JP2023540617A - がんを評価するためのアッセイ - Google Patents

Abstract

本明細書において、患者のがんを検出および／またはモニタリングするためのイムノアッセイの方法であって、ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と患者由来の生体液サンプルを接触させるステップ、ならびに前記モノクローナル抗体と前記サンプル中のペプチドとの間の結合の量を検出および決定するステップとを含む、イムノアッセイの方法が記載される。【選択図】図２

Description

本発明は、患者のがんを検出および／またはモニタリングするためのイムノアッセイに関する。がんは、特に、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、または膵がんであり得る。イムノアッセイは、特定の実施形態では、患者のがんのステージを検出するためまたは患者のがんの予後を決定するためのものであり得る。

ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンは、文献での記載が不十分であるが、その物理的な役割を伴う研究が徐々に出現している。これは、主に、末梢神経および後根神経節に局在しているが、同様に、皮膚でも見出されている^１、２。ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンは、ＶＩ型コラーゲンに構造上類似しているビーズ状のコラーゲンであり、５２８アミノ酸のコラーゲン性ドメインに隣接する２つのフォン・ヴィルブランド因子Ａドメインを有する^３。ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンは、健常な肺組織では非常に低いレベルで見出されたが、ブレオマイシンを誘導する肺損傷では過剰発現し^４、これはＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンを発現する細胞が組織修復プロセスに関与し得ることを表し得る。またＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンは、マウス肝細胞癌でアップレギュレートされることが以前に見られている^５。

ここで本発明者らは、ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンの形成が、がん、特に肺がん、乳がん、結腸直腸がん、または膵がんなどでアップレギュレートされることを決定し、また、ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端を標的とするモノクローナル抗体を利用した競合ＥＬＩＳＡを開発したが、このＥＬＩＳＡは、がんを検出および／またはモニタリングし、がんのステージおよび／または予後を決定するために使用できる。

よって、本発明は、患者のがんを検出および／またはモニタリングするためのイムノアッセイの方法であって、
（ｉ）ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と患者由来の生体液サンプルを接触させるステップと、
（ｉｉ）前記モノクローナル抗体と前記サンプル中のペプチドとの間の結合の量を検出および決定するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で決定した前記モノクローナル抗体の結合の量を、正常な健常な対象に関連する値および／または既知のがんの重症度に関連する値および／または以前の時点で前記患者から得た値および／または所定のカットオフ値と相関させるステップと
を含む、方法を提供する。

イムノアッセイは、限定するものではないが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイであり得る。イムノアッセイは、たとえば、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）であり得る。このようなアッセイは、当業者に知られている技術である。

がんは、特定の実施形態では、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、卵巣がん、および／または膵がんであり得る。特に、がんは、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、および／または膵がんであり得る。

本方法は、特定の実施形態では、患者のがんの重症度を検出するための方法であり得る。たとえば、本方法は、患者のがんのステージを検出するための方法、および／または患者のがんの予後を決定する（たとえば、可能性のある患者の生存時間または生存確率を決定するなどの）方法であり得る。

特定の実施形態では、患者は、たとえば、がんの治療を経験した患者であり得、本方法は、患者のがんをモニタリングするステップを含み得る。

患者の生体液サンプルは、限定するものではないが、血液、血清、血漿、尿、または細胞もしくは組織培養物由来の上清であり得る。好ましくは、生体液は、血清または血漿、最も好ましくは血清である。

本明細書中使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、全抗体、および全抗体の結合特異性を保持するそのフラグメント、たとえばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、または当業者に知られている他のこのようなフラグメントなどを表す。よく知られているように、全抗体は、通常、各対が１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖から作製されている、同一の２対のポリペプチド鎖である「Ｙ型」の構造を有する。各軽鎖および重鎖のＮ末端領域は可変領域を含み、各重鎖および軽鎖のＣ末端部は定常領域を構成する。可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、これらは主に抗原認識に寄与している。定常領域は、抗体に、免疫系の細胞および分子を動員させる。結合特異性を保持する抗体フラグメントは、少なくとも、ＣＤＲおよび上記結合特異性を保持するために十分な可変領域の残りの部分を含む。

本発明の方法では、当該分野で知られているいずれかの定常領域を含むモノクローナル抗体が使用され得る。ヒト定常領域の軽鎖は、κ軽鎖およびλ軽鎖に分類される。重鎖定常領域は、μ、δ、γ、α、またはεに分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義する。ＩｇＧアイソタイプは、限定するものではないが、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むいくつかのサブクラスを有する。モノクローナル抗体は、好ましくはＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のいずれか１つを含むＩｇＧアイソタイプであり得る。

抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔらにより記載されるものなどの当該分野で知られている方法を使用して決定され得る。抗体は、実施例に記載されるようにＢ細胞クローンから作製され得る。抗体のアイソタイプは、ヒトＩｇＭ、ＩｇＧ、もしくはＩｇＡのアイソタイプ、またはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４のサブクラスに特異的なＥＬＩＳＡにより決定され得る。作製された抗体のアミノ酸配列は、標準的な技術を使用して決定され得る。たとえば、ＲＮＡは、細胞から単離され、逆転写によりｃＤＮＡを作製するために使用され得る。次に、ｃＤＮＡは、抗体の重鎖および軽鎖を増幅するプライマーを使用するＰＣＲに供される。たとえば、全てのＶＨ（可変重鎖）配列のリーダー配列に特異的なプライマーが、以前に決定したアイソタイプの定常領域に位置する配列に結合するプライマーと共に使用され得る。軽鎖は、ＶκまたはＶλのリーダー配列にアニーリングするプライマーと共に、κまたはλ鎖の３’末端に結合するプライマーを使用して増幅され得る。完全長の重鎖および軽鎖が作製され、シーケンシングされ得る。

本発明に係る方法の一部の実施形態では、生体液サンプルは、Ｃ末端のアミノ酸配列ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号１）（本明細書中「ＰＲＯ－Ｃ２８」とも呼ばれる）に特異的に結合するモノクローナル抗体と接触される。好ましくは、上記モノクローナル抗体は、ＱＥＴＣＩＱＧＡ（配列番号２）である前記Ｃ末端のアミノ酸配列の伸長されたバージョンを認識しないかまたは特異的に結合しない。好ましくは、上記モノクローナル抗体は、ＱＥＴＣＩＱ（配列番号３）である前記Ｃ末端のアミノ酸配列のトランケートされたバージョンを認識しないかまたは特異的に結合しない。

好ましくは、Ｃ末端のアミノ酸配列ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号１）に対する上記抗体の親和性の、伸長されたＣ末端のアミノ酸配列ＱＥＴＣＩＱＧＡ（配列番号２）に対する上記抗体の親和性に対する比率は、少なくとも１０：１であり、より好ましくは少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも５００：１、少なくとも１，０００：１、少なくとも１０，０００：１、少なくとも１００，０００：１、または少なくとも１，０００，０００：１である。

好ましくは、Ｃ末端のアミノ酸配列ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号１）に対する上記抗体の親和性の、トランケートされたＣ末端のアミノ酸配列ＱＥＴＣＩＱ（配列番号３）に対する上記抗体の親和性に対する比率は、少なくとも１０：１であり、より好ましくは少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも５００：１、少なくとも１，０００：１、少なくとも１０，０００：１、少なくとも１００，０００：１、または少なくとも１，０００，０００：１である。

本明細書中使用される場合、用語「Ｃ末端」は、ポリペプチドの末端、すなわちポリペプチドのＣ末端にあるＣ末端ペプチド配列を表し、その一般的な方向の意味として解釈されるべきではない。

Ｃ末端のアミノ酸配列ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号１）に特異的に結合するモノクローナル抗体は、当該分野で知られているいずれかの適切な技術を介して作製され得る。例として、モノクローナル抗体は、たとえば、げっ歯類（または他の適切な哺乳類）を、任意選択で免疫原性担体タンパク質（キーホールリンペットヘモシアニンなど）に結合し得る配列ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号１）からなる合成ペプチドで免疫処置し、単一の抗体を産生する細胞を、単離およびクローニングし、得られたモノクローナル抗体を、それらの望ましい特異性の保有を確保するためにアッセイすることなどにより、アミノ酸配列ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号１）を有する合成ペプチドに対して産生され得る。Ｃ末端のアミノ酸配列ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号１）に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するための例示的なプロトコルは、以下に記載される。

本発明に係る方法の一部の実施形態では、ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端のエピトープに特異的なモノクローナル抗体の結合の量を、正常な健常な対象に関連する値および／または既知のがんの重症度に関連する値および／または以前の時点で患者から得た値と相関させる。

本明細書中使用される場合、用語「正常な健常な対象に関連する値および／または既知のがんの重症度に関連する値」は、健常、すなわちがんを有さないとみなされた対象で上述の方法により決定された標準化された量、および／または既知の重症度を伴うがんを有すると知られている対象で上述の方法により決定された標準化された量を意味する。よって、たとえば、本方法は、肺がん、乳がん、または結腸直腸がんを検出するための方法である場合、モノクローナル抗体の結合の量は、健常な対象で本方法により決定された標準化された量、および／または既知の重症度を伴う上記がんを有すると知られている対象で本方法により決定された標準化された量と相関され得る。

本発明に係る方法の一部の実施形態では、ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端のエピトープに特異的なモノクローナル抗体の結合の量を、１つ以上の所定のカットオフ値と相関させる。

本明細書中使用される場合、「カットオフ値」は、患者において、がんの尤度が高いこと、または特定のステージもしくは他の重症度のレベルのがんの尤度が高いことを表すと統計的に決定される結合の量を意味する。たとえば、カットオフ値は、統計上のカットオフ値以上である患者サンプルにおけるバイオマーカーの結合の測定された値が、患者におけるがんまたはがんの特定のステージもしくは他の重症度のレベルの存在または尤度の少なくとも７０％の確率、好ましくは少なくとも８０％の確率、好ましくは少なくとも８５％の確率、より好ましくは少なくとも９０％の確率、および最も好ましくは少なくとも９５％の確率に対応するように選択され得る。

ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端のエピトープに特異的なモノクローナル抗体の結合の量に関する所定のカットオフ値は、たとえば少なくとも５０ｎｇ／ｍＬであり得、より好ましくは少なくとも６０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも７０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも８０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも９０ｎｇ／ｍＬ、または少なくとも１００ｎｇ／ｍＬであり得る。これに関して、統計分析の使用を介して、上記カットオフ値以上のＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端のエピトープに特異的なモノクローナル抗体の結合の測定された量（たとえば少なくとも６０ｎｇ／ｍＬのカットオフ値が使用される場合測６０ｎｇ／ｍＬ以上の測定された量）が、様々ながんを表し得ることが見出されている。また、モノクローナル抗体の結合の測定された量が高いことが、より後期のステージのがんおよびより悪い予後と統計上相関することが見出されている。よって、本方法が患者のがんのステージを検出するための方法である場合、がんの各ステージのカットオフ値が使用されてよく、ここで高いカットオフ値は、より後期のステージで使用される。同様に、本方法が患者のがんの予後を決定するための方法である場合、特定の予後（たとえば可能性のある生存の期間または生存の確率）に対応するカットオフ値が使用され得る。このような統計的なカットオフ値を使用することにより、本発明の方法を利用して高いレベルの信頼度を伴う診断を提供することが可能である。このような統計的なカットオフ値を適用することは、これが単独独立型の診断アッセイをもたらす、すなわち、診断の結論に達するために、健常な個体および／または既知のがんの重症度を有する患者との直接的な比較の必要性を完全に排除するため、特に好適である。またこれは、（たとえば医療の専門家での身体検査および／または診断により決定される）一般的にがんを表す医学的な兆候または症状をすでに有する患者を評価するためアッセイを利用する場合、これは、最初の診断を実証するための迅速かつ確定的なツールとして作用し、よって潜在的に、より侵襲的な手法の必要性を除外し、適切な処置レジメンの開始を早めることが可能であるため、特に好適であり得る。またこれは、長期入院の必要性を回避し得る。特定のがんの場合、早められた診断は、疾患がより早期のステージで検出され得、よって、総合的な生存の確率を改善し得る。

抗体の特異性。標準的なペプチド（ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号１））、伸長されたペプチド（ＱＥＴＣＩＱＧＡ（配列番号２））、ナンセンスペプチド（ＧＬＲＰＧＳＥＹＴＶ（配列番号４））、およびナンセンスコーター（ＧＬＲＰＧＳＥＹＴＶ－Ｋ－ビオチン（配列番号５））を使用して、反応性を試験した。 健常な対照およびがん患者の血清におけるＰＲＯ－Ｃ２８のレベル。ＰＲＯ－Ｃ２８のレベルは、がん患者由来の混合性サンプル（Ａｓｔｅｒａｎｄ、Ｐ＝０．００２）および肺がんサンプル（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ、Ｐ＜０．０００１）において有意に高かった（図２Ａ）。統計的差異は、ＡＮＯＶＡおよびダネットの多重比較検定を使用して評価した。ＰＲＯ－Ｃ２８は、健常な個体と、混合性がん患者（図２Ｂ）および肺がん患者（図２Ｃ）のコホートとの間を有意に区別することができた（それぞれＰ＝０．０００７、Ｐ＜０．０００１）。 健常な対照および臓器により定義される様々な固形腫瘍を有する患者由来の血清におけるＰＲＯ－Ｃ２８のレベル。 がんのステージによりグループ分けされる様々ながん患者由来の血清におけるＰＲＯ－Ｃ２８のレベル。線は、線形回帰分析から適合される。 化学療法を経験した膵がん患者のＫａｐｌａｎ Ｍｅｉｅｒ法による全生存率曲線。この患者は、ＰＲＯ－Ｃ２８の前処置レベルにより三分位（Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３）に分けられ、グループ分けされる。

実施例
本明細書中開示される実施形態は、以下の実施例で記載されており、これは、本開示の理解を支援するために記載されており、以下に続く特許請求の範囲に定義される本開示の範囲をいかなる方法でも限定するようには解釈すべきではない。以下の実施例は、記載される実施形態を作製および使用する方法の完全な開示および記載を当業者に提供するために提示されており、本開示の範囲を限定するようには意図されておらず、本発明者らは、以下の実験が行われた実験の全てまたは唯一の実験であることを表すようには意図していない。使用される数（たとえば量、温度など）に関する正確性を保証するための試みがなされているが、一部の実験上の誤差および偏差が考慮されている。他の記載がない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧に近い。

以下の実施例では、以下の材料および方法を使用した。

材料および方法
この実験で使用した全ての試薬は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）およびＭｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ， ＮＪ， ＵＳＡ）などの企業からの高品質規格であった。免疫処置およびアッセイの開発で使用した合成ペプチドは、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ）から購入した。

ＰＲＯ－Ｃ２８を標的とするモノクローナル抗体の作製
ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端を標的とするモノクローナル抗体を、ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端で見出された７アミノ酸配列ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号１）（「ＰＲＯ－Ｃ２８」）に対する抗体を産生させることにより作製した。システイン残基の数を低減し、これにより抗体を作製するために使用されていた免疫原性ペプチドでのシス－シス架橋の形成を回避するために、より長い配列、たとえば１０アミノ酸Ｃ末端配列ＫＥＣＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号６）ではなく、この７アミノ酸配列が選択された。

ＰＲＯ－Ｃ２８を標的とするモノクローナル抗体の作製のため使用されるプロトコルは、以下の通りであった。

６～７週齢の雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウス（体重１４～１８ｇ）の免疫処置を、Ｓｔｉｍｕｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＳＰＥＣＯＬ）（Ｃａｔ ＃７９２５０００， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において１００μｇの免疫原性ペプチドＫＬＨ－ＣＧＧ－ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号７）（ここで「ＫＨＬ」はキーホールリンペットヘモシアニンを表し、ＣＧＧは結合リンカーである）を含む２００μＬの乳化した抗原溶液の皮下注射により開始した。この免疫処置を、安定した血清抗体力価のレベルに到達するまで、２週間ごとに反復した。最も高い血清力価および最良の阻害を伴うマウスを融合のため選択し、最後の免疫処置の後少なくとも３週間休息させた。その後、マウスに、細胞融合のための脾臓の単離の３日前に、１００μｇの免疫原性ペプチドを含む１００μＬの０．９％のＮａＣｌ溶液を静脈内にブーストした。ハイブリドーマ細胞を産生させるため、マウスの脾臓細胞を、Ｇｅｆｔｅｒらに記載されるようにＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合した。このハイブリドーマ細胞は、半固体培地法を使用して培養皿でクローン化した。次に、このクローンを、さらなる増殖のため９６ウェルマイクロタイタープレートに載置し、限界希釈法を適用してモノクローナルの増殖を促進させた。ストレプトアビジンでコーティングしたプレートで行った間接ＥＬＩＳＡを、上清の反応性のスクリーニングに使用した。ビオチン－ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号８）を、スクリーニングペプチドとして使用し、標準的なペプチド（ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号１））、伸長されたペプチド（ＱＥＴＣＩＱＧＡ（配列番号２））、ナンセンスペプチド（ＧＬＲＰＧＳＥＹＴＶ（配列番号４））、およびナンセンスコーター（ＧＬＲＰＧＳＥＹＴＶ－Ｋ－ビオチン（配列番号５））を、クローンの特異性のさらなる試験に使用した。上清をハイブリドーマ細胞から回収し、ＨｉＴｒａｐ親和性カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｒｏｎｔ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を製造社の指示にしたがい使用し精製した。全ての動物は、動物福祉のガイドラインにしたがい処置した。

クローンの選択および性質決定
後述の競合ＥＬＩＳＡにおいて標準的なペプチド（ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号１））に対する反応性に関して最良の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、ＰＲＯ－Ｃ２８を標的とするモノクローナル抗体の産生に関して、最も高い反応性を示すクローンを選択した。抗体の特異性を、標準的なペプチド（ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号１））、伸長されたペプチド（ＱＥＴＣＩＱＧＡ（配列番号２））、ナンセンスペプチド（ＧＬＲＰＧＳＥＹＴＶ（配列番号４））、およびナンセンスコーター（ＧＬＲＰＧＳＥＹＴＶ－Ｋ－ビオチン（配列番号５））を使用して試験した。モノクローナル抗体のアイソタイプは、Ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ－ＨＲＰ ｋｉｔ， ｃａｔ． ５３００－０５（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＡＬ， ＵＳＡ）を使用して決定した。

ＰＲＯ－Ｃ２８ ＥＬＩＳＡ
Ｒｏｃｈｅ製のｃａｔ．１１９４０２７９の９６ウェルのストレプトアビジンでコーティングしたＥＬＩＳＡプレートを、アッセイバッファー（２５ｍＭのＴＢＳ－ＢＴＥ＋２ｇ／ｌのＮａＣｌ、ｐＨ８）に溶解した１００μＬ／ウェルのビオチン化ペプチドのビオチン－ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号８）でコーティングし、暗室で振とうさせながら２０℃で３０分間インキュベートし、その後、洗浄バッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）にて５回洗浄した。その後、２０μｌのペプチド標準物質またはサンプルを適切なウェルに添加し、次に１００μｌの精製された抗体溶液（アッセイバッファーに溶解したＰＲＯ－Ｃ２８に特異的なモノクローナル抗体）を添加し、振とうさせながら２０℃で１時間インキュベートし、次に洗浄バッファーで５回洗浄した。次に、１００μＬの二次抗体溶液（ＰＲＯ－Ｃ２８に特異的なモノクローナル抗体で使用したものと同じアッセイバッファーに溶解した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗マウス抗体）を各ウェルに添加し、振とうさせながら２０℃で１時間インキュベートし、次に洗浄バッファーで５回洗浄した。最後に、１００μｌのテトラメチルベンジニジン（ｂｅｎｚｉｎｉｄｉｎｅ）（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃ ｃａｔ．：４３８ＯＨ）を各ウェルに添加し、プレートを暗室において２０℃で１５分間インキュベートし、反応を止めるため、ストップ溶液（１％のＨ_２ＳＯ_４）１００μｌを添加し、次にプレートを、参照としての６５０ｎｍを伴い、４５０ｎｍで、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて分析した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ， ＣＡ， ＵＳＡ）。検量線は、４－パラメトリック数学的適合モデルを使用してプロットした。

ＰＲＯ－Ｃ２８ ＥＬＩＳＡの技術的な評価
ヒトの血清、ヒトの尿、およびＥＤＴＡ、ヘパリン、またはクエン酸塩で処置したヒト血漿サンプル（サンプルの各タイプのうち４つ）の２倍希釈物を使用して、直線性を評価した。直線性は、希釈していないサンプルの回収率のパーセンテージとして計算した。

アッセイ内およびアッセイ間の変動は、５つのクオリティコントロール（ＱＣ）の１０回の独立した実行と、二連の判定で行われる２つのキットコントロールにより決定した。

アッセイの正確性は、標準的なペプチドでスパイクした健常なヒト血清サンプルで測定し、バッファーにおける血清の回収率のパーセンテージとして計算した。

測定範囲の下限（ＬＬＭＲ）および測定範囲の上限（ＵＬＭＲ）は、アッセイ内およびアッセイ間の変動からの１０の個々の標準曲線に基づき計算した。

がんのバイオマーカーとしてのＰＲＯ－Ｃ２８の生物学的なバリデーション
ＰＲＯ－Ｃ２８を、健常な対照の２つのコホート由来の血清サンプル（Ｌｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ， ＵＳＡおよびＶａｌｌｅｙ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ， ＵＳＡから入手）、様々ながん種を有する患者のコホート由来の血清サンプル（Ａｓｔｅｒａｎｄ， ＵＳＡから入手、様々な腺がん、浸潤性乳腺癌、皮膚の悪性メラノーマ、および肺の小細胞癌／扁平上皮癌を有する患者由来のサンプルを含む）、ならびに肺がん患者のコホート由来の血清サンプル（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ， ＵＳＡから入手）において測定した。ＰＲＯ－Ｃ２８のレベルは、上述のＰＲＯ－Ｃ２８ ＥＬＩＳＡのプロトコルを使用して、盲検で測定した。インフォームドコンセントおよび地元の倫理委員会による承認の後、全ての血清サンプルを回収し、がん患者由来の全ての血清サンプルは、切除前に回収した。患者の人口動態を表１および２に示す。健常なコホート（Ｌｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓから得たサンプル）のうちの１つの患者の平均年齢は、２つのがんのコホートの患者の平均年齢と有意に異なるものであったが、いずれのコホートにおいても年齢とＰＲＯ－Ｃ２８のレベルとの間に相関はなかった。

膵がんの予後マーカーとしてのＰＲＯ－Ｃ２８の生物学的なバリデーション
ＰＲＯ－Ｃ２８を、ステージＩ～ＩＶの膵がん（ＰＣ）を有する７０１名の患者のコホート由来の前処置血清サンプルにおいて測定した。全てのＰＣ患者は、デンマークのＢＩＯＰＡＣ（膵がんを有する患者のバイオマーカー）試験（ＮＣＴ０３３１１７７６）由来であった。２００８年１２月から２０１７年９月まで６つのデンマークの病院から患者を動員した。ＰＣ患者は、組織的に腫瘍が確認されており、国のガイドライン（ｗｗｗ．ｇｉｃａｎｃｅｒ．ｄｋ）にしたがい様々な種類の化学療法で処置されていた。この試験は、Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓでのデンマーク地域委員会（Ｄａｎｉｓｈ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の推奨に従い行われた。ＢＩＯＰＡＣのプロトコルは、Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓでのデンマーク地域委員会（ＶＥＫ ｒｅｆ． ＫＡ－２００６０１１３）およびデータ保護機関（Ｄａｔａ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ）（ｊ．ｎｒ． ２００６－４１－６８４８）により承認されたものであった。全ての対象は、ヘルシンキの宣言（バージョン８）に従いインフォームドコンセントに記入した。血清サンプルは、診断の時点または手術の前に入手した。サンプルは、血液に関して国により承認された標準的な術法により処理された（ｗｗｗ．ｈｅｒｌｅｖｈｏｓｐｉｔａｌ．ｄｋ／ｂｉｏｐａｃ．ｄｋ）。

結果
クローンの選択および性質決定
標準的なペプチドに対する反応性および選択性に関して最良の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングし、反応性に基づき、ＰＲＯ－Ｃ２８ ＥＬＩＳＡの技術的および生物学的な評価での使用のためＰＲＯ－Ｃ２８を標的とするモノクローナル抗体の産生のため、クローンＮＢＨ２１８＃６５ ８Ｃ１１－２Ｆ１０－１Ｈ７を選択および使用した。このモノクローナル抗体は、アイソタイプ：ＩｇＧ２ｂ、ｋであった。伸長されたペプチド、ナンセンスペプチド、またはナンセンスコーターに対する反応性は見出されなかった（図１）。

ＰＲＯ－Ｃ２８ ＥＬＩＳＡの技術的な評価
一連の技術的なバリデーションを行い、ＰＲＯ－Ｃ２８ ＥＬＩＳＡのアッセイを評価した。バリデーションデータの概要を、表３に示す。

がんのバイオマーカーとしてのＰＲＯ－Ｃ２８の生物学的な評価
図２Ａに示されるように、ＰＲＯ－Ｃ２８のレベルは、健常な対照のコホート（Ｌｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓコホート）と比較して、混合種のがんを有する患者のコホートおよび肺がん患者のコホートにおいて有意に高かった。ＰＲＯ－Ｃ２８のレベルは、平均して、健常な対照（Ｌｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓコホート）で４９．７７ｎｇ／ｍｌ（３０．３７）、混合性がん患者のコホートで７８．３２ｎｇ／ｍｌ（５５．９２）、および肺がん患者のコホートで１４０．８ｎｇ／ｍｌ（３４．３３）であると評価された（対照ｖｓ混合性Ｐ＝０．００２、対照ｖｓ肺Ｐ＜０．０００１）。ＰＲＯ－Ｃ２８は、健常と混合性がんとの間（図２Ｂ、ＡＵＣ＝０．６８、Ｐ＝０．０００７）、および健常と肺がんとの間（図２Ｃ、ＡＵＣ＝０．９８、Ｐ＜０．０００１）を有意に区別した。よって、ＰＲＯ－Ｃ２８は、健常な患者と様々な病因のがん患者との間を高い正確性および有意性で区別するために使用できる。

がんの種類により分類される結果を、図３および表４に示す。肺がんおよび乳がんの患者は、使用される統計分析（ダンの多重比較検定またはマン・ホイットニー検定）のいずれかにより評価される場合、健常な対照（Ｖａｌｌｅｙ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌコホート）と比較して有意に高いレベルのＰＲＯ－Ｃ２８を有していた。また結腸直腸がんも、マン・ホイットニー検定により有意に高く、卵巣がんおよび膵がんでも同様に高い傾向があった。

疾患のステージとＰＲＯ－Ｃ２８との間の関連を評価するために、がん患者の結果を、患者がステージ１（ｎ＝１５）、ステージ２（ｎ＝３５）、ステージ３（ｎ＝４０）、またはステージ４（ｎ＝２２）のがんを有しているかどうかにより同様にグループ分けし、ステージの情報が入手可能ではない１３名の患者は考慮しなかった。これら各グループの患者のＰＲＯ－Ｃ２８のレベルは、図４に示されており、表５に統計的にまとめられている。示されるように、ＰＲＯ－Ｃ２８のレベルは、疾患のステージと相関しており、ＰＲＯ－Ｃ２８のレベルが腫瘍量、よって恐らくは同様に予後に関連していることをさらに示唆している。

膵がんにおける予後マーカーとしてのＰＲＯ－Ｃ２８の生物学的な評価
カプランマイヤー曲線およびｌｏｇ－ｒａｎｋのｐ値を使用して、膵がん患者のコホートの全生存率（ＯＳ）曲線を比較した。ここでの患者は、ＰＲＯ－Ｃ２８の前処置レベルにより三分位（Ｑ１、Ｑ２、およびＱ３）に分けられている。ｐ値 ｐ＜０．０５は、統計的に有意とみなした。単変量コックス比例ハザード回帰モデルは、ＰＲＯ－Ｃ２８バイオマーカーの三分位：Ｑ１と比較したＱ２およびＱ３あたりのＯＳの９５％の信頼区間（ＣＩ）でのハザード比（ＨＲ）を計算することであった。

表５および図５に示される場合、ＰＲＯ－Ｃ２８の前処置レベルとＯＳとの間の関連を評価する場合、「高い」ＰＲＯ－Ｃ２８のレベル（Ｑ３）および「中程度の」ＰＲＯ－Ｃ２８のレベル（Ｑ２）は、「低い」ＰＲＯ－Ｃ２８のレベル（Ｑ１）と比較して短いＯＳを予測した。ここで、Ｑ２およびＱ３の患者は、Ｑ１の患者（ＨＲ＝１．０）と比較して５３％（ＨＲ＝１．５３）および２４％（ＨＲ＝１．２４）高い死亡するリスクを有している。同様に、各三分位のカプランマイヤー曲線は有意に異なり（ｌｏｇ ｒａｎｋのｐ値＜０．０００１）、ＯＳ時間の中央値の数値は、Ｑ１→Ｑ２→Ｑ３と低くなった。これらデータは、ＰＲＯ－Ｃ２８が、ＰＣ患者において予後の値を有することを表している。

本明細書では、他の意味が明示されない限り、用語「または」は、条件の１つのみが満たされることを必要とする演算子（ｏｐｅｒａｔｏｒ）「排他的論理和（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｏｒ）」とは対照的に、複数の記載された条件のうちのいずれかまたは両方が満たされる場合に真の値を返す演算子の意味で使用される。用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」の意味よりも「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の意味で使用される。上記で認識されている全ての従来の教示は、本明細書によって参照により組み込まれている。本明細書中の従来より公開されている全ての文書の承認は、その教示が本明細書の日付でオーストラリアまたは他の場所で共通する一般的な知識であったことを承認または表すものとすべきではない。

参照文献
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Claims (10)

1. 患者のがんを検出および／またはモニタリングするためのイムノアッセイの方法であって、
   （ｉ）ＸＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と患者由来の生体液サンプルを接触させるステップと、
   （ｉｉ）前記モノクローナル抗体と前記サンプル中のペプチドとの間の結合の量を検出および決定するステップと、
   （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で決定した前記モノクローナル抗体の結合の量を、正常な健常な対象に関連する値および／または既知のがんの重症度に関連する値および／または以前の時点で前記患者から得た値および／または所定のカットオフ値と相関させるステップと
   を含む、方法。
2. 前記がんが、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、または膵がんである、請求項１に記載の方法。
3. 患者のがんのステージを検出または予後を決定するための方法である、請求項２に記載の方法。
4. 前記モノクローナル抗体が、Ｃ末端のアミノ酸配列ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号１）に特異的に結合する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記モノクローナル抗体が、ＱＥＴＣＩＱＧＡ（配列番号２）である前記Ｃ末端のアミノ酸配列の伸長されたバージョンを認識しないかまたは特異的に結合しない、請求項４に記載の方法。
6. 前記モノクローナル抗体が、ＱＥＴＣＩＱ（配列番号３）である前記Ｃ末端のアミノ酸配列のトランケートされたバージョンを認識しないかまたは特異的に結合しない、請求項４または５に記載の方法。
7. 前記モノクローナル抗体が、アミノ酸配列ＱＥＴＣＩＱＧ（配列番号１）を有する合成ペプチドに対して産生される、請求項４～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記生体液が、血液、血清、血漿、尿、または細胞もしくは組織培養物由来の上清である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記イムノアッセイが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着測定法である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

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