JP2022535513A

JP2022535513A - 心不全を評価するためのアッセイ

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Publication number: JP2022535513A
Application number: JP2021571375A
Authority: JP
Inventors: イェノベセ，フェデリカ; カルスダル，モルテン; ツァオ，レイ; ゴードン，デイビッド; ワン，ツァオキン; メディナ，フリオ，アロンソ，チリノス
Original assignee: Nordic Bioscience AS; Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Nordic Bioscience AS; Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2019-06-05
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2022-08-09
Also published as: WO2020245404A1; US20220317133A1; CN114270190A; KR20220038663A; EP3980785A1

Abstract

患者における心血管疾患を検出および／またはモニタリングするための、および／または、患者における心血管疾患の可能性または重症度を評価するためのイムノアッセイ法であって、患者からの生体液試料をVI型コラーゲンのα3鎖のC5ドメインのＣ－末端エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させること、および／または、患者からの生体液試料をIII型コラーゲンのＮ－末端プロペプチドのＣ－末端ネオ－エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させること、を含む。

Description

本発明は、患者における心血管疾患を検出および／またはモニタリングするための、および／または患者における心血管疾患の可能性または重症度を評価するためのイムノアッセイに関する。心血管疾患は、特に、心不全、特に、駆出率が保持された心不全であり得る。イムノアッセイは、心血管疾患の有害な転帰の可能性を評価するためのものであり得る。患者は、アルドステロン拮抗剤による治療を受けている患者のような心血管疾患の治療を受けている患者であってもよい。本発明はまた、アルドステロン拮抗剤による治療に適した患者を識別するためのイムノアッセイにも関する。

心不全（HF）の疾病負荷は、最近の数年間で劇的に増加している（引用１、２）。ＨＦの約半分は、駆出率が保持されたＨＦ（HFpEF）に対して従位的であるが、これは、人口の高齢化に伴ってＨＦの疾病負荷総量のより大きな割合を占めると予想される（引用３）。最近の数十年にわたる数多くのフェーズＩＩＩランダム化比較試験にもかかわらず、どのような薬理学的介入によって、この患者集団にとって明確に利益が与えられるのかということについて証明されることが待ち望まれている。

HFpEF症候群の不均一性は、候補とされる薬理学的介入の有効性を実証することに対して重大な障壁であることが突き止められている。HFpEFの不均一な性質が存在すると、種々の病態生理学的プロセスからの寄与の程度が異なるため、臨床試験において試験された薬理学的治療に対する平均的な応答に悪影響を及ぼすかもしれない。従って、特定の生物学的プロセスの基礎となる関連物であって薬理学的介入を用いて標的となり得るものを容易に識別することができる、単純で非侵襲的なバイオマーカーの利用可能性は、HFpEFへの我々の臨床および治療的アプローチを増強する有望なアプローチを提示する（引用４）。

HFpEFの不均一性はまた、個々の患者の予後に差があることについて、重大な関連性を有する。HFpEF患者をより効果的にリスク等級別分類する能力は、非常に必要とされる。新規なリスク等級別分類マーカーは、臨床の実践においてHFpEF患者を予後判定するための我々の能力を向上させるだけでなく、将来の試験においてハイリスク個体の登録を告知するために大きな価値があるだろう。

心筋線維症は、HFpEFの病理生理学において役割を果たすと考えられる（引用５、６）。線維化の増大は、コラーゲンの分解に関連する過剰な形成から生じ、最終的には、間質中の間質コラーゲン蓄積を増加させる。HFpEFにおける心筋細胞外マトリクス蓄積の増大が、剖検試料およびインビボ研究において実証されており（引用６－８）、この条件における心筋細胞外マトリクス蓄積の増大が、左室受動硬直および拡張期機能不全と相関することが示されている（引用５、８）。心筋線維症はまた、冠血流予備能低減（引用６、９）、心室同期不全および不整脈傾向の一因となり得る（引用１０、１１）。HFpEFにおける心筋線維症の役割を考えると、線維症の繊維化進行または退行の基礎となる動的プロセスを反映する単純な線維化バイオマーカーとして高い価値があるであろう（引用１０）。

心臓磁気共鳴イメージングによって測定された心筋線維症の指標である、細胞外体積分率（ECVF）は、HFpEFを有する患者における有害な転帰（引用１２、１３）またはHFpEFのリスク（引用１４）を予測することが報告されている。MRIは、前臨床研究における心筋線維症の評価、ヒトにおける早期フェーズ調査、およびいくつかの臨床的設定において重要な役割を果たすことが見込まれるが、そのコストおよび入手可能性は、世界的なフェーズIII試験および臨床的実施において、その使用を制限または妨げる可能性が高い。さらに、HFpEFを有する多くの患者は、閉所恐怖症または進行度の高い腎疾患のせいでECVF測定の候補にならない。これにより、組織線維症のバイオマーカーを普及させるための探索は、大きな課題の領域として残されている。

しかしながら、HFpEFのための適切なバイオマーカーの探索は、「線維症は単に線維症であるというだけではない」こと、および、異なる区画およびコラーゲン型のECM再建は異なる生物学的および予後的な関連性を有し得ることにより、複雑化する（引用１５）。例えば、慢性Ｂ型肝炎とＣ型肝炎の対比において、コラーゲンネオエピトープ断片と肝線維症との関連に差があることが報告されている。また、HFpEFにおいては心筋線維症が重要であると考えられているが、心臓外線維症も重要な役割を果たすことがある。例えば、HFpEFにおいて、骨格筋の線維性脂肪浸潤が報告されている（引用１６）。同様に、線維化は、動脈壁、腎臓および肝機能不全においても起こり、これらの全ては、この集団において有害な転帰の一因となり得る。

また、スピロノラクトンのようなアルドステロン拮抗剤から恩恵を受ける個体を識別することを可能にする、コラーゲン代謝回転のバイオマーカーが必要とされている。この概念は、他の集団（駆出率が減少したHF、及び／又は、心筋梗塞後のHF）での以前の研究（引用１７）において評価されているが、HFpEFでは現在のところ一つの研究がこの問題を調査しただけである（引用１８）。この以前行われた研究では、血清マトリクスメタロプロテイナーゼ－１（CITP：MMP-1）に対するコラーゲンＩ型の血清カルボキシ末端テロペプチドの比が、スピロラクタムによる１２週間の治療後に、心エコーにおける輪組織に対する僧帽流入の速度比（左心室充填圧のマーカー）の減少を示した患者を識別するように見えた（引用１８）。しかし、この研究は臨床的な事象を検討しなかった。

III型コラーゲンは、骨以外のI型コラーゲンを含む組織の大部分に発現し、結合組織、筋組織および皮膚の重要な成分である。コラーゲン型III型は、心臓血管系および他の器官におけるコラーゲンI型原繊維形成に必須である。原繊維の集合化の際中に、III型プロコラーゲン（これは、３つの同一のα鎖からなり、総分子量が４２kDaである。）のＮ－末端プロペプチドは、成熟コラーゲンが細胞外マトリクス（ECM）への取り込みに先立ち、特定のＮ－プロテアーゼによって開裂される。開裂したプロペプチドは、ECM内に保持される場合もあるし、循環中に放出される場合もある。しかし、プロペプチドの開裂が不完全で、分子に結合したプロペプチドが残る場合がある。これにより、異常な架橋を有する細いフィブリルが形成されて異常分子を引き起こし、代謝回転が急速となる傾向がある。PIIINPは、コラーゲン型IIIのＮ－末端プロペプチドであり、成熟III型コラーゲン合成の際中に除去される。それゆえ、適切な試料中のIII型コラーゲンのＮ－末端プロペプチド（PIIINP）のレベルは、コラーゲンIII型の形成および／または分解のマーカーとすることができる。

PRO-C3は、コラーゲンIII型の形成のバイオマーカーであって、コラーゲンIII型のＮ－末端プロペプチドのＣ－末端ネオ－エピトープ（すなわち、PIIINPのＣ－末端ネオ－エピトープ）を含んでおり、当該ネオ－エピトープは、ADAMTS-2によるプロ－コラーゲンからのプロペプチドの開裂後に形成される。PRO-C3バイオマーカーおよびPRO-C3アッセイ（具体的には、PRO-C3 ELISA）は、WO2014/170312に記載されている。このアッセイは、PIIINPのＣ－末端１０アミノ酸配列に特異的に結合するモノクローナル抗体を利用して、開裂後に形成されるＮ－末端プロ－ペプチドの遊離Ｃ－末端を標的とする（引用１９）。PRO-C3は、肝線維症のよく探索されたバイオマーカーであり、肝臓における線維症の負荷と、異なる肝臓の徴候を有する患者における線維症の進行および有害な転帰との両方に関連している（引用２０－２６）。

コラーゲンVI型は、細胞の基底膜中に独立した微小な原繊維ネットワークを形成することができる独特の細胞外コラーゲンである。これは、コラーゲン、ビグリカンおよびプロテオグリカンを含む他のマトリクスタンパク質と相互作用することができる。筋においては、VI型コラーゲンは筋鞘の一部となって、筋肉繊維を筋肉内細胞外マトリクスに固定することに関与し、力伝達に関与する。さらに、VI型コラーゲン内の突然変異は、Bethlem筋疾患およびUllrich先天性筋ジストロフィーを引き起こすことがある。このVI型コラーゲンα３鎖のＣ－末端アミノ酸配列は、分泌後の成熟VI型ミクロ原繊維から開裂されることが報告されている。しかし、VI型コラーゲンは、筋や筋損失に関与するだけではない。

構成鎖α1(VI)、α2(VI)およびα3(VI)からなる三重らせん状分子である微小フィラメント状間質VI型コラーゲンは、ほとんどの結合組織で発現され、脂肪組織において顕著に発現され、当該組織内において、他のECMタンパク質との相互接続を介して細胞を固定する。微小フィラメントの形成中に、VI型コラーゲンの三重らせんコアは、プロ－ペプチドからタンパク質分解的に放出され、α3(VI)鎖のＣ－末端プロ－ペプチドの開裂はエンドトロフィン、アディポカインを生成する。

PRO-C6は、コラーゲンVI型の形成およびエンドトロフィン放出のためのバイオマーカーであり、新規なコラーゲンVI型分子が細胞外マトリクス中に集合化するときに開裂するコラーゲンVI型のα3鎖のC5ドメインのＣ－末端エピトープを含んでおり、当該Ｃ－末端エピトープは、生物活性断片エンドトロフィンのＣ－末端エピトープでもある。PRO-C6バイオマーカーおよびPRO-C6アッセイ（具体的には、PRO-C6 ELISA）は、WO 2016/156526に記載されている。このアッセイは、コラーゲンVI型のα3鎖のC5ドメインのＣ－末端１０アミノ酸配列に特異的に結合するモノクローナル抗体を利用する。線維化促進性、炎症促進性および腫瘍形成促進性の分子としてのエンドトロフィンの役割は、乳癌および肝線維症の前臨床モデルにおいて観察されている（引用２７－３１）。PRO-C6は、慢性腎疾患および糖尿病性腎疾患の患者における死亡率および疾患進行のための予測バイオマーカーとして（引用３２－３４）、および、糖尿病患者におけるグルコース低下療法に対する応答性のための予測マーカーとして（引用３５）確立されている。

コラーゲンIVは、主に血管の基底膜中に見出されるコラーゲンの類型である。血管壁は、２つの主要な種類の細胞外マトリクス：すなわち、基底膜と、間質マトリクスとからなる。基底膜は、プロテオグリカンおよび種々の他の糖タンパク質に加えて、２つの独立したポリマーネットワーク：すなわち、IV型コラーゲンからなるネットワークと、ラミニンからなるネットワークとから構成されている（引用３６、３７）。基底膜中のコラーゲンIVネットワークは高度に架橋され、機械的安定性を維持すると考えられる。基底膜はまた、基底膜の分解および再建において機能する広域スペクトルプロテアーゼの広範な一群である、マトリクスメタロプロテアーゼ（MMPs）を内部に含んでいる。基底膜の足場を分解することにより、MMPsは、シグナリング機能を有するクリプティック断片を放出することができる。例えば、MMP9によるコラーゲンIVの開裂は、血管新生に関与するクリプティックサイトを露出させる（引用３７）。

C4Mは、MMP12によるα1(IV)鎖の開裂により形成されたIV型コラーゲンの断片のＮ－末端ネオ－エピトープを含む、IV型コラーゲンのMMP－媒介分解のためのバイオマーカーである。C4Mバイオマーカー、およびC4Mアッセイ（具体的には、C4M ELISA）が、以前に記載されている（引用３８）。アッセイは、当該Ｎ－末端ネオ－エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を利用する。

本発明者らは、心血管疾患のバイオマーカーとしての、PRO-C6およびpro-C3の可能性を調査した。駆出率が保持された心不全（HFpEF）患者の集団の循環におけるPRO-C6およびPRO-C3のレベルを調べた。ベースラインのPRO-C3レベルおよびPRO-C6レベルを分析し、バイオマーカーと転帰の間の関係を調べ、PRO-C3とPRO-C6は両方とも、心不全の有効な診断および予測バイオマーカーであることが見出された。

さらに、本発明者らは、アルドステロン拮抗剤による治療に反応し得る心血管疾患を有する患者のバイオマーカーとしてのC4Mの可能性も調査した。HFpEF患者におけるC4Mレベルを調べ、C4Mはアルドステロン拮抗剤スピロノラクトンによる治療に対して良好な応答を示す可能性が高い患者を識別することを見出した。

従って、第１の態様において、本発明は、患者における心血管疾患を検出および／またはモニタリングするための、および／または、患者における心血管疾患の可能性または重症度を評価するためのイムノアッセイ法であって：
（ｉ）患者からの生体液試料をVI型コラーゲンのα3鎖のC5ドメインのＣ－末端エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させること、および／または、患者からの生体液試料をIII型コラーゲンのＮ－末端プロペプチドのＣ－末端ネオ－エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させること、
（ｉｉ）工程（ｉ）で用いた各モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合量を検出して決定すること、及び、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において決定された各モノクローナル抗体の結合量を、正常な健常者に関連する値および／または既知の疾患の重症度に関連する値および／または当該患者から過去の時点において得られた値および／または所定のカットオフ値と相関させることを含む方法を提供する。

前記イムノアッセイは、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイであってもよいが、これらに限定されるものではない。イムノアッセイは、例えば、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）であり得る。このようなアッセイは、当業者にとって公知の技術である。

心血管疾患は、ある実施形態においては心不全であってもよい。特に、心血管疾患は、駆出率が保持された心不全（HFpEF）であってもよい。
本方法は、ある実施形態において、心血管疾患の結果としての患者の死亡および／または入院の可能性、および／または、有害な心血管系の事象の複合状態を評価することを含む、患者における心血管疾患の重症度を評価するための方法であってもよい。
患者は、例えば、心血管疾患の治療を受けている患者であってもよい。
患者の生体液試料は、血液、血清、血漿、尿または羊水であってもよいが、これらに限定されるものではない。好ましくは、生体液は血清または血漿である

本明細書で使用される用語”モノクローナル抗体”は、全体抗体、および、それらの断片であって、例えばFabフラグメント、F (ab')2フラグメント、単一鎖Fvフラグメント、または当業者に知られている他のそのようなフラグメントのように、全体抗体の結合特異性を保持しているものの両方を意味する。よく知られているように、全体抗体は、典型的には、２つの同一のポリペプチド鎖群が対をなす”Ｙ字形”構造を有し、対をなす要素のそれぞれは、１つの”軽”鎖と１つの”重”鎖とから構成される。軽鎖及び重鎖のそれぞれのN－末端領域は可変領域を含み、重鎖および軽鎖のそれぞれのＣ－末端部分は定常領域を構成する。可変領域は、３つの相補性決定領域（CDRs）を含んでおり、それらは主に抗原認識の原因となる。定常領域は、抗体が免疫系の細胞および分子を補充することを可能にする。結合特異性を保持する抗体フラグメントは、この結合特異性を保持するために、少なくともCDRsと可変領域の残部のうち十分な部分とを含む。

本発明の方法においては、当該技術分野で公知のいかなる定常領域を含むモノクローナル抗体も使用することができる。ヒト定常軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖に分類される。定常重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、IgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEとしての抗体のアイソタイプをそれぞれ定義する。IgGアイソタイプは、IgG1、lgG2、IgG3およびIgG4を含むいくつかのサブクラスを有するが、これに限定されるものではない。前記モノクローナル抗体は、好ましくは、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のいずれかうちの１つを含むIgGアイソタイプに属するものであってもよい。

抗体のCDRは、kabatらにより記載されているような当該技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。抗体は、それらの例に記載されるように、Ｂ細胞クローンから生成させることができる。抗体のアイソタイプは、ヒトIgM、IgGまたはIgAアイソタイプまたはヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4サブクラスに特異的なELISAによって決定することができる。生成された抗体のアミノ酸配列は、標準的な手法を用いて決定することができる。例えば、RNAを細胞から単離し、逆転写によりcDNAを生成するために使用することができる。次いで、当該cDNAを、当該抗体の重鎖および軽鎖を増幅するプライマーを用いてPCR処理する。例えば、全てのVH（可変重鎖）配列についてのリーダー配列に特異的なプライマーを、あらかじめ決定されているアイソタイプの定常領域に位置する配列に結合するプライマーと共に使用することができる。軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖の３’末端に結合するプライマーを、VカッパまたはV ラムダのリーダー配列にアニールするプライマーと共に用いて増幅することができる。全長の重鎖および軽鎖を生成し、配列決定することができる。

本発明の第１の態様にかかる方法のいくつかの実施形態においては、生体液試料は、タイプVI型コラーゲンのα3鎖のC5ドメインのＣ－末端エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触される。好ましくは、当該モノクローナル抗体は、Ｃ－末端アミノ酸配列KPGVISVMGT（配列番号１）と特異的に結合する（本明細書においては、“PRO-C6配列”または簡素に“PRO-C6”とも称する。）。好ましくは、当該モノクローナル抗体は、KPGVISVMGTA（配列番号２）である当該Ｃ－末端アミノ酸配列の伸長物、または、KPGVISVMG（配列番号３）である当該Ｃ－末端アミノ酸配列の切り詰め物を認識しないか、または、それらと特異的に結合しない。

好ましくは、Ｃ－末端アミノ酸配列KPGVISVMGT（配列番号１）に対する当該抗体の親和性と、伸長されたＣ－末端アミノ酸配列KPGVISVMGTA（配列番号２）および／または切り詰められたＣ－末端アミノ酸配列KPGVISVMG（配列番号３）に対する当該抗体の親和性との比は、少なくとも１０対１、より好ましくは、少なくとも５０対１、少なくとも１００対１、少なくとも５００対１、少なくとも１，０００対１、少なくとも１０，０００対１、少なくとも１００，０００対１、または少なくとも１，０００，０００対１である。

本明細書で使用される用語“Ｃ－末端“は、ポリペプチドの末端にある、すなわちポリペプチドのＣ－側の終末にある、Ｃ－末端ペプチド配列を意味し、その一般的な方向に意味するものと解釈されるべきではない。

PRO-C6配列に特異的に結合するモノクローナル抗体は、好ましくは下記から選ばれる１つ以上の相補性決定領域（CDRs）を含んでいてもよい：
CDR-L1：RSSQRIVHSNGITFLE（配列番号４）
CDR-L2：RVSNRFS（配列番号５）
CDR-L3：FQGSHVPLT（配列番号６）
CDR-H1：DFNMN（配列番号７）
CDR-H2：AINPHNGATSYNQKFSG（配列番号８）
CDR-H3：WGNGKNS（配列番号９）

好ましくは、上記抗体は、上記列挙されたCDR配列のうち少なくとも２、３、４、５または６を含む。

好ましくは、モノクローナル抗体の軽鎖可変領域は、下記CDR配列を含む。
CDR-L1：RSSQRIVHSNGITFLE（配列番号４）
CDR-L2：RVSNRFS（配列番号５）、及び、
CDR-L3：FQGSHVPLT（配列番号６）

好ましくは、モノクローナル抗体の軽鎖は、CDRs間にフレームワーク配列を含み、当該フレームワーク配列は、以下の軽鎖配列（CDRsは太字かつ下線を付して示し、フレームワーク配列は斜字体で示す。）内のCDRs間に存在するフレームワーク配列と実質的に同一であるか、または実質的に類似している。

好ましくは、モノクローナル抗体の重鎖可変領域は、下記CDR配列を含む。
CDR-H1：DFNMN（配列番号７）
CDR-H2：AINPHNGATSYNQKFSG（配列番号８）、及び、
CDR-H3：WGNGKNS（配列番号９）

好ましくは、モノクローナル抗体の重鎖は、CDRs間にフレームワーク配列を含み、当該フレームワーク配列は、以下の重鎖配列（CDRsは太字かつ下線を付して示し、フレームワーク配列は斜字体で示す。）内のCDRs間に存在するフレームワーク配列と実質的に同一であるか、または実質的に類似している。

本明細書において、抗体のCDRs間に存在するフレームワークのアミノ酸配列は、もしそれらが、他の抗体のCDRs間に存在するフレームワークのアミノ酸配列に対し、少なくとも７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％の類似性または同一性を有する場合には、当該他の抗体のCDRs間に存在するフレームワークのアミノ酸配列と実質的に同一のもの、または実質的に類似するものである。類似または同一のアミノ酸は、連続していてもよいし、非連続であってもよい。

フレームワーク配列は、１つ以上のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を含んでいてもよい。アミノ酸置換は、置換されたアミノ酸が元のアミノ酸と類似する化学的性質を有することを意味する保存的な置換であってもよい。当業者は、どのアミノ酸が類似する化学的性質を共有しているのか理解しているであろう。例えば、アミノ酸の以下のグループは、大きさ、帯電性、極性等の点で、類似する化学的性質を共有している：グループ１ Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；グループ２ Asp、Asn、Glu、Gln；グループ３ His、Arg、Lys；グループ４ Met、Leu、Ile、Val、Cys；グループ５ Phe、Thy、Trp。

CLUSTALプログラムのようなプログラムは、アミノ酸配列を比較するために用いることができる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較して、いずれかの適切な配列内に空間を挿入することによって、最適なアラインメントを見つけ出す。最適なアラインメントのために、アミノ酸の同一性又は類似性（同一性に加えて、アミノ酸タイプの保存性）を計算することが可能である。BLASTxのようなプログラムは、類似する配列の最も長い区間を整列し、適合する部位に値を割り振る。このようにして対比を得ることが可能であり、それぞれ異なるスコアをもち、類似性がある幾つかの領域が発見される。本発明において、この２つのタイプの分析を用いることが考えられる。同一性又は類似性は、好ましくはフレームワーク配列の全長に亘って計算される。

ある一定の好ましい実施形態において、PRO-C6配列に特異的に結合するモノクローナル抗体は、軽鎖可変領域配列：

および／または、重鎖可変領域配列：

を含んでいてもよい。（CDRsは太字かつ下線付き；フレームワーク配列は斜字体）

本発明の第１の態様にかかる方法のいくつかの実施形態においては、生体液試料は、III型コラーゲンのＮ－末端プロペプチドのＣ－末端ネオ－エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させる。好ましくは、当該モノクローナル抗体は、Ｃ－末端アミノ酸配列CPTGPQNYSP（配列番号１４）（本明細書においては、“PRO-C3配列”または簡素に“PRO-C3”とも称する。）に特異的に結合する。より好ましくは、当該モノクローナル抗体は、CPTGPQNYSPQ（配列番号１５）である当該Ｃ－末端アミノ酸配列の伸長物、または、CPTGPQNYS（配列番号１６）である当該Ｃ－末端アミノ酸配列の切り詰め物を認識しないか、または、それらと特異的に結合しない。

好ましくは、Ｃ－末端アミノ酸配列CPTGPQNYSP（配列番号１４）に対する当該抗体の親和性と、伸長されたＣ－末端アミノ酸配列CPTGPQNYSPQ（配列番号１５）および／または切り詰められたＣ－末端アミノ酸配列CPTGPQNYS（配列番号１６）に対する当該抗体の親和性との比は、少なくとも１０対１、より好ましくは、少なくとも５０対１、少なくとも１００対１、少なくとも５００対１、少なくとも１，０００対１、少なくとも１０，０００対１、少なくとも１００，０００対１、または少なくとも１，０００，０００対１である。

PRO-C3配列に特異的に結合するモノクローナル抗体は、好ましくは下記から選ばれる１つ以上の相補性決定領域（CDRs）を含んでいてもよい：
CDR-L1：RSSQNIVYSNGDTYFE（配列番号１７）
CDR-L2：KVSQRFS（配列番号１８）
CDR-L3：FQGAHDPPA（配列番号１９）
CDR-H1：GYTFINYVIH（配列番号２０）
CDR-H2：YMNPYNDVPKNNAKFRG（配列番号２１）
CDR-H3：GGFFGPLSY （配列番号２２）

好ましくは、上記抗体は、上記列挙されたCDR配列の少なくとも２、３、４、５または６を含む。

好ましくは、モノクローナル抗体の軽鎖可変領域は、下記CDR配列を含む。
CDR-L1：RSSQNIVYSNGDTYFE（配列番号１７）
CDR-L2：KVSQRFS（配列番号１８）、および、
CDR-L3：FQGAHDPPA（配列番号１９）

好ましくは、モノクローナル抗体の重鎖可変領域は、下記CDR配列を含む。
CDR-H1：GYTFINYVIH（配列番号２０）
CDR-H2：YMNPYNDVPKNNAKFRG（配列番号２１）、および、
CDR-H3：GGFFGPLSY（配列番号２２）

いくつかの実施形態においては、PRO-C3配列に特異的に結合するモノクローナル抗体は、下記軽鎖可変領域配列：

および／または、下記重鎖可変領域配列：

本発明の第１の態様にかかる方法のいくつかの実施形態においては、コラーゲンVI型のα3鎖のC5ドメインのＣ－末端エピトープに特異的なモノクローナル抗体の結合量、および／または、III型コラーゲンのＮ－末端プロペプチド（PIIINP）のＣ－末端ネオ－エピトープに特異的なモノクローナル抗体の結合量を、正常な健常者に関連する値および／または既知の疾患の重症度に関連する値および／または当該患者から過去の時点において得られた値と相関させる。

本明細書で使用される用語” 正常な健常者に関連する値および／または既知の疾患の重症度に関連する値”は、健康である、すなわち心血管疾患を有していないと考えられる被験者について上記の方法によって決定される標準化された量、および／または、既知の重症度を伴った心血管疾患を有することが分かっている被験者について上記の方法によって決定される標準化された量を意味する。

本発明の第１の態様にかかる方法のいくつかの実施形態においては、コラーゲンVI型のα3鎖のC5ドメインのＣ－末端エピトープに特異的なモノクローナル抗体の結合量、および／または、III型コラーゲンのＮ－末端プロペプチド（PIIINP）のＣ－末端ネオ－エピトープに特異的なノクローナル抗体の結合量を、１つ以上の所定のカットオフ値と比較する。

本明細書で使用される”カットオフ値”とは、患者における心血管疾患の高い可能性、または、重症度が特定レベルに属する心血管疾患を示すために統計的に決定される結合量を意味しており、当該意味において、患者試料中のバイオマーカー結合の測定値は、心血管疾患の存在または可能性がある確立、または、疾患の重症度が特定レベルに属する確立が、少なくとも７０％の確率、好ましくは少なくとも８０％の確率、好ましくは少なくとも８５％の確率、より好ましくは少なくとも９０％の確率、最も好ましくは少なくとも９５％の確率に対応する統計的カットオフ値以上である。

コラーゲンVI型のα3鎖のC5ドメインのＣ－末端エピトープに特異的なモノクローナル抗体の結合量に関する所定のカットオフ値は、好ましくは１１．０ng/mL以上、より好ましくは１６．０ng/mL以上である。PIIINPのＣ－末端ネオ－エピトープに特異的なノクローナル抗体の結合量に関する所定のカットオフ値は、好ましくは１０．０ng/mL以上、より好ましくは１４．０ng/mL以上である。これに関して、コラーゲンVI型のα3鎖のC5ドメインのＣ－末端エピトープに特異的なモノクローナル抗体の結合量が少なくとも１１ng/mLまたはそれ以上、特に少なくとも１６．０ng/mLまたはそれ以上であると測定された場合には、心血管疾患がある、および／または、入院または死亡のリスクが増大したと決定し得ることが、種々の統計的分析を組み合わせて使用することによって見出された。統計的カットオフ値を１１．０ng/mL以上、より好ましくは１６．０ng/mL以上とすることにより、本発明の方法を利用して、心血管疾患、および／または、入院または死亡のリスク増大に関して、信頼性のレベルが高い予測を与えることが可能である。同様に、PIIINPのＣ－末端ネオ－エピトープに特異的なモノクローナル抗体の結合量が少なくとも１０．０ng/mLまたはそれ以上、特に少なくとも１４．０ng/mLまたはそれ以上であると測定された場合には、心血管疾患がある、および／または、入院または死亡のリスクが増大したと決定し得ることが見出されており、統計的カットオフ値を１０．０ng/mL以上のPRO-C3、より好ましくは１４．０ng/mL以上とすることにより、本発明の方法を利用して、心血管疾患、および／または、入院または死亡のリスク増大に関して、信頼性のレベルが高い予測を与えることが可能である。このような統計的カットオフ値を適用することにより、単独の診断アッセイにつながるので、特に有利である；すなわち、診断の結論に到達するために、健康な個体および／または既知の疾患の重症度を有する患者との直接比較する必要性がなくなる。これはまた、一般的に心血管疾患を示す医学的徴候または症状（例えば、身体検査および／または医療専門家の診察によって決定されるもの）を既に有する患者を評価するためのアッセイを利用する場合には、初期の予測を確証するための迅速かつ確定的なツールとしての機能を果たすことができ、そのことによって、より侵襲性の高い処置の必要性がなくなって、適切な治療計画を速やかに開始できる可能性があるから、特に有利であり得る。また、長期間に亘って病院に滞在する必要性を回避することもできる。心血管疾患の具体的事例としては、確定的診断の迅速化によって、より早期の段階における疾患の検出につなげることができ、さらには、全体的な生存機会を改善し、および／または入院のリスクを低減することができる。

第２の態様において、本発明は、アルドステロン拮抗剤による治療を受けている患者における心血管疾患をモニタリングおよび／または心血管疾患の重症度を評価する方法を提供するが、当該方法は：
（ｉ）アルドステロン拮抗剤による治療を受けている患者からの生体液試料を、VI型コラーゲンのα3鎖のC5ドメインのＣ－末端エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させること、および／または、当該患者からの生体液試料を、III型コラーゲンのＮ－末端プロペプチドのＣ－末端ネオ－エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させること
（ｉｉ）工程（ｉ）で用いた各モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合量を検出して決定すること、及び、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において決定された各モノクローナル抗体の結合量を、正常な健常者に関連する値および／または既知の疾患の重症度に関連する値および／または当該患者から過去の時点において得られた値および／または所定のカットオフ値と相関させることを含む。

このような方法は、アルドステロン拮抗剤による治療に最適に応答する患者の識別およびモニタリングを可能にし得る。アルドステロン拮抗剤（抗鉱質コルチコイド薬としても知られている）には、スピロノラクトン、エプレレノン、カンレノン、フィネレノンおよびメキシレノンが包含される。アルドステロン拮抗剤は、スピロノラクトンであることが好ましい。
本発明の第２の態様の好適な実施形態は、第１の態様に関連して上述した通りである。

第３の態様において、本発明は、アルドステロン拮抗剤による治療に有利に応答する可能性がより高い心血管疾患を有する患者を識別する方法を提供するが、当該方法は：
（ｉ）患者からの生体液試料を、Ｎ－末端アミノ酸配列ILGHVPGMLL（配列番号２７）（本明細書においては、“C4M配列”または簡素に“C4M”とも称する。）に特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させること、
（ｉｉ）工程（ｉ）で用いた各モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合量を検出して決定すること、及び、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において決定されたモノクローナル抗体の結合量を、アルドステロン拮抗剤による治療に有利に応答する可能性が高い患者に関連する値および／またはアルドステロン拮抗剤による治療に有利に応答する可能性が低い患者に関連する値および／または所定のカットオフ値と相関させることを含む。

アルドステロン拮抗剤は、スピロノラクトンであることが好ましい。
イムノアッセイは、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイであってもよいが、これらに限定されるものではない。イムノアッセイは、例えば、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）であってもよい。

心臓血管疾患は、ある実施形態においては心不全であり得る。特に、心血管疾患は、駆出率が保持された心不全（HFpEF）であってもよい。
患者の生体液試料は、血液、血清、血漿、尿または羊水であってもよいが、これらに限定されるものではない。好ましくは、生体液は血清または血漿である。

好ましくは、モノクローナル抗体は、EILGHVPGMLL（配列番号２８）である当該Ｎ－末端アミノ酸配列の伸長物、または、LGHVPGMLL（配列番号２９）である当該Ｎ－末端アミノ酸配列の切り詰め物を認識しないか、または、それらと特異的に結合しない。

好ましくは、Ｎ－末端アミノ酸配列ILGHVPGMLL（配列番号２７）に対する当該抗体の親和性と、伸長されたＮ－末端アミノ酸配列EILGHVPGMLL（配列番号２８）および／または切り詰められたＮ－末端アミノ酸配列LGHVPGMLL（配列番号２９）に対する当該抗体の親和性との比は、少なくとも１０対１、より好ましくは、少なくとも５０対１、少なくとも１００対１、少なくとも５００対１、少なくとも１，０００対１、少なくとも１０，０００対１、少なくとも１００，０００対１、または少なくとも１，０００，０００対１である。

本明細書で使用される用語“Ｎ－末端”は、ポリペプチドの末端にある、すなわちポリペプチドのＮ－側の終末にある、Ｎ－末端ペプチド配列を意味し、その一般的な方向に意味するものと解釈されるべきではない。

非調整分析（バイオマーカーごとに１モデル）における線維化バイオマーカーの標準偏差変化に対応する主要評価項目についてのハザード比非調整分析（バイオマーカーごとに１モデル）における線維化バイオマーカーの標準偏差変化に対応する死亡または心不全入院からなる複合された評価項目についてのハザード比 Pro-C6（左）とPro-C3（右）の３分位点により等級分類された対象群の間における主要評価項目についてのカプラン－マイヤー生存曲線 Pro-C6（左）とPro-C3（右）の３分位点により等級分類された対象群の間における死亡または心不全入院からなる複合された評価項目についてのカプラン－マイヤー生存曲線

［実施例１ Pro-C6の抗体開発］
Pro-C6に特異的なモノクローナル抗体は、免疫原性ペプチドとして、VI型コラーゲンα3鎖の最後の１０個のアミノ酸（すなわち、Ｃ－末端配列^3168'KPGVISVMGT^'3177（配列番号１））を使用して、WO2016/156526（Nordic biosciences、参照することにより本明細書に組み込まれる。）に記載されているように開発された。簡単に説明すると、４－６週齢のBalb/cマウスを、免疫原性ペプチドを６０μｇ含む２００μｍのエマルジョン化抗原で皮下免疫した。安定した血清力価レベルに達するまで、フロイント不完全アジュバントを用いて２週間間隔で連続免疫を行い、２回目の免疫からマウスを採血した。各採血時に血清力価を検出し、抗血清力価が最も高く、最も生来の反応性を有するマウスを、融合のために選択した。選択されたマウスを１ヶ月休養させ、続いて、細胞融合に用いる脾臓を単離する３日前に、５０μｇの免疫原性ペプチドを含む１００μｌの０．９％塩化ナトリウム溶液を用いて静脈内ブーストを行った。

マウス脾臓細胞を、SP2/0ミエローマ融合パートナー細胞と融合させた。融合細胞を９８ウェルプレート中で育成し、CO2-インキュベーター内でインキュベートした。ここで、標準的な限界希釈を用いて、モノクローナル増殖を促進した。選択ペプチドに特異的で、かつ、伸長したペプチド（KPGVISVMGTA（配列番号２）、チャイニーズペプチドカンパニー、中国）または切り詰められたペプチド（KPGVISVMG（配列番号３）、アメリカンペプチドカンパニー、米国）のいずれとも交差反応することがない細胞株を選択し、サブクローン化した。最後に、IgGカラムを用いて抗体を精製した。

生成された抗体を配列決定し、CDRsを決定した。
鎖の配列は、以下の通りである（CDRsは下線付きかつ太字）：
［重鎖配列（マウスIgG1アイソタイプ）］

［軽鎖配列（マウスカッパアイソタイプ）］

［実施例２ Pro-C3の抗体開発］
Pro-C3に特異的なモノクローナル抗体は、免疫原性ペプチドとして、PIIINPのα1鎖の配列145'-CPTGPQNYSP-'153（配列番号１４）を使用して、WO 2014/170312（Nordic biosciences、参照することにより本明細書に組み込まれる。）に記載されているように開発された。簡単に述べると、モノクローナル抗体の生成は、４－５週齢のBalb/Cマウスを、フロイント不完全アジュバントを使用した５０μｇのPIIINPネオ－エピトープＣ－末端配列（OVA-CGG-CPTGPQNYSP（配列番号３２））を含む２００μｌのエマルジョン化抗原で皮下免疫することによって、開始させた。安定した血清力価レベルに達するまで２週間毎に免疫化を繰り返した。脾臓細胞をSP2/0ミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、半固体培地法を用いて培養皿内でクローン化した。上清を、ストレプトアビジン被覆プレートを用いた間接ELISAで、キャリブレーターペプチドおよび天然物質に対する反応性についてスクリーニングした。スクリーニングペプチドとしてビオチン-CGG-CPTGPQNYSP（配列番号３３）を用い、また、クローンの特異性をさらに試験するために、遊離ペプチドCPTGPQNYSP（配列番号１４）をキャリブレータとして使用した。

抗体が持っている生来の反応性および親和性を、ヒトおよびラットからの尿、血清および羊水（AF）のような異なる生物材料を用いて、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート上の２ｎｇ／ｍｌのビオチン化ペプチドおよび成長中のモノクローナルハイブリドーマ細胞からの上清を用いた予備的ELISAで評価した。抗体特異性は、選択除外用の伸長されたペプチド（すなわち、１０個のアミノ酸置換を有するキャリブレーターペプチドと、開裂部位に１つの付加アミノ酸を有するキャリブレーターペプチドのそれぞれ）を用いた予備的アッセイで試験した。モノクローナル抗体のアイソタイプは、Clonotyping System-HRPキット、cat. 5300-05（Southern Biotech、Birmingham、アラバマ州、米国）を用いて決定された。サブタイプは、IgG2サブタイプであると決定された。

生成された抗体を配列決定し、CDRを決定した。
鎖の配列は、以下の通りである（CDRsは下線付きかつ太字）：
［重鎖配列（マウスIgG2Aアイソタイプ）］

［軽鎖配列（マウスカッパアイソタイプ）］

［実施例３ C4Mの抗体開発］
C4Mに特異的なモノクローナル抗体は、IV型コラーゲンのα1鎖のアミノ酸１６１とアミノ酸１６２の間のMMP-12切断によって生成されるＮ－末端ネオ－エピトープ配列162'-ILGHVPGMLL-'171（配列番号２７）を免疫原性ペプチドとして用いて、以前にSandら（引用３８）が記載したように開発された（参照することにより本明細書に組み込まれる。）。簡単に述べると、モノクローナル抗体の生成は、４－６週齢のBalb/Cマウスを、フロイント不完全アジュバントを使用した５０μｇの免疫原性ペプチド（ILGHVPGMLL-GGC-KLH（配列番号３６））を含む２００μｌのエマルジョン化抗原で皮下免疫することによって、開始させた。安定した血清力価レベルに達するまで２週間目毎に免疫化を行った。血清力価が最も高いマウスを融合のために選択した。マウスを１ヶ月間休養させてから、細胞融合のための脾臓を単離する３日前に、５０μｇの免疫原性ペプチド含む１００μlの０．９％塩化ナトリウム溶液を用いて、静脈注射によりブーストさせた。マウス脾臓細胞をSP2/0ミエローマ融合パートナー細胞と融合させた。得られたハイブリドーマ細胞を、半固体培地法を用いてクローン化し、さらに成長させるために９６穴マイクロタイタープレートに移し、CO2インキュベーター内でインキュベートした。モノクローナル成長を促進するために、標準的な限界希釈を用いた。

モノクローナル抗体が持っている生来の反応性およびペプチド親和性を、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート上のビオチン化ペプチド（ILGHVPGMLL-K-ビオチン（配列番号３７））および成長中のモノクローナルハイブリドーマ細胞からの上清を用いた予備的間接ELISAで、元の試料（ヒト、ラットおよびマウスの血清、血漿、尿）の置換を行うことにより、評価した。遊離ペプチド（ILGHVPGMLL（配列番号２７））ナンセンスペプチド、および伸長されたペプチド（EILGHVPGMLL（配列番号２８））に対するクローンの特異性を試験した。モノクローナル抗体のアイソタイピングは、SBA Clonotyping System-HRPキットを用いて行った。モノクローナル抗体は、選択したクローンから採集した上清から、HiTrapタンパク質Gカラムを用いて精製し、その後、製造業者の指示に従って、Lightning link HRP標識化キットを用いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で標識化した。

最良の生来の反応性、ペプチド親和性および安定性を有するモノクローナル抗体を、マウス脾臓細胞とミエローマ細胞との融合後に生成した抗体産生クローンから選択した。選択されたクローンは、IgG1サブタイプであり、抗体は、健康なヒト、ラットおよびマウスの血清に対して、ヒト血漿EDTAと同様に反応性を示したが、伸長させたペプチドまたはナンセンスペプチドに対する反応性を示さなかった

［実施例４ PRO-C3イムノアッセイ］
PRO-C3は、WO2014/170312に記載されており、他の刊行物（引用１９）にも詳細に記載されているように、Nordic bioscienceで開発された酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて測定された。簡単に説明すると、これらの手順は以下の通りであった：
Roche社製の９６穴ストレプトアビジン被覆ELISAプレートである、cat.11940279を、コーター緩衝液（50mM PBS-BTE＋10%ソルビトール、pH 7.4）に溶解したビオチン化ペプチド、ビオチン-CGG-CPTGPQNYSP（配列番号３３）で被覆し、暗所内２０℃で３０分間インキュベートし、続いて洗浄緩衝液（20mM Tris、50mM NaCl、pH 7.2）で洗浄した。その後、２０μｌのペプチドキャリブレータまたは試料を適切な穴に添加し、続いてインキュベーション緩衝液（50 mM PBS-BTB＋10% Liquid II （Roche）、pH 7.4）に溶解した１００μlのHRP-コンジュゲートさせたモノクローナル抗体NB61N-62を添加し、プレートを４℃で２０時間インキュベートし、洗浄した。最後に、１００μｌのテトラメチルベンジジン（TMB）（Kem-En-Tec cat.：438OH）を添加し、プレートを暗所内２０℃で１５分間インキュベートし、反応を停止させるために１００μｌの停止液（1% H₂SO₄）を添加し、プレートをELISAリーダー（Molecular Devices、SpectraMax M、カリフォルニア州、米国）で、６５０ｎｍをリファレンスとして４５０ｎｍで分析した。検量線は、４パラメータ数学的適合モデルを用いてプロットした。

［実施例５ PRO-C6イムノアッセイ］
PRO-C6は、WO2016/156526号に記載されており、他の刊行物（引用３９）にも詳細に記載されているように、Nordic bioscienceで開発された酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて測定された。簡単に説明すると、これらの手順は以下の通りであった：
アッセイ開発に使用されるELISAプレートは、Rocheのストレプトアビジン被覆品（cat.：11940279）である。全てのELISAプレートを、Molecular Devices（カリフォルニア州、米国）のELISAリーダーであるSpectraMax Mで分析した。我々は、選択されたモノクローナル抗体を、製造者（Innovabioscience、Babraham、ケンブリッジ、イギリス）の指示に従って、Lightning link HRP標識キットを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で標識した。９６穴ストレプトアビジンプレートを、コーティング緩衝液（40 mM Na₂HPO₄、7 mM KH₂PO₄、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、0.1% Tween 20、1% BSA、pH 7.4）に溶解したビオチン化合成ペプチド、ビオチン-KPGVISVMGT（配列番号３８）（Chinese Peptide Company、中国）で被覆し、２０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション緩衝液（40 mM Na₂HPO₄、7 mM KH₂PO₄、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、0.1% Tween 20、1% BSA、5% Liquid II、pH 7.4）で希釈した２０μLの標準ペプチドまたは試料を、適切な穴に添加し、続いて、１００μLのHRPコンジュゲートさせたモノクローナル抗体10A3を添加し、４℃で２１時間インキュベートした。最後に、１００μｌのテトラメチルベンジジン（TMB）（Kem-En-Tec cat. 438OH）を添加し、プレートを暗所内２０℃で１５分間インキュベートした。全ての上記インキュベーション工程は３００ｒｐｍでの振盪を含んでいた。各インキュベーション工程の後、プレートを洗浄緩衝液（20mM Tris、50 mM NaCl）で5回洗浄した。TMB反応は、１００μLの停止液（1% H₂SO₄）を添加して停止し、６５０ｎｍをリファレンスとして４５０ｎｍで測定した。

［実施例６ C4Mイムノアッセイ］
C4Mは、Sandら（引用３８）に記載されているように、Nordic bioscienceで開発された酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて測定した。簡単に説明すると、これらの手順は以下の通りであった：
９６穴ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（cat. No. 11940279、Roche Diagnostics、Hvidovre、デンマーク）を、コーティング緩衝液（50 mM Tris、1%ウシ血清アルブミン、0.1% Tween-20、および0.4% bronidox（BTB）を含む。pH 8.0）に溶解させた１００μｌのビオチン化ペプチド（ILGHVPGMLL-K-ビオチン（配列番号３７））で被覆し、２０℃で３０分間インキュベートした。アッセイ緩衝液（50 mM Tris-BTB、pH 8.0）で溶解した２０μｌの標準ペプチドまたは試料を適切な穴に添加し、続いて、アッセイ緩衝液で希釈した１００μｌのコンジュゲートさせたモノクローナル抗体を添加し、２０℃で１時間インキュベートした。最後に、１００μｌのテトラメチルベンジジン（TMB）（cat. No. 4380H、Kem-En-Tec、Taastrup、デンマーク）を添加し、プレートを２０℃で１５分間インキュベートした。ＴＭＢ反応は、１００μｌの停止液（1% H₂SO₄）を添加することにより停止させた。全てのインキュベーション工程を３００ｒｐｍで振盪しながら暗所で行った後、洗浄緩衝液（20 mM Tris、50 mM NaCl、pH 7.2）中で５回洗浄した。その結果を、ELISAマイクロプレートリーダー（VersaMax、Molecular Devices、Sunnyvale、カリフォルニア州、米国）を用いて、６５０ｎｍをリファレンスとして、４５０ｎｍで分光光度的に分析した。標準曲線は、標準ペプチドの連続希釈を行い、４パラメータ数学的適合モデルを用いてプロットすることにより作成した。

［実施例７ TOPCAT試料中におけるバイオマーカー分析］
この研究では、TOPCAT試験に登録されたHFpEFを有する被験者における、III型、IV型、VI型コラーゲン形成のネオエピトープバイオマーカー（それぞれPro-C3、Pro-C4、Pro-C6）およびIII型、IV型、VI型コラーゲン分解のネオエピトープバイオマーカー（それぞれC3M、C4M、C6M）と、被験者の転帰との関係を評価した。

［方法］
［研究集団］
本研究においては、国立心肺血液研究所（National Heart, Lung, and Blood Institute）から得られたTOPCAT試験のデータおよび生体試料を使用した。親試験データは、National Institutes of Health biolinccウェブサイトを介して他の研究者が利用可能である。

TOPCAT試験の設計および研究集団の一般的な特徴は、以前の刊行物（引用４０－４２）に記載されている。簡単に説明すると、TOPCATは、２００６年８月から２０１２年１月までに６か国の２７０を超える医療施設に亘って３４４５人のHFpEFを有する成人を登録した、多拠点、国際的、無作為化、二重盲検、プラシーボ－コントロールされたスピロノラクトンの試験である。試験の一次結果は以前に公表されている（引用４２）。全ての研究参加者は、署名した同意書を提出した。

TOPCATの包含基準は次の通りであった：年齢≧５０歳；研究スクリーニングのときに少なくとも１つのＨＦ症状およびスクリーニング前１２か月以内に少なくとも１つのＨＦ徴候があることに基づいてＨＦであると診断；左心室ＥＦ≧４５％（局所読み当たり）；研究スクリーニング前１２か月以内に少なくとも１回のＥＦ入院、または、スクリーニング前６０日以内にＢＮＰ（Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド）＞１００ｐｇ／ｍＬまたはＮＴ―ｐｒｏＢＮＰ（N－末端pro-BNP）＞３６０ｐｇ／ｍＬ（高ナトリウム利尿ペプチドレベルについて他の説明ができない）；および、無作為化前の血清カリウム＜５．０ｍｍｏｌ／Ｌ（引用４０、４２）。

排除基準は、以前に詳細に公表されている（引用４０）が、余命＜３年の重度な全身性疾患、重大な慢性肺疾患、浸潤性または肥厚性の心筋症、収縮性心膜炎、心臓移植またはＬＶ補助装置の既往、既知の慢性肝疾患、重度の慢性腎疾患（糸球体濾過速度［eGFR］＜１．７３ｍ^２当たり３０ｍＬ／ｍｉｎまたは血清クレアチニン≧２．５ｍｇ／ｄＬと推定されるものとして定義される。）、重大な高カリウム血症の履歴、アルドステロン拮抗剤に対する既知の不耐性および最近の心筋梗塞、冠状動脈バイパス移植、または、経皮的冠動脈形成は包含される。

試験の主な目標は、スピロノラクトンが、心臓血管系の死亡、心停止による打ち切りまたは心不全入院からなる複合的な転帰の減少に関連しているかどうかを判定することであった。全てのＨＦ入院は、以前に記載されたように（引用４０）、事前に明記された基準に従ってBrigham and Women's病院で臨床評価項目委員会によって調整され、研究－薬物割り当てが盲検化された。この分析において、我々は、バイオマーカーと組織線維化と：（１）上記で定義した主要評価項目；（２）HFpEF研究においてますます利用されている死亡または心不全入院からなる複合的な評価項目（引用４３）との間の関係を調べた。
試験集団において有意な地域的変動がある場合には（引用６）、本研究における分析は、アメリカにおいて登録された被験者に限定された。

［バイオマーカーアッセイ］
保管されていた血漿試料は、アメリカにおいて登録され、保管されていた血漿がベースライン検査（ｎ＝２０６）からあった全ての参加者について、Biolinccから取得した。
コラーゲン形成の特異的バイオマーカー（Pro-C3、Pro-C4およびPro-C6）および分解の特異的バイオマーカー（C3M、C4MおよびC6M）を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて測定した。Pro-C3、Pro-C6およびC4MのELISAは、上記のように実施した（それぞれ実施例４、５および６を参照）。Pro-C4はコラーゲンIV型形成の既知のバイオマーカーであり、Pro-C4 ELISAはLeemingら（引用４４）に記載された方法で行った。C3MおよびC6Mは、それぞれ、コラーゲン型III分解およびコラーゲン型VI分解の既知のバイオマーカーであり、C3MおよびC6M ELISAは、それぞれBarascukら（引用４５）およびJuhl ら（引用４６）に記載された方法で行った。
NT-proBNPレベルは、検証されたLuminex（登録商標）ビーズベースのマルチプレックスアッセイを用いて測定した（Bristol Myers-Squibb；Ewing Township、ニュージャージー州）。

［統計解析］
参加者の特徴は、正規分布する変数については平均（SD）を用い、非正規分布する連続的変数については中央値（四分位点間領域）を用いて要約した。分類別の変数はカウント（百分率）として表現される。アメリカにおいて登録され、注目しているバイオマーカーの測定のために利用可能な試料がある被験者と、アメリカにおいて登録され、利用可能な試料がない被験者を比較した。正規分布する変数については２標本ｔ検定を用い、非正規分布する変数についてはクルスカル－ワリス検定を用い、分類別の変数についてはカイ二乗検定またはフィッシャーの正確確率検定を適宜用いた。

バイオマーカーと主要な転帰（心臓血管系の死亡、心停止による打ち切りまたは心不全入院）との間の関係、ならびにＨＦ入院または全ての原因による死亡からなる複合的な転帰との関係は、コックス回帰を用いて評価された。各バイオマーカーの３分位点間のカプラン－マイヤー生存曲線を描き、これらをログランク検定を用いて比較した。非調整の群が、交絡因子と無関係であるか否かを評価するために、（１）人口統計学的、臨床および実験室的な複数の変数を組み込んだＭＡＧＧＩＣリスクスコア（モデル１）（引用４７）；（２）ＭＡＧＧＩＣリスクスコアにＮＴ―ｐｒｏＢＮＰレベルを追加（モデル２）；（３）年齢、性別、糖尿病状態、推定される糸球体濾過速度、収縮期血圧（SBP）、および、ＮＹＨＡ重症度III/IVと心筋梗塞の履歴を含む、経験的に選択された重要な個々の臨床的共変量（モデル３）を含む、調整されたコックスモデルを適宜組み立てた。バイオマーカー間の直感的な比較を提供するために、全てのバイオマーカーについてハザード比を標準化した（標準偏差増加当たり、または、zスコアにおける１ポイント増加当たりで表現される。）。

最後に、各バイオマーカーのランダム化前のレベルと、ランダム化されたスピロノラクトンによる処置との間の相互作用を、上記した評価項目の予測変数として試験した。相互作用が認められた場合には、前記バイオマーカーの中央値に応じて等級分類された生存解析を行い、スピロノラクトン処置の効果を評価した。
統計学的有意性は、両側検定ｐ値＜0.05として定義された。提示された全ての確率値は、両側検定によるものである。統計分析は、Matlab statistics and machine learning toolbox（Matlab 2016b, the Mathworks；Natwick、マサチューセッツ州）およびSPSS for Mac v22（SPSS Inc.、Chicago、イリノイ州）を用いて行った。

［結果］
表１に、アメリカで登録された試験参加者であってバイオマーカー測定のために利用可能な凍結生体試料があった者と、アメリカで登録された試験参加者であって同試料がなかった者との比較を示す。年齢または性別におけるサブグループ間に有意な差はなかった。利用可能な試料がある被験者は、白人の参加者がわずかに大きな割合を示し（85.44対77.36%）、黒人の参加者がわずかに低い割合（12.62対17.7%）を示した。ＮＹＨＡ重症度がIII-IVの罹患率、心筋梗塞、脳卒中、末梢動脈疾患または糖尿病の履歴は、サブグループ間で異なることはなかったが、利用可能な試料がある参加者の間で、ＣＯＰＤの罹患率は低く、高血圧および心房細動の罹患率は大きかった。抗高血圧薬、利尿剤、グルコース低下剤、および、ＡＣＥ阻害剤／ＡＲＢの使用は、群間の差がなかった。利用可能な試料を有する被験者は、スタチン投与を受けている場合がより多かった。

［組織線維化のベースラインバイオマーカーと転帰の関係］
図１Ａは、非調整分析における主要評価項目について試験された全ての線維化バイオマーカー（バイオマーカーごとに１モデル）の標準化されたハザード比を示す。図１Ｂは、死亡または心不全入院について対応する標準化されたハザード比を示す。これらの分析において、Pro-C6（HR=1.90；95%Cl=1.54-2.34；P<0.0001）およびPro-C3（HR=1.57；95%Cl=1.28-1.94；P<0.0001）は、試験の主要評価項目を強く予測した。同様に、Pro-C6（HR=1.94；95%Cl=1.60-2.35；P<0.0001）およびPro-C3（HR=1.56；95%Cl=1.29-1.89；P<0.0001）は、死亡または心不全入院からなる複合された評価項目を予測した。

図２は、それぞれPro-C6（左）及びPro-C3（右）の３分位点に対応する主要評価項目についてのカプラン－マイヤー生存曲線を示す。Pro-C6は、広範囲の絶対リスクに亘って被験者を等級分類した。Pro-C6の低い３分位点（Pro-C6 <11.0 ng/ml）から高い３分位点（Pro-C6 >16.0 ng/ml）に至るまで、無再発生存における顕著な減少があると等級付けされた。Pro-C3については、高い３分位点（Pro-C3 >14.0 ng/ml）のみが無再発生存の顕著な減少を示した。図３に示すように、死亡または心不全入院についても同様のパターンが見出された。

Pro-C6とPro-C3の両方が含まれているモデルでは、Pro-C6は、主要評価項目（HR=1.84；95%Cl=1.36-2.47；P<0.0001）および死亡／ＨＦ入院（HR=1.92；95%Cl=1.46-2.53；P<0.0001）を、独立的に予測した。それとは対照的に、これらのモデルでは、Pro-C3は、主要評価項目（HR=1.06；95%Cl=0.76-1.46；P=0.74）または死亡／ＨＦ入院（HR=1.01；95%Cl=0.75-1.37；P=0.93）のいずれとも、有意に関連していなかった。同様に、Pro-C6（連続変数として）と、Pro-C3レベル >14ng/mL（２値変数として表される高い３分位点の分布）の両方が含まれているモデルでは、Pro-C6の状態によって主要評価項目および死亡／HF入院を独立して予測したが、Pro-C3の状態によって予測することはできなかった。

次に、Pro-C6のみについて調整分析を行った（表２）。ＭＡＧＧＩＣリスクスコアについて調整されたモデルにおいて、ProC6は、主要評価項目（HR=1.88；95%Cl=1.52-2.33；P<0.0001）および死亡／HF入院（HR=1.91；95%Cl=1.57-2.33；P<0.0001）を、強く予測した。Pro-C6についてのハザード比は、ＮＴ－ＰｒｏＢＮＰの追加調整を行った場合（調整されたモデル２、表２）と非常に類似していた。Pro-C6のために調節された場合、ＮＴ－ＰｒｏＢＮＰは転帰を弱く予測しただけに止まり、一方、ＭＡＧＧＩＣリスクスコアは主要評価項目または死亡／ＨＦ入院を予測できなかった。
同様に、年齢、性別、糖尿病状態、推定される糸球体濾過速度、ＳＢＰ、ＮＹＨＡ重症度III/IV、および心筋梗塞の履歴が調整されたモデル（調整されたモデル３、表２）においては、Pro-C6は、主要評価項目（HR=1.81；95%Cl=1.44-2.27；P<0.0001）および死亡／ＨＦ入院からなる評価項目（HR=1.84；95%Cl=1.49-2.26；P<0.0001）を、強く予測した。

表２に示すように、主要評価項目については、Pro-C6単独のみを含むモデル（0.705）に関するハレルのＣ－統計値が、ＭＡＧＧＩＣリスクスコアを含むモデルに関するハレルのＣ－統計値（0.552）、ＭＡＧＧＩＣリスクスコアにＢＮＰを追加したモデルに関するハレルのＣ－統計値（0.582）または調整されたモデル３に含まれる臨床的変数の組み合わせを含むモデル（0.64）と比べて、はるかに高かった。同様に、死亡／心不全関連の入院については、Pro-C6単独のみを含むモデルに関するハレルのＣ－統計値（0.707）が、ＭＡＧＧＩＣリスクスコアを含むモデル（調整されたモデル１：0.571）、ＭＡＧＧＩＣリスクスコアにＢＮＰを追加したモデル（調整されたモデル２：0.602）または臨床的変数の組み合わせを含むモデル（調整されたモデル３：0.623）と比べて、はるかに高かった。従って、ＭＡＧＧＩＣリスクスコアを既に含んでいるモデル、ＭＡＧＧＩＣリスクスコアにＢＮＰを追加したモデル、または臨床的変数の組み合わせを既に含んでいるモデルへのPro-C6の追加は、ハレルのＣ－統計値を著しく向上させた（表２）。

＊カッコ内の数字は、予測された標準誤差を表す。
調整されたモデル１：ＭＡＧＧＩＣリスクスコアのために調整される。
調整されたモデル２：ＭＡＧＧＩＣリスクスコアおよびＮＴ―ｐｒｏＢＮＰレベルのために調整される。
調整されたモデル３：年齢、性別、糖尿病、推定される糸球体濾過速度、収縮期血圧（SBP）、ＮＹＨＡ重症度III/IVおよび心筋梗塞の履歴のために調整される。

［無作為化された群との相互作用］
C4Mのベースラインレベルと無作為化された治療群との間の有意な相互作用は、主要評価項目（C4M-治療群についてのP=0.0061）および死亡／ＨＦ入院（C4M-治療群についてのP=0.0063）の予測変数として見出され、ベースラインにおいてより低いC4Mレベルを有する参加者の間で治療に対してより好ましい応答を示す。他の検査された線維化バイオマーカーについては、治療群との相互作用が見られなかった。

［ディスカッション］
ＴＯＰＣＡＴ試験で登録された参加者のベースラインにおいて測定されたECM代謝回転のバイオマーカー間の関係が研究された。Pro-C6およびPro-C3は、それぞれVI型およびIII型のコラーゲン形成について評価される線維形成のバイオマーカーであって、心臓血管事象が発生する危険性を予測したこと、並びに、この集団における全ての原因の死亡／ＨＦ関連の入院からなる複合された評価項目を予測することが実証された。特に、Pro-C6は、これらの転帰および広範囲の絶対リスクに亘り等級分類された被験者の強い独立した予測変数であった。Pro-C6単独は、ＭＡＧＧＩＣリスクスコア、ＮＴ－ＰｒｏＢＮＰまたは臨床的変数の組み合わせよりも、転帰の予測変数としてより良好に機能した。ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰレベルの追加の調整を伴うまたは伴わないＭＡＧＧＩＣリスクスコアへのPro-C6の追加は、ハレルのＣ－統計値の顕著な増加、モデル適合の尺度、および、レシーバー－オペレーター特性曲線に類似する識別をもたらした。さらに、コラーゲンIV型分解のバイオマーカー（主として血管基底膜中に存在する）であるC4Mのレベルと、スピロノラクトン対プラシーボに対する不作為化に関連するリスク低減との間に、相互作用が見出された。これらのポストホック分析において、より高いC4Mレベルを有する被験者が、スピロノラクトンに対する無作為化からより大きな利益を引き出すと思われた。これらの知見は、HFpEFにおける組織線維化にとって重要な役割を支持し、容易に測定されるＥＣＭ代謝回転のバイオマーカーを特定し、この集団におけるリスク等級分類のための様々な設定において実行することが可能であろう。

本研究において、高いレベルのPro-C6は、転帰を強く予測した。このバイオマーカーの顕著な予測力は、ＭＡＧＧＩＣリスクスコア、ＭＡＧＧＩＣリスクスコアにＮＴ―ｐｒｏＢＮＰレベルを追加、および、重要な臨床的変数の組み合わせのそれを、大きく超えていることに留意することが重要である。さらに、Pro-C6は、これらの予測因子を既に含んでいるモデルの識別を著しく向上させる；これと対照的に、既にPro-C6を含むモデルに標準的な予測変数を付加すると、モデル適合のごく小さな改善がもたらされた。従って、Pro-C6は、HFpEFにおける転帰の特に強力で堅牢な独立した予測変数であると思われる。従って、Pro-C6は、FpEFの診断において、抗線維症治療のための良好な候補を特定するために、および／または、そのような治療の有効性をモニタリングし特徴付けるために、有用であり得る。

本研究の特に興味深い発見は、C4Mと、無作為化されたスピロノラクトンによる治療に関連するリスク調整との間の有意に高い相互作用である。これらの知見は、コラーゲン代謝回転のバイオマーカーがスピロノラクトンから利益を受ける個体を特定することができるという概念を支持する。本研究は、第１に、コラーゲン代謝回転のバイオマーカーと、スピロノラクトン療法に関連する臨床事象のリスクの低減との間の相互作用を報告するものである。より低いC4Mレベルは、スピロノラクトン不作為化に関連するリスクのより大きな減少に関連していることが見出された。C4Mは、コラーゲン分解のマーカーである；したがって、低レベル化は、分解の低減と、それに伴うコラーゲン蓄積の増加を示し、スピロノラクトンの治療対象となる。

コラーゲンIVは、血管にだけでなく、尿中への血漿タンパク質の漏出を防止する糸球体基底膜中にも存在する。しかしながら、興味深いことに、C4Mは、本研究の集団におけるアルブミン尿には関連しなかった。同様に、C4Mの変化とスピロノラクトンの間の顕著な相互作用とは対照的に、ＴＯＰＣＡＴ試験（引用４８）の最近の分析において、蛋白尿症とスピロノラクトン治療との間に相互作用は認められなかった。したがって、C4Mとスピロノラクトン効果との相互作用は、糸球体基底膜の分解によって媒介されにくい。

要約すれば、Pro-C6によって評価される線維形成は、HFpEFにおける予後不良を強く独立的に予測することができる。これとは対照的に、低レベルのC4Mは、アルドステロン拮抗剤（鉱質コルチコイド受容体拮抗薬）に対して特に好ましい応答を示すHFpEF患者を特定すると思われる。

本明細書において、他に明記のない限り、単語「又は（or）」は、述べられた条件の一方又は両方が満たされる場合に真値を返す演算子という意味で用いられており、これと対照的なのは、複数ある条件の中の１つだけ満たすことを要する「排他的ＯＲ（exclusive or）」という演算子である。単語「を含む（comprising）」は「を含む（including）」という意味で用いられているのであって、「からなる（consisting of）」という意味ではない。上記で認めた全ての従来の教示は本明細書に参照することにより組み込まれる。本明細書における先に発行された文献のいかなる認識も、該文献の教示が本明細書の時点におけるオーストラリア又は他国の共通の一般知識であるという自白又は表明として捉えるべきではない。

［参考文献］
１．ラムＣＳ、ドナルＥ、クレイガー－クレイナーＥ、バサンＲＳ。駆出率が保持された心不全の疫学および臨床的過程。
Eur J Heart Fail 2011；13：18-28
２．ロイド－ジョーンズＤＭ、ホンＹ、ラバルスＤほか。心臓血管の健康増進および疾患の減少のための国家的目標の定義と設定：American Heart Associationの２０２０年及び将来に向けての戦略的インパクトゴール。
Circulation 2010；121：:586-613
３．ラムＣＳ、ドナルＥ、クレイガー－クレイナーＥ、バサンＲＳ。駆出率が保持された心不全の疫学および臨床的過程。
Eur J Heart Fail 2011；13：18-28
４．カイリノスＪＡ。ＨＦｐＥＦにおける全身動脈血行動態の深い表現型分類（パート２）：臨床および治療上の考慮。
J Cardiovasc Transl Res 2017；10：261-274
５．ロメルＫＰ、フォンローデルＭ、ラツシンスキＫほか。心不全および保持された駆出率を有する患者の特徴付けのための細胞外容積画分。
J Am coll Cardiol 2016；67：1815-25

６．モハムドＳＦ、フサインＳ、ミルゾエフＳＡ、エドワーズＷＤ、マレスゼウスキＪＪ、レッドフィールドＭＭ。保持された駆出率をもつ心不全における冠微小血管希薄化および心筋繊維症。
Circulation 2015；131：550-9
７．カイリノスＪＡ、エイカーＳＲ、トライユＬほか。心不全、左心室再建、および循環一酸化窒素代謝物。
J Am Heart Assoc 2016；5
８．スＭＹ、リンＬＹ、ツエンＹＨほか。ＣＭＲ－検証されたびまん性心筋線維症は、ＨＦｐＥＦにおける拡張期機能不全と関連している。
JACC Cardiovasc Imaging 2014；7：991-7
９．モハムドＳＦ、マジュレＤＴ、レッドフィールドＭＭ。駆出率が保持された心不全における微小脈管構造への接近。
Circ Heart Fail 2016；9
１０．リチャーズＡＭ。心臓線維化の循環バイオマーカー：いかなるものがあり、どんな用途があるのか？
Circ Heart Fail 2017；10

１１．リンＬＹ、ウーＣＫ、ユアンＪＭほか。心筋領域間質線維症は、心不全患者における左心室内同期不全と関連している：心臓血管系磁気共鳴研究。
Sci Rep 2016；6：20711
１２．デュカＦ、カメルランデルＡＡ、ゾッター－テュファロＣほか。駆出率が保持された心不全における間質線維化、機能状態および転帰：心磁気共鳴イメージングの前向き研究からの洞察。
Circ Cardiovasc Imaging 2016；9
１３．ロイＣ、スリマニＡ、ダミーステルＣほか。駆出率が保持された心不全における心血管磁気共鳴によるびまん性心筋線維症の関連性および予後の重要性
J Cardiovasc Magn Reson 2018；20：55
１４．シェルベルトＥＢ、フリドマンＹ、ウォンＴＣほか。心筋線維症と駆出率が保持された心不全との間の時間的関係：ベースライン疾患の重症度とその後の転帰との関連。
JAMA Cardiol 2017
１５．ニールセンＭＪ、カルスダルＭＡ、カザンコフＫほか。線維症は、ただ線維症というものではない－基底膜構築およびコラーゲン代謝はＢ型肝炎誘導損傷とＣ型肝炎誘導損傷との間で異なる。
Aliment Pharmacol Ther 2016；44：1242-1252

１６．ハイコウスキＭＪ、コウバＥＪ、ブルベーカーＰＨ、ニクラスＢＪ、エッゲビーンＪ、キツマンＤＷ。骨格筋組成および駆出率が保持された心不全の高齢患者における運動不耐性との骨格筋組成の関係
Am J Cardiol 2014；113：1211-6
１７．ロシノルＰ、フェレイラＪＰ、ザナドＦ。線維化機構の表現型分類および心不全におけるバイオマーカーを用いた抗線維化応答の決定：単一バイオマーカーでは全ての設定に適合しないことがある。
Eur J Heart Fail 2018；20：1300-1302
１８．ラバッサＳ、トリッペルＴ、バッハＤほか。心筋線維症のバイオマーカーに基づく表現型分類は、スピロノラクトンの有益な効果に対して抵抗性をもつ駆出率が保持された心不全の患者を特定する：Aldo-DHF試験からの結果。
Eur J Heart Fail 2018；20：1290-1299
１９．ニールセンＭＪ、ネデルガアルドＡＦ、スンＳほか。ネオ－エピトープ特異的PRO-C3 ELISAは、肝臓および筋肉パラメータに関連するIII型コラーゲンの真の形成を測定する。
Am. J. Transl. Res. 2013；5：303-315
２０．ニールセンＭＪ、ベイダルＳＳ、カルスダルＭＡほか。血漿Pro-C3（Ｎ－末端III型コラーゲンプロペプチド）は、慢性Ｃ型肝炎患者における線維化進行を予測する。
Liver Int. 2015；35：429-437

２１．ダニエルズＳＪ、リーミングＤＪ、エスラムＭほか。PRO-C 3を組み込んだアルゴリズムが、ＮＡＦＬＤおよび高度線維化を有する患者を正確に特定する。
Hepatology 2018
２２．リーミングＤＪ、カルスダルＭＡ、バイルジャルセンＩほか。門脈高血圧の検出のための細胞外マトリクスタンパク質の新規な血清学的ネオ－エピトープマーカー
Aliment. Pharmacol. Ther. 2013；38：1086-96
２３．ヤンセンＣ、リーミングＤＪ、マンドルフェルＭほか。ＨＩＶ／ＨＣＶ共感染を有する患者におけるPRO-C3レベルは、線維化の段階および門脈高血圧の程度を反映している。
Avila MA, ed. PLoS One 2014；9：e108544
２４．カルスダルＭＡ、ヒュレルＳＴ、ルオＹほか。血清学的コラーゲン代謝回転プロファイルによる肝線維症の進行および後退の評価
Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2019；316：G25-G31
２５．ニールセンＳＨ、マイガインドＮＤ、ミチェルセンＭＭほか。閉塞性冠動脈疾患のない狭心症を有する女性において促進されたコラーゲン代謝回転：ｉＰＯＷＥＲサブスタディ
Eur. J. Prev. Cardiol. 2018；25：719-727

２６．ハンセンＪＦ、ジュールニールセンＭ、ナイストラムＫほか。PRO-C3：慢性Ｃ型肝炎患者における肝線維症のための新規かつより精密なコラーゲンマーカー。
Scand. J. Gastroenterol. 2018；53：83-87
２７．パークＪ、シェレールＰＥ、カルレＥほか。脂肪細胞誘導のエンドトロフィンは、悪性腫瘍の進行を促進する。
J. Clin. Invest. 2012；122：4243-4256
２８．リーＣ、キムＭ、リーＪＨほか。COL6A3誘導のエンドトロフィンは慢性肝疾患の病態における肝細胞間の相互作用に関連する。
J. Pathol. 2018
２９．サンＫ、パークＪ、ギュプタＯＴほか。エンドトロフィンは、脂肪組織の線維化および代謝機能障害を誘発する。
Nat. Commun. 2014；5：3485
３０．パークＪ、モーリーＴＳ、シェレールＰＥ。エンドトロフィンの阻害、コラーゲンVIの開裂生成物は、腫瘍にシスプラチン感受性を付与する。
EMBO Mol. Med. 2013；5：935-48

３１．ブＤ、クレウェＣ、クスミンスキＣＭほか。悪性腫瘍増殖の促進因子としてのヒトエンドトロフィン
JCI Insight 2019
３２．ラスムッセンＤＧＫ、ハンセンＴＷ、フォンショルテンＢＪほか。より高いコラーゲンVI形成は、２型糖尿病および微量アルブミン尿を有する患者における全ての原因の死亡に関連している。
Diabetes Care 2018：dc172392
３３．フェントンＡ、ジェスキーＭＤ、フェッロ CJ ほか。血清エンドトロフィン、VI型コラーゲン開裂産物は、慢性腎疾患における死亡率の増加と関連している。
Aguilera Al, ed. PLoS One 2017；12：e0175200
３４．ラスムッセンＤＧＫ、フェントンＡ、ジェスキーＭほか。尿エンドトロフィンは、慢性腎疾患患者における疾患進行を予測する。
Sci Rep. 2017；7：17328
３５．カルスダルＭＡ、ヘンリクセンＫ、ジェノベーゼＦほか。血清エンドトロフィンは、２型糖尿病におけるPPARγアゴニストに対する最適な応答者を特定する。
Diabetologia 2017；60

３６．ティンプルＲ。基底膜の高分子組織。
Curr Opin Cell Biol 1996；8：618-24
３７．ヤイヤデフＲ、シェルウッドＤＲ。基底膜。
Curr Biol 2017；27：R207-R211
３８．サンドＪＭ、ラーセンＬ、ホガボアムＣほか。VI型コラーゲンα１およびα３鎖のＭＭＰ媒介分解は実験的および臨床的な線維症における基底膜再建を反映している－２つの新規バイオマーカーアッセイの検証
PLoS One 2013；8：e84934
３９．サンＳ、ヘンリクセンＫ、カルスダルＭＡほか。長期間固定化に対する応答におけるコラーゲンIII型およびVI型の代謝回転
PLoS One 2015；10：e0144525
４０．デサイＡＳ、ルイスＥＦ、リＲほか。アルドステロン拮抗剤を用いた心機能が保持された心不全の治療試験の原理および設計：駆出率が保持された症候性心不全の患者におけるスピロノラクトンの無作為化され、制御された研究。
Am. Heart J. 2011；162：966-972.e10

４１．フェッファーＭＡ、クラゲットＢ、アスマンＳＦほか。心機能が保持された心不全のアルドステロン拮抗剤を用いた治療（ＴＯＰＣＡＴ）試験における患者および転帰の地域的な変動。
Circulation 2015；131：34-42
４２．ピットＢ、フェッファーＭＡ、アスマンＳＦほか。駆出率が保持された心不全のためのスピロノラクトン。
N Engl J Med 2014；370：1383-92
４３．ラムＣＳＰ、ガンブルＧＤ、リンＬＨほか。国際的な多民族集団の前向き研究における駆出率が保持された心不全と、駆出率が低下した心不全に関連する死亡率。
Eur Heart J 2018；39：1770-1780
４４．リーミングＤＪ、ニールセンＭＪ、ダイＹほか。コラーゲンIV型の7Sドメイン（P4NP 7S）に特異的な酵素結合免疫吸着血清アッセイ：肝線維形成中の細胞外マトリクス再建に関連するマーカー。
Hepatol Res 2012；42：482-93
４５．バラスククＮ、ベイダルＳＳ、ラーセンＬほか。肝線維症に関連する細胞外マトリクス再建のための新規なアッセイ：MMP-9タンパク質分解により明らかにされたIII型コラーゲンのネオ－エピトープのための酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）
Clin Biochem 2010；43：899-904

４６．ジュールＰ、ベイ－ヤンセンＡＣ、カルスダルＭ、シーバーＡＳ、フランチモントＮ、チャベツＪ。びまん性全身性強皮症の診断ツール可能性としてのコラーゲン代謝回転の血清バイオマーカー
PLoS One 2018；13：e0207324
４７．ポコクＳＪ、アリタイＣＡ、マクマレイＪＪほか。心不全における生存予測：３０の研究からの39372人の患者に基づくリスクスコア。
Eur Heart J 2013；34：1404-13
４８．セルバラジＳ、クラゲットＢ、シャーＳＪほか。駆出率が保持された心不全におけるアルブミン尿の予後値およびスピロノラクトンの影響
Circ Heart Fail 2018；11：e005288

Claims

患者における心血管疾患を検出および／またはモニタリングするための、および／または、患者における心血管疾患の可能性または重症度を評価するためのイムノアッセイ法であって、当該方法は：
（ｉ）患者からの生体液試料をVI型コラーゲンのα3鎖のC5ドメインのＣ－末端エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させること、および／または、患者からの生体液試料をIII型コラーゲンのＮ－末端プロペプチドのＣ－末端ネオ－エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させること、
（ｉｉ）工程（ｉ）で用いた各モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合量を検出して決定すること、及び、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において決定された各モノクローナル抗体の結合量を、正常な健常者に関連する値および／または既知の疾患の重症度に関連する値および／または当該患者から過去の時点において得られた値および／または所定のカットオフ値と相関させることを含む。
前記心血管疾患が心不全である、請求項１に記載の方法。
前記心血管疾患が、駆出率が保持された心不全（HFpEF）である、請求項２に記載の方法。
前記方法は、心血管疾患の結果としての患者の死亡および／または入院の可能性、および／または、有害な心血管系の事象の複合状態を評価することを含む、患者における心血管疾患の重症度を評価するための方法である、請求項１に記載の方法。
前記患者は、心血管疾患の治療を受けている患者である、請求項１に記載の方法。
工程（ｉ）が、患者からの生体液試料を、VI型コラーゲンのα3鎖のC5ドメインのＣ－末端エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
前記モノクローナル抗体が、Ｃ－末端アミノ酸配列KPGVISVMGT（配列番号１）に特異的に結合する、請求項６に記載の方法。
前記モノクローナル抗体が、KPGVISVMGTA（配列番号２）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の伸長物、または、KPGVISVMG（配列番号３）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の切り詰め物を認識しないか、または、それらと特異的に結合しない、請求項７に記載の方法。
工程（ｉ）が、患者からの生体液試料を、III型コラーゲンのＮ－末端プロペプチドのＣ－末端ネオ－エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
前記モノクローナル抗体が、Ｃ－末端アミノ酸配列CPTGPQNYSP（配列番号１４）に特異的に結合する、請求項９に記載の方法。
前記モノクローナル抗体が、CPTGPQNYSPQ（配列番号１５）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の伸長物、または、CPTGPQNYS（配列番号１６）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の切り詰め物を認識しないか、または、それらと特異的に結合しない、請求項１０に記載の方法。
前記生体液が血清または血漿である、請求項１に記載の方法。
前記イムノアッセイが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイである、請求項１に記載の方法。
前記イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイである、請求項１に記載の方法。
アルドステロン拮抗剤による治療を受けている患者における心血管疾患をモニタリングおよび／または心血管疾患の重症度を評価する方法であって、当該方法は：
（ｉ）アルドステロン拮抗剤による治療を受けている患者からの生体液試料を、VI型コラーゲンのα3鎖のC5ドメインのＣ－末端エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させること、および／または、当該患者からの生体液試料を、III型コラーゲンのＮ－末端プロペプチドのＣ－末端ネオ－エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させること
（ｉｉ）工程（ｉ）で用いた各モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合量を検出して決定すること、及び、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において決定された各モノクローナル抗体の結合量を、正常な健常者に関連する値および／または既知の疾患の重症度に関連する値および／または当該患者から過去の時点において得られた値および／または所定のカットオフ値と相関させることを含む。
アルドステロン拮抗剤がスピロノラクトンである、請求項１５に記載の方法。
前記心血管疾患が心不全である、請求項１５に記載の方法。
前記心血管疾患が、駆出率が保持された心不全（HFpEF）である、請求項１７に記載の方法。
請求項１５に記載の方法であって、前記方法は、心血管疾患の結果としての患者の死亡および／または入院の可能性、および／または、有害な心血管系の事象の複合状態を評価することを含む、患者における心血管疾患の重症度を評価するための方法である。
工程（ｉ）が、患者からの生体液試料を、VI型コラーゲンのα3鎖のC5ドメインのＣ－末端エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
前記モノクローナル抗体が、Ｃ－末端アミノ酸配列KPGVISVMGT（配列番号１）に特異的に結合する、請求項２０に記載の方法。
前記モノクローナル抗体が、KPGVISVMGTA（配列番号２）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の伸長物、または、KPGVISVMG（配列番号３）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の切り詰め物を認識しないか、または、それらと特異的に結合しない、請求項２１に記載の方法。
工程（ｉ）が、患者からの生体液試料を、III型コラーゲンのＮ－末端プロペプチドのＣ－末端ネオ－エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させることを含む、請求項１５に記載の方法。
前記モノクローナル抗体が、Ｃ－末端アミノ酸配列CPTGPQNYSP（配列番号１４）に特異的に結合する、請求項２３に記載の方法。
前記モノクローナル抗体が、CPTGPQNYSPQ（配列番号１５）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の伸長物、または、CPTGPQNYS（配列番号１６）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の切り詰め物を認識しないか、または、それらと特異的に結合しない、請求項２４に記載の方法。
前記生体液が血清または血漿である、請求項１５に記載の方法。
前記イムノアッセイが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイである、請求項１５に記載の方法。
前記イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイである、請求項１５に記載の方法。