JP7169356B2

JP7169356B2 - Ｓｐａｒｃアッセイ

Info

Publication number: JP7169356B2
Application number: JP2020533806A
Authority: JP
Inventors: キーレト，ステファニー，ニーナ; オースネス－レーミング，ディアーナ; カルスダル，モルテン
Original assignee: Nordic Bioscience AS
Current assignee: Nordic Bioscience AS
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2022-11-10
Anticipated expiration: 2038-12-13
Also published as: JP2021507242A; CN111656193A; WO2019121345A1; GB201721308D0; EP3729096A1; US20210080464A1

Description

本発明は、酸性でシステインに富む分泌型プロテオーム（ＳＰＡＲＣ）の検出を用途としたアッセイ、より具体的には、肺癌を評価する際の本アッセイの使用に関する。

酸性でシステインに富む分泌型プロテオーム（ＳＰＡＲＣ）は、オネクチンまたは基底膜タンパク質４０（ＢＭ－４０）とも呼ばれる、３２ｋＤａの母細胞タンパク質であり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の会合および析出、増殖因子のシグナル伝達、細胞およびその周囲のＥＣＭ間の相互作用を制御する［１、２］。ＳＰＡＲＣの発現は、胚発生中に上昇し、正常な成人組織では低減する。ただし、その発現は、腫瘍に関連して組織の増殖が異常が起こった際、ならびに組織に損傷および炎症が起こった際に、ＥＣＭ代謝回転の高い上皮／内皮細胞において増加し、それにより、組織の再モデリングにおけるＳＰＡＲＣの重要性が強調される［３～５］。

ＳＰＡＲＣは、アルコールデヒドロゲナーゼの熱凝集を濃度依存的に阻害することにより、シャペロン様の活性を有することが、明らかにされてきた［６］。更になお、いくつかの研究から明らかにされてきたように、ＳＰＡＲＣは、ＥＣＭ内の種々のコラーゲンに結合する。これは、コラーゲンを適切に析出させ且つ会合させるうえで重要とされる［７－１３］。ＳＰＡＲＣのシャペロン活性は、種々の要因によって調節されている。ＳＰＡＲＣをそのＥＣＭパートナーに結合させるには、中程度の細胞外濃度のＣａ^２＋が必要とされることが、明らかにされてきた。そのコラーゲン結合活性を調節する際に重要とされるスイッチとしては、それ以外にも、細胞外プロテアーゼの存在が挙げられる。数々の研究によって明らかにされたように、異なるメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、コラーゲンに対する親和性を最大２０倍に増加させる特定の部位にて、ＳＰＡＲＣを開裂し得る［１４、１５］。興味深いことに、ＳＰＡＲＣは、線維芽細胞におけるＭＭＰの発現を増加させ［１６～１８］、正のフィードバックループを生起させることが、明らかにされてきた。このフィードバック機構が制御されなくなると、線維性疾患の病理に関与し、コラーゲン析出の増加を伴う可能性がある。

癌、高血圧、肝硬変および線維性肺障害のような多くの疾患における、病理学の一部および／またはエンドポイントとされているのが、線維症である。線維症は、コラーゲンを含むＥＣＭの析出を増加させてしまい、それにより、正常な組織機能を妨害し、遂には臓器不全にまで至らしめることを特徴としている。線維形成のための重要な要素とされていることが公知のものとして、ＳＰＡＲＣが挙げられる［１９～２３］。ＳＰＡＲＣヌルマウスとの比較では、ブレオマイシン誘発肺線維症の野生型マウスの方が、肺内のコラーゲンの量が増加していることが明らかにされてきた。このことから示唆されるように、ＳＰＡＲＣが存在している場合の方が、発生する線維化反応は高度になる［１９、２０］。更になお、線維症および癌では、ＳＰＡＲＣの発現が上方制御されることも、明らかにされてきた［２４～２７］。

本発明者らが現在開発しているのが、高感度ＳＰＡＲＣアッセイである。本ＳＰＡＲＣアッセイは、肺癌に罹患している患者と高度に相関する。本アッセイは、肺癌と他の線維性疾患とを識別できることから明らかなように、肺癌を評価する際の診断ユーティリティとして優れたものとされている。また、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の評価において見出されてきたように、本アッセイは、前途有望な実用性を有する。

したがって、第１の態様において、本発明は、患者における肺癌の検出および／またはモニターを用途とした、イムノアッセイ法に関するものであり、本方法は、患者の生体液試料をＮ末端アミノ酸配列ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）に対し特異的に反応するモノクローナル抗体に接触させることであって、モノクローナル抗体は、前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを特異的に認識することもないし、また結合することもない、接触させることと、前述のモノクローナル抗体と前述のＮ末端アミノ酸配列含有ペプチドとの間の結合量を算定することと、前述の結合量を、正常な健常被験対象に関連する値および／または既知の肺癌の重篤度に関連する値および／または以前の時点で前述の患者から得られた値、および／または所定のカットオフ値と相関させることと、を含む。

上記のように、モノクローナル抗体は、前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを特異的に認識することもないし、また結合することもない。この点に関して、「前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョン」は、配列Ｈ_２Ｎ－ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）のＮ末端を超えて延在する、１つ以上のアミノ酸を意味する。例えば、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ_２Ｎ－ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）がグルタミン酸残基で伸長された場合、対応する「Ｎ延在伸長バージョン」はＨ_２Ｎ－ＥＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：２）となる。同様に、「前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョン」は、配列Ｈ_２Ｎ－ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）のＮ末端から除去された１つ以上のアミノ酸を意味する。例えば、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ_２Ｎ－ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）が１アミノ酸残基だけ短縮された場合、対応する「Ｎ切断短縮バージョン」はＨ_２Ｎ－ＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（ＬＡＲＤＦＥＫＮＹ）（配列番号：３）となる。

所定のカットオフ値は、好ましくは少なくとも９．０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも１５．０ｎｇ／ｍＬ、更により好ましくは少なくとも２０．０ｎｇ／ｍＬ、更により好ましくは少なくとも２５．０ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも３０ｎｇ／ｍＬである。この点に関して、様々な統計分析を併用することによって見出されてきたように、モノクローナル抗体（上記）とＮ末端バイオマーカーの間の結合量の測定値が少なくとも９ｎｇ／ｍＬ以上の場合、肺癌の存在を判別することが可能とされている。統計的カットオフ値を、少なくとも９ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは少なくとも１５．０ｎｇ／ｍＬ、更により好ましくは少なくとも２０．０ｎｇ／ｍＬ、更により好ましくは少なくとも２５．０ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも３０ｎｇ／ｍＬとすることにより、本発明の方法を利用して、肺癌を高い信頼レベルにて診断することが可能である。あるいは、統計的カットオフ値を本発明の方法に適用することは特に有利である、とも言い換えられる。そうすることにより、スタンドアロン型の診断アッセイに帰結する、すなわち、健常者および／または疾患重篤度が既知である患者と直接比較する必要無しに、診断の結論に到達することが可能となるからである。また、このことが特に有利とされるのは、アッセイを利用して、概ね肺癌を示唆する（例えば、身体診察および／または医療専門家との相談により判別された）医学的徴候または症状を既往とする患者を評価する場合である。これは、初期の予後を確証するための迅速且つ最も信頼のおけるツールとして機能し、それにより、内視鏡検査または生検のような侵襲性の高い手技の必要性をなくし、好適な治療レジメンの開始を早めることが可能となる。肺癌の特定の事例において、迅速な決定的診断により、疾患が早期に検出される可能性があり、ひいては、生存の全般的確率が向上することが見込まれる。

患者の生体液試料は、限定されるものではないが、血液、尿、滑液、血清または血漿としてもよい。

本イムノアッセイは、限定されるものではないが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイとしてもよい。同様に、本イムノアッセイは、限定されるものではないが、酵素結合免疫吸着アッセイまたは放射免疫アッセイとしてもよい。

第２の態様において、本発明は、患者が肺癌の治療に対し陽性反応するかどうかを判定する方法に関するものであり、本方法は、上記の方法を使用して、少なくとも２つの生体試料中のＮ末端アミノ酸配列ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）含有ペプチドの量を定量化することを含み、前述の生体試料が、前述の患者に対し治療薬を投与した期間中の第１の時点および少なくとも１つの以後の時点において前述の患者から得られたものであり、且つ治療期間中の前述の第１の時点から前述の少なくとも１つの以後の時点に至るまでに、Ｎ末端アミノ酸配列ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）含有ペプチドの量の減少は、前述の患者が前述の治療に対し陽性反応することを示唆するものである。

また、上記の方法を使用して、肺癌の治療を用途とした新規な治療法の有効性を判別することも、可能である。その点に関して、新規な治療法が有効であると考えられるのは、Ｎ末端アミノ酸配列ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）含有ペプチドの量が、前述の新規な治療薬を使用した治療期間中の前述の第１の時点から前述の少なくとも１つの以後の時点に至るまでに、減少した場合である。

別の態様において、本発明は、患者における特発性肺線維症（ＩＰＦ）の検出および／またはモニターを用途とした、イムノアッセイ法に関するものであり、本方法は、患者の生体液試料をＮ末端アミノ酸配列ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）に対し特異的に反応するモノクローナル抗体に接触させることであって、モノクローナル抗体は、前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前述のＮ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを特異的に認識することもないし、また結合することもない、接触させることと、前述のモノクローナル抗体と前述のＮ末端アミノ酸配列含有ペプチドとの間の結合量を算定することと、前述の結合量を、正常な健常被験対象に関連する値および／または既知のＩＰＦの重篤度に関連する値および／または以前の時点で前述の患者から得られた値、および／または所定のカットオフ値と相関させることと、を含む。

本イムノアッセイは、限定されるものではないが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイとしてもよい。同様に、本イムノアッセイは、限定されるものではないが、酵素結合免疫吸着アッセイまたは放射免疫アッセイとしてもよい。
定義

本明細書中に使用されている「Ｎ末端」という用語は、ポリペプチドの先端、すなわち、該ポリペプチドのＮ末端端部を指し、その一般的な方向における意味として解釈すべきではない。

本明細書中に使用されている「競合的ＥＬＩＳＡ」という用語は、競合的酵素結合免疫吸着アッセイを指し、本技術は、当業者に公知とされている。

本明細書中に使用されている「サンドイッチイムノアッセイ」という用語は、試料中の抗原の検出を用途とした少なくとも２つの抗体を使用することを指し、本技術は、当業者に公知とされている。

本明細書中に使用されている「結合量」という用語は、抗体とバイオマーカーとの間の結合の定量化を指し、前記定量化は、生体液試料中のバイオマーカーの測定値を検量曲線と比較することによって算定されたものであり、この検量曲線は、バイオマーカーの既知濃度の標準試料を使用して作成されたたものである。本明細書中に開示されている特定のアッセイでは、Ｎ末端アミノ酸配列ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）を有するＮ末端バイオマーカーが、生体液中で測定され、この検量曲線は、既知濃度の検量ペプチドＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）の標準試料を使用して作成される。生体液試料にて測定された値を、検量曲線と比較することによって、試料中のバイオマーカーの実際の量が算定される。本発明では、分光光度分析を利用して、標準曲線を作成し、生体液試料中の結合量を測定する。下掲の例において、本方法では、ＨＲＰおよびＴＭＢを使用して、測定可能な色強度を生成する。この色強度は結合量に比例する強度であると共に、分光光度計での読取りも可能な強度とされる。当然のことながら、ほかにも、任意の好適な分析方法を使用しても差し支えない。

本明細書中に使用されている「カットオフ値」は、患者における肺癌またはＩＰＦの尤度が高いことを示唆するものと統計的に判別される結合量を意味する。ここで、患者試料のバイオマーカーの測定値は、統計的カットオフ値に到達しているか、または統計的カットオフ値を超えていて、肺癌またはＩＰＦの存在または尤度の少なくとも７０％の確率、好ましくは少なくとも８０％の確率、好ましくは少なくとも８５％の確率、より好ましくは少なくとも９０％の確率、最も好ましくは少なくとも９５％の確率に対応している。

本明細書中に使用されている「正常な健常被験対象に関連する値および／または既知の疾患に関連する値重篤度」とは、健康であると見なされる、すなわち肺癌もしくはＩＰＦに患確していないと見なされる被験対象を対象として上記の方法より算定されたＳＰＡＲＣの標準化量、および／または、既知の重篤度の肺癌もしくはＩＰＦを有することが知られている被験対象を対象として上記の方法により算定されたＳＰＡＲＣの標準化量を意味する。

本明細書において、「ＳＰＡＲＣ－ＭＥＬＩＳＡ」は、本明細書中に開示されている特定の競合的ＥＬＩＳＡで、試料中のＮ末端アミノ酸配列ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）を有するペプチドの量を定量化するものを指す。

ＳＰＡＲＣ－Ｍモノクローナル抗体の特異性：（Ａ）標準ペプチド（ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ；配列番号：１）、伸長ペプチド（ＥＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ；配列番号：２）、切断ペプチド（ＬＡＲＤＦＥＫＮＹ；配列番号：３）、ナンセンスペプチド（ＶＰＫＤＬＰＰＤＴＴ；配列番号：４）およびナンセンス被覆ペプチド（ＶＰＫＤＬＰＰＤＴＴ－ビオチン；配列番号：５）；ならびに（Ｂ）フォンヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、ＡＤＡＭＴＳ１５（Ａ１５）、ＳＰＡＲＣ様タンパク質１（ＳＬＰ１）およびグルカゴン（ＧＣＧ）に対するモノクローナル抗体反応性を、競合的ＳＰＡＲＣ－ＭＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。シグナルは、４５０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）（６５０ｎｍにおけるバックグラウンドを差し引いたもの）として、ペプチド濃度に相関して表される。コラゲナーゼによるＳＰＡＲＣの開裂：ＳＰＡＲＣを種々のＭＭＰと共にインキュベートし、２４時間後にＳＰＡＲＣ－Ｍレベルを測定した。バッファー単独で測定されたバックグラウンドを差し引くことにより、データを正規化した。下掲のグラフは、２つの実験を表している。線維性疾患患者および健常対照における血清中ＳＰＡＲＣ－Ｍレベル：（Ａ）コホート１：健常対照（ｎ＝６）、ＩＰＦ患者（ｎ＝７）、ＣＯＰＤ患者（ｎ＝８）および肺癌患者（ｎ＝８）における血清中ＳＰＡＲＣ－Ｍを評価した。ダンの多重比較検定用に調整されたクラスカルウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）を使用して、諸群の比較を行った；（Ｂ）コホート２：健常対照（ｎ＝２０）および肺癌患者（ｎ＝４０）における血清中ＳＰＡＲＣ－Ｍを評価した。対応のない両側マンホイットニー検定を使用して、諸群の比較を行った；（Ｃ）肺癌患者（コホート２）は、癌の病期（Ｉ～ＩＶ期、各群にてｎ＝１０）に応じて層別化した。データの比較には、一元配置ＡＮＯＶＡを、テューキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重比較検定用に調整されたものを使用した。データは、テューキー（Ｔｕｋｅｙ）ボックスプロットとして表されている。有意水準：^＊＊＊：ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。

本開示の実施形態は、下記実施例において記載されている本開示を理解する一助となるように説明されたものであって、下掲の特許請求の範囲において定義されている開示の範囲を限定するものと解釈すべきではない。下記実施例は、記載されている実施形態を作製し使用する方法に関する完全な開示および説明を当業者に提供することを目的に提示されたものであって、本開示の範囲を限定することを意図したものではないし、また、下記実験は、実施された全ての実験、または実施された唯一の実験であることを表明することを意図したものでもない。使用されている数値（例えば、量、温度など）に関する精確性を期すための努力が為されてきたが、或る程度の実験誤差および偏差を考慮に入れる必要がある。別途明記されていない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、且つ圧力は大気圧または大気圧に近似する。

下記実施例において使用されている材料および方法は、以下の通りである。

ＳＰＡＲＣ－ＭＥＬＩＳＡの開発
ペプチドの選択
ＳＰＡＲＣ上の次の開裂部位（↓）は、以前にエドマン分解によって同定されていた［１４］。
_２１１ＨＰＶＥ ↓ ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹＮＭＹＩＦＰ_２３０。開裂断片のＮ末端に特異的な抗体を生成することを目的に、当該部位に隣接する１０アミノ酸の配列を標的として選択した：↓_２１５ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ_２２４（配列番号：１）。ＮＰＳ＠：ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－ｐｒｏｔデータベースを用いたネットワークタンパク質配列分析を使用して、他のヒト分泌型細胞外マトリックスタンパク質との相同性に合うように、本配列をブラストした［２９］。

ＥＬＩＳＡアッセイのモノクローナル抗体の生成および検証に使用された合成ペプチドは、米国ニュージャージー州のゲンスクリプト社（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）から購入されたものであり、これらの合成ペプチドは、表１に示した通りである。

標的配列を、標準ペプチド（ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ；配列番号：１）として使用した。ビオチン化ペプチド（ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ－Ｋ－ビオチン；配列番号：７）を、Ｃ末端端部にリジン残基が付加された被覆ペプチドとして具備させることにより、ビオチン結合が確実に為されようにした。抗体特異性の試験は、標的ペプチド配列のＮ末端に追加的なアミノ酸が付加された伸長標準ペプチド（ＥＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ；配列番号：１）、第１のＮ末端アミノ酸が除去された切断標準ペプチド（ＬＡＲＤＦＥＫＮＹ；配列番号：３）、ナンセンス標準ペプチド（ＶＰＫＤＬＰＰＤＴＴ；配列番号：４）、およびナンセンスビオチン化被覆ペプチド（ＶＰＫＤＬＰＰＤＴＴ－ビオチン；配列番号：５）を、アッセイ検証において含めることにより行った。また、標的配列中の最初の６アミノ酸と比較して１アミノ酸のミスマッチを有する４つのペプチド（フォンヴィレブランド因子、グルカゴン、ＳＰＡＲＣ様タンパク質１、およびＡＤＡＭＴＳ１５）も含めることによって、抗体特異性を更に試験した。スクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート、ＳＭＣＣ（米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）製、カタログ番号２２３３６）を使用して、標準ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体タンパク質に共有結合することにより、免疫原性ペプチド（ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ－ＧＧＣ－ＫＬＨ；配列番号：６）を生成した。担体タンパク質の適正な結合が確実に為されるように、グリシン残基およびシステイン残基がＣ末端端部に付加した。

モノクローナル抗体の作製
４～６週齢のげっ歯類／Ｃマウスの免疫は、フロイントの不完全アジュバント（米国ミズーリ州セントルイスのシグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））と混合した５０μｇの免疫原性ペプチド（ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ－ＧＧＣ－ＫＬＨ；配列番号：６）含有の乳化抗原２００μＬを皮下注射することにより行った。連続免疫は、安定した血清力価レベルに到達するまで、２週間間隔で行った。最高力価を有するマウスを４週間休息させてから、免疫原性ペプチド５０μｇ含有の０．９％ＮａＣｌ溶液１００μＬを、静脈内に追加免疫した。前述されているように、脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させることにより、ハイブリドーマ細胞を作製した［３０］。次いで、結果として得られたハイブリドーマ細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートで培養し、標準的な限界希釈を使用して、モノクローナル増殖を確保した。競合的イムノアッセイにおいて被覆剤としてビオチン化ペプチド（ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ－Ｋ－ビオチン；配列番号：７）を使用して、上清の反応性をスクリーニングした。

クローンの特性評価
ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（スイス国バーゼルのロッシュ社（Ｒｏｃｈｅ）製、カタログ番号＃１１９４０２７９）上に１０ｎｇ／ｍＬビオチン化被覆ペプチド、およびモノクローナルハイブリドーマ細胞産生抗体の上清を用いた予備ＥＬＩＳＡで、ヒト血清試料および標準ペプチド（ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ；配列番号：１）を用いて置換することにより、モノクローナル抗体の反応性を評価した。製造元の指示書に従い、プロテインＧ（ＰｒｏｔｅｉｎＧ）カラム（英国リトルチャルフォントのＧＥヘルスケアライフサイエンス社（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）製のカタログ番号＃１７－０４０４－０１）を使用して、標準ペプチドに対する反応性が最も高いクローンを精製した。

ＳＰＡＲＣ－ＭＥＬＩＳＡプロトコール
最適なインキュベーションのバッファー、時間および温度、ならびに抗体および被覆ペプチドの最適濃度を算定した。最終的なＳＰＡＲＣ－Ｍ競合的ＥＬＩＳＡプロトコールは、次の通りである。

９６ウェルのストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートを、アッセイバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＢＴＢ、４ｇ／ＬＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解した１．１ｎｇ／ｍＬビオチン化被覆ペプチドで被覆してから、暗所で振盪（３００ｒｐｍ）しながら、２０℃にて３０分間インキュベートした。２０μＬの標準ペプチドまたは１：４の予備希釈済み血清を適切なウェルに加え、続いてアッセイバッファーに溶解された濃度１４ｎｇ／ｍＬのモノクローナル抗体１００μＬを各ウェルに加えて、暗所で振盪（３００ｒｐｍ）しながら、２０℃で１時間インキュベートした。アッセイバッファー中で１：６０００に希釈されたヤギ抗マウスＰＯＤ接合ＩｇＧ抗体（米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）製、カタログ番号＃３１４３７）１００μＬを各ウェルに加えて、暗所で振盪させながら、２０℃で１時間インキュベートした。全てのインキュベーションステップ後に、洗浄バッファー（２０ｍＭＴｒｉｓ、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した。最後に、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（デンマーク国のＫｅｍ－Ｅｎ－Ｔｅｃダイアグノスティクス社（Ｋｅｍ－Ｅｎ－ＴｅｃＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製、カタログ番号４３８ＯＨ）１００μＬを各ウェルに加え、プレートを暗所で振盪させながら２０℃で１５分間インキュベートした。０．１８ＭＨ_２ＳＯ_４を添加して酵素反応を停止させた。吸光度は、６５０ｎｍを基準として用い、４５０ｎｍにて測定した。４パラメータロジスティック曲線適合を使用して、検量曲線をプロットした。ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏｖ．６．３ソフトウェアを使用して、データを分析した。

ＳＰＡＲＣ－ＭＥＬＩＳＡの技術評価
ＳＰＡＲＣ－ＭＥＬＩＳＡの技術的性能を評価することを目的として、以下：アッセイ間変動、アッセイ内変動、直線性、検出下限、検出上限、検体安定性（凍結／解凍および保存）、ならびに干渉性に関する検証試験を実施した。

検出範囲をカバーする７つの品質管理試料を使用して、別々の日に１０回にわたって個別に泳動させることにより、アッセイ間変動およびアッセイ内変動を判別した。各泳動は、試料の二重測定で構成された。７つの品質管理試料は、２つのト血清試料と、バッファー中に標準ペプチドを含有する５つの試料とから構成されていた。アッセイ内変動は、プレート内の平均分散係数（ＣＶ％）として計算した。アッセイ間変動は、別々の日に分析された個別泳動１０回分の平均ＣＶ％として計算した。本アッセイの直線性を評価するため、ヒト血清試料を２倍希釈し、希釈直線性を無希釈試料の回収率（パーセンテージ）として計算した。検出下限（ＬＬＯＤ）は、試料としてアッセイバッファーを用いた２１回にわたる測定により算定し、平均＋３＊標準偏差として計算した。検出上限（ＵＬＯＤ）は、標準ペプチドの最高濃縮物を１０回にわたって個別に泳動させることにより算定し、平均バックキャリブレーション計算値＋３標準偏差として計算した。まず、検体安定性を、血清試料を繰り返し凍結／解凍する効果により算定した。その際、４回にわたる凍結／解凍サイクルにて３つのヒト血清試料のＳＰＡＲＣ－Ｍレベルを測定した。第１のサイクルをバッファー中で洗浄した。凍結／解凍回収率の計算を行った。第２に、検体安定性を、保管との関連において、４℃または２０℃にて実施された４８時間の研究によって算定した。０時間、４時間、２４時間、および４８時間の保管後に、３つのヒト血清試料のＳＰＡＲＣ－Ｍレベルを測定し、－２０℃にて保管された試料を基準として用い、回収率の計算を行った。ヘモグロビン（０．１５５／０．３１０ｍＭ）、脂質血症／脂質（４．８３／１０．９８ｍＭ）、およびビオチン（３０／９０ｎｇ／ｍＬ）の低／高含有量を既知濃度の血清試料に加えることにより、干渉を算定した。血清試料を基準として用い、回収率を計算した。

ＳＰＡＲＣの生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）開裂
組換えヒトＳＰＡＲＣ（米国ニュージャージー州のペプロテック社（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）製、カタログ番号＃１２０－３６）を、ＭＭＰバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ_２、１０μＭＺｎＣｌ、０．０５％Ｂｒｉｊ３５、ｐＨ７．５）中で最終濃度１０００μｇ／ｍＬに再構成した。ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－８、ＭＭＰ－９、およびＭＭＰ－１３（イタリア国フィレンツェのギオット社（Ｇｉｏｔｔｏ）製、カタログ番号＃Ｇ０４ＭＰ０２Ｃ、＃Ｇ０４ＭＰ０８Ｃ、＃Ｇ０４ＭＰ０９Ｃ、＃Ｇ０４ＭＰ１３Ｃ）を、１：１０（１μｇのＭＭＰ、および１０μｇのＳＰＡＲＣ）にて加えた。上記のプロテアーゼを介して開裂されることが公知である、陽性対照タンパク質を含めた。溶液を３７℃にて２４時間インキュベートした。本溶液中に１μＭＥＤＴＡを加えることにより、反応を停止させた。種々のプロテアーゼを含有のＭＭＰバッファーを、対照として含めた。試料を分析まで－８０℃で保管した。製造元（インビトロジェン社（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）製ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（登録商標）、カタログ番号＃ＬＣ６１００）の指示書に従い、クーマシーブルーで銀染色して、プロテアーゼの活性を確証した（データ不図示）。

ＳＰＡＲＣ－Ｍの臨床評価
患者の血清試料は、商業ベンダー（米国カリフォルニア州カルバーシティのプロテゲネックス社（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ）から得たものである。コホート１は、肺癌患者、特発性肺線維症（ＩＰＦ）患者、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）患者、および症候性または慢性疾患のない結腸内視鏡検査陰性患者で構成されていた（表２）。コホート２には、肺癌の病期が異なる男性および女性４０人と、年齢が一致する、無症候性または慢性疾患無しの大腸内視鏡検査陰性対照２０人とが含まれていた（表２）。適切な制度審査委員会／独立倫理委員会（Institutional Review Board/Independent Ethical Committee）が試料収集を承認し、全ての被験対象がインフォームドコンセントを提出した。

統計分析
血清試料中のＳＰＡＲＣ－Ｍレベルの比較は、対応のない両側マンホイットニー検定、およびダンの多重比較検定用に調整されたクラスカルウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）を使用して行った。患者を腫瘍の病期に応じて層別化し、テューキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重比較検定用に調整された一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、各群のＳＰＡＲＣ－Ｍレベルを比較した。データの正常性は、ダゴスティーノ＆ピアソンオムニバス（Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ－Ｐｅａｒｓｏｎｏｍｎｉｂｕｓ）検定を用いて評価した。診断能力は、受信者操作特性（ＡＵＲＯＣ）下の領域にて調査した。

グラフの設計および統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン7（米国カリフォルニア州のグラフパッドソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ）製）を使用して行った。

結果
ＳＰＡＲＣ－ＭＥＬＩＳＡアッセイの特異性
ＮＰＳ＠：ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－ｐｒｏｔデータベースを用いたネットワークタンパク質配列分析を使用して、他のヒト分泌型細胞外マトリックスタンパク質との相同性に合うように、標的配列ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）をブラストした。この標的配列は、他の分泌型ＥＣＭタンパク質と比較して、ヒトＳＰＡＲＣに対し特有であることが見出された。１つのアミノ酸のミスマッチを許容し、４つの分泌型細胞外マトリックスタンパク質（すなわち、フォンヴィレブランド因子、グルカゴン、ＳＰＡＲＣ様タンパク質１、およびＡＤＡＭＴＳ１５）については、それぞれ第６位、第２位、第３位、および第６位にミスマッチを同定した（表１）。４つのペプチドの配列に対する反応性は、全く見られなかった（図１Ｂ）。このことから示唆されるように、標的配列に対する抗体特異性は、高度であった。標準ペプチド、ナンセンスペプチド、伸長ペプチド、切断ペプチドに対する反応性を分析し、ナンセンスビオチン化被覆ペプチドを使用して、競合的ＳＰＡＲＣ－ＭＥＬＩＳＡの特異性を更に評価した。全てのペプチド配列を表１に示す。結果は、図１Ａに図示されている。抗体は、標準ペプチドに対してのみ反応した。標準ペプチドは、他のペプチドと比較して用量依存的にシグナルを阻害することが明白であった。ナンセンスビオチン化被覆ペプチドを使用した場合、検出可能なシグナルは全く観察されなかった。

総合的に言うと、これらのデータから示唆されるように、選択されている抗体には、高度なネオエピトープ特異性が見られる。

ＳＰＡＲＣ－ＭＥＬＩＳＡアッセイの技術評価
ＳＰＡＲＣ－ＭＥＬＩＳＡの技術的性能を、アッセイ間変動、アッセイ内変動、直線性、検出下限、検出上限、検体安定性（凍結／解凍および保存）、ならびに干渉性に応じて、更に評価した。種々の検証手順およびＳＰＡＲＣ－Ｍの性能を、表３に示す。

アッセイの測定範囲（ＬＬＯＤ－ＵＬＯＤ）は、２．７～３００．７ｎｇ／ｍＬと算定した。アッセイ間変動およびアッセイ内変動はそれぞれ、６％および１０％であった。許容基準は、アッセイ内変動の場合は１０％未満、アッセイ間変動の場合は１５％未満であった。このため、許容範囲内にある。直線性を得るには、ヒト血清を１：４に希釈する必要がある。１：４に予備希釈されたヒト血清の平均希釈回収率は９６％であった。検体安定性を、凍結／解凍サイクル、および４℃および２０℃での保存安定性に応じて分析し、回収率の許容基準を１００％±２０％以内に設定した。血清中の検体の回収率は、４回にわたる凍結／解凍サイクル後に、９２％となった。４℃で４８時間保存した後、回収率は８４％となった。また、検体安定性を、２０℃で４時間、２４時間および４８時間試験した。４時間後の回復率は、８８％となった。ただし、２４時間後、検体は許容範囲（回収率５０％）内では回収できなかった。これらのデータから示唆されるように、血清中の検体は４℃にて４８時間まで安定である。ただし、血清試料は、分析した際、２０℃以上にて４時間を超えて保管すべきではない。ビオチン、脂質、またはヘモグロビンの含有量の低い場合および高い場合のどちらにおいても干渉は全く検出されず、回収率は８０～９８％の範囲内に留まっていた。回収率１００％±２０％以内を、許容基準とした。

コラゲナーゼ（ＭＭＰ－８およびＭＭＰ－１３）を介したＳＰＡＲＣの分解
抗体特異性を更に評価し、どのプロテアーゼがＳＰＡＲＣ－Ｍを生成するかを調べるために、異なるゼラチナーゼ（ＭＭＰ－２およびＭＭＰ－９）ならびにコラゲナーゼ（ＭＭＰ－８およびＭＭＰ－１３）を、組換え全長ＳＰＡＲＣと共にインキュベートした。図２に図示されているように、コラゲナーゼによって断片を生成することが可能である。ＭＭＰ－１３を用いたことにより、ＳＰＡＲＣ－Ｍが最高レベルにて生成された。対照的に、プロテアーゼ不使用の場合、またはＭＭＰ－９と共にインキュベートした場合には、ＳＰＡＲＣ－Ｍが全く生成されなかった。ＭＭＰ－２は、コラゲナーゼと比較して少量のＳＰＡＲＣ－Ｍを生成することを可能とした。

これらの結果から示唆されるのは、抗体は開裂部位に特異的であること、およびこの特定の部位にてコラゲナーゼは、ゼラチナーゼと比較してＳＰＡＲＣを優先することである。

ＳＰＡＲＣ－Ｍの臨床評価
ＳＰＡＲＣ－Ｍに臨床疾患の関連性およびバイオマーカーの可能性があるかどうかの調査を目的として、異なる線維性肺疾患患者および健常対照において、ＳＰＡＲＣ－Ｍを測定した。コホート１は、肺癌患者、ＩＰＦ患者、ＣＯＰＤ患者、および健常対照で構成されていた。図３Ａに図示されているように、ＳＰＡＲＣ－Ｍは、健常対照およびＣＯＰＤ患者と比較して、肺癌患者で有意に上昇した。ＩＰＦ患者は、健常対照と比較してＳＰＡＲＣ－Ｍレベルも上昇した。これらの所見の確証を目的として、肺癌患者４０人と健常対照２０人とを含めた第２コホートまたはそれより大きいコホートにおいて、ＳＰＡＲＣ－Ｍを測定した。肺癌患者ではＳＰＡＲＣ－Ｍが、健常対照と比較して有意に増加したことが、確証された（図３Ｂ）。受信者操作特性（ＡＵＲＯＣ）下の領域を用いて、肺癌患者および健常対照（コホート２）に関連したＳＰＡＲＣ－Ｍの識別力を評価した。ＳＰＡＲＣ－Ｍは、ＡＵＲＯＣが０．８７（９５％ＣＩ：０．７８～０．９６）の患者および健常対照を識別できた。

転移を有する（高腫瘍量）患者では、ＳＰＡＲＣ－Ｍレベルが限局性腫瘍の患者と比較して異なるかどうかを調査するため、コホート２の患者を、腫瘍の病期（Ｉ～ＩＶ期）に従って層別化した。腫瘍の病期間に有意差は観察されなかったが、腫瘍の病期の昇順ではＳＰＡＲＣ－Ｍの増加する傾向が観察された（図３Ｃ）。

結論
本研究の説明は、血清中ＳＰＡＲＣの断片を定量化する競合的ＥＬＩＳＡアッセイの開発、および生物学的検証に関するものである。本研究の主要所見は、次の通り：１）調査対象となった断片は、血清中で検出可能であり、肺癌患者では、健常対照と比較して有意に上昇したこと、２）アッセイは技術的に堅牢であり、ＳＰＡＲＣ、ＳＰＡＲＣ－Ｍの一意なＭＭＰ－８／ＭＭＰ－１３分解断片に対し特異的であったこと、３）アッセイは、ＩＰＦを評価する際の使用に関して将来性のあることが明らかにされていること、である。

本明細書中で別途明記されていない限り、「または」という単語は、指定された条件のいずれかまたは両方が満たされたときに真の値を返す演算子の意味で使用されている。これは、一方の条件のみが満たされることを要求する「排他的論理和」演算子とは対照を為す。「含む」という用語は、「からなる」という意味ではなく寧ろ「含む」という意味で使用されている。上記に承認された先行する諸教示はいずれも、本明細書において参照により援用されている。

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Claims

患者における肺癌の進行の検出および／またはモニターを用途とした、イムノアッセイ法であって、患者の生体液試料をＮ末端アミノ酸配列ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）に対し特異的に反応するモノクローナル抗体に接触させることであって、前記モノクローナル抗体は、前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを特異的に認識することもないし、また結合することもない、接触させることと、前記モノクローナル抗体と前記Ｎ末端アミノ酸配列含有ペプチドとの間の結合量を算定することと、前記結合量を、正常な健常被験対象に関連する値および／または既知の肺癌の重篤度に関連する値および／または以前の時点で前記患者から得られた値、および／または所定のカットオフ値と相関させることと、を含む、イムノアッセイ法。
前記所定のカットオフ値が少なくとも９．０ｎｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
前記患者の生体液試料が、血液、尿、滑液、血清または血漿である、請求項１または２に記載の方法。
前記イムノアッセイが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイである、請求項１～３に記載の方法。
前記イムノアッセイが、酵素結合免疫吸着アッセイまたは放射免疫アッセイである、請求項１～４に記載の方法。
患者が肺癌の治療に対し陽性反応するかどうかを判定する方法であって、前記方法が、請求項１～５に記載の方法を使用して、少なくとも２つの生体試料中の前記Ｎ末端アミノ酸配列ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）含有ペプチドの量を定量化することを含み、前記生体試料が、前記患者に対し治療薬を投与した期間中の第１の時点および少なくとも１つの以後の時点において前記患者から得られたものであり、且つ治療期間中の、前記第１の時点から前記少なくとも１つの以後の時点に至るまでに、前記Ｎ末端アミノ酸配列ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）含有ペプチドの量の減少は、前記患者が前記治療に対し陽性反応することを示唆するものである、方法。
患者における特発性肺線維症（ＩＰＦ）の進行の検出および／またはモニターを用途とした、イムノアッセイ法であって、患者の生体液試料をＮ末端アミノ酸配列ＬＬＡＲＤＦＥＫＮＹ（配列番号：１）に対し特異的に反応するモノクローナル抗体に接触させることであって、前記モノクローナル抗体は、前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ延在伸長バージョンもしくは前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ切断短縮バージョンを特異的に認識することもないし、また結合することもない、接触させることと、前記モノクローナル抗体と前記Ｎ末端アミノ酸配列含有ペプチドとの間の結合量を算定することと、前記結合量を、正常な健常被験対象に関連する値および／または既知のＩＰＦの重篤度に関連する値および／または以前の時点で前記患者から得られた値、および／または所定のカットオフ値と相関させることと、を含む、イムノアッセイ法。
前記患者の生体液試料が、血液、尿、滑液、血清または血漿である、請求項７に記載の方法。
前記イムノアッセイが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイである、請求項７または８に記載の方法。
前記イムノアッセイが、酵素結合免疫吸着アッセイまたは放射免疫アッセイである、請求項７～９に記載の方法。