ES2315697T3 - Deteccion de modificacion de historia en nucleosomas libres de celulas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para evaluar una enfermedad en un individuo, que comprende: contactar los nucleosomas libres de células en una muestra de sangre, suero o plasma obtenida del individuo con un anticuerpo que se une específicamente con una proteína de histona modificada; en el que la proteína de histona modificada se muestra en la siguiente tabla: (Ver tabla) y en el que la unión de dicha anticuerpo a dichos nucleosomas libres de células es indicativa de que el individuo tiene una enfermedad.
Description
Detección de midoficación de histona en
nucleosomas libres de células.
Esta invención se refiere al diagnóstico de
enfermedades, tal como cáncer y enfermedades autoinmunes, mediante
el análisis de nucleosomas libres de células en muestras de
individuos, en particular en análisis de nucleosomas libres de
células que contienen modificaciones de histona.
En los eucariotas, el ADN se hace complejo con
proteínas para formar nucleosomas, la unidad básica de cromatina.
Los nucleosomas consisten en aproximadamente 150 pares de bases de
ADN envueltos alrededor de un núcleo de histona, que es un complejo
de proteína que implica las cuatro histonas H4, H3, H2B y H2A. Los
extremos amino-terminales de estas proteínas están
entre las proteínas conservadas conocidas más evolucionadas. Estos
extremos se modifican de manera post-translacional
mediante la adición de una serie de grupos químicos que incluyen
metil, acetil y fosforil. Estas modificaciones químicas, o marcas,
juegan un papel clave en la determinación de la estructura de la
cromatina, y así el acceso a las células genómicas de ADN (Wu J y
Grunstein M (2000) Trends Biochem. Sci. 25,
619-623; Berger SL (2001) Oncogene 20,
3007-3013). También se han mostrado que las marcas
están implicadas en el mecanismo de control para un amplio rango de
procesos celulares. Por ejemplo, en general, la desacetilación de
las marcas y ciertas marcas de mutilación están asociadas con el
silenciado de los genes (Hu JF y Hoffman AR (2001) Methods Mol Biol
181, 285-296; Rice JC y Allis CD (2001) Curr Opin
Cell Biol 13, 263-273; Carrozza MJ et al
(2003) Trends Genet 19, 321-329; Nephew KP y Huang
TH (2003) Cancer Lett 190, 125-133) y marcas de
fosforil con apoptosis (Enomoto R et al (2001) Mol Cell Biol
Res Commun 4, 276-281; Ajiro K (2000) J Biol Chem
275, 439-443; Talasz H et al (2002) Cell
Death Differ 9, 27-39; Rogakou EP et al
(2000) J Biol Chem 265, 9390-9395) y mitosis
(Crosio et al (2002) Mol Cell Biol 22
874-885; Goto et al (2002) Genes Cells 7,
11-17; Hans y Dimitrov (2001) Oncogene 20,
3021-3027; Preuss et al (2003) Nucl Acids Res
31, 878-885). Los nucleosomas marcados de una
manera específica se pueden aislar de las células mediante la
utilización de anticuerpos específicos, y el componente del ADN se
puede analizar (por ejemplo, Clayton et al (2000) EMBO J 19,
3714-3726; Li et al (2001) Mol Cell Biol 21,
8213-8224; Osano y Ono (2003) Eur J Biochem 270,
2532-2539; Kondo y Issa (2003) J Biol Chem (2003)
272 (30): 27658-62).
Los pacientes que sufren enfermedades tales como
cáncer y enfermedades autoinmunes tiene nucleosomas circulando en
la sangre, resultante de la apoptosis aumentada (Holdenrieder et
al (2001) Int J Cancer 95, 114-120;
Trejo-Becerril et al (2003) Int J Cancer
104, 663-668; Kuroi et al 1999 Breast Cancer
6, 361-364; Kuroi et al (2001) Int J
Oncology 19, 143-148; Amoura et al (1997)
Arth Rheum 40, 2217-2225; Williams et al
(2001) J Rheumatol 28, 81-94). La medición de los
niveles de nucleosomas libres de células se ha propuesto como medios
para diagnosticar enfermedades asociadas con la apoptosis
(Holdenrieder et al (1999) Anticancer Res. 19,
2721-2724). Sin embargo, la presencia de
nucleosomas libres de células con marcas específicas no se ha
evaluado. El documento WO 03/014142 describe la generación de
anticuerpos contra un residuo de serina 14
alfa-fosforilatado en Histona 2B. Esta modificación
post-translacional del amino terminal de la Histona
2B está asociada con las células que van a entrar hoy han sufrido
apoptosis. Estos anticuerpos son útiles en la identificación de
células apoptóticas y sirven como herramientas de diagnóstico y
tamizado. El documento WO 03/07894 describe el uso de anticuerpos
dirigidos contra modificaciones amino terminales de histona
específicas como indicadores de diagnóstico de enfermedades o
defectos congénitos. Por ejemplo, los nucleosomas se aíslan de una
muestra de sangre o suero de un paciente utilizando anticuerpos
específicos de histona y el ADN adjunto se purifica y se analiza
para propósitos de diagnóstico y tamizado.
La presente invención se refiere a
procedimientos para detectar nucleosomas y contienen histonas
modificadas en muestras de pacientes, en particular procedimientos
que implican interacciones anticuerpo-antígeno.
Varios aspectos de la invención se refiere al
uso de anticuerpos que se unen específicamente a histonas
modificadas para detectar nucleosomas en muestras que comprenden
histonas modificadas.
Un aspecto de la invención proporciona un
procedimiento para evaluar una enfermedad en un individuo tal como
se indica en la reivindicación 1.
Una enfermedad en el individuo se puede evaluar
mediante la determinación de una o más de: la presencia de una más
modificaciones de histona en la muestra, una lento en el número de
nucleosomas libres de células que contienen histonas modificadas en
la muestra respecto a los niveles normales, una alteración en la
relación de una o más modificaciones de histona particulares
respecto a otras modificaciones de histona en la muestra y un
número límite de nucleosomas en la muestra que comprende una
modificación de histona.
Después de que la muestra de fluido biológico se
haya contactado con el anticuerpo bajo condiciones adecuadas para
permitir la unión específica del anticuerpo con su antígeno
objetivo, los nucleosomas que comprenden la histona modificada se
pueden identificar y, opcionalmente, aislar utilizando técnicas
estándar.
Un fluido biológico adecuado para su uso según
los presentes procedimientos es sangre, suero o plasma.
Los nucleosomas se puede concentrar a partir de
la muestra de fluido biológico antes de contactar con el anticuerpo.
Los nucleosomas se puede concentrar a partir de la muestra de
fluido biológico mediante cualquier procedimiento de concentración
conveniente, incluyendo, por ejemplo:
- filtración centrífuga tal como unidades de
filtración centrífuga con una membrana de corte de peso molecular
apropiado, por ejemplo unidades de Millipore's Centricon® o
Amicon®,
- precipitación de ácido (Yoshida, M et
al (1990), J Biol Chem 265, 17174-17179),
- inmunoprecipitación utilizando procedimientos
convencionales, por ejemplo, mediante la incubación de la muestra
con un anticuerpo anti-nucleosoma o un anticuerpo de
marca específica de histona, y a continuación inmunopurificando el
complejo anticuerpo/antígeno utilizando una columna giratoria
empaquetada con una matriz de inmunoafinidad. Los nucleosomas
capturados se aclararían a continuación y se analizarían,
- separación basada en la carga, por ejemplo,
uniéndose a soportes sólidos cubiertos con poliK (Williams RC et
al (2001) J Rheumatol 28, 81-94),
- separación basada en biotinilación. Las
histonas se pueden biotinilar mediante biotinidasa (Hymes et
al (1995), Biochem Mol Med 56, 76-83; Stanley
JS et al, (2001) Eur J Biochem 268,
5424-5429.
En algunas realizaciones, los nucleosomas se
puede concentrar mediante un procedimiento diferente a la recogida
sobre un soporte recubierto con poli K o estreptavidina.
Una marca de histona puede ser un cambio químico
post-translacional en uno o más residuos aminoácidos
de histona, por ejemplo la adición/retirada de un grupo químico o
isomerización de un residuo aminoácido.
Un anticuerpo específico para una de histona
modificada es específico para un único epítope formado mediante
modificación post-translacional de un núcleo de
histona, por ejemplo histona H2A, H2B, H3, H4 (Luger K. et
al (1997) Nature 30, 251-260) una modificación o
variante de la misma (ver por ejemplo Ausio J (2001) Biochem Cell
Bio 79, 693). Las secuencias conocidas de histonas se describen en
la base de datos de secuencias de histonas NHGRI/NCBI es accesible
en línea.
Una modificación puede ser en la región central
de una histona o en el extremo flexible N-terminal o
C-terminal.
La modificación
post-translacional puede incluir acetilación,
mutilación, que puede ser mono-, di- o
tri-metilación, fosforilación, ribosilación,
citrulinación, ubiquitinación, hidroxilación, glicoxilación,
nitrosilación, glutaminación y/o isomerización (Ausio (2001)
Biochem Cell Bio 79, 693).
Un residuo de lisina que está metilado puede
estar mono-, di- o tri- metilado. Un residuo de arginina que está
metilado puede estar dimetilado de manera simétrica o asimétrica, o
monometilado.
Un residuo de aminoácido de histona que tiene
una modificación puede ser cualquier residuo de Ser, Lys, Arg, His,
Glu, Pro o Thr en la secuencia de aminoácido de histona.
Por ejemplo, un residuo de lisina en la
secuencia de núcleo de histona puede estar mono-, di- o tri-
metilado, acetilado o ubiquitinado, un residuo de arginina en la
secuencia de núcleo de histona puede estar monometilado, dimetilado
de manera simétrica o asimétrica o convertido en citrulina, un
residuo de serina o treonina en la secuencia de núcleo de histona
se puede fosforilar y/o un residuo de prolina en la secuencia de
núcleo se puede isomerizar.
La notación utilizado para describir una
modificación de histona particular indica que histona se ha
modificado, el(los) aminoácido(s)
particular(es) que se ha(n) modificado y el tipo de
modificación que se ha producido. Por ejemplo H3 Lys 9 (Me) indica
la metilación de histona H3 en lisina 9.
Ejemplos de modificaciones incluyen las
modificaciones mostradas en la tabla 1.
Una marca de histona que produce un efecto
celular puede consistir en una modificación a una histona o puede
consistir en dos o más modificaciones de la histona. En otras
palabras, una única marca, por ejemplo se puede saciar con el
silenciado o con la activación, puede consistir en una combinación
de modificaciones separadas en diferentes residuos en una secuencia
de histona.
Por ejemplo, una histona modificada puede
comprender una marca que está asociada con un silenciado de genes,
tal como H3 Lys 9(Me) H3 Lys 27(Me), H3 Lys
36(Me), H3 Lys 79(Me) y H4 Lys 20(Me) o una
marca que está asociada con la activación de genes, tal como H3 Lys
4(Me) H3 Lys 9(Ac), H3 Lys 14(Ac) y H3 Lys
23(Ac).
Se pueden utilizar anticuerpos que sean
específicos para marcas de histona que están asociadas con
secuencias de genes activos (eucromatina) o secuencias de genes
inactivos (heterocromatina), por ejemplo, para detectar expresiones
de genes inapropiadas que son indicativas de una enfermedad. El
tamizado de la población de nucleosomas libres de células presentes
en una muestra de un individuo podrá revelar la inactivación de un
gen de supresión de un tumor o, alternativamente, la activación de
un oncogén.
Un "nucleosoma modificado" es un nucleosoma
que comprende una histona que comprende una o más modificaciones,
tal como se ha descrito anteriormente.
Un anticuerpo que específicamente se une a un
antígeno tal como una histona modificada o un nucleosoma puede no
mostrar ninguna unión significativa con las moléculas diferentes del
antígeno. Un anticuerpo puede unirse específicamente a un epítope
particular que es llevado mediante una serie de antígenos, en cuyo
caso el anticuerpo podrá unirse a los diferentes antígenos que
llevan el epítope.
En algunas realizaciones, una enfermedad se
puede evaluar mediante la determinación de la presencia de dos o
más modificaciones de histona en nucleosomas libres de células en la
muestra. En particular, la presencia de una marca de histona que
consiste en más de una modificación se puede determinar mediante la
determinación de la presencia de dos o más modificaciones
separadas. Dos o más modificaciones de histona en una muestra se
pueden caracterizar mediante el contacto de la muestra con un
anticuerpo que se une específicamente a dos o más modificaciones de
histona, o alternativamente, contactando la muestra con dos o más
anticuerpos, uniéndose específicamente cada anticuerpo a una
modificación de histona diferente.
Un procedimiento para evaluar la modificación de
histona en nucleosomas libres de células en una muestra de fluido
biológico puede comprender:
contactar una muestra de fluido biológico con un
anticuerpo que se une específicamente a una histona que comprende
una modificación; y
determinar la unión de dicha anticuerpo a
nucleosomas en dicha muestra, siendo la unión de dicha anticuerpo
indicativo de la presencia de histona modificada en nucleosomas en
la sangre de dicho individuo.
Un anticuerpo puede unirse específicamente a una
modificación de histona descrita anteriormente, por ejemplo una
modificación mostrada en la tabla 1, o una combinación de estas
modificaciones.
Un anticuerpo puede unirse específicamente a una
histona que comprende una modificación mostrada en la tabla 2 o una
combinación de estas modificaciones.
La muestra de fluido biológico se puede
contactar con un anticuerpo adicional que según específicamente a
una histona que comprende una modificación diferente del primer
anticuerpo. Se pueden utilizar una serie de anticuerpos para
detectar la presencia de un rango de modificaciones de histona.
Los nucleosomas libres de células en muestras de
fluido del paciente se pueden utilizar para evaluar enfermedades
asociadas con la muerte celular, en particular cáncer y/o
enfermedades autoinmunes. Por ejemplo, la presencia de células
cancerosas en un individuo puede generar un nivel mayor de
nucleosomas libres de células en la sangre como resultado de la
apoptosis aumentada de las células cancerosas. Un anticuerpo
dirigido contra las marcas asociadas con la apoptosis, tal como H2B
Ser 14(P), se puede utilizar para aislar de manera selectiva
nucleosomas que se han liberado de las células neoplásicas
apoptóticas.
Una histona modificada, por ejemplo, puede tener
una modificación seleccionada entre el grupo que consiste en H2B
Ser 14 (Phos), H3 lys 9(Me), H3 lys 27(Me) y H3Ser 10
(Phos). En algunas realizaciones, la histona modificada no es H2B
Ser 14 (Phos).
Las enfermedades asociadas con nucleosomas
modificados libres de células incluyen, pero no están limitados a,
neoplasmas y tumores pre-malignos y malignos, (por
ejemplo, histocitoma, glioma, astrocioma, ostenoma), cánceres (por
ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas,
cáncer gastrointestinal, cáncer de intestino grueso, cáncer de
colon, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, cáncer de próstata,
cáncer testicular, cáncer del hígado, cáncer de riñón, cáncer de
vejiga, cáncer de páncreas, cáncer cerebral, sarcoma, osteosarcoma,
sarcoma de Kaposi, melanoma), leucemias, enfermedades autoinmunes
(por ejemplo eritematosis de lupus sistémico) y enfermedades
proliferativas (por ejemplo, psoriasis, enfermedades óseas,
enfermedades fibroproliferativas de tejido conectivo, cataratas y
arteriosclerosis).
Una enfermedad pre-maligna o
maligna se puede producir en cualquier tipo de célula, incluyendo
pero no estando limitado a pulmón, colon, pecho, ovario, próstata,
hígado, páncreas, cerebro y piel.
Un anticuerpo que según específicamente a una
histona modificada se puede generar utilizando técnicas que son
convencionales en la técnica. Los procedimientos para producir
anticuerpos incluyen inmunizar a un mamífero (por ejemplo, ratón,
rata, conejo, caballo, cabra, oveja o mono) con una histona
modificada un fragmento de tejido de la histona que comprende la
modificación o marca. Los fragmentos del péptido con modificaciones
particulares se pueden diseñar a partir de secuencias de histona
conocidas y producidas mediante procedimientos de síntesis de
rutina. Los anticuerpos se pueden obtener a partir de animales
inmunizados utilizando cualquiera de una serie de técnicas
conocidas en la técnica, y tamizando, preferiblemente utilizando la
unión del anticuerpo al antígeno de interés. Por ejemplo, se pueden
utilizar técnicas de Western Blot o inmunoprecipitación (Armitage
et al., (1992) Nature 357, 80-82).
Como un alternativa o suplemento a la
inmunización de un mamífero con un péptido, se puede obtener un
anticuerpo específico para una proteína a partir de una librería
producida de manera recombinante de dominios variables de
inmunoglobulina expresada, por ejemplo, utilizando bacteriófagos
lambda o bacteriófagos filamentosos que muestran dominios de unión
de inmunoglobulina funcionales en sus superficies; por ejemplo, ver
el documento WO 92/01047. La librería puede ser naive, es decir,
construida a partir de secuencias obtenidas de un organismo que no
sea inmunizado con cualquiera de las proteínas (o fragmentos), o
puede ser una construido utilizando secuencias obtenidas a partir
de un organismo que se ha expuesto al antígeno de interés.
Los anticuerpos adecuados para su uso según los
presentes procedimientos están también disponibles a partir de
proveedores comerciales.
La unión de un anticuerpo se puede determinar
mediante cualesquiera medios apropiados. El marcado con moléculas
individuales indicadoras es una posibilidad. Las moléculas
indicadoras puede generar de manera directa o indirecta señales que
se pueden detectar, y preferiblemente medir. El enlace de las
moléculas indicadoras puede ser de manera directa o indirecta,
covalente, por ejemplo a través de una unión de péptido o de manera
no covalente. En enlace a través de una unión de péptido puede ser
como resultado de la expresión recombinante de una fusión de gen
que codifica el anticuerpo en la molécula indicadora.
Un ensayo radioinmune (RIA) es otra posibilidad.
El antígeno marcado de manera radiactiva se mezcla con un antígeno
no marcado (la muestra de prueba) y se deja que se una al
anticuerpo. El antígeno unido está físicamente separado del
antígeno un unido y la cantidad de antígeno radioactivo unido al
anticuerpo se determina. Cuanto más antígeno haya en la muestra de
prueba, menos antígeno radio esquivo se unirá al anticuerpo. Un
ensayo de unión competitivo también se puede utilizar con antígeno
no radiactivo, utilizando antígeno a un análogo vinculado a una
molécula indicadora. La molécula indicadora puede ser un
fluorocromo, fósforo o tinte láser con características de absorción
o emisión aisladas de manera espectral. Florocromos adecuados
incluyen fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y Texas Red. Tintes
cromogénicos adecuados incluyen diaminobenzodima.
Otros indicadores incluyen partículas coloidales
macromoleculares o material en partículas tales como cuentas de
látex que están coloreadas, magnéticas o paramagnéticas, y agentes
activos biológica o químicamente que pueden provocar de manera
directa o indirecta señales que se pueden detectar para observarse
visualmente, detectarse de manera electrónica o registrarse de otra
manera. Estas moléculas pueden ser enzimas que catalizan reacciones
que se desarrollan o cambian el color o provocan cambios en las
propiedades eléctricas, por ejemplo. Pueden ser excitables, tales
como transiciones electrónicas entre estados de energía que producen
absorciones o emisiones espectrales características. Pueden incluir
entidades químicas utilizadas en conjunción con biosensores. Se
pueden utilizar sistemas de detección de biotina/avidina o
biotina/estreptavidina y fosfatasa alcalina. El modo de determinar
la unión no es una característica de la presente invención y los
expertos en la materia son capaces de elegir un procedimiento
adecuado según su preferencia y su conocimiento general.
Las señales generadas mediante conjugados
anticuerpo individual-indicador se podrán utilizar
para derivar datos absolutos o relativos que se pueden cuantificar
del anticuerpo relevante que se une en las muestras (normal y
prueba).
Los procedimientos de la invención se puede
realizar en cualquier formato conveniente. Los ensayos inmunológicos
son bien conocidos en la técnica y muchos formatos adecuados están
disponibles, por ejemplo ELISA, Western Blot o Biacore®, (Biacore,
Upsala, Suecia). En algunas realizaciones preferidas, se puede
utilizar un formato de ensayo sandwich. Un ensayo sandwich utiliza
un anticuerpo de captura y un anticuerpo de detección para detectar
la presencia de antígeno en una muestra. El anticuerpo de captura,
por ejemplo, puede unirse específicamente a un nucleosoma y el
anticuerpo del sección a una histona con una modificación
particular, o viceversa.
Otro aspecto de la invención proporciona un
procedimiento para evaluar una enfermedad en un individuo, que
comprende:
contactar una muestra de sangre, plasma o suero
de dicho individuo con un primer anticuerpo; y
determinar la unión de dicho primer anticuerpo
con nucleosomas libres de células en dicha muestra que contiene una
modificación de histona utilizando un segundo anticuerpo,
en el que uno de dicho primer o segundo
anticuerpos se une a un nucleosoma y el otro de dicho primer o
segundo anticuerpos según específicamente a una histona
modificada.
En algunas realizaciones, el primer anticuerpo
se une a nucleosomas el segundo anticuerpos según específicamente a
la histona modificada. Un procedimiento para evaluar una enfermedad
en un individuo puede comprender así:
contactar una muestra de sangre, plasma o suero
de dicho individuo con un primer anticuerpo que se une a nucleosomas
libres de células en la muestra; y
determinar la presencia de una histona
modificada en nucleosomas unido mediante dicho primer anticuerpo
utilizando un segundo anticuerpo que según específicamente a una
histona modificada.
Los anticuerpos que se unen específicamente a
histonas modificadas se describen en mayor detalle anteriormente.
Un anticuerpo que se une a un nucleosoma puede unirse a cualquier
epítope comúnmente encontrado en cualquier componente no modificado
de los nucleosomas, incluyendo histona y epítopes de ADN específico
sin secuencia. En algunas realizaciones, un anticuerpo se puede
unir a la histona y a los componentes de ADN del nucleosoma. Un
anticuerpo se pueden unir específicamente a uno o más componentes
del nucleosoma.
Anticuerpos anti-nucleosoma
adecuados incluyen el anticuerpo conocido como clon 11E6 (disponible
por parte de BD PharMingen) que interactúa con el complejo
sub-nucleosomal
(H2A-H2B)-ADN (Jovelin F et
al (1998) Eur J Immunol 28, 3411).
En otras realizaciones, el segundo anticuerpo se
une a los nucleosomas el primer anticuerpo se une específicamente a
la histona modificada. Un procedimiento para evaluar una enfermedad
en un individuo puede así comprender:
contactar una muestra de sangre, suero plasma de
dicho individuo con un primer anticuerpo que se une específicamente
a una histona modificada;
determinar la unión de dicho primer anticuerpo a
un nucleosoma libre de células en dicha muestra que contiene una
histona modificada utilizando un segundo anticuerpo que se une a un
nucleosoma.
Uno de dichos primer y segundo anticuerpos se
puede inmovilizar y la unión del otro anticuerpo se puede detectar.
Preferiblemente, se inmoviliza el primer anticuerpo. Un anticuerpo
se puede movilizar, por ejemplo, mediante fijación a un soporte
insoluble. En soporte puede ser en forma de partículas consolida, y
puede incluir una placa, un tubo de prueba, cuentas, una bola, un
filtro o una membrana. Un anticuerpo, por ejemplo, puede fijarse un
soporte insoluble que es adecuado para su uso en cromatografía de
afinidad. Los procedimientos para fijar los anticuerpos a soportes
insolubles son conocidos por parte de los expertos en la materia. Un
anticuerpo se puede movilizar, por ejemplo, para aislar nucleosomas
libres de células de la muestra de fluido biológico.
El anticuerpo no inmovilizado puede comprender
una marca detectable tal como se ha descrito anteriormente. Por
ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un fluoroforo, tal como
FITC o rodamina, un radioisótopo, o un reagente de marcado no
isotópico, tal como biotina o digoxigenina; los anticuerpos que
contienen biotina se pueden detectar utilizando "reagentes de
detección", tal como avidina conjugada a cualquier marca
deseable, tal como un fluorocromo.
En algunas realizaciones, el anticuerpo no
inmovilizado se puede detectar utilizando un tercer anticuerpo que
se une a dicha anticuerpo no inmovilizado. Un tercer anticuerpo
adecuado se marca y se une específicamente al primer cual segundo
anticuerpo. El tercer anticuerpo puede comprender una marca
detectable.
En algunas realizaciones, un reagente de bloqueo
se puede utilizar para bloquear o absorber componentes endógenos
que interfieren, tales como anticuerpos o proteínas. Por ejemplo, se
pueden reducir nuestras de anticuerpos endógenos mediante, por
ejemplo, la aplicación de una columna giratoria empaquetada con una
matriz de inmunoafinidad para retirar la inmunoglobulina.
Alternativamente, la interferencia potencial mediante anticuerpos
heterofílicos se podría minimizar mediante el uso de unos reagentes
de bloqueo. Reagentes de bloqueo adecuados están disponibles
comercialmente, por ejemplo, HBR de Scantibodies Ltd (Santee, Calif,
US). El exceso de albúmina en las muestras se pueda retirar
convenientemente mediante el uso de una columna giratoria de
afinidad de albúmina (Montage^{TM} Albumin Deplete kit,
Millipore).
Los anticuerpos específicos para las histonas
modificadas se pueden utilizar para detectar cualquier modificación
anormal que podría indicar una enfermedad. Alternativamente, las
secuencias de ácido nucleico asociadas con los nucleosomas
modificados se pueden analizar utilizando técnicas estándar para
analizar una enfermedad o la susceptibilidad de una enfermedad.
Los procedimientos tal como se han descrito aquí
se pueden utilizar para aislar y/o identificar secuencias de ácido
nucleico asociadas con una marca particular. Estas secuencias de
ácido nucleico se pueden asociar con una enfermedad. La
identificación del ADN asociado con nucleosomas modificados también
puede ser útil en la monitorización del progreso de un tratamiento
terapéutico, por ejemplo, monitorizar los efectos positivos y/o
adversos resultantes del tratamiento.
Los procedimientos puede comprender el
aislamiento de un nucleosoma que comprende una histona modificada.
Los nucleosomas que comprenden histonas modificadas se pueden aislar
mediante inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo específico de
histona modificada un anticuerpo específico de nucleosoma, tal como
se describen aquí. Alternativamente, los nucleosomas se pueden
aislar mediante su unión a un anticuerpo inmovilizado, tal como se
ha descrito anteriormente.
Una vez se han aislado de la muestra los
nucleosomas, el ADN asociado con los nucleosomas se puede recuperar
utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, el ADN se puede movilizar
sobre filtros, matrices de columna, o cuentas magnéticas. Numerosos
equipos comerciales, tal como el equipo Qiagen QIAamp (Quiagen,
Crawley, UK) se pueden utilizar. Brevemente, la muestra se puede
colocar en un tubo microcentrífugo y combinarse con Proteinasa K,
mezclarse, y permitir que se incube para lisar las células. A
continuación se añade etanol y el lisato se transfiere a una
columna giratoria QIAamp, desde la cual el ADN se diluye después de
varios lavados. Finalmente, el ADN aislado se puede amplificar a
través de PCR u otras técnicas de amplificación. La secuencia del
ADN asociado con los nucleosomas se puede obtener, por ejemplo,
para identificar el polipéptido codificado mediante el ADN. El ADN
asociado con el nucleosoma se puede asociar con una marca un
modificación de histona particular. Por ejemplo, dependiendo de la
especificidad de unión del anticuerpo usado para aislar inicialmente
los nucleosomas de la muestra, se pueden identificar los genes
están asociados con las marcas de activación o silenciado.
Cualquiera de los procedimientos analíticos
conocidos por los expertos en la materia se pueden utilizar para
identificar las secuencias de ADN asociadas con los nucleosomas
aislados. Las secuencias de ADN, por ejemplo, se pueden identificar
mediante microsecuencia directa del ADN purificado.
Alternativamente, el ADN purificado se puede
amplificar primero utilizando tecnología PCR u otra técnica de
amplificación antes del análisis adicional del ADN.
El ADN asociado con los nucleosomas aislados se
puede identificar mediante el contacto del ADN purificado con
secuencias de ácido nucleico conocidas bajo condiciones adecuadas
para la hibridización de las secuencias complementarias, en el que
la hibridización del ADN purificado en su complemento identifica la
secuencia de ADN purificada; y la determinación de la
hibridización. Por ejemplo, se puede realizar un análisis Southern
Blot, en el cual las secuencias de ADN conocidas o el ADN purificado
sirven como la sonda marcada, y las secuencias no marcadas se
inmovilizan sobre una superficie sólida. Entonces se detecta la
formación de duplicidades de ácido nucleico. El ADN asociado al
nucleosoma se puede identificar a continuación a partir de
la(s) secuencia(s) a la(s) cual(es) se
hibrida.
Las sondas de ácido nucleico se pueden marcar
con un marcador detectable utilizando técnicas estándar conocidas
por los expertos en la materia. Por ejemplo, las sondas de ácido
nucleico se pueden marcar con un fluoroforo, un radioisótopo, o un
reagente de marcado no isotópico, tal como biotina o
digoxigenina.
Las secuencias de ácido nucleico conocidas, por
ejemplo, secuencias de varios genes de interés, se pueden
inmovilizar sobre una superficie sólida, tal como se ha descrito
anteriormente. Preferiblemente, las secuencias inmovilizan en forma
de una microserie, en la a cual cada secuencia conocida se le asigna
una posición sobre una superficie sólida. Preferiblemente, la
microserie comprende una pluralidad de moléculas de ADN, teniendo,
cada una, una secuencia conocida diferente. El ADN de nucleosoma
purificado se puede marcar y a continuación colocar en contacto con
una microserie de secuencias conocidas bajo condiciones adecuadas
para la hibridización de secuencias complementarias. Después de un
período de tiempo predeterminado, el material no unido y no
específicamente unido se puede lavar de la microserie y tamizar la
serie para señales detectables. Una señal generada en una posición
específica sobre la superficie sólida mediante hibridización de una
secuencia del ADN de nucleosoma purificado en su complemento
identifica la secuencia del ADN de nucleosoma purificado.
Las microseries permiten la miniaturización de
los ensayos, por ejemplo el marcado utilizando agentes de unión
(tales como secuencias de ácido nucleico) inmovilizados en pequeñas
posiciones discretas (micropuntos) y/o como series sobre soportes
sólidos o sobre chips de diagnóstico. Estas aproximaciones pueden
ser particularmente valiosas porque proporcionan una gran
sensibilidad (particularmente a través del uso de reagentes marcados
fluorescentes), requiriendo solamente en cantidades muy pequeñas de
muestras biológicas de individuos que se prueban y que permiten
realizar simultáneamente una variedad de ensayos separados. Esta
última ventaja puede ser útil porque proporciona un ensayo para un
número de secuencias diferentes que se realizan utilizando una
única muestra. Ejemplos de técnicas que permiten esta tecnología
miniaturizada se proporcionan en los documentos WO 84/01031, WO
88/1058, WO 89/01157, WO 93/8472, WO 95/18376, WO 95/18377, WO
95/24649 y EP-A- 0373203, cuyo objeto se incorpora
aquí por referencia.
Los principios de la hibridización de microserie
se describen en Yershov, G. et al (1996) Proc Natl Acad Sci
USA 93 4913-4918, Cheung V.G. et al (1999)
Nature Genetics 21 15-19, y Schena, M. (1999) DNA
Microarrays "a practical approach", ISBN 0-
19-963777-6, Oxford press, editor B.
D. Hames. Brevemente, la microserie de ADN se puede generar
utilizando oligonucleótidos que se han seleccionado para hibridar
con el polimorfismo objetivo específico. Estos oligonucleótidos se
pueden aplicar mediante un robot en una posición predeterminada de
un portaobjetos de vicios, por ejemplo en unas coordenadas
cartesianas X, Y predeterminadas, e inmovilizarse. La muestra de
ARN o ADN (por ejemplo ARN o ADN marcado de manera fluorescente) se
introducen en la microserie de ADN y se realiza la reacción de
hibridación de manera que la muestra de ARN o ADN según en a
secuencias complementarias o oligonucleótidos en una manera de
secuencia específica, y permiten que se lave el material no unido.
Las secuencias se pueden así identificar mediante su capacidad para
unirse a oligonucleótidos complementarios en la serie y producir
una señal. La ausencia de una señal fluorescente para una sonda de
oligonucleótido específico indica que la secuencia de la muestra de
ADN o ARN no está presente en la microserie. Por supuesto, el
procedimiento no está limitado al uso de marcado fluorescente, sino
que se puede utilizar cualquier otra marca adecuada conocida en la
técnica. La fluorescencia en cada coordenadas se puede leer
utilizando un detector automatizado adecuado, para correlacionar
cada señal fluorescente con un oligonucleótido particular.
La hibridización del ADN asociado a un
nucleosoma de dicho individuo se puede comparar con la hibridización
del ADN asociado a un nucleosoma de otros individuos. Por ejemplo,
los parámetros de hibridización de un paciente con una enfermedad
proliferativa se pueden comparar con los parámetros de un individuo
sano para identificar los genes cuya cromatina está marcada de
manera diferencial (por ejemplo, activada o inactiva) en la
enfermedad proliferativa. Por ejemplo, un gen supresor de tumores
se puede asociar con una marca de silenciado o un oncogén con una
marca de activación en una enfermedad cancerosa.
Un procedimiento de identificación de un gen
supresor de tumores puede comprender:
contactar una muestra de fluido biológico
obtenida de un individuo que tiene una enfermedad cancerosa con un
anticuerpo que se une específicamente a una histona que tiene una
modificación asociada con nucleosomas aislados de silenciado unidos
a dicho anticuerpo, secuenciar el ADN asociado con dichos
nucleosomas unidos; y
identificar dicho ADN como un gen supresor de
tumores.
Un procedimiento puede comprender comparar dicho
ADN con el ADN asociado con dichos nucleosomas unidos en la muestra
de un individuo sano (es decir, un individuo que no tiene cáncer).
Una secuencia de ADN que está asociada con una marca de silenciado
en la muestra de cáncer pero no la muestra de no cáncer es un
supresor de tumores candidato.
En algunas realizaciones, una modificación
asociada con el silenciado puede excluir mutilación Lys 9 de histona
H3.
Un procedimiento puede incluir la concentración
de los nucleosomas en la muestra mediante un procedimiento
diferente que la recogida sobre un soporte de poli K o recubierto
con estreptavidina, antes de contactar con el anticuerpo.
Un procedimiento de identificación de un gen
supresor de tumores puede incluir el contacto de los nucleosomas
con un primer anticuerpo que se unen específicamente a una histona
que tiene una modificación asociada con el silenciado y un segundo
anticuerpo que se une a los nucleosomas, por ejemplo en un formato
de ensayo de sándwich.
Un procedimiento de identificación de un oncogén
puede comprender:
contactar la muestra de fluido biológico
obtenida de un individuo que sufre cáncer con un anticuerpo que
según específicamente a una histona que tiene una modificación
asociada con la activación;
aislar los nucleosomas unidos a dicha
anticuerpo;
secuenciar el ADN asociado con dichos
nucleosomas unidos, y
identificar dicho ADN como un oncogén.
Las modificaciones asociadas con la activación
genética se describen en mayor detalle anteriormente. En algunas
realizaciones, una modificación asociada con la activación puede
excluir H3 Lys 4 (Me), H3 Lys 9 (Ac) y/o H4 Lys 5 (Ac).
Un procedimiento puede comprender comparar dicho
ADN con el ADN asociado con dichos nucleosomas unidos en la muestra
de un individuo sano (es decir, un individuo que no tiene cáncer).
Una secuencia de ADN que está asociada con una marca de activación
en la muestra de cáncer pero no en la muestra de no cáncer es un
oncogén candidato.
Un procedimiento puede incluir la concentración
de los nucleosomas en la muestra mediante un procedimiento
diferente que la recogida sobre un soporte de poli K o recubierto
con estrepavidina, antes de contactar con el anticuerpo.
Un procedimiento de identificación de un oncogén
puede incluir contactar los nucleosomas con un primer anticuerpo
que según específicamente a una histona que tiene una modificación
asociada con el silenciado y un segundo anticuerpo que se une a los
nucleosomas, por ejemplo en un formato de ensayo de sándwich.
Los procedimientos aquí descritos pueden ser
útiles en la detección de alteraciones de cromatina que están
asociadas con una enfermedad. Los nucleosomas libres de células se
pueden aislar de las muestras de individuos sanos y de los
individuos que tienen una enfermedad, utilizando un anticuerpo
específico de histona modificada y, óptimamente, un anticuerpo
específico de nucleosoma, para generar un primer y un segundo bancos
de nucleosomas, respectivamente. Preferiblemente, los
procedimientos de detección de alteraciones de cromatina asociadas
con una enfermedad comprenden contactar los nucleosomas con un
primer anticuerpo que según específicamente una histona que tiene
una modificación y un segundo anticuerpo que según específicamente a
los nucleosomas, por ejemplo en un formato de ensayo de
sándwich.
Después del aislamiento, el ácido nucleico
asociado con los nucleosomas aislados se puede aislar y/o purificar
del primer y el segundo bancos de nucleosomas para generar un primer
y un segundo bancos de ácido nucleico purificado. El ácido nucleico
purificado en cada banco se analiza a continuación, utilizando
técnicas moleculares estándar tales como secuenciado de ADN,
análisis de hibridización de ácido nucleico (incluyendo análisis
Southern Blot), amplificación PCR o tamizado diferencial, para
identificar diferencias entre los dos bancos de secuencias de ácido
nucleico. Aquellas secuencias de ácido nucleico que están presentes
en solamente uno de los dos bancos representan las secuencias de
ácido nucleico que están potencialmente relacionadas con la
enfermedad.
Por ejemplo, los bancos de secuencias de ácido
nucleico se puede contratar por separado con series idénticas de
microserie es de ADN bajo condiciones que permitan la hibridización
entre secuencias complementarias. Las microseries es pueden, por
ejemplo, contener una subserie de secuencias que están asociadas con
enfermedades particulares (tal como varios oncogenes y genes
supresores de tumores conocidos) o pueden contener la serie entera
de secuencias expresadas para uno o más tipos de células
particulares y etapas de desarrollo. La hibridización entre una
secuencia en el banco de ácido nucleico asociado con los nucleosomas
y una secuencia de ácido nucleico inmovilizada en la microserie
produce una señal detectable, que permite que se identifique el
ácido nucleico asociado a los nucleosomas. Las microseries adecuada
se pueden preparar utilizando técnicas conocidas por los expertos
en la materia.
En algunas realizaciones, los bancos de ácido
nucleico asociado con los nucleosomas se pueden amplificar mediante
PCR y/o marcado antes de contactarlos con la microserie. El lavado
de la microserie retira material no unido y no específicamente
unido y permite la detección de las secuencias marcadas que se han
hibridizado específicamente en las secuencias presentes en la
microserie, identificando así las secuencias marcadas. La
comparación de los diseños de hibridización obtenidos con el primer
y el segundo bancos de ácido nucleico asociado con los nucleosomas
permite la identificación de alteraciones de cromatina que están
potencialmente asociados con una enfermedad.
Los bancos de nucleosomas se pueden comparar
utilizando un chip genético, una microserie de ADN, un chip
proteómico utilizando técnicas estándar conocida por los expertos
en la materia (por ejemplo, WO 01/16860, WO 01/16860, WO 01/05935,
WO 00/79326, WO 00/73504, WO 00/71746 y WO 00/53811).
Los procedimientos tal como se describen aquí
también permiten la identificación de ADN genético que está
asociado con marcadores particulares. El ADN que está asociado con
un nucleosoma que tiene una modificación de histona particular, por
ejemplo, se puede inmovilizar sobre una superficie sólida o
"chip". Este ADN, por ejemplo, puede representar todas las
secuencias de ácido nucleico de una célula dada que es competente
para la transcripción o no es competente para la transcripción,
dependiendo de la modificación de histona (por ejemplo, activo: H3
lys 4 (Me), inactivo: H3 lys 9 (Me).
Un procedimiento para identificar un paciente
como que responde a una terapia de modulación de modificación de
histona puede comprender:
determinar el nivel de modificación de histona
en los nucleosomas libres de células en una muestra obtenida del
paciente, respecto a una muestra obtenida de un individuo sano,
un cambio, por ejemplo un aumento una
disminución, en el nivel de modificación que es indicativo que el
paciente responde a la terapia de modulación de modificación de
histona.
Los procedimientos también se pueden utilizar
para monitorizar el efecto de la terapia de modulación de
modificación de histona. La terapia de modulación de modificación
de histona puede incluir, por ejemplo, la inhibición de las enzimas
que modifican o des-modifican la histona, tal como
transferasas, acetilasas y deacetilasas de metil histona.
Un procedimiento de monitorización del efecto de
la terapia de modulación de la modificación de histona en un
paciente puede comprender:
contactar las muestras obtenidas del paciente en
un primer y un segundo puntos de tiempo en dicha terapia con un
anticuerpo que según específicamente a una histona que tiene una
modificación; y
determinar la unión de dicho que cuerpo a dichas
muestras;
un cambio, por ejemplo un aumento una
disminución, en la unión de dicha anticuerpo a la muestra obtenida
en el segundo punto de tiempo respecto al primero, siendo
indicativa del efecto de dicha terapia.
Un paciente puede sufrir un cáncer a una
enfermedad autoinmune, tal como se ha descrito anteriormente.
Por ejemplo, las células tumorales pueden
sobreexpresar enzimas que borran marcas de acetil, provocando una
expresión reducida de genes supresores de tumores (Johnstone RW
(2002) Nature Reviews Drug Discovery, 1, 287). Los pacientes
identificados utilizando los presentes procedimientos teniendo una
acetilación de histona reducida se pueden tratar con un agente que
inhibe las enzimas de deacetilación de histona. Esto aumenta la
acetilación de histona, aumentando así la expresión de los genes
supresores de tumores. El efecto de la terapia se puede monitorizar
mediante la determinación de un aumento en el nivel o la cantidad de
marcas de acetilación.
La aurora quinasa B, con fosforilatos de H3 Ser
10, se sobreexpresa en muchas enfermedades cancerígenas. Los
inhibidores de aurora quinasa B se han mostrado que tienen un efecto
anti-proliferación que está asociado con la
inhibición de esta etapa de marcado de histona (Ditchfield C (2003)
J. Cell Biol. 161, 267). Los pacientes con una fosforilación
aumentada en H3 Ser 10 se pueden identificar utilizando
procedimientos de la invención y monitorizar los efectos del
tratamiento con un inhibidor de aurora quinasa.
El ADN asociado con nucleosomas específicamente
marcados se puede analizar para identificar los regímenes de
tratamiento apropiados.
Por ejemplo, este análisis puede indicar si un
tumor es propenso a la metástasis, la dependencia de la hormona de
un tumor, o la activación en un tumor de ciertos genes y
trayectorias resistentes, por ejemplo, glutationa
S-transferasa-pi (Tonwsend D y Tew K
(2003) Am J Pharmacogenomics 3, 157-172), proteína
asociada con la resistencia a múltiples medicamentos,
p-glicoproteína (Mattern J (2003) Anticancer Res 23,
1769-1772) y glioxalasa-I (Tsuruo T
(2003) Cancer Sci 94, 15-21). El efecto de los
regímenes de tratamiento se podría monitorizar, por ejemplo,
mediante la observación de los cambios en las marcas de
silenciado/activación de los genes asociadas con estos genes.
Un procedimiento de evaluar paciente para un
tratamiento terapéutico puede comprender:
determinar la presencia de uno o más genes que
confieren resistencia al dicho tratamiento en un nucleosoma libre
de células en una muestra obtenida del paciente, tal como se ha
descrito anteriormente;
en el que dicho nucleosoma comprende o contiene
una modificación de histona asociado con la activación o el
silenciado.
Las modificaciones de histona asociadas con la
activación o el silenciado se describen en mayor detalle
anteriormente.
Ciertos aspectos y realizaciones de la invención
se ilustran ahora a modo de ejemplo y con referencia a las figuras
y la tabla descrita posteriormente.
La figura 1 muestra la recuperación eficiente y
la detección de nucleosomas de gallina marcados (Lys 4 de histona
H3 dimetilada) inyectados en sangre humana. La columna A muestra
plasma pobre en plaquetas (PPP), derivado de sangre normal
inyectada con nucleosomas de gallina, la columna B muestra un tampón
inyectado con nucleosomas de gallina y la columna C muestra PPP
derivado de sangre normal.
La figura 2 muestra una curva estándar ELISA
para nucleosomas de gallina indicadas en el tampón, detectados
utilizando un anticuerpo de Lys 4 dimetilado de histona H3.
La figura 3 muestra el análisis de una muestra
de plasma concentrado de un paciente con cáncer y de una muestra de
plasma normal concentrada utilizando un anticuerpo para Lys 4
dimetilada de histona H3.
La tabla 1 muestra una lista de marcas de
histona conocidas. En la tabla, Me = mono, di o trimetil, Ac =
acetil,
Ph = fosforilación, Ubiq = ubiquitinado (para Arg, Me puede significar mono o dimetilado, donde la dimetilación puede ser simétrica o asimétrica).
Ph = fosforilación, Ubiq = ubiquitinado (para Arg, Me puede significar mono o dimetilado, donde la dimetilación puede ser simétrica o asimétrica).
La tabla 2 muestra ejemplos de marcas preferida
según la invención. Como en la tabla 1, Me = mono, di o trimetil,
Ac = acetil, Ph = fosforilación, Ubiq = ubiquitinado (para Arg, Me
puede significar mono o dimetilado, donde la dimetilación puede ser
simétrica o asimétrica).
La tabla 3 muestra ejemplos de péptidos que se
pueden utilizar para generar anticuerpos específicos de histona
modificada.
\vskip1.000000\baselineskip
20 ml de sangre se retiraron mediante inyección
en vena en tubos vacutainer que contenían citrato de sodio, que se
mantuvieron sobre hielo. Se preparó plasma rico en plaquetas (PRP)
dentro de 4 horas de la recogida de la sangre mediante
centrifugación a 4ºC en 300 g durante 20 minutos. Un volumen
apropiado de cóctel inhibidor 20x se añadió directamente al PRP
resultante (resultando en concentraciones supramaximales de ácido
ocadaico, cipermetrina, estaurosporina, tricostatina A, AEBSF,
aprotinina, E-64, EDTA y leupeptina). Se generó
plasma pobre en plaquetas (PPP) mediante la centrifugación del PRP
en una deposición de Percoll en 1500 g durante 20 minutos
adicionales.
En algunos experimentos, los nucleosomas en las
muestras del paciente y de plasma normal se concentraron antes del
análisis como sigue:
muestras de plasma (1,1 ml), recogidas y
preparadas tal como se ha descrito anteriormente, se diluyeron
con
2,4 ml de Dulbeccos PBS (no conteniendo Ca^{2+} o Mg^{2+}). Las muestras se centrifugaron en 328.000 g a 4ºC durante 1,5 horas. Los supernatantes se retiraron y las cuentas se volvieron a suspender en 100 \mul de 10 mM EDTA, se agitaron en su vértice y se dejaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadió un tampón de lisis celular (190 \mul), suplementado con el mismo cóctel inhibidor y 334 \mug/ml HBR-1 (reagente de bloqueo heterofílico, Scantibodies Laboratories Inc., San Diego), y sin cubo a temperatura ambiente durante una hora antes del análisis con ELISA.
2,4 ml de Dulbeccos PBS (no conteniendo Ca^{2+} o Mg^{2+}). Las muestras se centrifugaron en 328.000 g a 4ºC durante 1,5 horas. Los supernatantes se retiraron y las cuentas se volvieron a suspender en 100 \mul de 10 mM EDTA, se agitaron en su vértice y se dejaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadió un tampón de lisis celular (190 \mul), suplementado con el mismo cóctel inhibidor y 334 \mug/ml HBR-1 (reagente de bloqueo heterofílico, Scantibodies Laboratories Inc., San Diego), y sin cubo a temperatura ambiente durante una hora antes del análisis con ELISA.
Nota: la misma relación de EDTA: tampón de
lisis, que contenían las mismas concentraciones de inhibidores y
HBR-1, se utilizó como el diluyente ELISA para las
muestras del paciente y las muestras de la curva estándar.
En algunos experimentos, la curva estándar se
preparó en presencia de una preparación de plasma normal de banco
concentrado.
Procedimiento
1
Una placa ELISA Nunc Maxisorp con 96 pozos se
recubrió a lo largo de la noche a 4ºC con un anticuerpo monoclonal
anti-nucleosomas de ratón purificado con una
concentración de 2,5 \mug/ml en un tampón de carbonato/bicarbonato
pH 9,5, 50 \mul/pozo añadidos (125 ng/pozo). Los contenidos de la
placa se expulsaron y se lavaron tres veces con PBS (Dulbecco A). A
continuación se añadió el tampón de bloqueo (1% BSA en PBS + 0,05%
Tween 20).
PPP derivado de la sangre normal que se inyectó
con nucleosomas de gallina o tampón inyectado con nucleosomas de
gallina, se diluyó aproximadamente con el tapón de bloqueo.
El tampón de bloqueo se retiró de la placa ELISA
y las muestras diluidas (por ejemplo 50 \mul) se transfirieron a
la placa. Se prepararon los pozos de control apropiados.
La placa se transfirió de manera sellada a un
incubador de agitación (30ºC) durante un período de tiempo de dos
horas. La placa se expulsó y se lavó cuatro veces con PBS.
Los anticuerpos de detección
anti-marcas se diluyeron de manera apropiada en
tampón de bloqueo y se añadieron a los pozos designados de la placa
(típicamente 50 \mul/pozo). Las placas se sellaron y se
devolvieron al incubador de agitación durante 1,5 horas
adicionales. Las placas se lavaron como en la etapa previa, seguido
por la adición de, por ejemplo, 50 \mul del conjugado HRP
anti-conejo a todos los pozos, de continuación
volvieron al incubador durante una hora.
La etapa de lavado se repitió en las placas y se
añadió a todo los pozos 100 \mul/pozo de substrato de peroxidada
SureBlue TMB Microwell. Las placas se devolvieron al
agitador/incubador para permitir el desarrollo del color azul,
típicamente durante 40 minutos. Finalmente, se detuvo la reacción
mediante la adición de TMB Stop Solution. Las placas se leyeron en
una longitud de onda de 450 nM.
Procedimiento
2
Se utilizó un sándwich indirecto modificado
ELISA para detectar modificaciones covalentes de histonas de
nucleosomas de muestras de sangre humana, concentradas como
anteriormente.
Una placa ELISA Nunc Maxisorp de 96 pozos se
recubrió a lo largo de la noche a 4ºC con un anticuerpo monoclonal
anti-nucleosomas de ratón purificado con una
concentración de 3,0 \mug/ml en un tampón de carbonato/bicarbonato
pH 9,5, añadidos 50 \mul/pozo (125 ng/pozo). Los contenidos de la
placa se expulsaron y se lavaron tres veces con PBS (Dulbecco A). A
continuación se añadió tampón de bloqueo (1% BSA en Ultrablock +
0,05% Tween 20) durante una hora.
Las muestras de PPP se diluyeron en serie con
diluyente ELISA.
El tampón de bloqueo se retiró de la placa ELISA
y las muestras diluidas (por ejemplo 50 \mul) se transfirieron a
la placa. Se prepararon pozos de control apropiados.
La placa se transfirió de manera sellada a un
incubador de agitación (30ºC) durante un período de tiempo de dos
horas. La placa se expulsó y se lavó cuatro veces con PBS.
Se diluyeron y añadieron apropiadamente
anticuerpos de detección para designar los pozos de la placa
(típicamente 50 \mul/pozo). Las placas se sellaron y se
devolvieron al incubador de agitación durante 1,5 horas
adicionales. Las placas se lavaron como en la etapa previa, seguido
mediante la adición de, por ejemplo, 50 \mul de conjugado
anti-conejo biotinilado en todos los pozos, y a
continuación se volvieron al incubador durante una hora. La etapa
de lavado se repitió y se añadió conjugado de
estreptavidina-HRP a todos los pozos y la
incubación continuó durante 0,5 horas.
La etapa de lavado se repitió en las placas y se
añadió a todo los pozos 100 \mul/pozo de substrato de peroxidada
SureBlue TMB Microwell a todo los pozos. Las placas se devolvieron
al agitador/incubador para permitir el desarrollo del color azul,
típicamente durante 20 minutos. Finalmente, la reacción se detuvo
mediante la adición de TMB Stop Solution. Las placas se leyeron con
una longitud de onda de 450 nM.
Utilizando el sándwich ELISA descrito en el
procedimiento 1 y un anticuerpo de lisina 4 dimetilado de histona
H3 como segundo anticuerpo, las muestras del tampón se inyectaron
con nucleosomas de gallina y PPP derivadas de la sangre normal que
se habían inyectado con nucleosomas de gallina generaron señales
equivalentes (figura 1). No se obtuvo ninguna señal significativa
del PPP derivados de la sangre normal que no se había inyectado con
nucleosomas de pollo en el rango de disolución utilizado en el
ensayo (figura 1).
Utilizando el sándwich ELISA descrito en el
procedimiento 2 y un anticuerpo de lisina 4 dimetilado de histona
H3 como el segundo anticuerpo, las muestras de tampón inyectado con
nucleosomas de gallina se mostraron que generaban una curva
estándar (figura 2).
Utilizando el procedimiento de concentración
descrito anteriormente, el sándwich ELISA descrito en el
procedimiento 2 y un anticuerpo de histona H3 dimetil lisina 4 como
segundo anticuerpo en el ELISA, se midió una señal aumentada como
la concentración de la muestra derivada de un aumento del paciente
(figura 3). En contraste, una muestra de plasma concentrado de
individuos normales de banco fallo para generar una señal en la
concentración más alta (figura 3).
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ejemplo de péptido que se puede usar
para generar anticuerpos específicos de histona modificada: H3 lys
4 (Me)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> METILACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ejemplo de péptido que se puede usar
para generar anticuerpos específicos de histona modificada: H4 arg
3 (Me)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> METILACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ejemplo de péptido que se puede usar
para generar anticuerpos específicos de histona modificada: H4 lys
5 (Ac)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ACETILACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ejemplo de péptido que se puede usar
para generar anticuerpos específicos de histona modificada: H4 arg
3 (Me)/lys 5 (Ac)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> METILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ACETILACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ejemplo de péptido que se puede usar
para generar anticuerpos específicos de histona modificada: H4 Ser
2(phos)/Arg 3 (me)/Lys 5 (Ac)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FOSFORILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> METILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ACETILACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ejemplo de péptido que se puede usar
para generar anticuerpos específicos de histona modificada: H3 lys
9 (Me)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> METILACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ejemplo de péptido que se puede usar
para generar anticuerpos específicos de histona modificada: H2B ser
14 (Phos)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (9)..(9)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FOSFORILACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ejemplo de péptido que se puede usar
para generar anticuerpos específicos de histona modificada: H3 lys
27 (Me)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> METILACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ejemplo de péptido que se puede usar
para generar anticuerpos específicos de histona modificada: H3 lys
36 (Me)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> METILACIÓN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ejemplo de péptido que se puede usar
para generar anticuerpos específicos de histona modificada: H4 lys
20 (Me)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MOD_RES
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> METILACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
Claims (27)
1. Procedimiento para evaluar una enfermedad en
un individuo, que comprende:
contactar los nucleosomas libres de células en
una muestra de sangre, suero o plasma obtenida del individuo con un
anticuerpo que se une específicamente con una proteína de histona
modificada;
en el que la proteína de histona modificada se
muestra en la siguiente tabla:
y en el que la unión de dicha
anticuerpo a dichos nucleosomas libres de células es indicativa de
que el individuo tiene una
enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que dichos nucleosomas se concentran a partir de la muestra de
sangre, plasma o suero.
3. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha anticuerpo comprende
una marca detectable.
4. Procedimiento para evaluar una enfermedad en
un individuo, que comprende:
contactar una muestra de sangre, plasma o suero
de dicho individuo con un primer anticuerpo;
determinar la unión de dicho primer anticuerpo
con nucleosomas libres de células en la muestra contiene una
modificación de histona utilizando un segundo anticuerpo;
en el que uno de dichos primer o segundo
anticuerpos se une a un nucleosoma y el otro de dicho primer o
segundo anticuerpos se une específicamente a una histona
modificada.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que dicho primer anticuerpo se une a nucleosomas y el segundo
anticuerpo se une específicamente a la histona modificada.
6. Procedimiento según la reivindicación 4, en
el que el segundo anticuerpo se une a nucleosomas y el primer
anticuerpo se une específicamente a la histona modificada.
7. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6, en el que la histona modificada comprende
una modificación mostrada en la tabla 1.
8. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 6, en el que la histona modificada comprende
una modificación mostrada en la tabla 2.
9. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 8, en el que dicho primer o dicho segundo
anticuerpo está inmovilizado.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, en
el que el anticuerpo no inmovilizado de dicho primer y segundo
anticuerpos comprende una marca detectable.
11. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad es una
enfermedad cancerosa o una enfermedad autoinmune.
12. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, que comprende aislar ADN asociado con el
nucleosoma que comprende una histona modificada.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
que comprende la amplificación de dicho ADN asociado al
nucleosoma.
14. Procedimiento según la reivindicación 12 o
la reivindicación 13, que comprende la secuencia de dicho ADN
asociado al nucleosoma.
15. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14, que comprende el marcado de dicho ADN
asociado con el nucleosoma con una marca detectable.
16. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 15, que comprende el contacto de dicho ADN
asociado con el nucleosoma con una molécula de ADN que tiene una
secuencia conocida bajo condiciones adecuadas para la hibridización
y la determinación de la hibridización.
17. Procedimiento según la reivindicación 16 en
el que dicha molécula de ADN de secuencia conocida está comprendida
en una microserie.
18. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 17, que comprende la determinación de la
hibridización del ADN de dicho individuo que está asociado con dicha
modificación de histona respecto al ADN asociado con dicha
modificación de histona de uno o más de otros individuos.
19. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 10, en el que dicha histona modificada
comprende una modificación asociada con el silenciado de los
genes.
20. Procedimiento según la reivindicación 19, en
el que dicha modificación se selecciona entre H3 Lys 9 (Me), H3 Lys
27 (Me), H3 Lys 36 (Me), H3 Lys 79 (Me) y H4 Lys 20 (Me).
21. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 10, en el que dicha histona modificada
comprende una modificación asociada con la activación de los
genes.
22. Procedimiento según la reivindicación 21, en
el que dicha modificación se selecciona entre H3 Lys 4 (Me), H3 Lys
9 (Ac), H3 Lys 14 (Ac) y H3 Lys 23 (Ac).
23. Procedimiento de determinación de la
presencia de un nucleosoma libre de células que tiene una
modificación de histona, que comprende:
determinar la presencia de un anticuerpo que se
une específicamente a la modificación de histona en una muestra de
sangre, plasma o suero obtenida de un individuo;
siendo la presencia de dicha anticuerpo
indicativo de la presencia de dichos nucleosomas libres de células
en dicho individuo.
24. Procedimiento según la reivindicación 23,
que comprende el contacto de la muestra con un antígeno que
comprende un epítope de modificación de histona y la determinación
de la unión con el antígeno.
25. Procedimiento según la reivindicación 24, en
el que dicho antígeno está inmovilizado sobre un soporte
sólido.
26. Procedimiento según la reivindicación 24, en
el que dicho antígeno comprende una marca detectable.
27. Procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 26, en el que dicha histona modificada
comprende una modificación mostrada en la tabla 1 y/o la tabla
2.
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