JP2022547009A

JP2022547009A - 心不全を評価するためのアッセイ

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Publication number: JP2022547009A
Application number: JP2022513934A
Authority: JP
Inventors: スン，シュ; レエセ－ペーターセン，アレクサンダー，リン; イェノベセ，フェデリカ; カルスダル，モルテン
Original assignee: Nordic Bioscience AS
Current assignee: Nordic Bioscience AS
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2020-09-03
Publication date: 2022-11-10
Also published as: US20230258658A1; WO2021043945A1; KR20220057546A; EP4025915A1; CN114729939A; GB201912856D0

Abstract

本開示は、イムノアッセイ、特に、心不全のような心血管疾患を検出および／またはモニタリングするためのイムノアッセイである。また本開示は、当該アッセイに用いられるモノクローナル抗体およびキットである。当該アッセイ、抗体およびキットは、XXVIII型コラーゲンのＣ－末端エピトープを標的とする。

Description

本発明はイムノアッセイに関し、特に、患者における心血管疾患を検出および／またはモニタリングするためのイムノアッセイ、および、当該アッセイに用いられるモノクローナル抗体に関する。心血管疾患は、特に心不全、特に、駆出率が保持された心不全であり得る。イムノアッセイは、心血管疾患の有害な転帰の可能性を評価するためのものであり得る。

心不全（HF）の疾病負荷は、最近の数年間で劇的に増加している（引用１、２）。ＨＦの約半分は、駆出率が保持されたＨＦ（HFpEF）に対して従位的であるが、これは、人口の高齢化に伴ってＨＦの疾病負荷総量のより大きな割合を占めると予想される（引用３）。最近の数十年にわたる数多くのフェーズＩＩＩランダム化比較試験にもかかわらず、どのような薬理学的介入によって、この患者集団にとって明確に利益が与えられるのかということについて証明されることが待ち望まれている。

HFpEF症候群の不均一性は、候補とされる薬理学的介入の有効性を実証することに対して重大な障壁であることが突き止められている。HFpEFの不均一な性質が存在すると、種々の病態生理学的プロセスからの寄与の程度が異なるため、臨床試験において試験された薬理学的治療に対する平均的な応答に悪影響を及ぼすかもしれない。従って、特定の生物学的プロセスの基礎となる関連物であって薬理学的介入を用いて標的となり得るものを容易に識別することができる、単純で非侵襲的なバイオマーカーの利用可能性は、HFpEFへの我々の臨床および治療的アプローチを増強する有望なアプローチを提示する（引用４）。

HFpEFの不均一性はまた、個々の患者の予後に差があることについて、重大な関連性を有する。HFpEF患者をより効果的にリスク等級別分類する能力は、非常に必要とされる。新規なリスク等級別分類マーカーは、臨床の実践においてHFpEF患者を予後判定するための我々の能力を向上させるだけでなく、将来の試験においてハイリスク個体の登録を告知するために大きな価値があるだろう。

心筋線維症は、HFpEFの病理生理学において役割を果たすと考えられる（引用５、６）。線維化の増大は、コラーゲンの分解に関連する過剰な形成から生じ、最終的には、間質中の間質コラーゲン蓄積を増加させる。HFpEFにおける心筋細胞外マトリクス蓄積の増大が、剖検試料およびインビボ研究において実証されており（引用６－８）、この条件における心筋細胞外マトリクス蓄積の増大が、左室受動硬直および拡張期機能不全と相関することが示されている（引用５、８）。心筋線維症はまた、冠血流予備能低減（引用６、９）、心室同期不全および不整脈傾向の一因となり得る（引用１０、１１）。HFpEFにおける心筋線維症の役割を考えると、線維症の繊維化進行または退行の基礎となる動的プロセスを反映する単純な線維化バイオマーカーは、高い価値があるであろう（引用１０）。

心臓磁気共鳴イメージングによって測定された心筋線維症の指標である、細胞外体積分率（ECVF）は、HFpEFを有する患者における有害な転帰（引用１２、１３）またはHFpEFのリスク（引用１４）を予測することが報告されている。MRIは、前臨床研究における心筋線維症の評価、ヒトにおける早期フェーズ調査、およびいくつかの臨床的設定において重要な役割を果たすことが見込まれるが、そのコストおよび入手可能性は、世界的なフェーズIII試験および臨床的実施において、その使用を制限または妨げる可能性が高い。さらに、HFpEFを有する多くの患者は、閉所恐怖症または進行度の高い腎疾患のせいでECVF測定の候補にならない。これにより、組織線維症のバイオマーカーを普及させるための探索は、大きな課題の領域として残されている。

しかしながら、HFpEFのための適切なバイオマーカーの探索は、「線維症は単に線維症であるというだけではない」こと、および、異なる区画およびコラーゲン型のECM再建は異なる生物学的および予後的な関連性を有し得ることにより、複雑化する（引用１５）。例えば、慢性Ｂ型肝炎とＣ型肝炎の対比において、コラーゲンネオエピトープ断片と肝線維症との関連に差があることが報告されている。また、HFpEFにおいては心筋線維症が重要であると考えられているが、心臓外線維症も重要な役割を果たすことがある。例えば、HFpEFにおいて、骨格筋の線維性脂肪浸潤が報告されている（引用１６）。同様に、線維化は、動脈壁、腎臓および肝機能不全においても起こり、これらの全ては、この集団において有害な転帰の一因となり得る。

XXVIII型コラーゲンは文献上わずかしか記述されていないが、その身体的役割を特定する研究が、少しずつ現れ始めている。XXVIII型コラーゲンは、主に末梢神経および後根神経節内に存在しているが、皮膚にも見られる（引用１７、１８）。XXVIII型コラーゲンは、２つのフォンウィレブランド因子Ａドメイン（von Willebrand factor A domain）が５２８アミノ酸コラーゲンドメインの側面に配列している数珠状のコラーゲンであり、構造的にVI型コラーゲンに似ている（引用１９）。XXVIII型コラーゲンは、健康な肺組織には極めて低レベルしか見られないが、ブレオマイシン誘導の肺損傷において過剰発現する（引用２０）。このことは、XXVIII型コラーゲンを発現している細胞は、組織修復過程にあるかもしれないことを示している可能性がある。またXXVIII型コラーゲンは、マウス肝細胞癌において上方制御されることが以前から知られている。

本発明者らは、HFpEFにおいてXXVIII型コラーゲンの形成が上方制御されることを今般特定し、XXVIII型コラーゲンのＣ－末端を標的とするモノクローナル抗体を用いる新規の競合ELISAを開発した。

従って、第１の態様において、本発明は、イムノアッセイ法を提供し、当該方法は：
（ｉ）患者からの生体液試料をXXVIII型コラーゲンのＣ－末端エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させること、及び、
（ｉｉ）前記モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合量を検出して決定することを含む。

前記方法は、生体液試料中に存在するXVIII型コラーゲンの前記Ｃ－末端エピトープを有するペプチドを定量するために利用することができ、例えば、XXVIII型コラーゲン形成のレベルを評価するために利用することができる。

好ましい実施形態において、前記方法は、患者における心血管疾患を検出および／またはモニタリングするための、および／または、患者における心血管疾患の可能性または重症度を評価するためのイムノアッセイ法である。当該実施形態においてイムノアッセイ法は：
（ｉ）患者からの生体液試料をXXVIII型コラーゲンのＣ－末端エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させること、
（ｉｉ）前記モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合量を検出して決定すること、及び、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において決定された前記モノクローナル抗体の結合量を、正常な健常者に関連する値および／または既知の疾患の重症度に関連する値および／または当該患者から過去の時点において得られた値および／または所定のカットオフ値と相関させることを含む。

前記イムノアッセイは、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイであってもよいが、これらに限定されるものではない。前記イムノアッセイは、例えば、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）であってもよい。そのようなアッセイは、当業者にとって知られた手技である。

心血管疾患は、ある実施形態において、心不全であってもよい。特に、心血管疾患は、駆出率が保持された心不全（HFpEF）であってもよい。
本方法は、ある実施形態において、心血管疾患の結果としての患者の死亡および／または入院の可能性、および／または、有害な心血管系の事象の複合状態を評価することを含む、患者における心血管疾患の重症度を評価するための方法であってもよい。

ある実施形態において、患者は、例えば、心血管疾患の治療を受けている患者であってもよく、そして本方法は、患者における心血管疾患をモニタリングすることを含んでいてもよい。
患者の生体液試料は、血液、血清、血漿、尿、または、細胞または組織の培養物から得られた上清であってもよいが、これらに限定されるものではない。好ましくは、生体液は血清または血漿であり、最も好ましくは血清である。

本明細書で使用される用語“モノクローナル抗体”は、全体抗体、および、それらの断片であって、例えばFabフラグメント、F (ab')2フラグメント、単一鎖Fvフラグメント、または当業者に知られている他のそのようなフラグメントのように、全体抗体の結合特異性を保持しているものの両方を意味する。よく知られているように、全体抗体は、典型的には、２つの同一のポリペプチド鎖群が対をなす“Ｙ字形”構造を有し、対をなす要素のそれぞれは、１つの“軽”鎖と１つの“重”鎖とから構成される。軽鎖及び重鎖のそれぞれのN－末端領域は可変領域を含み、重鎖および軽鎖のそれぞれのＣ－末端部分は定常領域を構成する。可変領域は、３つの相補性決定領域（CDRs）を含んでおり、それらは主に抗原認識の原因となる。定常領域は、抗体が免疫系の細胞および分子を補充することを可能にする。結合特異性を保持する抗体フラグメントは、この結合特異性を保持するために、少なくともCDRsと可変領域の残部のうち十分な部分とを含む。

本発明の方法においては、当該技術分野で公知のいかなる定常領域を含むモノクローナル抗体も使用することができる。ヒト定常軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖に分類される。定常重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンに分類され、IgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEとしての抗体のアイソタイプをそれぞれ定義する。IgGアイソタイプは、IgG1、lgG2、IgG3およびIgG4を含むいくつかのサブクラスを有するが、これに限定されるものではない。前記モノクローナル抗体は、好ましくは、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4のいずれかうちの１つを含むIgGアイソタイプに属するものであってもよい。

抗体のCDRは、kabatらにより記載されているような当該技術分野で公知の方法を用いて決定することができる。抗体は、それらの例に記載されるように、Ｂ細胞クローンから生成させることができる。抗体のアイソタイプは、ヒトIgM、IgGまたはIgAアイソタイプまたはヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4サブクラスに特異的なELISAによって決定することができる。生成された抗体のアミノ酸配列は、標準的な手法を用いて決定することができる。例えば、RNAを細胞から単離し、逆転写によりcDNAを生成するために使用することができる。次いで、当該cDNAを、当該抗体の重鎖および軽鎖を増幅するプライマーを用いてPCR処理する。例えば、全てのVH（可変重鎖）配列についてのリーダー配列に特異的なプライマーを、あらかじめ決定されているアイソタイプの定常領域に位置する配列に結合するプライマーと共に使用することができる。軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖の３’末端に結合するプライマーを、VカッパまたはVラムダのリーダー配列にアニールするプライマーと共に用いて増幅することができる。全長の重鎖および軽鎖を生成し、配列決定することができる。

本発明の第１の態様にかかる方法のいくつかの実施形態においては、生体液試料は、Ｃ－末端アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）（本明細書においては、“PRO-C28”とも称する。）に特異的に結合するモノクローナル抗体と接触される。好ましくは、当該モノクローナル抗体は、QETCIQGA（配列番号２）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の伸長物を認識しないか、または、それと特異的に結合しない。好ましくは、当該モノクローナル抗体は、QETCIQ（配列番号３）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の切り詰め物を認識しないか、または、それと特異的に結合しない。

好ましくは、Ｃ－末端アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）に対する当該抗体の親和性と、伸長されたＣ－末端アミノ酸配列QETCIQGA（配列番号２）に対する当該抗体の親和性との比は、少なくとも１０対１、より好ましくは、少なくとも５０対１、少なくとも１００対１、少なくとも５００対１、少なくとも１，０００対１、少なくとも１０，０００対１、少なくとも１００，０００対１、または少なくとも１，０００，０００対１である。

好ましくは、Ｃ－末端アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）に対する当該抗体の親和性と、切り詰められたＣ－末端アミノ酸配列QETCIQ（配列番号３）に対する当該抗体の親和性との比は、少なくとも１０対１、より好ましくは、少なくとも５０対１、少なくとも１００対１、少なくとも５００対１、少なくとも１，０００対１、少なくとも１０，０００対１、少なくとも１００，０００対１、または少なくとも１，０００，０００対１である。

本明細書で使用される用語“Ｃ－末端”は、ポリペプチドの末端にある、すなわちポリペプチドのＣ－側の終末にある、Ｃ－末端ペプチド配列を意味し、その一般的な方向に意味するものと解釈されるべきではない。

Ｃ－末端アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）に特異的に結合するモノクローナル抗体は、当技術分野で知られている適当ないずれかの手技によって産出させることができる。例えば、モノクローナル抗体は、アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）を有する合成ペプチドに対抗して産出させてもよく、例えば：配列QETCIQG（配列番号１）からなる合成ペプチド、これは任意に（キーホールリンペットヘモカインのような）免疫原性キャリア蛋白に連結していても良い、を用いてげっ歯類動物（または他の適当な哺乳類）を免疫し、単一抗体を生産する細胞を単離およびクローニングし、それらが所望の特異性を有していることを確定するために得られたモノクローナル抗体をアッセイする、といったような方法により、産出させてもよい。Ｃ－末端アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）に特異的に結合するモノクローナル抗体を生産するためのプロトコルの具体例を、以下に記述する。

本発明の第１の態様にかかる方法のいくつかの実施形態においては、XXVIII型コラーゲンのＣ－末端エピトープに特異的な前記モノクローナル抗体の結合量を、正常な健常者に関連する値および／または既知の疾患の重症度に関連する値および／または当該患者から過去の時点において得られた値と相関させる。

本明細書で使用される用語“正常な健常者に関連する値および／または既知の疾患の重症度に関連する値”は、健康である、すなわち心血管疾患を有していないと考えられる被験者について上記の方法によって決定される標準化された量、および／または、既知の重症度を伴った心血管疾患を有することが分かっている被験者について上記の方法によって決定される標準化された量を意味する。

本発明の第１の態様にかかる方法のいくつかの実施形態においては、XXVIII型コラーゲンのＣ－末端エピトープに特異的なモノクローナル抗体の結合量を、１つ以上の所定のカットオフ値と相関させる。

本明細書で使用される“カットオフ値”とは、患者における心血管疾患の高い可能性、または、重症度が特定レベルに属する心血管疾患を示すために統計的に決定される結合量を意味しており、当該意味において、患者試料中のバイオマーカー結合の測定値は、心血管疾患の存在または可能性がある確率、または、疾患の重症度が特定レベルに属する確率が、少なくとも７０％の確率、好ましくは少なくとも８０％の確率、好ましくは少なくとも８５％の確率、より好ましくは少なくとも９０％の確率、最も好ましくは少なくとも９５％の確率に対応する統計的カットオフ値以上である。

XXVIII型コラーゲンのＣ－末端エピトープに特異的なモノクローナル抗体の結合量に関する所定のカットオフ値は、好ましくは１００ng/mL以上である。これに関して、XXVIII型コラーゲンのＣ－末端エピトープに特異的なモノクローナル抗体の結合量が少なくとも１００ng/mLまたはそれ以上であると測定された場合には、心血管疾患があると決定し得ることが、統計的分析を使用することによって見出された。統計的カットオフ値を１００ng/mL以上とすることにより、本発明の方法を利用して、心血管疾患の診断に関して高レベルの信頼性を与えることが可能である。このような統計的カットオフ値を適用することにより、単独の診断アッセイにつながるので、特に有利である；すなわち、診断の結論に到達するために、健康な個体および／または既知の疾患の重症度を有する患者と直接比較する必要性がなくなる。これはまた、一般的に心血管疾患を示す医学的徴候または症状（例えば、身体検査および／または医療専門家の診察によって決定されるもの）を既に有する患者を評価するためのアッセイを利用する場合には、初期の予測を確証するための迅速かつ確定的なツールとしての機能を果たすことができ、そのことによって、より侵襲性の高い処置の必要性がなくなって、適切な治療計画を速やかに開始できる可能性があるから、特に有利であり得る。また、長期間に亘って病院に滞在する必要性を回避することもできる。心血管疾患の具体的事例としては、確定的診断の迅速化によって、より早期の段階における疾患の検出につなげることができ、さらには、全体的な生存機会を改善し、および／または入院のリスクを低減することができる。

第２の態様において、本発明は、Ｃ－末端アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）に特異的に結合するモノクローナル抗体、及び、下記のうち少なくとも１つ：
－ストレプトアビジンを被覆したウエルプレート；
－ビオチニル化ペプチドビオチン－Ｌ－QETCIQG（配列番号４）、ここにおいて、Ｌは任意的な連結基である；
－サンドイッチイムノアッセイに用いられる第２抗体；
－配列QETCIQG（配列番号１）を含む較正用ペプチド；
－抗体ビオチニル化キット；
－抗体ＨＲＰ標識化キット；
－抗体放射標識化キット；及び、
－アッセイ視覚化キット
を含むイムノアッセイキットを提供する。

前記イムノアッセイキットは、前記第１の態様にかかる方法を実施するために適している。従って第２の態様の好ましい実施形態は、第１の態様の好ましい実施形態についての上記議論から明らかに理解できるであろう。例えば、当該キットは、患者における心血管疾患を検出および／またはモニタリングするため、および／または、患者における心血管疾患の可能性または重症度を評価するために好ましいものである。Ｃ－末端アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）に特異的に結合するモノクローナル抗体は、好ましくは、アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）を有する合成ペプチドに対抗して産出させたモノクローナル抗体である。好ましくは、当該モノクローナル抗体は、QETCIQGA（配列番号２）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の伸長物を認識しないか、または、それと特異的に結合しない。好ましくは、当該モノクローナル抗体は、QETCIQ（配列番号３）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の切り詰め物を認識しないか、または、それと特異的に結合しない。

第３の態様において、本発明は、Ｃ－末端アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。第３の態様の好ましい実施形態もまた、第１の態様の好ましい実施形態についての上記議論から明らかに理解できるであろう。例えば、当該モノクローナル抗体は、好ましくは、アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）を有する合成ペプチドに対抗して産出させたモノクローナル抗体である。好ましくは、当該モノクローナル抗体は、QETCIQGA（配列番号２）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の伸長物を認識しないか、または、それと特異的に結合しない。好ましくは、当該モノクローナル抗体は、QETCIQ（配列番号３）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の切り詰め物を認識しないか、または、それと特異的に結合しない。

抗体特異性。反応性は、標準ペプチド（QETCIQG）（配列番号１）、伸長したペプチド（QETCIQGA）（配列番号２）、ナンセンスペプチド（GLRPGSEYTV）（配列番号７）、および、ナンセンスコーター（GLRPGSEYTV-K-Biotin）（配列番号８）を用いて試験した。健常人コントロール（HC）およびHFpEF患者の血清中PRO-C28レベル

本開示の実施形態が、以下の実施例において記載及び開示されている。それらの実施例は、本開示の理解を助けるために提示されており、いかなる場合であっても以下に述べるクレームで特定された本開示の範囲を限定するために解釈すべきではない。以下に述べる実施例は、記述された実施形態をどのように作り、使用するのかについての完全な開示及び記述を当業者に提供するように提示されており、本開示を限定することを意図するものではなく、また、後述の実験が実施された全ての又は唯一の実験であることを意味することを意図するものでもない。用いた数値（例えば、量、温度など）について正確さを確保するために努力したが、実験的な誤り及び偏りが多少あることを考慮すべきである。別途示さない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度はセ氏、及び、圧力は大気圧または大気圧付近である。
以下に述べる実施例は、下記の材料および方法を用いた。

材料および方法
実験で用いた全ての試薬は、シグマアルドリッヒ（St. Louis, MO, USA）およびメルク（Whitehouse Station, NJ, USA）などの会社から入手した高品質の標準品であった。免疫およびアッセイ開発に用いた合成ペプチドは、ジェンスクリプト（New Jersey, USA）から購入した。健常人ドナーから採取したヒト血清は、商業販売者（リーバイオソリューション, MO 63043, USA）から購入した。TRAINING-HF集団に所属するHFpEF患者から採取したヒト血清は、スペイン、バレンシアのインクリバ健康研究所（INCLIVA Health Research Institute）との共同研究を通じて取得した。

PRO-C28を標的とするモノクローナル抗体の産出
XXVIII型コラーゲンのＣ－末端に見出される７アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）（“PRO-C28”）に対抗して抗体を産出させることにより、XXVIII型コラーゲンのＣ－末端を標的とするモノクローナル抗体を産出させた。システイン残基の数を減らすことにより、抗体の産出に用いられる免疫原性ペプチド内におけるＣｙｓ－ｃｙｓ架橋の形成を回避するために、１０アミノ酸Ｃ－末端配列KECQETCIQG（配列番号５）のような、もっと長い配列を選ぶのではなく、この７アミノ酸配列が選ばれた。PRO-C28を標的とするモノクローナル抗体の産出に用いたプロトコルは、次のとおりである。

６－７週齢の雌Balb/Cマウス（体重１４－１８ｇ）の免疫を、スティミューン免疫原性アジュバント（SPECOL）（Cat #7925000, Invitrogen）中に１００μｇの免疫原性ペプチド（KLH-CGG- QETCIQG（配列番号６））を含む、２００μＬのエマルジョン化抗原液を皮下注射することによって、開始させた。ここで、‘ＫＨＬ’とはキーホールリンペットヘモカインを示し、ＣＧＧはコンジュゲーションリンカーである。安定した血清力価レベルに達するまで２週間毎に免疫化を繰り返した。血清力価が最も高く、最良の阻害を示すマウスを融合のために選択した。そして、最後の免疫を行った後、マウスを少なくとも３週間休養させた。引き続き、細胞融合のための脾臓を単離する３日前に、１００μｇの免疫原性ペプチドを含む１００μLの０．９％塩化ナトリウム溶液を用いる静脈注射により、マウスをブーストさせた。ハイブリドーマ細胞を作成するために、ゲフターらが記述しているように、マウス脾臓細胞をSP2/0ミエローマ細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞を、半固体培地法を用いて培養皿内でクローン化した。そして、さらに成長させるために、クローンを９６ウエルマイクロタイタープレート内に接種し、限界希釈を用いてモノクローナル成長を促進させた。上清の反応性をスクリーニングするために、ストレプトアビジン被覆プレート上で実施する間接ELISAを利用した。ビオチン－QETCIQGをスクリーニングペプチドとして用いるとともに、クローンの特異性をさらに試験するために、標準ペプチド（QETCIQG（配列番号１））、伸長したペプチド（QETCIQGA（配列番号２））、ナンセンスペプチド（GLRPGSEYTV）（配列番号７）、および、ナンセンスコーター（GLRPGSEYTV-K-Biotin）（配列番号８）を用いた。上清をハイブリドーマ細胞から採集し、ＨｉＴｒａｐアフィニティカラム（ＧＥヘルスケアライフサイエンス, Little Chalfront, Buckinghamshire, UK）を使用して、製造者の指示に従って精製した。全ての動物は、動物福祉に関するガイドラインに従って取り扱った。

クローン選定および特性評価
標準ペプチド（QETCIQG（配列番号１））に対する反応性に関して最良の抗体生産ハイブリドーマを、下記の競合ELISAでスクリーニングし、PRO-C28を標的とするモノクローナル抗体を生産するために、最も高い反応性を示すクローンを選定した。抗体特異性は、標準ペプチド（QETCIQG（配列番号１））、伸長したペプチド（QETCIQGA（配列番号２））、ナンセンスペプチド（GLRPGSEYTV）（配列番号７）、および、ナンセンスコーター（GLRPGSEYTV-K-Biotin）（配列番号８）を用いて試験した。モノクローナル抗体のアイソタイプは、クロノタイピングシステム－ＨＲＰキット, cat. 5300-05（サザーンバイオテック, Birmingham, AL, USA）を用いて決定した。

PRO-C28 ELISA
Roche社製の９６ウエルストレプトアビジン被覆ELISAプレート, cat.11940279を、アッセイ緩衝液（25 mM TBS-BTE＋2 g/l NaCl, pH 8）に溶解した１００μＬ／ｗｅｌｌのビオチン化ペプチド、ビオチン- QETCIQG（配列番号４）で被覆し、暗所内２０℃で振とうしながら３０分間インキュベートし、続いて洗浄緩衝液（20 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7.2）で５回洗浄した。その後、２０μｌの較正用ペプチドまたは試料を適切なウエルに添加し、続いて、１００μｌの精製した抗体溶液（アッセイ緩衝液に溶解したPRO-C28に特異的なモノクローナル抗体）を添加し、２０℃で振とうしながら１時間インキュベートしてから、洗浄緩衝液で５回洗浄した。次に、１００μｌの第２抗体溶液（PRO-C28に特異的なモノクローナル抗体に使用したものと同じアッセイ緩衝液に溶解した西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）標識化抗マウス抗体）を各ウエルに添加し、２０℃で振とうしながら１時間インキュベートしてから、洗浄緩衝液で５回洗浄した。最後に、１００μｌのテトラメチルベンジジン（TMB）（Kem-En-Tec cat.：438OH）を各ウエルに添加し、プレートを暗所内２０℃で１５分間インキュベートし、反応を停止させるために１００μｌの停止液（1% H₂SO₄）を添加し、プレートをELISAリーダー（モレキュラーデバイスズ、SpectraMax M, CA, USA）で、６５０ｎｍをリファレンスとして４５０ｎｍで分析した。検量線は、４パラメータ数学的適合モデルを用いてプロットした。

PRO-C28 ELISAの技術的評価
ヒト血清試料、ヒト尿とＥＤＴＡ試料、ヘパリンまたはクエン酸処理ヒト血漿試料（４つの各タイプの試料）の２重希釈を用いて直線性を評価した。直線性は、非希釈試料の回収パーセンテージとして算出した。
イントラアッセイの変動およびインターアッセイの変動は、５点の品質コントロール（ＱＣ）を独立して１０回実施すること、および、２点のキットコントロールを実施することにより、２重測定で決定した。
アッセイの精度は、標準蛋白を用いてスパイクした健常ヒト血清試料について測定し、緩衝液中の血清回収パーセンテージとして算出した。
測定範囲の下限（LLMR）および測定範囲の上限（ULMR）は、イントラアッセイの変動およびインターアッセイの変動から得られた個別の１０個の標準曲線に基づいて算出した。

HFpEFのバイオマーカーとしてのPRO-C28の生物学的妥当性の検証
HFpEF（駆出率が保持された心不全）患者の集団、および、健常人コントロールの集団における血清試料について、上述のPRO-C28 ELISAプロトコルを用いて、PRO-C28を測定した。患者の人口統計学的構成を、表１に示す。

^★年齢は２群間に有意差が有るが、どちらの群においても年齢とPRO-C28の間の相関は無い。

結果
クローン選定および特性評価
標準ペプチドに対する反応性および選択性に関して最良の抗体生産ハイブリドーマをスクリーニングし、反応性に基づいてクローン NBH218#65 8C11-2F10-1H7を選定した。そして、PRO-C28 ELISAの技術的および生物学的評価に使用するPRO-C28標的モノクローナル抗体を生産するために、当該クローンを用いた。モノクローナル抗体は、アイソタイプ：IgG2b, kに属するものであった。伸長したペプチド、ナンセンスペプチド、または、ナンセンスコーターに対する反応性は見られなかった（図１）。

PRO-C28 ELISAの技術的評価
PRO-C28 ELISAアッセイを評価するために、一連の技術的妥当性の検証を実施した。検証データの概要を、表２に示す。

HFpEFのバイオマーカーとしてのPRO-C28の生物学的評価
HFpEF（駆出率が保持された心不全）患者の集団、および、健常人コントロール（HC）の集団における血清試料について、PRO-C28 ELISAを用いて、PRO-C28レベルを測定した。そして、２つの集団に由来する血清試料中のバイオマーカーレベルを、マン－ホイットニー検定（ノンパラメトリックデータ）を用いて比較した。結果を図２に示す（この図において、結果はテューキーのボックスプロットとして示す。）。見て分かるとおり、PRO-C28は、健常人コントロールと比べて、HFpEF患者に由来する血清中で有意に上昇した（p<0.0001）。
また、研究過程を通じて３つの異なる時点で、HFpEF患者血清資料についてNT-proBNPレベルを測定し、測定されたNT-proBNP濃度を、スピアマン相関を用いて、同一試料について測定されたPRO-C28濃度（上述の方法で測定）と比較した。下記の表３に示すように、HFpEF集団におけるPRO-C28レベルは、HFを診断およびモニタリングするための標準的な臨床評価バイオマーカーであるNT-proBNPと有意に相関することが見出された。

本明細書において、他に明記のない限り、単語「又は（or）」は、述べられた条件の一方又は両方が満たされる場合に真値を返す演算子という意味で用いられており、これと対照的なのは、複数ある条件の中の１つだけ満たすことを要する「排他的ＯＲ（exclusive or）」という演算子である。単語「を含む（comprising）」は「を含む（including）」という意味で用いられているのであって、「からなる（consisting of）」という意味ではない。上記で認めた全ての従来の教示は本明細書に参照することにより組み込まれる。本明細書における先に発行された文献のいかなる認識も、該文献の教示が本明細書の時点におけるオーストラリア又は他国の共通の一般知識であるという自白又は表明として捉えるべきではない。

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https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002147

Claims

患者における心血管疾患を検出および／またはモニタリングするための、および／または、患者における心血管疾患の可能性または重症度を評価するためのイムノアッセイ法であって、当該方法は：
（ｉ）患者からの生体液試料をXXVIII型コラーゲンのＣ－末端エピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体と接触させること、及び、
（ｉｉ）前記モノクローナル抗体と試料中のペプチドとの間の結合量を検出して決定することを含む。
患者における心血管疾患を検出および／またはモニタリングするための、および／または、患者における心血管疾患の可能性または重症度を評価するためのイムノアッセイ法であって、当該方法は、さらに：
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において決定された前記モノクローナル抗体の結合量を、正常な健常者に関連する値および／または既知の疾患の重症度に関連する値および／または当該患者から過去の時点において得られた値および／または所定のカットオフ値と相関させることを含む、請求項１に記載の方法。
前記心血管疾患が心不全である、請求項２に記載の方法。
前記心血管疾患が、駆出率が保持された心不全（HFpEF）である、請求項３に記載の方法。
前記モノクローナル抗体は、Ｃ－末端アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）に特異的に結合する、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
前記モノクローナル抗体が、QETCIQGA（配列番号２）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の伸長物を認識しないか、または、それと特異的に結合しない、請求項５に記載の方法。
前記モノクローナル抗体が、QETCIQ（配列番号３）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の切り詰め物を認識しないか、または、それと特異的に結合しない、請求項５または６に記載の方法。
前記モノクローナル抗体は、アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）を有する合成ペプチドに対抗して産出させたものである、請求項５乃至７のいずれか一項に記載の方法。
前記生体液が血液、血清、血漿、尿、または、細胞または組織の培養物から得られた上清である、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
前記イムノアッセイが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイである、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
前記イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイである、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
Ｃ－末端アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）に特異的に結合するモノクローナル抗体、及び、下記のうち少なくとも１つ：
－ストレプトアビジンを被覆したウエルプレート；
－ビオチニル化ペプチドビオチン－Ｌ－QETCIQG（配列番号４）、ここにおいて、Ｌは任意的な連結基である；
－サンドイッチイムノアッセイに用いられる第２抗体；
－配列QETCIQG（配列番号１）を含む較正用ペプチド；
－抗体ビオチニル化キット；
－抗体ＨＲＰ標識化キット；
－抗体放射標識化キット；及び、
－アッセイ視覚化キット
を含むイムノアッセイキット。
前記モノクローナル抗体は、アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）を有する合成ペプチドに対抗して産出させたものである、請求項１２に記載のイムノアッセイキット。
前記モノクローナル抗体が、QETCIQGA（配列番号２）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の伸長物を認識しないか、または、特異的に結合しない、請求項１２または１３に記載のアッセイキット。
前記モノクローナル抗体が、QETCIQ（配列番号３）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の切り詰め物を認識しないか、または、それと特異的に結合しない、１２乃至１４のいずれか一項に記載のアッセイキット。
Ｃ－末端アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）に特異的に結合する、モノクローナル抗体。
アミノ酸配列QETCIQG（配列番号１）を有する合成ペプチドに対抗して産出させたものである、請求項１６に記載のモノクローナル抗体。
QETCIQGA（配列番号２）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の伸長物を認識しないか、または、それと特異的に結合しない、請求項１６または１７に記載のモノクローナル抗体。
QETCIQ（配列番号３）である前記Ｃ－末端アミノ酸配列の切り詰め物を認識しないか、または、それと特異的に結合しない、１６乃至１８のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体。