KR20230145319A - 콜라겐 xviii 바이오마커 검출용 검정 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유형 XVIII 콜라겐의 긴 및/또는 중간 이소형에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 면역검정의 방법 및 면역검정 키트를 제공한다. 발명은 또한 환자가 항섬유증 약물로의 치료에 반응할 가능성을 평가하고 환자에서 간 섬유증을 모니터링하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 유형 XVIII의 긴 및/또는 중간 이소형을 검출하고/하거나 환자 샘플에서 상기 이소형의 양을 정량하기 위한 면역검정에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 면역검정에 사용하기 위한 항체 및 상기 면역검정을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다. 면역검정, 항체 및 키트는 환자에서의 간 섬유증을 검출 또는 모니터링하거나 간 섬유증이 있는 환자에서 환자가 항섬유화 약물로의 치료에 반응할 가능성을 평가하는데 사용될 수 있다.
만성 간 질환(CLD)은 전 세계적으로 년간 2백만 명이 넘는 사망을 차지하는, 사망 및 이환율의 주요 원인이다. 이들 CLD 관련된 사망 중 대략적으로 1백만 건은 바이러스성 간염으로 인한 것이며, 그 중 C형 간염이 주요 원인이다1. CLD 병인 중 공통적인 것은 간 섬유화의 발생이며 궁극적인 평가변수는 간경화이다. 간 섬유증은 장기간의 상처 치유 반응의 결과이고 간의 세포외 기질(ECM) 조성이 건강한 자의 것과 질적 및 양적으로 다르게 되는 ECM의 축적을 특징으로 한다. 최근 보고서는 섬유성 간의 ECM 조성이 환자 생존의 핵심 결정인자이며, 이는 조직 프로파일링 환자의 값을 시사한다. 섬유성 병변은 주로 콜라겐으로 구성되며 이것은 크게 두 그룹; 간질 매트릭스 및 기저막으로 나눌 수 있다. 기저막은 세포의 기능을 조절하고 성장 인자의 저장소이다. 기저막 매트릭스의 축적은 회복 조직 반응과 연관되어 있다. 반대로, 간질 매트릭스의 축적은 더 심각하고 진행성인 질환과 연관되어 있다.
멀티플렉신 유형 XVIII 콜라겐은 콜라겐 계열 중에서 독특하다. 유형 XVIII 콜라겐은 기저막에 위치한 헤파란 황산염 프로테오글리칸으로, 여기서 그것은 라미닌, 펄레칸, 니도겐, 피불린, 유형 IV 및 VI 콜라겐과 상호작용하여 매트릭스 환경의 유연성에 필수적인 역할을 한다2,3. 3가지 이소형이 그 각각의 분포에 차이를 가지고 존재하며; 짧은 이소형은 주로 맥관구조와 골격근에서 발견되는 반면, 중간 및 긴 이소형은 대부분 그것이 간세포에 의해 생성되는 간에서 발견된다4,5. 3가지 이소형 모두는 항혈관신생 및 종양 성장 억제 특성을 갖는 것으로 알려진 삼중-나선 영역 및 C-말단 단편 엔도스타틴에 세포 부착 부위를 수반한다6. 그럼에도 불구하고 3가지 이소형은 그 기본 구조에서 상이하며 가장 유의한 차이점은 프리즐드 도메인이다. 긴 이소형 상의 N-말단 종단에 위치한 프리즐드(Fz) 도메인은 세포 운명, 증식 및 이동을 조절하는 능력을 가진 Wnt 분자에 대한 결합 부위로 역할을 하는 막관통 수용체이다. Fz 도메인은 시험관내 및 생체내 연구 둘 모두에서 인간 암-세포 증식 및 세포-주기 진행을 조절하는 것으로 나타났다7,8. 부가하여, Fz는 마우스에서 지방세포 성숙과 풍부도를 결정하는 것으로 밝혀졌다9. 따라서 유형 XVIII 콜라겐의 긴 이소형은 잠재적으로 간 병리 및 간세포 기능에 영향을 미치는 광범위한 기능을 수행한다.
간 섬유증의 중증도는 전형적으로 간 생검 또는 순간 탄성측정법의 사용을 통하여 평가된다. 그러나, 간 생검은 높은 경제 및 노동 비용과 연관된 본질적으로 결함이 있는 양식이고; 매력적인 비-침습적 대안이기는 하지만 순간 탄성측정법은 널리 이용 가능하지 않고 간 섬유증의 역학에 관한 정보를 제공하지 않는다.
결론적으로, 환자에서 간 섬유증의 존재 및/또는 중증도를 평가하는 신규한 방법이 당업계에 필요하다. 특히, 질환이 진행될 가능성이 있거나 항-섬유화 요법에 반응할 가능성이 있는 개체를 식별하기 위해 임상적으로 사용될 수 있는 혈청학적 바이오마커는 매우 유용할 것이다.
요약
출원인은 현재 유형 XVIII 콜라겐의 간 특이적 이소형, 긴 및 중간 이소형을 정확하게 정량화할 수 있는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 바이오마커를 개발했으며 경증에서 중증 간 섬유증이 있는 환자에서 그 임상적 가치를 평가했다.
따라서, 제1 양태에서 본 발명은 (i) 환자로부터의 생체액 샘플을 유형 XVIII의 긴 및/또는 중간 이소형에 특이적으로 결합하고 유형 XVIII의 짧은 이소형에는 특이적으로 결합하지 않는 단일클론 항체와 접촉시키는 것; 및 (ii) 상기 샘플에서 상기 단일클론 항체와 펩티드 사이의 결합하는 양을 검출하고 측정하는 것을 포함하는 면역검정의 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "결합의 양"은 환자 샘플에서 단일클론 항체와 펩티드 사이의 결합의 정량화를 지칭한다. 상기 정량화는 예를 들어 항체가 특이적으로 결합하는 펩티드의 알려진 농도를 함유하는 표준 샘플에서 결합의 측정된 값을 사용하여 생성된 캘리브레이션 곡선에 대해 환자 샘플에서 결합의 측정된 값을 비교함에 의해 결정될 수 있고, 이에 의해 항체가 환자 샘플에서 특이적으로 결합하는 펩티드의 양을 결정할 수 있다. 하기 제시된 실시예에서, 분광광도계 분석이 환자 샘플에서 그리고 캘리브레이션 곡선을 생성할 때 둘 모두에서 결합의 양을 측정하기 위해 사용되는 ELISA 방법이 사용된다. 그러나, 임의의 적합한 분석 방법이 사용될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 환자 샘플은 간 섬유증이 있는 환자로부터 유래하고 방법은 환자가 항섬유화 약물로의 치료에 반응할 가능성을 평가하기 위한 것이다. 방법은 추가로: (iii) 단계 (ii)에서 측정된 상기 단일클론 항체의 결합의 양을 치료에 대한 반응자와 연관된 값 및/또는 비-반응자와 연관된 값 및/또는 미리 결정된 는컷-오프 값과의 상관성을 보는 것을 포함할 수 있다. 환자 샘플은 만성 간 질환이 있는 환자로부터의 것일 수 있다. 환자 샘플은, 예를 들어, 바이러스성 간염, 알코올성 간 질환 또는 비-알코올성 지방간 질환이 있는 환자로부터의 것일 수 있다.
이 맥락에서, 용어 "치료에 대한 반응자와 연관된 값"은 항섬유화 약물로의 치료에 후속적으로 반응한 것으로 알려진 환자, 예를 들어 항섬유화 약물로의 치료에 이어 간 섬유증이 감소한(예를 들어, 치료의 과정에 걸쳐 하나 이상의 Ishak 점수에서 감소에 의해 결정된) 환자로부터의 샘플에 대해 상기 기재된 방법에 의해 결정된 결합의 표준화된 양을 의미하고; 용어 "비-반응자와 연관된 값"은 항섬유화 약물로의 치료에 후속적으로 반응하지 않는 것으로 알려진 환자, 예를 들어, 항섬유화 약물로의 치료에 이어 간 섬유화에서 증가가 있는 환자부터의 샘플에 대해 상기 기재된 방법에 의해 결정된 결합의 표준화된 양을 의미한다.
또한 본 맥락에서, 용어 "미리 결정된 컷-오프 값"은 항섬유화 약물로의 치료에 반응할 가능성이 낮은 환자와 항섬유화 약물로의 치료에 반응할 가능성이 높은 환자 간을 구별하기 위해 통계적으로 결정되는 결합의 양을 의미한다. 예를 들어, 미리 결정된 컷-오프 값은 이후에 항섬유화 약물 또는 위약으로 치료받은 간 섬유증 환자로부터의 샘플에서 결합에 대한 수준의 이전 분석으로부터 계산될 수 있으며, 여기서 컷-오프 값 아래의 결합의 양을 갖는 환자에서 간 섬유증이 감소한 환자의 수 또는 간 섬유증이 증가한 환자의 수의 관점에서 위약과 항섬유화 약물 치료군 간에 통계적으로 유의한 차이가 없었고/없었거나 컷-오프 값을 넘는 값을 갖는 환자에서 간 섬유증이 감소한 환자의 수 및/또는 간 섬유증이 증가한 환자의 수의 관점에서 위약과 항섬유화 약물 치료군 간에 통계적으로 유의한 차이가 있었다.
또 다른 실시형태에서, 방법은 환자에서 간 섬유증을 모니터링하기 위한 것으로, 상기 방법은: (iii) 단계 (ii)에서 측정된 상기 단일클론 항체의 상기 결합의 양을 이전 시점에서 상기 환자로부터 얻은 값과의 상관성을 보는 것을 추가로 포함한다. 환자는 만성 간질환이 있는 환자일 수 있다. 예를 들어, 환자는 바이러스성 간염, 알코올성 간질환 또는 비-알코올성 지방간 질환이 있는 환자일 수 있다.
따라서, 이 실시형태에서 방법은 제1 시점 및 적어도 하나의 후속 시점에서 환자로부터 얻은 적어도 2개의 샘플에서 단일클론 항체와 펩티드 사이의 결합의 양을 정량화하는 것을 포함할 수 있다.
환자는 항섬유화 약물로 치료를 받고 있는 환자일 수 있다. 이 경우에, 방법은 추가로 간 섬유증을 치료하기 위한 약물의 효능을 평가하기 위한 것일 수 있으며, 이에 의해 방법은 환자에게 약물의 투여의 기간 동안 제1 시점 및 적어도 하나의 후속 시점에서 환자로부터 얻은 적어도 2개의 샘플에서 단일클론 항체와 펩티드 사이의 결합의 양을 정량하는 것을 포함한다.
다른 실시형태에서, 방법은 환자에서 간 섬유증을 검출하기 위한 것이다. 방법은 추가로: (iii) 단계 (ii)에서 측정된 상기 단일클론 항체의 상기 결합의 양을 정상적인 건강한 대상체와 관련된 값 및/또는 알려진 질환 중증도와 관련된 값 및/또는 미리 결정된 컷오프 값과의 상관성을 보는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 방법은 환자에서 만성 간 질환을 검출하기 위한 것일 수 있다.
이 맥락에서, 용어 "정상적인 건강한 대상체와 연관된 값"은 건강한 것으로, 즉 질환이 없는 (그리고 보다 구체적으로는 간 섬유증이 없는) 것으로 간주되는 대상체로부터의 샘플에 대해 상기 기재된 방법에 의해 결정된 결합의 표준화된 양을 의미하고; 용어 "알려진 질환 중증도와 연관된 값"은 알려진 중증도의 간 섬유증을 갖는 것으로 알려진 환자로부터의 샘플에 대해 상기 기재된 방법에 의해 측정된 결합의 표준화된 양을 의미한다.
또한 이 맥락에서 용어 "미리 결정된 컷-오프 값"은 통계적 컷-오프 값이거나 그 초과인 환자 샘플에서 결합의 측정된 값이 간 섬유증의 존재 또는 가능성의 적어도 70% 확률, 바람직하게는 적어도 80% 확률, 바람직하게는 적어도 85% 확률, 더 바람직하게는 적어도 90% 확률, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 95% 확률에 해당하는 환자에서 간 섬유증의 높은 가능성을 나타내는 것으로 통계적으로 측정되는 결합의 양을 의미한다.
바람직한 실시형태에서, 샘플은 생체액이다. 생체액은 혈액, 혈청, 혈장, 소변 또는 세포 또는 조직 배양액으로부터의 상등액일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 생체액은 혈액, 혈청 또는 혈장이다.
면역검정은 경쟁 검정 또는 샌드위치 검정일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 면역검정은 예를 들어 방사면역검정 또는 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)일 수 있다. 이러한 검정은 당업자에게 공지된 기술이다.
바람직한 실시형태에서, 단일클론 항체는 아미노산 서열 NLLNLN(서열번호 1)에 특이적으로 결합한다. 상기 아미노산 서열은 유형 XVIII의 긴 및 중간 이소형의 N-말단에 존재하고 (그리고 유형 XVIII의 짧은 이소형에는 부재하고), 따라서 상기 단일클론 항체는 유형 XVIII의 긴 및 중간 이소형의 N-말단에 특이적으로 결합한다.
특정 실시형태에서, 단일클론 항체는 아미노산 서열 NLLNLNKDKE(서열번호 2)를 갖는 합성 펩티드에 맞서 생성된 단일클론 항체이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "단일클론 항체"는 전체 항체 및 전체 항체의 결합 특이성을 보유하는 이의 단편 둘 모두, 예컨대 예를 들어 Fab 단편, F(ab')2 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 또는 당업자에게 공지된 다른 이러한 단편을 지칭한다. 잘 알려진 바와 같이, 전체 항체는 전형적으로 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍의 "Y-형상" 구조를 가지며, 각 쌍은 하나의 "경쇄" 및 하나의 "중쇄"로 구성된다. 각각의 경쇄 및 중쇄의 N-말단 영역은 가변 영역을 함유하는 반면, 중쇄 및 경쇄 각각의 C-말단 부분은 불변 영역을 구성한다. 가변 영역은 주로 항원 인식을 담당하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 불변 영역은 항체가 면역 체계의 세포와 분자를 모집할 수 있도록 한다. 결합 특이성을 보유하는 항체 단편은 적어도 CDR 및 상기 결합 특이성을 보유하기 위한 가변 영역의 나머지의 충분한 부분을 포함한다.
본 발명의 방법에서, 당업계에 공지된 임의의 불변 영역을 포함하는 단일클론 항체가 사용될 수 있다. 인간 불변 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 불변 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되고 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. IgG 이소형은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하지만 이에 제한되지 않는 여러 서브클래스를 갖는다. 단일클론 항체는 바람직하게는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 임의의 하나를 포함하는 IgG 이소형일 수 있다.
항체의 CDR은 Kabat 등에 의해 기술된 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체는 실시예에 기재된 바와 같이 B 세포 클론으로부터 생성될 수 있다. 항체의 이소형은 인간 IgM, IgG 또는 IgA 이소형, 또는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스에 특이적인 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 생성된 항체의 아미노산 서열은 표준 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, RNA는 세포에서 단리되고 역전사에 의해 cDNA를 생성하는데 사용될 수 있다. 그런 다음 cDNA는 항체의 중쇄 및 경쇄를 증폭하는 프라이머를 사용하여 PCR에 적용된다. 예를 들어 모든 VH(가변 중쇄) 서열에 대한 리더 서열에 특이적인 프라이머는 이전에 결정된 이소형의 불변 영역에 위치된 서열에 결합하는 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 경쇄는 V 카파 또는 V 람다 리더 서열에 어닐링하는 프라이머와 함께 카파 또는 람다 사슬의 3' 말단에 결합하는 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다. 전체 길이 중쇄 및 경쇄가 생성되고 시퀀싱될 수 있다.
단일클론 항체 또는 이의 단편은 바람직하게는 다음으로부터 선택된 하나 이상의 상보성-결정 영역(CDR)을 포함할 수 있다:
CDR-H1: DYWIH(서열번호 3)
CDR-H2: EINPSDGRSNYNEKFKT(서열번호 4)
CDR-H3: DLGFAD(서열번호 5)
CDR-L1: RSSQSIVYSNGNTYLQ(서열번호 6)
CDR-L2: KVSNRFS(서열번호 7)
CDR-L3: FQGSHVPFT(서열번호 8)
바람직하게는 항체 또는 이의 단편은 상기 열거된 CDR 서열 중 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함한다.
바람직하게는 단일클론 항체 또는 이의 단편은 다음 CDR 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는다
CDR-L1: RSSQSIVYSNGNTYLQ(서열번호 6)
CDR-L2: KVSNRFS(서열번호 7) 및
CDR-L3: FQGSHVPFT(서열번호 8)
바람직하게는 단일클론 항체 또는 이의 단편은 CDR 사이에 프레임워크 서열을 포함하는 경쇄를 가지며, 여기서 상기 프레임워크 서열은 하기 경쇄 서열에서 CDR 사이의 프레임워크 서열과 실질적으로 동일하거나 실질적으로 유사하다(여기서 CDR은 굵고 밑줄쳐져 도시되고, 프레임워크 서열은 이탤릭체로 도시됨)
RSSQSIVYSNGNTYLQ WYLQKPGQSPQLLIY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQGSHVPFT (서열번호 9)
바람직하게는 단일클론 항체 또는 이의 단편은 다음 CDR 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는다
CDR-H1: DYWIH(서열번호 3)
CDR-H2: EINPSDGRSNYNEKFKT(서열번호 4) 및
CDR-H3: DLGFAD(서열번호 5)
바람직하게는 단일클론 항체 또는 이의 단편은 CDR 사이에 프레임워크 서열을 포함하는 중쇄를 가지며, 여기서 상기 프레임워크 서열은 하기 중쇄 서열에서 CDR 사이의 프레임워크 서열과 실질적으로 동일하거나 실질적으로 유사하다(여기서 CDR은 굵고 밑줄쳐져 도시되고, 프레임워크 서열은 이탤릭체로 도시됨)
DYWIH WVKQRPGQGLEWIG EINPSDGRSNYNEKFKT KATLTVDRSSSTAYMHLSSLTSEDSAVFYCAR DLGFAD (서열번호 10)
본 명세서에 사용된 바와 같이, 항체의 CDR 사이의 프레임워크 아미노산 서열은 다른 항체의 CDR 사이의 프레임워크 아미노산 서열이 적어도 70%, 80%, 90% 또는 적어도 95% 유사성 또는 동일성을 갖는 경우 그것에 실질적으로 동일하거나 실질적으로 유사하다. 유사하거나 동일한 아미노산은 연속적이거나 비-연속적일 수 있다.
프레임워크 서열은 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 함유할 수 있다. 아미노산 치환은 보존적일 수 있는데, 이는 치환된 아미노산이 원래 아미노산에 유사한 화학적 특성을 갖는다는 것을 의미한다. 당업자는 어떤 아미노산이 유사한 화학적 특성을 공유하는지 이해할 것이다. 예를 들어, 다음 아미노산 그룹은 크기, 전하 및 극성과 같은 유사한 화학적 특성을 공유한다: 그룹 1 Ala, Ser, Thr, Pro, Gly; 그룹 2 Asp, Asn, Glu, Gln; 그룹 3 His, Arg, Lys; 그룹 4 Met, Leu, Ile, Val, Cys; 그룹 5 Phe Thy Trp.
CLUSTAL 프로그램과 같은 프로그램을 사용하여 아미노산 서열을 비교할 수 있다. 이 프로그램은 아미노산 서열을 비교하고 적절하기로는 어느 서열에 공백을 삽입함에 의해 최적의 정렬을 찾는다. 최적 정렬을 위해 아미노산 동일성 또는 유사성(아미노산 유형의 동일성 플러스 보존)을 계산하는 것이 가능하다. BLASTx와 같은 프로그램은 유사한 서열의 가장 긴 스트레치를 정렬하고 맞춤을 위해 값을 할당한다. 따라서 각각 서로 다른 점수를 갖는 유사성의 여러 영역이 발견되는 비교를 얻는 것이 가능하다. 두 유형의 분석이 본 발명에서 고려된다. 동일성 또는 유사성은 바람직하게는 프레임워크 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산된다.
특정 바람직한 실시형태에서, 단일클론 항체 또는 이의 단편은 경쇄 가변 영역 서열:
DILMTQTPLSLPVGLGDQASISC RSSQSIVYSNGNTYLQ WYLQKPGQSPQLLIY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQGSHVPFT FGSGTKLEIK (서열번호 11)
및/또는 중쇄 가변 영역 서열을 포함할 수 있다:
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFI DYWIH WVKQRPGQGLEWIG EINPSDGRSNYNEKFKT KATLTVDRSSSTAYMHLSSLTSEDSAVFYCAR DLGFAD WGPGTTVTVSS (서열번호 12)
(굵게 밑줄쳐진 CDR; 이태릭체로 된 프레임워크 서열)
제2 양태에서, 본 발명은 유형 XVIII의 긴 및/또는 중간 이소형에 특이적으로 결합하고 유형 XVIII의 짧은 이소형에는 특이적으로 결합하지 않는 단일클론 항체를 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 단일클론 항체는 아미노산 서열 NLLNLN(서열번호 1)에 특이적으로 결합한다.
단일클론 항체는 아미노산 서열 NLLNLNKDKE(서열번호 2)를 갖는 합성 펩티드에 맞서 생성된 단일클론 항체일 수 있다.
제2 양태에 따른 단일클론 항체의 추가의 바람직한 실시형태 및 특징은 제1 양태에 따른 방법에 사용하기 위한 바람직한 단일클론 항체의 상기 논의로부터 명백할 것이다. 특히, 제2 양태에 따른 단일클론 항체는 바람직하게는 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 상보성-결정 영역(CDR), 프레임워크 서열 및/또는 가변 영역 서열을 포함할 수 있다.
제3 양태에서, 본 발명은 (a) 유형 XVIII의 긴 및/또는 중간 이소형에 특이적으로 결합하고 유형 XVIII의 짧은 이소형에는 특이적으로 결합하지 않는 단일클론 항체; 및 (b) 다음 중 적어도 하나를 포함하는 면역검정 키트를 제공한다:
- 스트렙타비딘 코팅된 웰 플레이트;
- 단일클론 항체가 특이적으로 결합하는 비오티닐화된 펩티드;
- 샌드위치 면역검정에 사용하기 위한 2차 항체;
- 단일클론 항체가 특이적으로 결합하는 캘리브레이터 펩티드;
- 항체 비오티닐화 키트;
- 항체 HRP 표지 키트;
- 항체 방사성표지 키트; 및
- 검정 시각화 키트.
바람직한 실시형태에서, 단일클론 항체는 아미노산 서열 NLLNLN(서열번호 1)에 특이적으로 결합한다. 단일클론 항체는 아미노산 서열 NLLNLNKDKE(서열번호 2)를 갖는 합성 펩티드에 맞서 생성될 수 있다. 특히, 단일클론 항체는 바람직하게는 상술한 바와 같이 본 발명의 제2 양태에 따른 단일클론 항체이다.
특정 실시형태에서 캘리브레이터 단백질은 아미노산 서열 NLLNLNKDKE(서열번호 2)를 포함하는 펩티드일 수 있다.
특정 실시형태에서 비오티닐화된 펩티드는 NLLNLNKDKE-L-비오틴(서열번호 13)을 포함할 수 있으며, 여기서 L은 선택적 링커이다.
도 1: PRO-C18L 검정의 특이성 테스트. PRO-C18L 항체의 반응성은 PRO-C18L 펩티드(표준 펩티드) 및 PRO-C18L N-말단 서열로부터 하나의 아미노산이 변경된 선택해제 펩티드에 대해 테스트되었다. 데이터는 y-축 상에 광학 밀도(OD)가 있고 x-축 상에 펩티드 함량(ng/ml)이 있는 억제 곡선으로 도시된다.
도 2: 모든 환자에서(A) 및 기준선에서 PRO-C18L의 중앙값 미만 또는 초과로 분리된 모든 환자에서 기준선(BL)으로부터 52주차(W52)까지 위약(PL) 또는 파글리타자 치료된(T) 환자에서의 PRO-C18L에서 백분율 변화. 그래프는 튜키 수염이 있는 박스 플롯으로 도시된다. p<0.05의 유의성은 *(A) 또는 정확한 값(B)으로 표시된다.
도 3: 기준선 PRO-C18L의 삼분위수 및 위약(PL) 또는 파글리타자(T)로 치료되었는지 여부에 따라 분할된 환자 그룹에서 회귀자, 안정 또는 진행자의 비율. 환자는 52주차에서 Ishak 스코어링에서 각각 하나 이상의 감소 또는 증가를 기준으로 회귀자, 안정 또는 진행자로 특성화되었다. 유의한 p-값은 정확한 값으로 표시된다. PRO-C18L 삼분위수 1(T1)에서 PL 그룹은 16% 회귀자, 58% 안정 및 26% 진행자를 가진 반면 T 그룹은 13% 회귀자, 25% 안정 및 7% 진행자를 가졌다. PRO-C18L 삼분위수 3(T3)에서 PL 그룹은 7% 회귀자, 60% 안정 및 33% 진행자를 가진 반면 T 그룹은 22% 회귀자, 59% 안정 및 19% 진행자를 가졌다.
도 4: 높은 PRO-C18L(중앙값 2.56ng/ml 초과)과 높은 PRO-C3의 상관 계수
도 2: 모든 환자에서(A) 및 기준선에서 PRO-C18L의 중앙값 미만 또는 초과로 분리된 모든 환자에서 기준선(BL)으로부터 52주차(W52)까지 위약(PL) 또는 파글리타자 치료된(T) 환자에서의 PRO-C18L에서 백분율 변화. 그래프는 튜키 수염이 있는 박스 플롯으로 도시된다. p<0.05의 유의성은 *(A) 또는 정확한 값(B)으로 표시된다.
도 3: 기준선 PRO-C18L의 삼분위수 및 위약(PL) 또는 파글리타자(T)로 치료되었는지 여부에 따라 분할된 환자 그룹에서 회귀자, 안정 또는 진행자의 비율. 환자는 52주차에서 Ishak 스코어링에서 각각 하나 이상의 감소 또는 증가를 기준으로 회귀자, 안정 또는 진행자로 특성화되었다. 유의한 p-값은 정확한 값으로 표시된다. PRO-C18L 삼분위수 1(T1)에서 PL 그룹은 16% 회귀자, 58% 안정 및 26% 진행자를 가진 반면 T 그룹은 13% 회귀자, 25% 안정 및 7% 진행자를 가졌다. PRO-C18L 삼분위수 3(T3)에서 PL 그룹은 7% 회귀자, 60% 안정 및 33% 진행자를 가진 반면 T 그룹은 22% 회귀자, 59% 안정 및 19% 진행자를 가졌다.
도 4: 높은 PRO-C18L(중앙값 2.56ng/ml 초과)과 높은 PRO-C3의 상관 계수
실시예
현재 개시된 실시형태는 개시내용의 이해를 돕기 위해 제시된 다음 실시예에 기재되어 있고, 이후에 이어지는 청구범위에서 정의된 바와 같이 개시내용의 범주를 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 다음의 실시예는 기술된 실시형태를 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시되고, 본 개시내용의 범주를 제한하려는 의도가 아니고, 아래 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내는 것도 아니다. 사용된 숫자(예를 들어 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 실험 오류 및 편차를 고려해야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압에 가깝다.
다음 실시예에서, 다음 재료 및 방법을 이용하였다.
재료 및 방법
시약
실험에 사용된 모든 시약은 Merck(미국 뉴저지주 화이트하우스 스테이션 소재)와 Sigma Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 고품질 화학물질과 GenScript(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)로부터 구입한 모든 합성 펩티드였다. 항체 생산 및 검증을 위한 펩티드를 정의하는 서열은 다음과 같다:
1. 항체 생산에 사용된 표준 펩티드, NLLNLNKDKE(서열번호 2). 이 펩티드는 유형 XVIII 콜라겐의 긴 및 중간 이소형의 10개 아미노산 N-말단 서열과 비교하여 그 마지막 4개 아미노산에서 상이하다. 유형 XVIII 콜라겐의 긴 및 중간 이소형의 10개 아미노산 N-말단 아미노산 서열(23개 아미노산 신호 펩티드의 절단 후 형성됨)은 24NLLNLNWLWF33(서열번호 14)이다. 이 N-말단 서열은 랫트, 마우스 및 소에 대한 서열 상동성에 대해 시험했을 때 인간 유형 XVIII 콜라겐에 대해 고유한 것으로 밝혀졌지만, 또한 불용성이고 따라서 항체 생산에 부적합한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 가용성인 서열 NLLNLNKDKE(서열번호 2)가 대신 항체 생산에 사용되었고, 유형 XVIII 콜라겐의 긴 및 중간 이소형 (그리고 따라서 N 말단 서열 NLLNLN(서열번호 1))에 대한 생산된 항체의 특이적 결합이 후속 시험으로 확인되었다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "PRO-C18L"은 표준 펩티드 및 유형 XVIII 콜라겐의 긴 및 중간 이소형 둘 모두에 존재하고 본 명세서에 기술된 항체가 특이적으로 결합하는, 표준 펩티드/서열인 NLLNLNKDKE(서열번호 2) 및 N-말단 에피토프/서열인 NLLNLN(서열번호 1) 둘 모두를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
2. 코팅 및 스크리닝을 위한, 비오틴 접합된 펩티드인 NLLNLNKDKE-K-비오틴(서열번호 15)
3. 면역 반응을 위한 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 접합된 면역원성 펩티드인 NLLNLNKDKEKK-GGC-KLH(서열번호 16).
단일클론 항체 생산
6 내지 7주령의 Balb/C 마우스를 Stimune 면역원성 보조제(SPECOL, 카탈로그 번호 7925000, Invitrogen)와 혼합된 PRO-C18L 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)-접합된 항원성 펩티드(NLLNLNKDKEKK-GGC-KLH(서열번호 16), 면역원성 펩티드)로 이루어진 100μg 유화된 면역원으로 피하로 면역화시켰다. 혈청 역가가 안정될 때까지 2주마다 면역화를 반복하였다. 혈청 역가가 가장 높고 펩티드 억제가 가장 좋은 마우스를 융합을 위해 선택했다. 따라서, 적어도 3주 휴식 후, 선택된 마우스에 100μl 0.9% NaCl 용액과 혼합된 50-100μg 유화된 면역원(항체 역가에 따라 다름)의 최종 부스트를 복강내로 제공하였다. 최종 부스트 3일 후, 마우스를 희생시키고 비장 세포를 단리하고 추가 배양을 위한 하이브리도마를 생성하기 위해 SP2/0 골수종 세포와 융합시켰으며, 이 절차는 이전에 기술되었다10. 하이브리도마는 단일클론성을 보장하기 위해 세미-배지 방법을 사용하고 제한된 희석을 이용하여 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 도말되었다. 부가하여, 서브클로닝은 단일클론성을 추가로 보장하기 위해 최소 2회 반복되었다. 상등액은 스트렙타비딘-코팅된 플레이트를 사용한 직접 경쟁 ELISA에서 표준 펩티드, 넌센스 펩티드(LHDSNPYPRR(서열번호 17)) 및 선택해제 펩티드(NALNLNWLWF(서열번호 18))에 대한 반응성 및 특이성에 대해 스크리닝되어 표준 펩티드에 대한 결합 및 넌센스 펩티드와 선택해제 펩티드에 대한 결합의 결여를 확인하였다. IgG 이소형을 확인하기 위해 클론은 Clonotyping System-HRP 키트, 카탈로그 번호 5300-05(Southern Biotech, 미국 앨라배마주 버밍햄 소재)에서 추가로 테스트되었다.
생성된 항체는 시퀀싱되고 CDR을 결정하였다.
사슬의 서열은 다음과 같다:
밑줄쳐지고 굵게 표시된 CDR
이탤릭체의 불변 영역:
중쇄: 아미노산 서열(514 aa)
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFI DYWIH WVKQRPGQGLEWIG EINPSDGRSNYNEKFKT KATLTVDRSSSTAYMHLSSLTSEDSAVFYCAR DLGFAD WGPGTTVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGLDLDDVCAEAQDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSASVTLFKVKWIFSSVVELKQTISPDYRNMIGQGA (서열번호 19)
경쇄: 아미노산 서열(219 aa)
DILMTQTPLSLPVGLGDQASISC RSSQSIVYSNGNTYLQ WYLQKPGQSPQLLIY KVSNRFS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC FQGSHVPFT FGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (서열번호 20)
클론의 특성화
선택된 클론을 HiTrap 친화성 컬럼(GE Healthcare Life Science, 영국 버킹엄셔 리틀 샤를폰트 소재)을 사용하여 정제하고 제조업체 지침에 따라 Roche Peroxidase 표지화 키트 카탈로그 번호 11829696001(Roche Diagnostics GmbH, 독일 만하임 소재)을 사용하여 양고추냉이 과산화효소(HRP)로 표지하였다. 클론의 고유 반응성 및 친화성은 EDTA, 헤파린 또는 시트레이트를 갖는 혈청 또는 혈장과 같은 다양한 인간 생물학적 물질을 사용하여 평가되었다.
PRO-C18L 경쟁적 ELISA 절차
혈청 또는 혈장 샘플에서 PRO-C18L의 혈청학적 수준을 측정하기 위해, 다음 절차가 사용된다:
1. Roche Diagnostics GmbH(독일 만하임 소재)로부터 96-웰 스트렙타비딘-코팅된 마이크로타이터 플레이트 카탈로그 번호 11940279를 10% 소르비톨을 갖는 50mM PBS-BTB에 용해되고 검정 완충액(50mM PBS-BTB, 8g NaCl, pH 7.4)에 희석된 100μl 비오티닐화된 펩티드(비오틴 접합된 펩티드)로 코팅한다. 30분 동안 300rpm의 진탕 장치에서 20℃ 어둠에서 인큐베이션한다.
2. 세정 완충액(20 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7.2)에서 5회 세정한다.
3. 20μl의 표준 펩티드, 대조군 또는 샘플을 적절한 웰에 중복하여 첨가하고 이어서 검정 완충액(50mM PBS-BTB, 8g NaCl, pH 7.4)에 희석된 100μl HRP-표지된 항체를 첨가한다. 4℃에서 밤새 인큐베이션하고 300rpm으로 진탕한다.
4. 세정 완충액 (20 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7.2)에서 5회 세정한다.
5. 100μl 테트라메틸벤지니딘(TMB)(카탈로그 번호 4380H, Kem-En-Tec, 덴마크 타스트럽 소재)을 첨가하고 20℃에서 15분 동안 인큐베이션한다.
6. 마지막으로, 정지 용액(1% H2SO4)을 추가한다.
7. 650 nm를 기준으로 하여 450 nm에서 흡광도를 판독한다. 이는 ELISA 마이크로플레이트 판독기(VerseMax, Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일 소재)에서 수행된다.
표준 곡선은 표준 펩티드의 2-배 희석에 의해 만들어진다.
기술적 검증
측정의 선형성을 결정하기 위해, 100% 샘플의 회수 백분율은 인간으로부터의 혈청 및 혈장 샘플의 2-배 희석에서 결정되었다. 마찬가지로, 항체 특이성은 100% 캘리브레이터 펩티드(표준 펩티드, NLLNLNKDKE(서열번호 2)), 넌센스 펩티드(LHDSNPYPRR(서열번호 17)) 및 선택해제 펩티드(NALNLNWLWF(서열번호 18))의 회수 백분율로 계산되었다. 검출의 하한(LLOD)은 21 블랭크(완충액)의 평균 +3x 표준 편차(SD)로 결정되었다. 검출의 상한(ULOD)은 표준 A의 10회 측정의 평균 -3x SD로 결정되었다. 검정-내 및 검정-간 변동을 평가하기 위해, 8개 품질 관리(QC) 샘플의 10회 독립적 실행이 이중 결정으로 측정되었고 평균 분산 계수(CV%)로 계산되었다. 측정의 정확도는 표준 펩티드로 스파이킹된 건강한 인간 혈청 샘플을 측정함에 의해 평가되고 이론적으로 수집된 분석물의 양의 회수 백분율로 계산되었다. 간섭은 유의한 농도에서 헤모글로빈, 지질혈증 및 비오틴으로 스파이킹된 인간 혈청 샘플의 회수 백분율로 측정되었다. 선형성, 정확도 및 간섭에 대한 허용가능한 범위는 ±20%였다.
분석물질 및 시약 안정성
3개의 혈청 및 혈장 인간 샘플을 5번의 동결-해동 주기에 적용하여 분석물질의 안정성을 결정했으며, 제1 주기는 기준으로 사용되었다. 부가하여, 4℃ 및 20℃에서 2-, 4-, 24- 및 48-시간 동안 3개의 혈청 및 3개의 혈장 샘플을 인큐베이션함에 의하여 분석물질 안정성을 테스트하고 비-스트레스된 샘플 기준에 대해 테스트했다. 모든 샘플 테스트는 중복 결정으로 실행되었다. 시약 안정성은 HRP 표지된 항체를 20℃ 및 37℃에서 7일 동안 인큐베이션함에 의해 테스트되었고 비-스트레스된 시약에 대해 테스트되었다. 분석물질 및 시약 안정성 테스트에 대한 허용가능한 범위는 ±20%였다.
임상 평가
환자 샘플
PRO-C18L ELISA는 이전에 기술된 바와 같이 C형 간염에 걸린 환자(NCT00244751)에 대한 잠재적인 항섬유화 화합물인 페록시좀 증식제-활성화된 수용체-감마 작용제인, 파글리타자의 효과를 조사하는 다중심의 제2상 임상 연구로부터의 코호트에서 테스트되었다11. 혈장 샘플은 52주 동안 파글리타자 또는 매칭하는 위약의 매일 용량을 투여받은 200명 환자의 하위모집단에서 이용가능했다. 간 생검은 기준선과 52주 후에 이용가능했으며 등급 및 병기결정을 위해 Ishak 변형된 조직학적 활성 지수를 사용하여 중앙의 경험이 풍부한 조직병리학자에 의해 관찰되었다. 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행되었고 관련된 모든 국가에 대한 윤리적 지침을 따랐다. 모든 환자는 서면 동의서를 제공했다. 기준선 환자 특성은 아래 표 1에 나타나 있다.
표 1:
환자 기준선 특성
HAI, 조직학적 활성 지수. BMI, 체질량 지수. AST, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제. SD, 표준 편차. IQR, 사분위 범위.
만성 C형 간염이 있고 이전의 항바이러스 요법이 실패하여 치료가 어려운 코호트가 선택되었다. 초기 연구에서는 Ishak 스코어링을 기준으로 질환의 진행 또는 회귀가 있는 대상체의 비율이 기준선에서 연구의 종료까지 동일했기 때문에 파글리타자의 영향이 없다고 결론지었다11. 그러나, 동일한 코호트에 대한 이후 간행물에서 유형 III 콜라겐 형성의 마커가 치료에 대한 반응자를 식별하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 섬유증의 혈청학적 측정이 질환 활성의 보다 역동적인 정량화를 제공한다는 것을 보여준다12.
바이오마커 측정
PRO-C18L은 상기에 기술된 환자로부터의 EDTA 혈장에서 이중으로 측정되었다. ELISA 및 측정은 상기에 기술된 바와 같이 Nordic Bioscience(덴마크 허를레브 소재)에서 개발되고 측정되었다.
통계적 분석
사용된 테스트: 카이 제곱, T-테스트, 일원 ANOVA
그래프 및 통계적 분석은 MedCalc 버전 19.3 (MedCalc Software Ltd, 벨기에 오스텐드 소재) 및 GraphPad Prism 버전 8(GraphPad Software, 미국 캘리포니아주 라호야 소재)을 사용하여 수행되었다. 데이터는 튜키 박스 플롯으로 도시된다. p<0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주된다.
결과
클론 선택 및 품질 보증
생산된 클론으로부터 최상의 항체를 선택하기 위해: 고유 반응성, 특이성 및 안정성이 평가되었다. ELISA 개발을 위해 선택된 항체는 NBH133A1-2B4로 명명되었고 IgG2a 서브타입인 것으로 결정되었다. 항체 특이성을 확인하기 위해, 표준 펩티드, 넌센스 펩티드(LHDSNPYPRR(서열번호 17)) 및 선택해제 펩티드(NALNLNWLWF(서열번호 18))에 대한 그 반응성이 상기에서 기술된 경쟁적 ELISA 절차를 사용하여 테스트되었다. 표준 펩티드는 용량-의존적 방식으로 신호를 억제하는 반면(도 1), 넌센스 펩티드(데이터는 도시되지 않음) 또는 선택해제 펩티드(도 1)에 대한 반응성은 없었다. 이 데이터는 선택된 단일클론 항체가 PRO-C18L N-말단 에피토프에 대해 높은 특이성을 가짐을 보여준다.
ELISA 기술 사양
PRO-C18L ELISA의 기술적 평가는 상기의 방법 섹션에 기술된 다양한 검증 단계를 통해 평가되었고 결과는 아래 표 2에 요약되어 있다.
표 2: PRO-C18L 검정의 기술적 검증
IC50은 11.7ng/ml이었다. 검출의 하한 및 상한은 1.7ng/ml 및 282.5ng/ml이었다. 검정-내 및 검정-간 편차는 각각 8% 및 11%로, 이는 10% 및 15%의 허용된 기준 한계보다 낮다. 희석되지 않은 상태에서 1:4 희석까지 혈청 및 혈장 둘 모두에서 희석 회수율은 100±20%의 허용된 기준 내에 있는 것으로 밝혀졌다. 혈청 내 캘리브레이션 펩티드(표준 펩티드)의 스파이킹 테스트에서 평균 회수율은 109%인 것으로 나타났고; 생물학적 단편 대 합성 표준에 대한 결합 친화도는 동일하여, N-말단 결합 및 높은 검정 특이성을 확인했다. 4회 동결/해동 주기로 분석물질을 테스트한 후 분석물질 회수율은 혈청 및 EDTA 혈장에서 각각 94% 및 105%였다. 부가하여, 혈청, 헤파린 혈장 및 EDTA 혈장을 4℃ 및 20℃에서 48시간 동안 보관해도 혈청의 경우 85% 및 116%, 헤파린 혈장의 경우 82% 및 109%, 그리고 EDTA 혈장의 경우 102% 및 92%로 분석물질 회수율에 영향을 미치지 않았다. 92% - 121% 범위인 회수율로 혈청 및 혈장에서 비오틴, 지질혈증 또는 헤모글로빈의 낮거나 높은 수준에서 간섭이 감지되지 않았다. 이들 결과는 모두 함께 PRO-C18L이 기술적으로 강력한 검정임을 입증한다.
PRO-C18L의 임상 검증
섬유증의 바이오마커로서 PRO-C18L의 가능성을 테스트하기 위해, 파글리타자 또는 위약으로 치료받은 127명의 HCV 환자의 종적 연구가 측정되었다. 표 1에서 테스트된 바와 같이 인구통계는 치료군과 위약군 사이에 분포에서 유의한 차이가 없음을 보여주었다.
먼저 기준선(BL)에서 52주차(W52)까지 PRO-C18L에서의 변화를 위약 대 파글리타자 치료된 환자에서 평가하여, 도 2a에 도시된 바와 같이 PRO-C18L 수준에서 위약은 증가한 반면 치료된 환자는 감소한 것을 밝혀냈다(p=0.05). PRO-C18L의 더 높은 기준선 수준(중앙값 초과)이 더 많은 치료 반응과 일치하는지 추가로 테스트하기 위해, PRO-C18L의 중앙값(2.56ng/ml) 초과 및 미만을 유사한 방식: 치료된 환자 대 위약 환자의 BL에서 W52까지의 델타 PRO-C18L에서 테스트했다. 기준선 PRO-C18L의 중앙값 수준 초과는 치료된 환자 중앙값 미만보다 치료로 더 시각적으로 감소하여(도 2b) 평균에 대한 변조를 나타내지만, 결과는 유의하지 않았다. 그러나, 이들 결과는 PRO-C18L이 요법에 의해 조절됨을 나타낸다.
간 섬유증의 바이오마커로서 PRO-C18L을 추가로 평가하기 위해, 환자를 BL에서 W52까지의 델타 Ishak에 기반하여 회귀자, 안정 또는 진행자로 나누었다. 회귀자 및 진행자는 BL에서 W52까지 하나 이상의 Ishak 점수가 각각 감소 또는 증가하는 것으로 특성화되는 반면 안정은 Ishak에서 변화가 없었다. PRO-C18L의 예측값을 평가하기 위해, 위약 및 파글리타자 치료군을 기준선에서의 PRO-C18L 수준을 기준으로 삼분위수로 더 나누었다. 삼분위수 3(가장 높은 PRO-C18L 기준선 수준을 가진 환자로 구성된 삼분위수)에서의 환자군에서 파글리타자 치료군은 위약군과 비교할 때 회귀자와 진행자의 비율에서 유의한 차이를 보였으며(도 3), 반면 이 차이는 삼분위수 1 환자군(가장 낮은 PRO-C18L 기준선 수준을 가진 환자로 구성된 삼분위수)에서는 발견되지 않았으며, 이는 기준선에서 PRO-C18L 수준이 높은 환자가 치료에 반응할 가능성이 더 높다는 것을 시사한다.
마지막으로, PRO-C18L이 PRO-C3(동일한 환자의 이전 연구에서 치료에 대한 반응자를 예측하는 것으로 밝혀짐)과 다른지 평가하기 위해 두 마커는 그의 예비 컷오프 수준(PRO-C3의 경우 20.2ng/ml 및 PRO-C18L의 경우 2.56ng/ml)에 대해 서로 상관되었다(도 4). 상관관계가 발견되지 않아, PRO-C18L이 동일한 모집단에서 치료에 대한 부가의 반응자를 식별한다는 것을 시사한다.
본 명세서에서 명시적으로 달리 표시하지 않는 한, '또는'이라는 단어는 명시된 조건 중 하나 또는 둘 모두를 충족될 때 참 값을 반환하는 연산자의 의미로 사용되고, 조건 중 하나만 충족되도록 요하는 연산자 '배타적 또는'에 반대이다. '포함하는'이라는 단어는 '포괄하거나 구성하는'을 의미하는데 사용된다. 상기에 인정한 모든 이전 교시는 이로써 참조로 합체된다. 본 명세서에서 임의의 이전에 공개된 문서에 대한 어떠한 인정도 그 교시가 호주 또는 그 날짜에 다른 곳에서 공통적인 일반 지식이었다는 것을 인정하거나 진술하는 것으로 간주되어서는 안된다.
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SEQUENCE LISTING
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
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Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180 185 190
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195 200 205
Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln
260 265 270
Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
275 280 285
Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu
290 295 300
Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro
340 345 350
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355 360 365
Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys
370 375 380
Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val
405 410 415
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420 425 430
His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Leu Asp Leu Asp
435 440 445
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450 455 460
Thr Ile Thr Ile Phe Ile Ser Leu Phe Leu Leu Ser Val Cys Tyr Ser
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Ala Ser Val Thr Leu Phe Lys Val Lys Trp Ile Phe Ser Ser Val Val
485 490 495
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180 185 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195 200 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
Claims (21)
- 면역검정의 방법으로서,
(i) 환자 샘플을 유형 XVIII 콜라겐의 긴 및/또는 중간 이소형에 특이적으로 결합하고 유형 XVIII 콜라겐의 짧은 이소형에는 특이적으로 결합하지 않는 단일클론 항체와 접촉시키는 것; 및
(ii) 상기 샘플에서 상기 단일클론 항체와 펩티드 사이의 결합하는 양을 검출하고 측정하는 것을 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 환자 샘플이 간 섬유증이 있는 환자의 샘플이고, 상기 방법은 환자가 항섬유화 약물로의 치료에 반응할 가능성을 평가하기 위한 것이고, 상기 방법은 추가로:
(iii) 단계 (ii)에서 측정된 상기 단일클론 항체의 상기 결합의 양에 대해, 치료에 대한 반응자와 연관된 값 및/또는 비-반응자와 연관된 값 및/또는 미리 결정된 컷-오프 값과의 상관성을 보는 것을 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 방법은 환자에서 간 섬유증을 모니터링하기 위한 것이고, 상기 방법은 추가로:
(iii) 단계 (ii)에서 측정된 상기 단일클론 항체의 상기 결합의 양에 대해, 이전 시점에서 상기 환자로부터 얻은 값과의 상관성을 보는 것을 포함하는, 방법. - 제3항에 있어서, 상기 환자 샘플은 항섬유증 약물로 치료를 받고 있는 환자의 샘플인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자 샘플은 만성 간 질환이 있는 환자의 샘플인, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자 샘플은 바이러스성 간염, 알코올성 간 질환 또는 비-알코올성 지방간 질환이 있는 환자의 샘플인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 환자에서 간 섬유증을 검출하기 위한 것이고, 상기 방법은 추가로:
(iii) 단계 (ii)에서 측정된 상기 단일클론 항체의 상기 결합의 양에 대해, 정상적인 건강한 대상체와 연관된 값 및/또는 알려진 질환 중증도와 연관된 값 및/또는 미리 결정된 컷-오프 값과의 상관성을 보는 것을 포함하는, 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 생체액인, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 생체액은 혈액, 혈청 또는 혈장인, 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역검정은 경쟁 검정 또는 샌드위치 검정인, 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역검정은 방사면역검정 또는 효소 결합 면역흡착 검정인, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체는 아미노산 서열 NLLNLN(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체는 아미노산 서열 NLLNLNKDKE(서열번호 2)를 갖는 합성 펩티드에 대해 발생되는, 방법.
- 유형 XVIII 콜라겐의 긴 및/또는 중간 이소형에 특이적으로 결합하고 유형 XVIII 콜라겐의 짧은 이소형에는 특이적으로 결합하지 않는 단일클론 항체.
- 제14항에 있어서, 단일클론 항체는 아미노산 서열 NLLNLN(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는, 단일클론 항체.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체는 아미노산 서열 NLLNLNKDKE(서열번호 2)를 갖는 합성 펩티드에 맞서 생성된 것인, 단일클론 항체.
- 면역검정 키트로서,
(a) 유형 XVIII 콜라겐의 긴 및/또는 중간 이소형에 특이적으로 결합하고 유형 XVIII 콜라겐의 짧은 이소형에는 특이적으로 결합하지 않는 단일클론 항체; 및 (b) 다음 중 적어도 하나를 포함하는, 면역검정 키트:
- 스트렙타비딘 코팅된 웰 플레이트;
- 단일클론 항체가 특이적으로 결합하는 비오티닐화된 펩티드;
- 샌드위치 면역검정에 사용하기 위한 2차 항체;
- 단일클론 항체가 특이적으로 결합하는 캘리브레이터 펩티드;
- 항체 비오티닐화 키트;
- 항체 HRP 표지 키트;
- 항체 방사성표지 키트; 및
- 검정 시각화 키트. - 제17항에 있어서, 단일클론 항체는 아미노산 서열 NLLNLN(서열번호 1)에 특이적으로 결합하는, 면역검정 키트.
- 제17항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체는 아미노산 서열 NLLNLNKDKE(서열번호 2)를 갖는 합성 펩티드에 맞서 생성된 것인, 면역검정 키트.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 캘리브레이터 단백질은 아미노산 서열 NLLNLNKDKE(서열번호 2)를 포함하는 펩티드인, 면역검정 키트.
- 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비오티닐화된 펩티드는 NLLNLNKDKE-L-비오틴(서열번호 13)을 포함하고, 여기서 L은 선택적 링커인, 면역검정 키트.
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2021
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