mezcle y/o que sus contenidos celulares se lisen en una o mas etapas en el ensayo. Anteriormente, para mezclar una muestra lfquida, la muestra se coloca en un recipiente, que se coloca entonces en un dispositivo de agitacion. El dispositivo de agitacion agita el recipiente, mezclando asf los contenidos lfquidos del recipiente. El lisado de celulas en una muestra lfquida puede implicar la adicion de partmulas ngidas, del tamano de micras, a la muestra antes de la etapa de mezcla. En este proceso de agitacion, conocido como ruptura con perlas, las partmulas ngidas alteran la pared celular con colisiones productivas, lisando asf las celulas.
Como un ejemplo de dicha tecnica anterior, el documento EP 0 224 650 A2 describe un montaje de recogida de sangre que incorpora un recipiente de micro-recogida, en donde se proporciona un miembro que induce el flujo sangumeo alargado separado o integral que sirve como una grna para inducir el paso del flujo sangumeo a lo largo de una superficie, y como un puente, que induce el flujo sangumeo a traves de un punto de transicion entre dos partes en un montaje de recogida de sangre. Miembros representativos que inducen el flujo sangumeo incluyen, por ejemplo, una disposicion en barra o tira alargada incorporada en un montaje de micro-recogida de sangre de tal forma que la sangre recogida se dirija desde el colector de forma continua al recipiente de recogida asociado. Como una caractenstica adicional, en el tubo de recogida de sangre, una vez que una muestra se recoge aim y el tubo se cierra, la invencion induce el flujo de la muestra hacia adelante y hacia atras para mejorar la mezcla de la muestra recogida con otros componentes en el tubo.
Como ejemplo adicional, el documento US 7 377 027 B2 describe un aparato que puede ser parte de un sistema automatizado para procesar multiples espedmenes con base lfquida, y un metodo para manejar un recipiente que tiene una cubierta extrafble, por ejemplo, un vial para contener un especimen fluido biologico. El recipiente puede tener en el un elemento interno que esta acoplado de forma extrafble a la cubierta, como un montaje para procesar el especimen en el recipiente. El metodo implica aplicar una fuerza externa al recipiente tapado suficiente para liberar el elemento interno de la cubierta, y despues quitar la cubierta del recipiente, en donde la fuerza externa puede ser una fuerza de aceleracion aplicada al recipiente, como una fuerza de impacto a la parte inferior del recipiente, o contacto directo con la cubierta con suficiente fuerza como para desviar la cubierta de forma interna.
En otro ejemplo de la tecnica anterior en el actual campo tecnico, es decir, en el documento WO 2011/034621 A2, se describe un metodo para lisar celulas, cuyo metodo incluye agitar celulas con un elemento agitador magnetico en presencia de una pluralidad de perlas de lisis celular a una velocidad suficiente para lisar las celulas. Ademas, en el documento WO 2011/034621 A2, se describe un dispositivo para lisar celulas, cuyo dispositivo incluye un recipiente que tiene un elemento agitador magnetico y una pluralidad de perlas de lisis celular dispuestas en el, en donde el recipiente esta dimensionado para permitir la rotacion del elemento de agitacion magnetico dentro del recipiente.
De forma convencional, un recipiente de muestra tiene una camara interior circular con una superficie lisa. Aunque ideal para algunos usos, la superficie lisa puede impedir la mezcla o lisis eficiente. Por ejemplo, en vez de hacer numerosas colisiones productivas con los componentes celulares de la muestra lfquida, las partmulas ngidas usadas en la ruptura con perlas pueden viajar principalmente en un drculo en el diametro interior del recipiente, generando pocas colisiones productivas. Por lo tanto, hay una necesidad no satisfecha en el campo para desarrollar metodos para aumentar la eficiencia con la que una mezcla lfquida puede mezclarse y/o sus componentes celulares pueden lisarse.
Compendio de la invencion
Solo como un ejemplo descriptivo, se describen los recipientes para operaciones de mezcla y lisis celular en un medio de laboratorio, tal como un recipiente (por ejemplo, un tubo) que incluye una camara interior con un eje central, una parte superior que incluye una abertura, y una seccion transversal esencialmente circular, en donde la superficie de la camara interior incluye uno o mas salientes esencialmente lineares esencialmente paralelos al eje central.
Como un ejemplo descriptivo adicional, se describe un recipiente (por ejemplo, un tubo), que incluye una camara interior con un eje central, una parte superior que incluye una abertura, y una seccion transversal esencialmente poligonal que tiene un radio, en donde el radio es la distancia del eje central a un punto en esquina. Aqrn, la superficie de la camara interior incluye uno o mas salientes esencialmente lineales esencialmente paralelos al eje central. Ademas, la seccion transversal esencialmente poligonal puede ser esencialmente triangular, cuadrada, pentagonal, hexagonal, heptagonal, octogonal, nonagonal, decagonal o dodecagonal.
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Los recipientes anteriores pueden tener, por ejemplo, un volumen menor de 5 mL (por ejemplo, 4, 3, 2, 1,5, 1, 0,5 mL o menos). De forma ejemplar, el recipiente puede tener un volumen de 2,8 mL.
Los recipientes anteriores pueden tener uno o mas salientes con una longitud paralela al eje central, una profundidad esencialmente paralela al radio de la seccion transversal esencialmente circular o poligonal, y una anchura esencialmente perpendicular al radio. De forma ejemplar, la profundidad y/o anchura son constantes o vanan a lo largo de la longitud del saliente esencialmente linear. De forma alternativa, la profundidad y/o anchura aumenta desde la parte superior a la parte inferior del saliente esencialmente linear. Ademas, la profundidad puede ser mayor del 10% del radio (por ejemplo, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50% o 60% del radio) en algun punto a lo largo de la longitud del saliente esencialmente linear. Ademas, la profundidad puede ser mayor del 20% del radio (por ejemplo, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70% del radio) en algun punto a lo largo de la longitud del saliente esencialmente linear. Ademas, la profundidad puede ser mayor del 30% del radio (por ejemplo, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% del radio) en algun punto a lo largo de la longitud del saliente esencialmente linear. Se describe tambien que la profundidad de la parte superior y la parte inferior del saliente esencialmente lineal estan al menos entre 0,3 y 0,5 milfmetros (mm) (por ejemplo, al menos entre 0,3 a 0,35 mm, al menos entre 0,35 a 0,4 mm, al menos entre 0,4 a 0,45 mm, o al menos entre 0,45 a 0,5 mm) y 0,75 a 1 mm (por ejemplo, al menos entre 0,75 a 0,8 mm, al menos entre 0,8 a 0,85 mm, al menos entre 0,85 a 0,9 mm, al menos entre 0,9 a 0,95 mm, o al menos entre 0,95 a 1 mm), respectivamente. Las profundidades de la parte superior y la parte inferior del saliente esencialmente linear pueden estar al menos entre 0,75 a 1,25 mm (por ejemplo, al menos entre 0,75 a 0,9 mm, al menos entre 0,9 a 1 mm, al menos entre 1 a 1,1 mm, o al menos entre 1,1 a 1,25 mm) y 1,75 a 2,25 mm (por ejemplo, al menos entre 1,75 a 1,9 mm, al menos entre 1,9 a 2 mm, al menos entre 2 a 2,1 mm, o al menos entre 2,1 a 2,25 mm), respectivamente.
Los recipientes ejemplarmente descritos anteriores pueden tener salientes con una longitud distal y una longitud proximal respecto al eje central, en donde las longitudes distal y proximal estan cada una entre 40-95% de la altura del recipiente (por ejemplo, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% o 90-95% de la altura del recipiente). Aqm, la longitud proximal puede ser igual a o mayor que la longitud distal. Ademas, el uno o mas salientes esencialmente lineales pueden ser esencialmente trapezoidales. Por ejemplo, las longitudes distales y proximales son cada una al menos alrededor de 15 mm. De forma alternativa, las longitudes distales y proximales pueden ser cada una alrededor de 30 mm.
Cualquiera de los recipientes anteriores puede tener salientes con una anchura mayor del 5% del radio (por ejemplo, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% o 25% del radio) en algun punto a lo largo de la longitud del saliente esencialmente linear. De forma alternativa, la anchura puede ser mayor del 10% del radio (por ejemplo, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% o 30% del radio) en algun punto a lo largo de la longitud del saliente esencialmente linear. Ademas, la anchura puede ser mayor del 15% del radio (por ejemplo, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% o 35% del radio) en algun punto a lo largo de la longitud del saliente esencialmente linear. De forma ejemplar, la anchura puede estar al menos entre 0,025 a 0,175 mm (por ejemplo, al menos entre 0,025 a 0,075 mm, al menos entre 0,075 a 0,1 mm, al menos entre 0,1 a 0,15 mm, o al menos entre 0,15 a 0,175 mm) en algun punto a lo largo de la longitud del saliente esencialmente linear. En otras realizaciones, la anchura esta al menos entre 0,175 a 0,375 mm (por ejemplo, al menos entre 0,175 a 0,225 mm, al menos entre 0,225 a 0,275 mm, al menos entre 0,275 a 0,325 mm, o al menos entre 0,325 a 0,375 mm) en algun punto a lo largo de la longitud del saliente esencialmente linear. De forma alternativa, la anchura puede estar al menos entre 0,5 a 0,7 mm (por ejemplo, al menos entre 0,5 a 0,55 mm, al menos entre 0,55 a 0,6 mm, al menos entre 0,6 a 0,65 mm, o al menos entre 0,65 a 0,7 mm) en algun punto a lo largo de la longitud del saliente esencialmente linear.
Los recipientes ejemplares descritos anteriormente pueden tener salientes que estan angulados hacia la parte inferior del recipiente y alejados del radio de la seccion transversal esencialmente circular o poligonal de entre aproximadamente 10° a 50°, por ejemplo, entre aproximadamente 10° a 25°, entre aproximadamente 25° a 35°, o entre aproximadamente 35° a 50°.
Las composiciones descritas anteriormente pueden tener una camara interior que incluye 2 a 6 salientes esencialmente lineares (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6 salientes esencialmente lineares). De forma alternativa, la camara interior puede incluir 2 a 4 salientes esencialmente lineares. Ademas, los salientes esencialmente lineares pueden estar espaciados uniformemente en la camara interior del recipiente.
Los recipientes ejemplares descritos anteriormente pueden ademas incluir una cubierta (por ejemplo, un tapon, tapa o superficie). Aqm, la cubierta puede incluir un paso que se extiende desde su superficie exterior a su superficie interior. Ademas, el paso puede incluir tres hendiduras espaciadas uniformemente (por ejemplo, una tri-hendidura) que convergen en un eje central de la cubierta. Ademas, la superficie exterior de la cubierta puede incluir una o mas protuberancias (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6 protuberancias) entre cada una de las tres hendiduras espaciadas uniformemente. Ademas, la superficie interior puede incluir un anillo con peso que circunda las tres hendiduras espaciadas uniformemente. Las una o mas protuberancias de la superficie exterior y el anillo con peso de la superficie interior pueden promover el cierre del paso (por ejemplo, cierre tras la apertura del paso mediante, por ejemplo, una punta de pipeta o una aguja). Ademas, se puede acceder a la camara interior del recipiente a traves del paso. Las cubiertas pueden, por ejemplo, evitar el escape de lfquido del recipiente durante la agitacion.
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Cualquiera de los recipientes ejemplares descritos anteriormente puede construirse sin un material que no sea de poliestireno (por ejemplo, policarbonato).
Tambien se describe un metodo ejemplar de mezcla de lfquido en un recipiente, incluyendo el metodo agitar el lfquido en cualquiera de los recipientes anteriores con, por ejemplo, un dispositivo de agitacion (por ejemplo, un mezclador de vortice, por ejemplo, un mezclador de vortice que agita en un movimiento por pulsos, por ejemplo, un mezclador de vortice que agita de una manera circular modificada (por ejemplo, orbital planetaria)), mezclando asf el lfquido en el recipiente.
Se describe ademas un metodo ejemplar de mezcla de lfquido en un recipiente, incluyendo el metodo (i) proporcionar lfquido en cualquiera de los recipientes anteriores de la invencion, donde el recipiente comprende partfculas ngidas inertes (por ejemplo, perlas, esquirlas, barras de vidrio, y discos de vidrio), y (ii) agitar el lfquido en el recipiente con, por ejemplo, un dispositivo de agitacion (por ejemplo, un mezclador de vortice, por ejemplo, un mezclador de vortice que agita en un movimiento por pulsos), mezclando asf el lfquido en el recipiente.
Actualmente, la presente invencion presenta un metodo para lisar celulas en una muestra lfquida, incluyendo el metodo proporcionar lfquido en un recipiente que tiene un volumen de menos de 5 ml, el recipiente que comprende una camara interior con un eje central, una parte superior que comprende una abertura, y una seccion transversal esencialmente circular o esencialmente poligonal, en donde la superficie de dicha camara interior comprende uno o mas salientes esencialmente lineares esencialmente paralelos a dicho eje central, donde el lfquido incluye partfculas ngidas y celulas (por ejemplo, celulas de hongos o levaduras), y agitar el lfquido en el recipiente con, por ejemplo, un dispositivo de agitacion (por ejemplo, un mezclador de vortice, por ejemplo, un mezclador de vortice que agita en un movimiento por pulsos, por ejemplo, un mezclador de vortice que agita de una manera circular modificada (por ejemplo, orbital planetaria), en donde la agitacion es de una fuerza y duracion suficientes para lisar las celulas.
En aun otro aspecto, la invencion presenta un metodo para detectar la presencia de un acido nucleico objetivo en una muestra de sangre completa, incluyendo el metodo: (i) proporcionar un extracto producido lisando los eritrocitos en una muestra de sangre completa de un sujeto (por ejemplo, un ser humano), centrifugar la muestra para formar un sobrenadante y un granulado, descartar algo o todo el sobrenadante, y suspender de nuevo el granulado; (ii) lisar las celulas en el extracto, incluyendo el lisado combinar el extracto con partfculas ngidas para formar una mezcla en un recipiente que tiene un volumen de menos de 5 ml, el recipiente que comprende una camara interior con un eje central, una parte superior que comprende una abertura, y una seccion transversal esencialmente circular o esencialmente poligonal, en donde la superficie de dicha camara interior comprende uno o mas salientes esencialmente lineares esencialmente paralelas a dicho eje central, y agitar la mezcla con, por ejemplo, un dispositivo de agitacion (por ejemplo, un mezclador de vortice, por ejemplo, un mezclador de vortice que agita en un movimiento por pulsos) para formar un lisato; (iii) proporcionar el lisato de la etapa (ii) en un tubo de deteccion y amplificar los acidos nucleicos en el para formar una disolucion de lisato amplificado que incluye del 40% (p/p) al 95% (p/p) del acido nucleico objetivo (por ejemplo, de 40% a 60%, 60% a 80%, 80% a 90% o 90% a 95% (p/p) del acido nucleico objetivo) y del 5% (p/p) al 60% (p/p) de acido nucleico que no es objetivo (por ejemplo, de 5% a 20%, 20% a 35%, 35% a 40% o 40% a 60% (p/p) del acido nucleico objetivo); y opcionalmente, (iv) detectar el acido nucleico diana amplificado.
La invencion tambien presenta un metodo de amplificacion de un acido nucleico objetivo en una muestra de sangre completa (i) proporcionando un extracto producido lisando los eritrocitos en una muestra de sangre completa de un sujeto (por ejemplo, un ser humano), centrifugando la muestra para formar un sobrenadante y un granulado, descartando algo o todo el sobrenadante, y suspendiendo de nuevo el granulado; (ii) lisando celulas en el extracto, el lisado que incluye combinar el extracto con partfculas ngidas para formar una mezcla en el recipiente de la invencion que tiene un volumen de menos de 5 ml, el recipiente que comprende una camara interior con un eje central, una parte superior que comprende una abertura, y una seccion transversal esencialmente circular o esencialmente poligonal, en donde la superficie de dicha camara interior comprende uno o mas salientes esencialmente lineares esencialmente paralelos a dicho eje central, y agitar la mezcla con, por ejemplo, un dispositivo de agitacion (por ejemplo, un mezclador de vortice, por ejemplo, un mezclador de vortice que agita en un movimiento por pulsos) para formar un lisato; (iii) proporcionando el lisato de la etapa (ii) en un tubo de deteccion y amplificando los acidos nucleicos en el para formar una disolucion de lisato amplificado que incluye de 40% (p/p) a 95% (p/p) del acido nucleico objetivo (por ejemplo, de 40% a 60%, 60% a 80%, 80% a 90% o 90% a 95% (p/p) de acido nucleico objetivo) y de 5% (p/p) a 60% (p/p) de acido nucleico que no es objetivo (por ejemplo, de 5% a 20%, 20% a 35%, 35% a 40% o 40% a 60% (p/p) de acido nucleico objetivo). En un aspecto relacionado, la invencion presenta un metodo de preparacion de una disolucion de lisato amplificado por el metodo anterior.
El metodo anterior puede comprender ademas: (iv) despues de la etapa (iii), proporcionar de 1x106 a 1x1013 partfculas magneticas por mililitro (por ejemplo, de 1x106 a 1x108, 1x107 a 1x108, 1x107 a 1x109, 1x108 a 1x1010, 1x109 a 1x1011 o 1x1010 a 1x1013 partfculas magneticas por mililitro) de la disolucion de lisato amplificado, en donde las partfculas magneticas tienen un diametro medio de 700 nm a 1200 nm (por ejemplo, de 700 a 850, 800 a 950, 900 a 1050, o de 1000 a 1200 nm) y restos de union en su superficie, los restos de union operativos para alterar la agregacion de las partfculas magneticas en presencia del acido nucleico objetivo o un agente de union multivalente; (v) colocar el tubo de deteccion en un dispositivo, el dispositivo que incluye un soporte que define un pocillo para contener el tubo de deteccion que incluye las partfculas magneticas y el acido nucleico objetivo, y que tiene una bobina de RF dispuesta
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alrededor del pocillo, la bobina de RF configurada para detectar una senal producida exponiendo la muestra Uquida a un campo magnetico polarizado creado usando uno o mas imanes y una secuencia de pulso de RF; (vi) exponer a la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulso de RF; (vii) despues de la etapa (vi), medir la senal del tubo de deteccion; y (viii) en base al resultado de la etapa (vii), detectar el acido nucleico objetivo, en donde la etapa (vii) se realiza, por ejemplo, sin ninguna purificacion previa de la disolucion de lisato amplificado.
En algunas realizaciones de los metodos de la invencion que usan partfculas inertes ngidas para mezclar o lisar, las partfculas ngidas (por ejemplo, perlas, esquirlas, barras de vidrio y discos de vidrio) tienen un diametro de entre aproximadamente 0,1 mm a 1 mm (por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 a 0,3 mm, entre aproximadamente 0,3 a 0,5 mm, entre aproximadamente 0,5 a 0,7 mm, entre aproximadamente 0,7 a 0,9 mm, o entre aproximadamente 0,9 a 1 mm). En otras realizaciones, las partfculas ngidas tienen un diametro de aproximadamente 0,8 mm.
En cualquiera de los metodos de la invencion, el dispositivo de agitacion es un mezclador de vortice. En otra realizacion, el mezclador de vortice agita en un movimiento linear, planetario, de orbita vertical o por pulsos.
Definiciones
Los terminos “agregacion”, “aglomeracion” y “agrupacion” se usan de forma intercambiable en el contexto de las partfculas magneticas descritas en esta memoria y significan la union de dos o mas partfculas magneticas las unas con las otras, por ejemplo, por medio de un analito multivalente, forma multimerica del analito, anticuerpo, molecula de acido nucleico, u otras molecula o entidad de union. En algunos ejemplos, la aglomeracion de partfculas magneticas es reversible.
Por “recipiente” se entiende un artfculo de forma ngida con una parte superior, parte inferior y lados, en donde la parte superior contiene opcionalmente una abertura para el acceso a un interior que es capaz de contener muestras lfquidas, gaseosas y/o solidas. No esta limitado a ninguna forma particular, y puede tener, por ejemplo, una seccion transversal con una forma cuadrada, rectangular, triangular, circular u ovalada. En algunas realizaciones, el recipiente pude tener una superficie superior que se puede abrir, por ejemplo, una tapa, cubierta o tapon.
El termino “partfcula magnetica” se refiere a partfculas que incluyen materiales de alta susceptibilidad magnetica positiva tal como compuestos paramagneticos, compuestos superparamagneticos y magnetita, oxido ferrico gamma o hierro metalico.
Por “secuencia por pulsos” o “secuencia por pulsos de RF” se entiende uno o mas pulsos de radiofrecuencia que se aplican a una muestra y se disenan para medir, por ejemplo, ciertas velocidades de relajacion de RMN, tal como las secuencias de eco de giro. Una secuencia por pulsos puede incluir tambien la adquisicion de una senal despues de uno o mas pulsos para minimizar el ruido y mejorar la precision en el valor de la senal resultante.
Como se usa en esta memoria, el termino “senal” se refiere a una velocidad de relajacion de RMN, desplazamiento de frecuencia, medida de susceptibilidad, medida de difusion o medidas de correlacion.
Otras caractensticas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada, los dibujos y las reivindicaciones.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1A es una vista en perspectiva superior esquematica de un ejemplo de un recipiente, que muestra la posicion relativa de cada saliente esencialmente linear en la camara interior del recipiente. Los tres salientes lineares estan sombreados en gris para contrastar. El recipiente se representa como semi-transparente.
La figura 1B es una vista en perspectiva superior esquematica angulada del recipiente en la Figura 1A. Los tres salientes lineares estan sombreados en gris para contrastar. El recipiente se representa como semi-transparente.
La Figura 2A es una vista en perspectiva superior esquematica ampliada de un ejemplo de un recipiente, que muestra la posicion relativa de cada saliente esencialmente linear en la camara interior del recipiente.
La Figura 2B es una vista en perspectiva superior esquematica angulada ampliada del recipiente en la Figura 2A. El recipiente se representa como semi-transparente.
La Figura 2C es una vista en perspectiva inferior esquematica ampliada del recipiente en la Figura 2A.
La Figura 3A es una vista en perspectiva lateral esquematica angulada de un ejemplo de un recipiente. El recipiente se representa como semi-transparente.
La Figura 3B es una vista en perspectiva lateral en corte angulado del recipiente en la Figura 3A.
La Figura 4A es una vista en perspectiva lateral esquematica de un ejemplo de un recipiente. El recipiente no esta representado como semi-transparente.
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La Figura 4B es una vista en perspectiva lateral esquematica del recipiente en la Figura 4A, rotada en 90° a lo largo del eje vertical.
La Figura 5A es una vista en perspectiva lateral en corte de un ejemplo de un recipiente.
La Figura 5B es una vista en perspectiva lateral en corte del recipiente en la Figura 5A, rotada sobre un eje vertical.
La Figura 6A es un dibujo que muestra las dimensiones de longitud, profundidad e inclinacion relativas de un ejemplo de un saliente esencialmente linear.
La Figura 6B es un dibujo que representa las dimensiones de anchura de un ejemplo de un saliente esencialmente linear, visto directamente a lo largo de la longitud del saliente.
La Figura 7A es una vista en perspectiva superior esquematica de un ejemplo de un recipiente con una seccion transversal esencialmente cuadrada.
La Figura 7B es una vista en perspectiva lateral esquematica del recipiente en la Figura 7A.
La Figura 7C es una vista en perspectiva inferior esquematica del recipiente en la Figura 7A.
La Figura 7D es una vista en perspectiva lateral esquematica angulada del recipiente en la Figura 7A.
La Figura 7E es una vista en perspectiva lateral esquematica angulada del recipiente en la Figura 7A.
La Figura 8A es una vista en perspectiva superior en corte de un ejemplo de un recipiente con una seccion transversal esencialmente cuadrada.
La Figura 8B es una vista en perspectiva lateral en corte del recipiente en la Figura 8A, rotada en 90° a lo largo de un eje vertical.
La Figura 8C es una vista en perspectiva superior en corte del recipiente en la Figura 8A, rotada en 45° a lo largo de un eje horizontal.
La Figura 8D es una vista en perspectiva lateral en corte del recipiente en la Figura 8C, rotada en 90° a lo largo de un eje vertical.
La Figura 9A es una vista en perspectiva inferior esquematica de una mitad inferior de un recipiente con una seccion transversal esencialmente cuadrada.
La Figura 9B es una vista en perspectiva lateral esquematica de la mitad inferior de un recipiente en la Figura 9A, rotada en 90° a lo largo de un eje vertical.
Las Figuras 9C y 9D son vistas en perspectiva inferior esquematicas de las mitades inferiores de recipientes con secciones transversales esencialmente circulares que tienen una o dos muescas, respectivamente.
Las Figuras 9E y 9F son vistas en perspectiva inferior esquematicas de las mitades inferiores de recipientes con secciones transversales esencialmente triangulares que tienen lados rectos o curvados, respectivamente.
La Figura 9G es una vista en perspectiva inferior esquematica de una mitad inferior de un recipiente con una seccion transversal esencialmente cuadrada que tiene lados curvados.
Las Figuras 9H-9J son vistas en perspectiva inferior esquematicas de mitades inferiores de recipientes con lados esencialmente pentagonales, hexagonales y octogonales.
La Figura 10A es una vista en perspectiva lateral en corte de una cubierta para un recipiente, que representa el tamano y la posicion relativos de un anillo con peso en la superficie interior de la cubierta.
La Figura 10B es una vista en perspectiva superior esquematica de una cubierta para un recipiente, que muestra la posicion relativa de un paso de tri-hendidura y seis protuberancias.
La Figura 11 es un grafico que muestra que la cantidad de lisis de celulas Candida en un ensayo de ruptura con perlas estandar es mayor de manera constante usando recipientes que incluyen tres salientes esencialmente lineares, o “aletas”, en comparacion con los recipientes estandar sin salientes lineares.
Mientras que la invencion esta abierta a diversas modificaciones y formas alternativas, los detalles de la misma se han mostrado por medio del ejemplo en los dibujos y se describiran en detalle. Debena entenderse, sin embargo, que la intencion no es limitar la invencion a las realizaciones particulares descritas. Por el contrario, la intencion es cubrir todas las modificaciones, equivalentes y alternativas que entran en el alcance de las reivindicaciones de la presente invencion.
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Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion esta basada, al menos en parte, en recipientes para usar en mezclar o lisar celulas en una muestra Kquida. Un recipiente puede tener una camara interior con uno o mas (por ejemplo, tres, cuatro o cinco) salientes esencialmente lineares, que promueven el proceso de mezcla o lisado. En algunas realizaciones, pueden anadirse partfculas ngidas (por ejemplo, perlas) a la muestra lfquida en el recipiente (o estar presentes en el recipiente antes de la adicion de un lfquido) para promover adicionalmente el proceso de mezcla o lisado. Un recipiente puede incluir ademas una cubierta con un paso (por ejemplo, una hendidura, por ejemplo, una tri-hendidura) que puede permitir el paso a la camara interior del recipiente mientras sella de forma segura la abertura superior del recipiente.
Recipientes para mezcla o lisado
Las camaras interiores de los recipientes pueden tener secciones transversales esencialmente circulares con salientes o secciones transversales esencialmente poligonales que tienen opcionalmente salientes. Ambos recipientes se adaptan particularmente para mezclar de forma eficiente una muestra lfquida o lisar celulas en una muestra lfquida.
Recipientes con secciones transversales circulares
Un recipiente puede incluir una camara interior con un eje central, una parte superior con una abertura, y una seccion transversal esencialmente circular, en donde la camara interior incluye uno o mas salientes esencialmente lineares (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6 salientes esencialmente lineares) que son esencialmente paralelos al eje central. El recipiente puede usarse para aumentar la eficiencia de la mezcla de una muestra lfquida o el lisado de celulas en una muestra lfquida en comparacion con un recipiente sin ningun saliente linear. Por ejemplo, el uno o mas salientes esencialmente lineares pueden promover colisiones productivas de las partfculas ngidas usadas en la ruptura con perlas y evitar que viajen en un drculo durante el proceso de agitacion, aumentando asf la eficiencia de la lisis celular.
En algunas realizaciones, los recipientes con secciones transversales esencialmente circulares tienen uno o mas salientes esencialmente lineares con una longitud paralela al eje central, una profundidad esencialmente paralela al radio de la seccion transversal esencialmente circular, y una anchura esencialmente perpendicular al radio. La profundidad y/o anchura puede variar a lo largo de la longitud del saliente linear. En algunas realizaciones, la profundidad y/o anchura aumenta de la parte superior a la parte inferior del saliente linear. La profundidad del saliente esencialmente linear puede ser, por ejemplo, mayor del 10% del radio (por ejemplo, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50% o 60% del radio), mayor del 20% del radio (por ejemplo, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 40%, 50%, 60% o 70% del radio), o mayor del 30% del radio (por ejemplo, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 50%, 60%, 70% u 80% del radio) en algun punto a lo largo de la longitud del saliente esencialmente linear. En otras realizaciones, las profundidades de la parte superior y la parte inferior de los salientes esencialmente lineares estan al menos entre 0,3 a 0,5 milfmetros (mm) (por ejemplo, al menos entre 0,3 a 0,35 mm, al menos entre 0,35 a 0,4 mm, al menos entre 0,4 a 0,45 mm, o al menos entre 0,45 a 0,5 mm) y 0,75 a 1 mm (por ejemplo, al menos entre 0,75 a 0,8 mm, al menos entre 0,8 a 0,85 mm, al menos entre 0,85 a 0,9 mm, al menos entre 0,9 a 0,95 mm, o al menos entre 0,95 a 1 mm), respectivamente; o al menos entre 0,75 a 1,25 mm (por ejemplo, al menos entre 0,75 a 0,9 mm, al menos entre 0,9 a 1 mm, al menos entre 1 a 1,1 mm, o al menos entre 1,1 a 1,25 mm) y 1,75 a 2,25 mm (por ejemplo, al menos entre 1,75 a 1,9 mm, al menos entre 1,9 a 2 mm, al menos entre 2 a 2,1 mm, o al menos entre 2,1 a 2,25 mm), respectivamente. Ejemplos de recipientes con una seccion transversal circular y tres salientes esencialmente lineares, cada uno con profundidad y anchura que aumentan desde la parte superior a la parte inferior del saliente, se representan en detalle en las Figuras 1A-5B. Las Figuras 9C y 9D representan ejemplos de recipientes con secciones transversales esencialmente circulares. Como se representa en la Figura 6A, un saliente esencialmente linear puede tener, por ejemplo, una profundidad en la parte superior y la parte inferior de alrededor de 1 y 1,92 mm, respectivamente, que corresponde a alrededor del 18% y 35% del radio del recipiente para un recipiente con un radio de 5,5 mm.
Los recipientes con secciones transversales esencialmente circulares pueden tener uno o mas salientes esencialmente lineares que pueden variar en la longitud. En algunas realizaciones, los recipientes con secciones transversales esencialmente circulares tienen uno o mas salientes esencialmente lineares con una longitud distal y una longitud proximal respecto al eje central, en donde las longitudes distal y proximal estan cada una entre 40-95% de la altura del recipiente (por ejemplo, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% o 90-95% de la altura del recipiente). En algunas realizaciones, la longitud proximal puede ser mayor que la longitud distal. El uno o mas salientes esencialmente lineares pueden ser por consiguiente trapezoidales, por lo que los bordes que controlan la profundidad del saliente son paralelos, pero las longitudes no. En algunas realizaciones, las longitudes distal y proximal son cada una al menos 15 mm. En otras realizaciones, las longitudes distal y proximal son cada una al menos 30 mm. Como se representa en las Figuras 1B, 3A, 3B, 5A y 5B, los salientes esencialmente lineares pueden tener, por ejemplo, longitudes que abarcan casi la altura total del recipiente, desde cerca de la abertura superior a cerca del fondo del recipiente.
En algunas realizaciones, el uno o mas salientes esencialmente lineares pueden tener salientes con una anchura mayor del 5% del radio (por ejemplo, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% o 25% del radio), mayor del 10% del radio (por ejemplo, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% o 30% del radio), o mayor del 15% del radio (por ejemplo, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% o 35% del radio) en algun punto a lo largo de la longitud del saliente esencialmente linear. En otras realizaciones, la
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anchura esta al menos entre 0,025 a 0,175 mm (por ejemplo, al menos entre 0,025 a 0,075 mm, al menos entre 0,075 a 0,1 mm, al menos entre 0,1 a 0,15 mm, o al menos entre 0,15 a 0,175 mm), al menos entre 0,175 a 0,375 mm (por ejemplo, al menos entre 0,175 a 0,225 mm, al menos entre 0,225 a 0,275 mm, al menos entre 0,275 a 0,325 mm, o al menos entre 0,325 a 0,375 mm), o al menos entre 0,5 a 0,7 mm (por ejemplo, al menos entre 0,5 a 0,55 mm, al menos entre 0,55 a 0,6 mm, al menos entre 0,6 a 0,65 mm, o al menos entre 0,65 a 0,7 mm) en algun punto a lo largo de la longitud del saliente esencialmente linear. Como se representa en la Figura 6B, un saliente esencialmente linear puede tener, por ejemplo, una anchura que aumenta a lo largo de la longitud del saliente a una anchura maxima de 0,635 mm, o alrededor de 11,5% del radio del recipiente para un recipiente con un radio de 5,5 mm.
En algunas realizaciones, por ejemplo, como se representa en las Figuras 1B, 3A, 3B, 5A y 5B, los salientes esencialmente lineares de los recipientes representados estan angulados hacia la parte inferior del recipiente y alejados del radio de la seccion transversal esencialmente circular por entre aproximadamente 10° a 50° (por ejemplo, entre aproximadamente 10° a 25°, entre aproximadamente 25° a 35°, o entre aproximadamente 35° a 50°). Como se representa en la Figura 6A, un saliente esencialmente linear puede estar angulado, por ejemplo hacia abajo en 30°, lo que se refleja en un angulo de 60° formado por la profundidad de la parte superior y la longitud distal del saliente linear en vez de un angulo de 90°, en el caso en que el saliente no este angulado.
Los recipientes con secciones transversales esencialmente circulares pueden tener una camara interior que incluye 2 a 6 salientes esencialmente lineares (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6 salientes esencialmente lineares). En algunas realizaciones, la camara interior incluye 2 a 4 salientes esencialmente lineares. Los salientes pueden, en algunos casos, estar espaciados uniformemente en la camara interior del recipiente. Un ejemplo de un recipiente con una seccion transversal esencialmente circular y tres salientes esencialmente lineares espaciados uniformemente se representa en las Figuras 1A y 1B.
Los recipientes pueden incluir adicionalmente una cubierta (por ejemplo, un tapon, tapa o superficie). La cubierta puede estar completamente cerrada o incluir un paso que se extiende de su superficie exterior a su superficie interior. El paso puede incluir, por ejemplo, tres hendiduras espaciadas uniformemente (por ejemplo, una tri-hendidura) que converge en un eje central de la cubierta. La tri-hendidura puede incluir, por ejemplo, cortes radiales cortos, que paran antes de que alcancen el borde de la cubierta. En comparacion con una unica hendidura de lado a lado, la tri-hendidura puede, por ejemplo, extenderse menos y abrirse menos mediante una fuerza que actua para abrir el paso (por ejemplo, la insercion de una punta de pipeta). En algunas realizaciones, la cubierta incluye adicionalmente una o mas protuberancias (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6 protuberancias), o bultos, entre los alrededores o el entorno de la hendidura o hendiduras (por ejemplo, tres hendiduras espaciadas uniformemente). En otras realizaciones, la superficie interior puede incluir un anillo con peso que rodea la hendidura o hendiduras. Las una o mas protuberancias de la superficie exterior y el anillo con peso de la superficie interior promueven el cierre del paso (por ejemplo, cierre tras la apertura del paso para acceder a la camara interior mediante, por ejemplo, una punta de pipeta o una aguja). Las Figuras 10A y 10B representan un ejemplo de una cubierta para un recipiente. En este ejemplo, la cubierta es circular e incluye un paso de tri-hendidura, dos protuberancias entre cada hendidura (seis en total), y un anillo con peso para reducir la extension de la superficie interior de la cubierta.
Recipientes con secciones transversales poligonales
Como se representa en las Figuras 7A-9B y 9E-9J, los recipientes pueden incluir de forma alternativa una camara interior con un eje central, una parte superior con una abertura, y una seccion transversal esencialmente poligonal, en donde el radio de la seccion transversal es la distancia desde el eje central a un punto en esquina. Los recipientes pueden tener, por ejemplo, esquinas esencialmente angulares en la camara interior que soportan la mezcla eficiente de una muestra lfquida y/o lisis celular en una muestra lfquida. Por ejemplo, en un procedimiento de lisis por ruptura con perlas, las esquinas angulares pueden evitar que las partfculas ngidas (por ejemplo, perlas) circulen de forma improductiva alrededor del diametro del tubo por la fuerza de la unidad de agitacion (por ejemplo, el mezclador de vortice).
Los recipientes con secciones transversales poligonales pueden incluir opcionalmente los salientes esencialmente lineares en los lados del polfgono, como se describe anteriormente para los recipientes con secciones transversales esencialmente circulares. Las secciones transversales esencialmente poligonales pueden ser, por ejemplo, esencialmente triangulares, cuadradas, pentagonales, hexagonales, heptagonales, octogonales, nonagonales, decagonales o dodecagonales. En algunos ejemplos, los lados de la seccion transversal poligonal pueden estar curvados (veanse, por ejemplo, las Figuras 9F y 9G). Aunque la camara interior incluye una region con una seccion transversal esencialmente poligonal, todo o una parte del exterior del tubo puede ser esencialmente circular (por ejemplo, para usar con soportes de tubo cilmdricos y/o conicos tradicionales en, por ejemplo, una unidad centnfuga). Como se representa en las Figuras 7A-8D, los recipientes con secciones transversales poligonales pueden conservar, por ejemplo, una mitad superior con una abertura circular. Esta caractenstica permite a todos los recipientes tener potencialmente aberturas circulares uniformes, permitiendo asf que los recipientes se manejen facilmente por un brazo robotico automatizado (por ejemplo, una pinza de agarre). Como se describe anteriormente para los recipientes con secciones transversales circulares, los recipientes con secciones transversales poligonales pueden incluir adicionalmente una cubierta, que sella de forma segura la abertura superior del recipiente. En las realizaciones en que
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la parte superior del recipiente es poligonal, la cubierta tendra tfpicamente la misma forma de seccion transversal general.
Metodos para mezclar o lisar
La presente invencion incluye metodos para mezclar una muestra Kquida o lisar celulas (por ejemplo, celulas de hongo) en una muestra lfquida que usan los recipientes de la invencion. En un aspecto, una muestra lfquida puede mezclarse agitando el Kquido en un recipiente (por ejemplo, un recipiente con una seccion transversal esencialmente circular o poligonal, como se describe anteriormente) usando un dispositivo de agitacion (por ejemplo, un mezclador de vortice), mezclando asf la mezcla lfquida. En otro aspecto, una muestra lfquida puede mezclarse (i) proporcionando lfquido en un recipiente (por ejemplo, un recipiente con una seccion transversal esencialmente circular o poligonal, como se describe anteriormente), donde el lfquido comprende partfculas ngidas (por ejemplo, perlas), y (ii) agitando el lfquido en el recipiente con un dispositivo de agitacion (por ejemplo, un mezclador de vortice), mezclando asf la muestra lfquida. Los salientes esencialmente lineares y/o esquinas esencialmente angulares en las camaras interiores de los recipientes soportan la mezcla eficiente de una muestra lfquida.
En otros aspectos, las celulas en una muestra lfquida pueden lisarse proporcionando la muestra lfquida en un recipiente (por ejemplo, un recipiente con una seccion transversal esencialmente circular o poligonal, como se describe anteriormente), donde el lfquido incluye partfculas ngidas (por ejemplo, perlas) y celulas (por ejemplo, celulas de hongo), y agitando el lfquido en el recipiente con un dispositivo de agitacion (por ejemplo, un mezclador de vortice), en donde la agitacion es de una fuerza y duracion suficientes para lisar las celulas.
En cualquiera de los metodos para mezclar o lisar celulas, las partfculas ngidas (por ejemplo, perlas) pueden tener un diametro de entre aproximadamente 0,2 mm a 1 mm (por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 a 0,3 mm, entre aproximadamente 0,3 a 0,5 mm, entre aproximadamente 0,5 a 0,7 mm, entre aproximadamente 0,7 a 0,9 mm, o entre aproximadamente 0,9 a 1 mm). En algunas realizaciones, las partfculas ngidas tienen un diametro de 0,8 mm. Las partfculas ngidas pueden ser, por ejemplo, perlas de vidrio de 0,5 mm, perlas de sflice de 0,1 mm, perlas de sflice de 0,7 mm, o una mezcla de perlas de diferentes tamanos (por ejemplo, perlas, esquirlas, barras de vidrio y discos de vidrio). El dispositivo de agitacion (por ejemplo, mezclador de vortice) usado para facilitar la mezcla o lisado de celulas puede agitar, por ejemplo, en un movimiento linear, planetario, de orbita vertical o por pulsos.
Metodos para detectar la presencia de un acido nucleico objetivo en una muestra de sangre completa
La deteccion de un analito biologico (por ejemplo, un acido nucleico) en una muestra puede necesitar que el analito se extraiga primero de un organismo biologico en la muestra. Para organismos biologicos con paredes celulares particularmente filamentosas (por ejemplo, levadura, bacterias y algas), un metodo fuerte de ruptura celular (por ejemplo, ruptura con perlas) debe emplearse para extraer un analito objetivo intracelular. En algunos ejemplos, el analito biologico puede estar presente a una baja concentracion en la muestra debido a que la muestra tiene una baja concentracion del organismo biologico. Por ejemplo, si un sujeto se infecto recientemente con un organismo biologico, tal como el hongo Candida albicans, la concentracion del microorganismo en una muestra de sangre del sujeto puede ser baja. Por consiguiente, la capacidad para lisar de forma eficiente el organismo biologico y detectar el analito objetivo con alta sensibilidad es importante de forma cntica.
La presente invencion presenta un metodo para detectar la presencia de un acido nucleico objetivo (por ejemplo, un acido nucleico objetivo de un hongo, por ejemplo, un hongo del genero Candida) en una muestra de sangre completa, incluyendo el metodo: (i) proporcionar un extracto producido lisando los eritrocitos en una muestra de sangre completa de un sujeto (por ejemplo, un ser humano), centrifugar la muestra para formar un sobrenadante y un granulado, descartar algo o todo el sobrenadante, y suspender de nuevo el granulado (por ejemplo, el granulado que contiene las celulas de hongo); (ii) lisar las celulas en el extracto, incluyendo el lisado combinar el extracto con partfculas ngidas (por ejemplo, perlas o esquirlas como se describe anteriormente) para formar una mezcla en un recipiente (por ejemplo, un recipiente con una seccion transversal esencialmente circular o poligonal, como se describe anteriormente), y agitar la mezcla con un dispositivo de agitacion (por ejemplo, un mezclador de vortice) para formar un lisato; (iii) proporcionar el lisato de la etapa (ii) en un tubo de deteccion y amplificar los acidos nucleicos en el para formar una disolucion de lisato amplificado que incluye del 40% (p/p) al 95% (p/p) del acido nucleico objetivo (por ejemplo, de 40% a 60%, 60% a 80%, 80% a 90% o 90% a 95% (p/p) del acido nucleico objetivo) y del 5% (p/p) al 60% (p/p) de acido nucleico no objetivo (por ejemplo, de 5% a 20%, 20% a 35%, 35% a 40% o 40% a 60% (p/p) de acido nucleico objetivo); y (iv) detectar el acido nucleico objetivo amplificado.
La invencion tambien presenta un metodo para detectar la presencia de un acido nucleico objetivo (por ejemplo, un acido nucleico objetivo de un hongo, por ejemplo, un hongo de genero Candida) en una muestra de sangre completa, incluyendo el metodo: (i) proporcionar un extracto producido lisando los eritrocitos en una muestra de sangre completa de un sujeto (por ejemplo, un ser humano), centrifugar la muestra para formar un sobrenadante y un granulado, descartar algo o todo el sobrenadante, y suspender de nuevo el granulado (por ejemplo, el granulado que contiene las celulas de hongo) para formar un extracto; (ii) lisar celulas en el extracto, incluyendo el lisado combinar el extracto con partfculas ngidas (por ejemplo, las perlas, como se describe anteriormente) para formar una mezcla en un recipiente (por ejemplo, un recipiente con seccion transversal esencialmente circular o poligonal, como se describe anteriormente), y agitar la mezcla con un dispositivo de agitacion (por ejemplo, un mezclador de vortice) para formar
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un lisato; (iii) colocar el lisato de la etapa (ii) en un tubo de deteccion y amplificar los acidos nucleicos en el para formar una disolucion de lisato amplificado que comprende de 40% (p/p) a 95% (p/p) del acido nucleico objetivo (por ejemplo, de 40% a 60%, 60% a 80%, 80% a 9o% o 90% a 95% (p/p) de acido nucleico objetivo) y de 5% (p/p) a 60% (p/p) de acido nucleico no objetivo (por ejemplo, de 5% a 20%, 20% a 35%, 35% a 40% o 40% a 60% (p/p) de acido nucleico objetivo); (iv) despues de la etapa (iii), proporcionar de 1x106 a 1x1013 partfculas magneticas por mililitro (por ejemplo, de 1x106 a 1x108, 1x107 a 1x108, 1x107 a 1x109, 1x108 a 1x1010, 1x109 a 1x1011 o 1x1010 a 1x1013 partfculas magneticas por mililitro) de la disolucion de lisato amplificado, en donde las partfculas magneticas tienen un diametro medio de 700 nm a 1200 nm (por ejemplo, de 700 a 850, 800 a 950, 900 a 1050, o de 1000 a 1200 nm) y restos de union en su superficie, los restos de union operativos para alterar la agregacion de las partfculas magneticas en presencia del acido nucleico objetivo o un agente de union multivalente; (v) colocar el tubo de deteccion en un dispositivo, el dispositivo que incluye un soporte que define un pocillo para contener el tubo de deteccion que incluye las partfculas magneticas y el acido nucleico objetivo, y que tiene una bobina de RF dispuesta alrededor del pocillo, la bobina de RF configurada para detectar una senal producida exponiendo la muestra lfquida a un campo magnetico polarizado creado usando uno o mas imanes y una secuencia de pulsos de RF; (vi) exponer la muestra a un campo magnetico polarizado y una secuencia de pulsos de RF; (vii) despues de la etapa (vi), medir la senal del tubo de deteccion; y (viii) en base al resultado de la etapa (vii), detectar el acido nucleico objetivo, en donde la etapa (vii) se realiza sin ninguna purificacion previa de la disolucion de lisato amplificado. Se describen metodos y reactivos adicionales (por ejemplo, sondas espedficas para Candida) en la Solicitud de patente de EE.UU. num. 13/363.916.
Deteccion de una infeccion por hongos en un sujeto
Las composiciones descritas en esta memoria permiten metodos de monitorizacion y diagnosis de la enfermedad infecciosa en un sistema multiplexado, automatizado, sin preparacion de muestra. Dichos sistemas y metodos podnan usarse para monitorizar, por ejemplo, la infeccion por hongos, tal como candidemia. La diagnosis temprana de la candidemia es clmicamente importante ya que este tipo de infeccion, si de deja sin tratar, puede llevar a una variedad de diferentes smtomas (dependiendo del area del cuerpo afectada) que incluyen, aunque no estan limitados a, lesiones y ulceras de la boca, endas sangrantes, quemazon al orinar, irritacion vaginal, picor vaginal, diarrea, nauseas y vomitos. Las infecciones de Candida son patogenos cada vez mas importantes en la UCIN. Los factores de riesgo para el desarrollo de candidemia en neonatos incluyen edad gestacional menor de 32 semanas, valores de Apgar a 5 min de menos de 5, shock, coagulopatfa intravascular diseminada, uso previo de intralfpidos, administracion de nutricion parenteral, uso de CVC, administracion de bloqueante H2, intubado, o duracion de la estancia mayor de 7 dfas.
En general, una muestra de sangre completa puede tomarse de un sujeto sospechoso de candidemia, y la presencia de, por ejemplo, una region genomica Candida conservada que es objetivo puede detectarse mediante el uso de los metodos de la invencion descritos en detalle anteriormente.
Ejemplo
El siguiente ejemplo se proporciona con el proposito de ilustrar la invencion y no pretende limitar la invencion de ninguna forma.
Ejemplo 1. Lisis celular aumentada usando recipientes con salientes esencialmente lineares
La eficiencia de la lisis celular de hongos usando recipientes de 2,8 ml que incluyen tres salientes esencialmente lineares espaciados uniformemente (“aletas”) se comparo con la eficiencia alcanzada con recipientes de 2,8 ml estandar. Ocho aislados de celulas fungicas (a una concentracion de 3 celulas/mL) se ensayaron por duplicado en los dos tipos de recipientes. A cada uno de los recipientes, se anadieron perlas de zirconia de 0,7 mm y los recipientes se agitaron con un mezclador de vortice a 2800 rpm (+/- 400 rpm) durante 8 minutos para los recipientes que inclrnan los tres salientes o 2000 rpm (+/- 400 rpm) durante 5 minutos para los recipientes de 2,8 ml estandar. Despues del procedimiento de ruptura con perlas, una alfcuota de cada lisato se sometio entonces a amplificacion por PCR mediante la adicion del lisato a una mezcla maestra para PCR que inclrna nucleotidos; tampon ((NH4)SO4 5 mM, MgCh 3,5 mM, glicerol al 6%, Tricina 60 mM, pH = 8,7); cebadores espedficos para Candida (cebador directo en exceso de 4x para permitir la produccion de hebra sencilla asimetrica en el producto final); y polimerasa termoestable (HemoKlenTaq (New England Biolabs)). Las partfculas magneticas se conjugaron con los acidos nucleicos, cada una con secuencia complementaria a una parte del objetivo amplificado de manera que las partfculas magneticas agregadas en presencia del acido nucleico objetivo, se anadieron a la reaccion de amplificacion por PCR. El acido nucleico de Candida objetivo amplificado se detecto entonces midiendo los tiempos de relajacion T2 (mseg.). Si todas las demas variables en el ensayo de deteccion tienen contribuciones aproximadamente iguales, entonces la diferencia en la deteccion del acido nucleico objetivo puede correlacionarse directamente con la eficiencia de la lisis celular.
Como se representa en la Figura 11, los datos indican que la deteccion aumentada del acido nucleico objetivo se observa para celulas Candida lisadas en recipientes que tienen tres salientes en comparacion con la obtenida a partir de recipientes estandar sin salientes. Los datos mostraron que los tiempos de relajacion T2 que miden los niveles de acido nucleico objetivo del primer grupo fueron uniformemente mayores que las medidas de T2 obtenidas del ultimo grupo. Ambos grupos mostraron senales T2 significativamente mayores que las obtenidas de los cuatro experimentos
de control en cada grupo. En suma, los datos indican que los recipientes aumentan la eficiencia de la lisis celular (por ejemplo, en un ensayo de ruptura con perlas) respecto a los recipientes estandar conocidos en la tecnica.
Otras realizaciones
Diversas modificaciones y variaciones del metodo descrito de la invencion seran evidentes para los expertos en la 5 tecnica sin separarse del alcance de las reivindicaciones de la presente invencion. Aunque la invencion se ha descrito en conexion con realizaciones espedficas, debena entenderse que la invencion como se reivindica no estana excesivamente limitada a dichas realizaciones espedficas. Otras realizaciones estan en las reivindicaciones.
Claims (12)
- 5101520253035404550REIVINDICACIONES1. Un metodo para lisar celulas en una muestra Kquida, comprendiendo dicho metodo proporcionar Kquido en un recipiente que tiene un volumen de menos de 5 ml, el recipiente que comprende una camara interior con un eje central, una parte superior que comprende una abertura, y una seccion transversal esencialmente circular o esencialmente poligonal, en donde la superficie de dicha camara interior comprende uno o mas salientes esencialmente lineares esencialmente paralelos a dicho eje central, en donde dicho lfquido comprende partfculas ngidas y celulas; yAgitar dicho lfquido en dicho recipiente, en donde dicha agitacion es de una fuerza y duracion suficientes como para lisar dichas celulas.
- 2. Un metodo para detectar la presencia de un acido nucleico objetivo en una muestra de sangre completa, comprendiendo el metodo:(a) proporcionar un extracto producido lisando eritrocitos en una muestra de sangre completa de un sujeto, centrifugar la muestra para formar un sobrenadante y un granulado, descartar algo o todo el sobrenadante, y suspender de nuevo el granulado;(b) lisar celulas en dicho extracto, comprendiendo dicho lisado combinar el extracto con partfculas ngidas para formar una mezcla en un recipiente que tiene un volumen de menos de 5 ml, el recipiente que comprende una camara interior con un eje central, una parte superior que comprende una abertura, y una seccion transversal esencialmente circular o esencialmente poligonal, en donde la superficie de dicha camara interior comprende uno o mas salientes esencialmente lineares esencialmente paralelos a dicho eje central, y agitar la mezcla para formar un lisato;(c) proporcionar el lisato de la etapa (b) en un tubo de deteccion y amplificar los acidos nucleicos en el para formar una disolucion de lisato amplificado que comprende de 40% (p/p) a 95% (p/p) del acido nucleico objetivo y de 5% (p/p) a 60% (p/p) de acido nucleico no objetivo; y(d) detectar el acido nucleico objetivo amplificado.
- 3. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dichas partfculas ngidas tienen un diametro de entre 0,1 mm a 1 mm, preferiblemente 0,8 mm.
- 4. Un metodo para amplificar un acido nucleico objetivo en una muestra de sangre completa, comprendiendo el metodo:(a) proporcionar un extracto producido lisando eritrocitos en una muestra de sangre completa de un sujeto, centrifugar la muestra para formar un sobrenadante y un granulado, descartar algo o todo el sobrenadante, y suspender de nuevo el granulado;(b) lisar celulas en dicho extracto, comprendiendo dicho lisado combinar el extracto con partfculas ngidas para formar una mezcla en un recipiente que tiene un volumen de menos de 5 ml, el recipiente que comprende una camara interior con un eje central, una parte superior que comprende una abertura, y una seccion transversal esencialmente circular o esencialmente poligonal, en donde la superficie de dicha camara interior comprende uno o mas salientes esencialmente lineares esencialmente paralelos a dicho eje central, y agitar la mezcla para formar un lisato; y(c) proporcionar el lisato de la etapa (b) en un tubo de deteccion y amplificar los acidos nucleicos en el para formar un lisato amplificado que comprende del 40% (p/p) al 95% (p/p) del acido nucleico objetivo y del 5% (p/p) al 60% (p/p) del acido nucleico no objetivo.
- 5. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el recipiente tiene una seccion transversal esencialmente circular.
- 6. El metodo segun la reivindicacion 5, en donde los salientes esencialmente lineares estan espaciados uniformemente en la camara interior del recipiente.
- 7. El metodo segun la reivindicacion 5, en donde el recipiente tiene un radio y un eje central, en donde dichos salientes esencialmente lineares tienen una longitud paralela a dicho eje central, una profundidad esencialmente paralela al radio, y una anchura esencialmente perpendicular a dicho radio, y en donde la profundidad y/o anchura aumenta de la parte superior a la parte inferior de dichos salientes esencialmente lineares.
- 8. El metodo segun la reivindicacion 7, en donde la profundidad de dichos salientes esencialmente lineares es mayor del 10% del radio en algun punto a lo largo de la longitud de dichos salientes esencialmente lineares.
- 9. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el recipiente tiene una seccion transversal esencialmente poligonal.
- 10. El metodo segun la reivindicacion 9, en donde dicha seccion transversal esencialmente poligonal es esencialmente triangular, cuadrada, pentagonal, hexagonal, heptagonal, octogonal, nonagonal, decagonal o dodecagonal.
- 11. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el recipiente tiene (x) una seccion transversal esencialmente circular que tiene un radio o (y) una seccion transversal esencialmente poligonal que tiene un radio, en5 donde dicho radio es la distancia de dicho eje central a un punto en esquina, y dicho uno o mas salientes esencialmente lineares tienen una longitud paralela a dicho eje central, una profundidad esencialmente paralela al radio de dicha seccion transversal esencialmente circular o poligonal, y una anchura esencialmente perpendicular a dicho radio.
- 12. El metodo segun la reivindicacion 11, en donde dicha profundidad y/o anchura aumenta desde la parte superior a la parte inferior de dicho saliente esencialmente linear.10 13. El metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha camara interior comprende 2 a 6 salientesesencialmente lineares.
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