ES2265682T3 - Deteccion de productos apoptoticos. - Google Patents
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Abstract
Un método para la determinación de la concentración de nucleosomas en muestras de suero tomadas de pacientes en los que una enfermedad o un tratamiento inducen la apoptosis; método que se caracteriza por que las muestras de suero son estabilizadas mediante inhibición de endonucleasas dependientes de Ca2+ y Mg2+ y endonucleasas con un pH ácido óptimo utilizando EDTA.
Description
Detección de productos apoptóticos.
La presente invención se refiere a un método en
el cual se determina la concentración de nucleosomas en muestras de
suero de pacientes de cáncer para determinar la efectividad del
tratamiento antitumoral. Además, la utilización de un método
mediante el que se determina la concentración de nucleosomas en
muestras de suero de pacientes de cáncer para determinar la
efectividad de la terapia antitumoral es un tema que trata la
presente invención.
Una célula eucariota puede morir de dos maneras
fundamentalmente diferentes. Una manera es la necrosis, que
consiste en la muerte celular como resultado de una lesión, p. ej.,
debido a un aporte sanguíneo inadecuado y, por lo tanto, un aporte
de oxígeno y nutrientes inadecuado, o como resultado de un
envenenamiento o una lesión física (daño mecánico, congelación o
calor). La otra vía, la llamada muerte celular programada, es de
vital importancia para el desarrollo y funcionalidad de los tejidos,
órganos y organismos en conjunto (J. Cohen, Advances in Immunology
50(1991), 55-85). Las células que mueren de
esta manera tienen fragmentos de DNA asociados a histonas como
mononucleosomas y oligonucleosomas en el citoplasma. Dicha
característica se observa asimismo en una muerte celular inducida
como la desencadenada por radiaciones ionizantes (Yamada et
al., Int. J. Radiat. Biol. 53 (1988), 65) o por ciertos
anticuerpos monoclonales tales como, p. ej. anti-Fas
(Yonehara et al.,J. Exp. Med. 169 (1989),
1747-1756) o
anti-APO-1 (Trauth et al.,
Science 245 (1989), 301-304). Las células T
citotóxicas y las células asesinas naturales también provocan esta
muerte celular inducida con las características descritas
(Sanderson, Biol. Rev. 56 (1981), 153-197; S. Curnow
et al., Cancer Immunol. Immunother. 36 (1993),
149-155 y Berke, Immunol. Today 12 (1991),
396-399). No obstante, el proceso también conduce a
un incremento de la permeabilidad de la membrana plasmática como se
observa en la necrosis (Krahenbuhl et al., Immunol. Today 12
(1991), 399-402). El tipo de muerte celular
programada o inducida descrita se denomina apoptosis (Wyllie et
al., Int. Rev. of Cytol. 68 (1980), 251-301). Se
caracteriza por protuberancias similares a ampollas de la membrana
plasmática, condensación del citoplasma y activación de
endonucleasas endógenas. Así, en contraste con la necrosis, la
apoptosis es un proceso activo de la célula eucariota. Por esta
razón tampoco se induce matando las células mediante calor,
congelación y descongelación o lisándolas mediante un anticuerpo
(R. Duke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80 (1983),
6361-6365). La endonucleasa dependiente de calcio y
magnesio activada en la apoptosis escinde la doble cadena de DNA en
las regiones de unión fácilmente accesibles entre los nucleosomas
dando lugar a mononucleosomas y oligonucleosomas. En contraste, el
DNA de los nucleosomas está estrechamente asociado con las histonas
del núcleo H2A, H2B, H3 y H4, y por lo tanto está protegido de la
escisión mediada por la endonucleasa (Burgoyne et al.,
Biochem. J. 143 (1974), 67 y Stach et al., J. Neurochem. 33
(1979), 257). Por lo tanto, tras la extracción de DNA y la
separación en gel de agarosa, se observa la escalera de DNA típica
de las células apoptóticas, la cual es un patrón de fragmentos de
DNA de una longitud aprox. de 180 pares de bases o múltiples de
ellos (Wyllie, Nature 284 (1980), 55-556 y J. Cohen,
Advances in Immunology 50 (1991), 55-85). En esta
primera etapa de apoptosis la membrana plasmática de las células
permanece intacta. Los mononucleosomas y oligonucleosomas se
acumulan en el citoplasma de la célula que está muriendo (Duke et
al., Lymphokine Research 5 (1986), 289-299).
La apoptosis ocurre durante el periodo
embrionario y durante el desarrollo del sistema inmunitario y
nervioso con el fin de mantener la homeostasis regulando el número
de células (por ejemplo en la mucosa intestinal) y asegurando la
función de las células del organismo; también tiene lugar en
procesos patológicos, p.ej las reacciones inflamatorias, como
resultado de lesiones isquémicas (p. ej. en un insulto cerebral
(ictus), infarto de miocardio, embolismo pulmonar), en enfermedades
autoinmunitarias (tales como el Lupus Eritematoso Sistémico (LES)),
como una reacción de defensa tras un transplante de médula ósea y un
transplante de otro órgano (reacción de huésped contra injerto o
injerto contra huésped) (Darzynkiewicz, Cytometry, 1997,
27:1-20; Kerr, Cancer 1994,
73:2013-2025; Kornbluth, Immun letters 1994,
43:125-132, K. Matsushita, Neuroscience 83 (1998),
439-448 y R. Majno y I. Joris, Am. J. Path 146
(1995), 3-15).
Se pueden observar procesos apoptóticos en
pacientes con tumores malignos y benignos (Leon, Cancer Res. 37
(1977), 646-650; Shapiro, Cancer 51 (1983),
2116-2120 y Fournie, Cancer Letters 91 (1995),
221-227). Por lo tanto, se observa frecuentemente
un recambio celular aumentado en los tumores malignos, es decir, la
tasa de proliferación celular y la tasa de muerte celular están
aumentadas (Kerr, Cancer 73 (1994), 2013-2025 y
Cotter, Anticancer Research 10 (1990), 1153-1160).
Esto último es una expresión de extinción celular apoptótica
masiva. La degradación controlada y programada del DNA, núcleo
celular y orgánulos, el empaquetamiento de los contenidos celulares
en cuerpos apoptóticos, así como la fagocitosis por macrófagos y
células circundantes, aseguran el reciclaje completo sin remanentes
(Darzynkiewicz, Cytometry 27 (1997), 1-20; Kerr,
Cancer 73 (1994), 2013-2025 y Cotter, Anticancer
Research 10 (1990), 1153-1160). Si este sistema de
disposición está sobrecargado, los componentes celulares, entre
otros, también alcanzan la circulación sanguínea (Emlen, J. Immunol
152 (1994), 3685-3692, Kornbluth, Immun Letters 13
(1994), 125-132; Emlen, J. Immunol. 148 (1992), 3042
y Franek, FEBS Letters 284 (1991), 285-287. Así, se
encontraron concentraciones de DNA más elevadas en el suero y plasma
de pacientes con tumores malignos (Leon, Cancer Res. 37 (1977),
646-650 y Shapiro, Cancer 51 (1983),
2116-2120 y Fournie, Cancer Letters 91 (1995),
221-227), estando el DNA presente en la circulación
unido mayoritariamente a histonas en forma de mononucleosomas y
oligonucleosomas (Rumore, J. Clin. Invest 86 (1990),
69-74 y Burlingame, J-Immunol 156
(1996), 4783-4788).
La cantidad absoluta de productos apoptóticos,
como los nucleosomas, en el suero puede correlacionarse con la
extensión de la enfermedad maligna. Algunas veces hay una
concentración de nucleosomas en suero considerablemente mayor en
enfermedades en estado avanzado. Además, se sabe que la apoptosis se
induce por radioterapia, hipertermia, deprivación hormonal y por
distintos fármacos citostáticos (Kerr, cancer 73 (1994),
2013-2025 y Sakakura, Br. J. Cancer 77 (199B),
159-166).
La patente WO93/09437 describe un método para
detectar y cuantificar proteínas solubles de la matriz nuclear en
fluidos corporales y medio extracelular. Este método se describe
como un método de utilidad para monitorizar la viabilidad de
células y tejidos, para evaluar el progreso de una enfermedad o su
tratamiento y para evaluar la citotoxicidad de compuestos
desconocidos.
La patente WO96/40985 divulga un método para
medir cuantitativamente la apoptosis determinando la concentración
de isodipéptido de E(\gamma-glutamil)
lisina. Los métodos mencionados anteriormente no son adecuados como
marcador rápido de la efectividad del tratamiento de pacientes en
los que la apoptosis se induce como resultado de enfermedad o
tratamiento. Además, los métodos descritos no son prácticos para el
uso diario en un entorno
clínico.
clínico.
Sorprendentemente, se encontró que el cambio en
la concentración de productos apoptóticos en muestras extraídas a
pacientes se correlaciona con la efectividad del tratamiento, siendo
estos pacientes aquellos en los que la apoptosis se induce como
resultado de enfermedad o tratamiento. Éstos son pacientes que
padecen un tumor o pacientes que han sido sujetos a tratamiento
quimioterapéutico o radioterapéutico o pacientes con procesos
inflamatorios agudos durante el tratamiento antibiótico. Esto
significa que se puede monitorizar el progreso del tratamiento
midiendo la concentración de productos apoptóticos en muestras
extraídas de los pacientes previamente mencionados.
En particular se encontró que la concentración
de productos apoptóticos en el suero de pacientes con cáncer
durante la radioterapia o quimioterapia puede utilizarse como
marcador para la efectividad del tratamiento.
Así, una cuestión de la presente invención es un
método para determinar la concentración de nucleosomas en muestras
de suero extraídas de pacientes en los que la apoptosis se induce
como resultado de enfermedad o tratamiento, pacientes cuyas
muestras de suero se estabilizan por inhibición de endonucleasas
dependientes de Ca^{2+} y Mg^{2+} y endonucleasas con un pH
ácido óptimo usando EDTA.
En particular, una cuestión de la presente
invención es un método para la determinación de nucleosomas en
muestras extraídas a pacientes, siendo éstos pacientes con cáncer,
pacientes que han sido sujetos a tratamiento quimioterapéutico o
radioterapéutico o pacientes con procesos inflamatorios agudos
durante el tratamiento antibiótico, método que se caracteriza por
la concentración de nucleosomas en muestras adecuadas de pacientes
y se correlaciona con la efectividad del tratamiento y por tanto
sirve como seguimiento del tratamiento.
Muestras de pacientes adecuadas para la presente
invención son: suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, esputo
(secreción bronquial), ascitis (líquido peritoneal), material de
punción de la cavidad pleural, sinovia (líquido sinovial) y orina.
Se usarán preferentemente muestras de suero para el método referente
a la invención, especialmente cuando se determine la efectividad de
un tratamiento antitumoral.
La efectividad del tratamiento antitumoral puede
determinarse mediante la tasa de remisión basándose en procesos de
generación de imagen (rayos X, tomografía computerizada). Por
definición, una "remisión completa" se entiende como la
desaparición completa del tumor durante al menos ocho semanas y la
"remisión parcial" significa una regresión de las
manifestaciones tumorales de más del 50% con respecto a su volumen;
"ningún cambio" refleja el estado entre una disminución 50 y
un aumento 25 de la masa tumoral; "progresión" denota una
progresión de más del 25% (criterios de UICC).
Las muestras de pacientes, por ejemplo muestras
de suero, se toman en diferentes tiempos y se determinan.
Los productos apoptóticos cuya concentración se
puede medir son, por ejemplo, nucleosomas o productos de caspasas
(p. ej. fragmentos de citoqueratinas), APO-I (fas),
APO-2, APO-3, Bcl-2,
blk, caspasas, fragmentos del receptor de fas, fos, enzimas FLICE,
mdm-2, TNF-\alpha o fragmentos del
receptor de TNF, pero también se consideran otras sustancias
implicadas en el proceso apoptótico, como el analito.
La presente invención en particular se refiere a
un método para la determinación de la concentración de productos
apoptóticos, en concreto de nucleosomas, en muestras adecuadas de
pacientes con cáncer en los que la efectividad del tratamiento se
correlaciona con la concentración de productos apoptóticos en estas
muestras de pacientes, en particular la concentración de
nucleosomas.
Se prefiere particularmente un método para
determinar la concentración de nucleosomas en muestras de suero de
pacientes con cáncer, en el que
a) el suero de un paciente con cáncer se
incuba con un anticuerpo antihistonas y con un anticuerpo antiDNA,
en el que uno de los anticuerpos se une a una fase sólida antes,
durante o después de esta incubación y el otro anticuerpo es un
anticuerpo marcado;
b) las fases sólida y líquida están
separadas; y
c) el marcador se determina en una de las
dos fases para determinar la concentración de nucleosomas en
muestras de suero de pacientes con cáncer. El ELISA Cell Death
Detection^{plus} comercializado por Boehringer Mannheim GmbH,
Alemania, es adecuado, por ejemplo, para determinar la concentración
de nucleosomas en muestras de suero de pacientes con cáncer.
Con el fin de determinar cuantitativamente la
concentración de nucleosomas, se hacen algunas modificaciones para
una aplicación en medio líquido:
Entre otras, se usa una curva estándar
utilizando material altamente apoptótico como base de la
interpretación en lugar de un factor de concentración (FC)
relacionado con un control negativo: El material estándar se
obtiene, por ejemplo, incubando sangre total de diversos donantes
de sangre (sanos).
Otra materia de interés de la invención es la
utilización de un método para la determinación de la concentración
de productos apoptóticos en muestras de suero de pacientes con
cáncer para determinar la efectividad del tratamiento antitumoral.
La utilización del equipo Cell Death Detection^{plus} ELISA de
Boehringer Mannheim se prefiere para determinar productos
apoptóticos en muestras de sangre de pacientes con cáncer.
En particular, se observó la concentración de
nucleosomas durante el tratamiento radioterapéutico o
quimioterapéutico de pacientes con enfermedad tumoral maligna y se
correlacionó con el curso clínico y los marcadores tumorales. La
concentración de nucleosomas en el suero se determinó, por ejemplo,
antes del tratamiento y en ciertos intervalos de tiempo durante y
tras el fin del respectivo tratamiento. Tras el inicio del
tratamiento aparecieron muy rápidamente en el suero concentraciones
de nucleosomas incrementadas en diferente medida, se observaron
también durante el curso del tratamiento y parecían dar una
indicación precoz de la eficiencia del tratamiento, en particular
para la radiación.
La máxima aparición de apoptosis durante la
quimioterapia se puede esperar sobre las 24 a 48 horas tras el
inicio de la administración de fármacos, dependiendo de los agentes
citostáticos seleccionados y de la dosis (Meyn, Cancer Chemother.
Pharmakol. 33 (1994), 410-414) y los nucleosomas
aparecen en la circulación sanguínea con un ligero retraso de
tiempo en relación con la apoptosis.
El tratamiento se llevó a cabo en ciclos, cuya
duración variaba entre 1 y 5 días dependiendo del protocolo y que
fueron interrumpidos por pausas de algunas semanas (normalmente de 3
a 4 semanas). Con el objetivo de determinar la cinética de la
concentración de nucleosomas en suero se extrajeron muestras de
sangre, por ejemplo, antes del inicio del primer ciclo y en el
segundo y cuarto día del ciclo, en cada caso antes de la
administración del agente citostático. Este procedimiento se
repitió para cada nuevo ciclo. Los siguientes parámetros se
correlacionaron con el curso clínico: el valor inicial antes de
empezar el tratamiento, el aumento de la concentración de
nucleosomas en suero, el valor máximo alcanzado durante el
tratamiento, la disminución en la concentración de nucleosomas y el
valor mínimo entre ciclos y la cinética de las concentraciones
basales de nucleosomas, que en cada caso se determinaron antes del
inicio de un nuevo ciclo.
Pasados tres o cuatro días se observó un aumento
de la concentración de nucleosomas y seguidamente una disminución
lenta en bastantes pacientes. Al repetir el ciclo se encontró
nuevamente un aumento, menos pronunciado en bastantes casos. Había
una correlación entre el curso clínico y la cinética de la
concentración basal de nucleosomas, que se determinó antes de cada
nuevo ciclo. Los pacientes con regresión de la enfermedad tumoral
presentaban mayoritariamente una disminución en la concentración
basal de nucleosomas. Se observó un aumento en la concentración
basal de nucleosomas mayoritariamente en pacientes con progresión de
la enfermedad (véase el ejemplo).
Durante la radioterapia, la máxima aparición de
apoptosis puede esperarse alrededor de 4 horas tras iniciar el
tratamiento, seguida de un descenso lento de la incidencia de
apoptosis (Mirkovic, Radiother. Oncol. 33 (1994),
11-16); la liberación de nucleosomas a la
circulación se espera tras un breve periodo de latencia.
El tratamiento se lleva a cabo diariamente, 5
días a la semana, durante un periodo de 4 a 6 semanas de acuerdo
con las correspondientes directrices para la enfermedad tumoral. Por
ejemplo, se extrajeron muestras de sangre antes de la primera
fracción, 3 horas, 6 horas, 1 día (p. ej. antes de la segunda
fracción), 4 días, 7 días y semanalmente tras iniciar el
tratamiento. El valor inicial antes de iniciar el tratamiento, el
aumento de la concentración de nucleosomas en suero, el máximo
valor alcanzado durante el tratamiento, el retraso en la
disminución de la concentración de nucleosomas y el mínimo valor
alcanzado durante o al final del tratamiento se correlacionaron con
el curso clínico.
En la mayoría de los pacientes había ya un
rápido incremento en la concentración de nucleosomas a diferentes
niveles a las 6 a 24 horas tras la primera fracción de radiación,
que puede depender del tipo de tumor y del valor preterapéutico
inicial. Además la concentración de nucleosomas descendió tras
periodos de latencia de distinta duración a valores mínimos de
diferentes magnitudes, en los que un descenso temprano y valores de
concentración mínima bajos puede correlacionarse con una regresión
del tumor (véase el ejemplo).
La invención además se refiere a un método en el
cual la concentración de nucleosomas en suero o en otras muestras
de pacientes se correlaciona con la respuesta al tratamiento de
pacientes en tratamiento hipertérmico, o en el cual la
concentración de nucleosomas en suero u otras muestras de pacientes
se correlaciona con las reacciones de defensa del sistema
inmunitario de pacientes que han sido sometidos a transplante de
médula ósea; en ambos tipos de tratamiento se esperaría una
inducción masiva de la muerte celular. También en el caso de
enfermedades sistémicas tumorales, y sobretodo en las distintas
formas de leucemia y linfoma, la determinación de la concentración
de nucleosomas en suero posibilita la obtención de información
temprana y fiable sobre la eficacia del tratamiento y evaluación
del pronóstico.
Además, la determinación de nucleosomas en suero
de pacientes tras un episodio isquémico agudo, como un infarto de
miocardio o infarto cerebral, posibilita una estimación precoz de la
extensión de la lesión. Además, la prueba puede utilizarse para el
seguimiento y para evaluar el pronóstico. Incluso en pacientes con
procesos inflamatorios agudos o con enfermedades autoinmunitarias,
-(sobretodo en el LES, una enfermedad en la cual la aparición de
nucleosomas y anticuerpos antinucleosoma en suero es de importancia
patogénica)- la intensidad y cinética del proceso patológico puede
detectarse con este parámetro.
La determinación de la concentración de
nucleosomas en otros fluidos corporales puede utilizarse para
evaluar la extensión y el progreso de procesos locales: por ejemplo
en líquido cefalorraquídeo de pacientes con tumor cerebral, con
enfermedad inflamatoria, con hemorragia cerebral, con enfermedad
degenerativa, tras un traumatismo cerebral o tras un insulto
cerebral (ictus).
El diagnóstico precoz o la información
pronóstica son concebibles en la ascitis, en el caso de una
diseminación peritoneal de un tumor maligno y en el material de
punción de la cavidad pleural, en el caso de un derrame pleural
maligno.
Además, es posible la detección precoz en la
orina de un proceso tumoral o inflamatorio en el riñón y tracto
urinario eferente, así como en el esputo (secreción bronquial) en
procesos malignos del pulmón.
El Cell Death Detection^{plus} ELISA
(Boehringer Mannheim, Núm. de Cat. 1774425) se basa en el principio
de inmunoensayo enzimático en sándwich cuantitativo. Se utilizan dos
anticuerpos monoclonales murinos dirigidos contra DNA e histonas.
La prueba se puede llevar a cabo con lisados citoplasmáticos,
sobrenadantes de cultivo, plasma, suero y otros fluidos corporales,
y permite una detección específica de mononucleosomas y
oligonucleosomas. La descripción que se da aquí se aplica a medidas
en medio líquido:
Se pipetean a un pocillo de placa microtitulada
cubierta con estreptavidina (MTP) 20 \mul de una alícuota del
material a ensayar. Se añaden 80 \mul de un inmunoreactivo
compuesto por anticuerpos antihistonas biotinados, anticuerpos
antiDNA marcados con peroxidasa y tampón de incubación (BSA 1%,
Tween 0,5%, EDTA 1 mM en PBS); se cubren con una lámina adhesiva y
se incuban durante 2 horas en un agitador MTP (500 rpm). Durante
este periodo de incubación el anticuerpo antihistonas reacciona
contra el componente histona de los nucleosomas e inmoviliza al
complejo a través de la biotina en la placa microtitulada cubierta
con estreptavidina. Además el anticuerpo antiDNA se une al
componente DNA de los nucleosomas. En este proceso se reconoce
dsDNA, así como ssDNA. Tras eliminar el anticuerpo que sigue sin
unirse mediante tres lavados con 300-400 \mul de
tampón de incubación en cada caso, los complejos inmovilizados se
incuban con 100 \mul de ABTS
(2,2'-azino-di(3-etil-benzotiazolina
sulfonato), el MTP se sella con una lámina adhesiva y se agita a 250
rpm. El sustrato reacciona con el marcador de peroxidasa del
anticuerpo antiDNA y provoca un cambio de color que es proporcional
a estos anticuerpos. Tras un periodo de desarrollo de color adecuado
se cuantifica de forma fotométrica a d=405 nm frente a la solución
de sustrato con un blanco (longitud de onda de referencia d=492
nm).
Una curva estándar con elevado material
apoptótico se utiliza como base para la interpretación en lugar de
un factor de enriquecimiento:
La apoptosis se induce incubando sangre total
con EDTA de 3 donantes de sangre sanos durante 24 horas. Tras
centrifugar, el plasma se liofiliza y se almacena a 4ºC. Al
resuspender a varios tiempos, los valores máximos reproducibles en
el rango superior de medida del fotómetro se obtienen con una
densidad óptica (DO) de 2500 mA; existe una buena estabilidad a
largo plazo así como un comportamiento de dilución lineal en el
rango entero de 0 a 2500 mA. Así se asegura la posibilidad de
comparación en una misma prueba, así como entre varias series de
la
prueba.
prueba.
Se utiliza una dilución 1:24 del material
estándar con tampón de incubación como el valor estándar más elevado
que alcanza 2500 mA tras 30 min. Los otros pasos de dilución (1:24,
1:32, 1:48, 1:64, 1:96, blanco) provocan una curva de dilución
lineal que corresponde a una línea recta a través del origen (Fig.
1). El ELISA ya puede detectar el contenido en nucleosomas de
10^{3} células.
Con el objetivo de no exceder un límite de
inexactitud aceptable del 5% debido a retrasos que resultan de los
pasos del pipeteo, el periodo de incubación con ABTS se establece en
30 minutos.
Los nucleosomas posiblemente difieren en su
accesibilidad para unir anticuerpos dependiendo de la forma en que
se encuentran presentes: como mononuclesomas u oligonucleosomas, el
último con o sin estructura terciaria. Así, la cantidad de
anticuerpo antiDNA marcado con POD y unido no corresponde
necesariamente a la concentración de nucleosomas exacta en el
material de la muestra. Por lo tanto, los datos de concentración
absoluta no se utilizan y se introduce una escala de las así
llamadas UAs (unidades arbitrarias). Mil UA se equivalen al nivel
estándar más elevado (2500 mA tras 30 min); la escala es lineal.
Esto, por lo tanto, tiene en cuenta la falta de conocimiento sobre
la razón de mononucleosomas a oligonucleosomas y la variabilidad
resultante referente a la cantidad de sitios de unión del
anticuerpo mientras aumenta al mismo tiempo la comparabilidad entre
las pruebas.
En los presentes experimentos se utiliza el
suero como matriz. La hemólisis puede conducir a resultados de la
prueba falsos positivos; por ello la centrifugación se lleva a cabo
durante 15 minutos a 3000 rpm durante un periodo de 2 horas tras la
recogida.
La adición de 1/10 partes por volumen de EDTA
100 mM (tampón TRIS, pH 8) directamente tras la extracción del
suero inhibe a las endonucleasas dependientes de Ca^{2+} y
Mg^{2+}, p. ej. la DNAsa I y endonucleasas que están activas en
un rango ácido, tales como la DNASA II con una actividad óptima a pH
4.5. Esto previene una escisión potencial de lugares de unión de
los anticuerpos antiDNA y previene el descenso de los valores
medidos.
Debe prestarse atención tras la descongelación a
la adaptación a la temperatura ambiente y a la homogenización
cuidadosa del material de la muestra. Las muestras de suero se
diluyen 1:4 con tampón de incubación (20 \mul de suero, 60 \mul
de tampón de incubación) y seguidamente son utilizadas para la
prueba.
En comparación con la curva estándar, se observa
una línea de dilución lineal para diluciones del suero (Fig. 1).
Se analizaron los sueros de un total de 507
personas. 445 de estos eran sueros de pacientes en tratamiento en
el periodo de agosto de 1996 a diciembre de 1997 y 62 eran personas
sanas.
Se probaron los sueros de 62 personas sanas de
la prueba. La distribución de edad de las personas se extendía de
20 a 60 años con una media de 35 años; en el estudio tomaron parte
33 mujeres (53%) y 29 hombres (47%).
Se examinaron 108 sueros de pacientes con
enfermedades benignas: 39 tenían enfermedades gastrointestinales
benignas (mayoritariamente colitis, pancreatitis, colecistolitiasis,
subíleo de varias causas), 13 tenían enfermedades pulmonares
benignas (sobretodo enfisema, neumonía), 37 tenían enfermedades
ginecológicas benignas (sobretodo quistes ováricos, endometriosis,
útero miomatoso), 19 tenían otras enfermedades benignas (sobretodo
abscesos, bocio nodular, ECC (enfermedad cardiocoronaria).
50 de 108 pacientes sufrían enfermedades
inflamatorias agudas, las cuales fueron divididas en 5 categorías
diferentes (10 en cada una) basándose en los niveles de proteína C
reactiva:
\newpage
(I:PCR \leq 1 ng/mL, II:1 ng/mL < PCR
\leq 5 ng/mL, III:5 ng/ml <PCR \leq 10 ng/ml; IV: 10 ng/ml
< PCR \leq 20 ng/ml, V:20 ng/mL < PCR).
Además, se examinaron los sueros de 337
pacientes con tumores sólidos (Ca= carcinoma); estos se
subdividieron en 38 Cas bronquiales, 60 Cas de colon, otros 44 Cas
gastrointestinales, 58 Cas de mama, 43 Cas de ovario, otros 19 Cas
ginecológicos, 8 Cas ENT, 16 linfomas, 20 Cas de riñón, 17 Cas de
próstata y otros 14 Cas.
Las muestras de sangre fueron retiradas en cada
caso antes del tratamiento primario operativo o antes de la
quimioterapia o radioterapia con el fin de medir la tasa de muerte
celular espontánea preterapéutica mediante la determinación de
nucleosomas.
Se llevó a cabo una monitorización del
seguimiento adicional en 16 de estos 337 pacientes durante la
radioterapia primaria o secundaria (6 con Ca bronquial, 4 con
linfomas, 4 con Ca ENT, 2 con Ca de colon) y en 20 pacientes en
tratamiento quimioterapéutico (7 con linfomas, 6 con Ca de colon, 2
con Ca pancreático, 2 con Ca bronquial, 2 con sarcomas, 1 con Ca
ENT).
En los pacientes tratados con radiación, se
tomaron muestras de sangre antes de la radiación y 3, 6, 24 y 72
horas, y una semana tras el inicio de la radiación y además antes
del inicio de cada primera dosis de radiación semanal. Ya que el
plan terapéutico de la mayoría de los pacientes incluía irradiación
diaria debe tenerse en cuenta que tras cuatro medidas tenía lugar
una nueva dosis terapéutica.
El contenido en nucleosomas se midió en
pacientes en tratamiento quimioterapéutico antes del tratamiento y
en el segundo y cuarto día y una semana tras la administración de la
primera dosis y además semanalmente o antes del inicio del
siguiente ciclo de tratamiento.
Probamos el suero y el plasma de 10 personas de
la prueba en paralelo, de éstos 4 eran sanos, 4 eran pacientes con
cáncer y 2 eran pacientes con enfermedad inflamatoria aguda. En este
caso las concentraciones de nucleosomas en suero se hallaron
normalmente más elevadas que en plasma (N=9). En un paciente con
valores de PCR extremadamente elevados, por encima de 45 ng/ml, los
resultados medidos fueron igual de elevados en suero que en
plasma.
Estas muestras de suero y plasma se almacenaron
durante un periodo de tres semanas a 25ºC, 4ºC, -20ºC y -80ºC con o
sin adición de EDTA 10 mM (pH 8). La mejor estabilidad se observó en
el suero al que se añadió EDTA 10 mM (pH 8)(ver arriba)
inmediatamente después de la centrifugación, y el cual se almacenó a
una temperatura de -20ºC o -80ºC (Fig.2).
Se indujo una ligera hemólisis en una muestra de
sangre total mediante agitación suave y exposición al calor (37ºC)
durante 4 horas. Tras eliminar el suero se utilizó para titrar un
suero sano ligeramente apoptótico. La señal analizada aumentaba de
forma continua con una cantidad creciente de hemolisado (Fig.3).
Tras la extracción de sangre se almacenaron
muestras de sangre total durante 0, 2, 4 y 6 horas antes de la
centrifugación bajo distintas condiciones de almacenaje (37ºC, 25ºC,
4ºC). A continuación se les añadió EDTA (ver arriba) o se
congelaron sin tratar. Como mayor era el periodo de tiempo antes de
añadir EDTA, mayores eran los valores analizados en suero. Este
efecto se volvió más pronunciado al almacenar a temperaturas más
elevadas (37ºC).
Después de centrifugar los sueros, estos se
almacenaron a 37ºC, 25ºC y 4ºC antes de añadir EDTA 10 mM (pH8)
tras 0, 2, 4, 6 o 8 horas y después se congelaron inmediatamente a
-20ºC. Como más tarde se añadía el EDTA al suero, más bajas eran
las señales obtenidas en suero. Eran excepciones valores muy bajos o
valores por encima del rango de medida que permanecieron
constantes. La temperatura no tenía una influencia
significativa.
Los sueros fueron almacenados durante 0, 2, 4 y
6 horas a 37ºC, 25ºC y 4ºC tras la centrifugación y adición
inmediata de EDTA 10 mM antes de ser congeladas a -20ºC. Ni el
tiempo ni la temperatura tuvieron influencia en las señales
analizadas obtenidas (Fig. 4).
Se comprobó la estabilidad a largo plazo tras 1,
2, 3, 4 y 6 meses con tres sueros congelados a -20ºC
(x_{1}-x_{3}) con resultados bajos (x_{1}=55
UA), medios (x_{2}=297 UA) y elevados (x_{3}=481 UA). Se
obtuvieron señales analizadas estables para los tres sueros con un
CV de 4,2%-9,2% (Fig.5).
Con el objetivo de establecer la imprecisión de
la medida se determinaron los coeficientes de variación de
distintos grupos de suero (x_{1}-x_{4}).
Dependiendo de los valores de medida el CV interensayo (n=14)
variaba entre 8,6% (x_{1}=455 UA) y 13,5% (x_{2}=235 UA), el CV
interensayo (n=10) variaba entre 3,0 (x_{3}=327 UA) y 4,1%
(X_{4}=181 UA), los sueros con valores de medida más altos tenían
una imprecisión menor.
Una señal de medida está unida al complejo de
formación de anticuerpos antihistonas biotinados, nucleosomas y
anticuerpos de DNA marcados con peroxidasa: se añadieron mediante
titración anticuerpos antihistonas no biotinados al inmunoreactivo
estándar que contenía anticuerpos antihistonas biotinados, que fue
incubado con un suero elevadamente apoptótico. Las señales medidas
decrecieron rápidamente mientras la concentración de los
anticuerpos antihistonas no biotinados aumentaba, lo que se
corresponde con una competición competitiva por desplazamiento
entre los
anticuerpos antihistonas provistos con o sin biotina y se aproximaron asintomáticamente a la región de personas sanas.
anticuerpos antihistonas provistos con o sin biotina y se aproximaron asintomáticamente a la región de personas sanas.
Así, los nucleosomas, DNA libre, histonas,
anticuerpos antihistonas o antiDNA por sí solos no pueden causar
cambios que interfieran en la OD (Fig.6).
La concentración menor detectable se calculó a
partir del valor de la media del blanco (n=20) + 3x la desviación
estándar como 16 UA.
Fue posible conseguir una imprecisión
interensayo de menos de 10% estableciendo una curva estándar como se
describe anteriormente.
Además, la medida en UA (unidades arbitrarias)
comparado con la densidad óptica mU posibilitó que la imprecisión
interensayo (N=14) aumentara de 15,3% a 8,6% (x_{1}=455 UA=1007
mU) y de 17,0% a 13,5% (x_{2}=235 UA =437 mU), mientras que la
imprecisión interensayo (N=10) era constante: 3,0% o 3,3%
(x_{3}=327 UA =882 mU) y 4,1% o 4,0% (x_{4}=181 AU =480 mU).
Se midió la concentración de nucleosomas
inferior a 100 UA en el suero de 60 de un total de 62 (=96,8%)
personas sanas ensayadas. Solamente dos (=3,2%) presentaron una
concentración de nucleosomas entre 100 y 200 UA. La mediana se
situó en 24 UA y la media fue de 34 UA. No se encontraron
diferencias por lo que respecta a la edad, el sexo o los hábitos
tóxicos (p. ej. tabaquismo, alcohol) de las personas ensayadas.
En el caso de pacientes con enfermedades
benignas (N=108) se encontró una concentración sérica de nucleosomas
superior a 100 UA en el 59,3% de los casos y superior a 500 UA en
el 17,6%; la mediana fue de 147 UA y la media de 271 UA.
Si se clasifican en función de los sistemas
afectados, el 61,5% se encontraba por encima de 100 UA y el 15,4%
por encima de 500 UA en el caso de las enfermedades pulmonares; el
48,7% se encontraba por encima de 100 UA y el 23,1% por encima de
500 UA en el caso de enfermedades gastrointestinales benignas; el
67,6% se encontraba por encima de 100 UA y el 10,8% por encima de
500 UA en el caso de enfermedades ginecológicas benignas; y el
63,2% se encontraba por encima de 100 UA y el 21,1% por encima de
500 UA en el caso del resto de enfermedades benignas.
De estas enfermedades benignas, 50 fueron
seleccionados con enfermedad inflamatoria aguda y una PCR conocida:
en los pacientes del grupo 1 (PCR \leq 1 ng/ml) (N=10), la
concentración sérica de nucleosomas era superior a 100 UA en el 40%
y superior a 500 UA en el 10%; en los pacientes del grupo 2 (1 ng/ml
< PCR \leq 5 ng/ml) (N=10), era superior a 100 UA en el 50% y
superior a 500 UA en el 20%; en los pacientes del grupo 3 (5 ng/ml
< PCR \leq 10 ng/ml) (N=10), era superior a 100 UA en el 80% y
superior a 500 UA en el 30%; en los pacientes del grupo 4 (10 ng/ml
< PCR \leq 20 ng/ml) (N=10), era superior a 100 UA en el 80% y
superior a 500 UA en el 30%; y en los pacientes del grupo 5 (PCR
> 20 ng/ml) (N=10), era superior a 100 UA en el 80% y superior a
500 UA en el 60%. Estos resultados demuestran la ten-
dencia hacia una concentración sérica de nuclesomas más elevada en el caso de pacientes con valores mayores de PCR.
dencia hacia una concentración sérica de nuclesomas más elevada en el caso de pacientes con valores mayores de PCR.
En pacientes con varios tumores sólidos, se
encontró un amplio abanico de valores independientemente de la
situación de los tumores. En el 62% de los pacientes la
concentración sérica de nucleosomas era superior a 100 UA y en el
24,6% era superior a 500 UA. La mediana se calculó en 183 UA y la
media en 329 UA.
En particular, se midió la concentración sérica
de nucleosomas mayor de 100 UA en el 92,1% de los pacientes con Ca.
bronquial, en el 58,3% de los pacientes con Ca. de colon, en el
54,4% de los pacientes con otros Cas. gastrointestinales, en el
75,9% de los pacientes con Ca. de mama, en el 72,1% de las pacientes
con Ca. de ovario, en el 68,4% de las pacientes con otros Cas.
ginecológicos, en el 75,0% de los pacientes con Ca. ORL, en el
56,3% de los pacientes con linfomas, en el 40,0% de los pacientes
con Ca. renal, sólo en el 5,9% de los pacientes con Ca. de próstata
y en el 50% de los pacientes con otros Cas. diferentes.
Se encontraron concentraciones de nucleosomas
mayores de 500 UA en el 36,8% de los pacientes con Ca. bronquial, en
el 21,7% de los pacientes con Ca. de colon, en el 22,7% de los
pacientes con otros Cas. gastrointestinales, en el 25,9% de los
pacientes con Ca. de mama, en el 34,9% de las pacientes con Ca. de
ovario, en el 21,1% de las pacientes con otros Cas. ginecológicos,
en el 12,5% de los pacientes con Ca. ORL, en el 37,5% de los
pacientes con linfomas, en el 15,0% de los pacientes con Ca. renal,
en el 0% de los pacientes con Ca. de próstata, así como en el 14,3%
de los pacientes con otros Cas. diferentes (Figs. 7a, b, c y Fig.
13).
Se hizo un control de la concentración sérica de
nucleosomas durante el seguimiento de pacientes con enfermedad
inflamatoria y pacientes sometidos a radioterapia y quimioterapia
con el fin de comparar el desarrollo de la concentración sérica de
nucleosomas y los hallazgos clínicos, así como la respuesta al
tratamiento.
En el caso de los pacientes con enfermedad
inflamatoria, la concentración sérica de nucleosomas se
correlacionada con la PCR y con los hallazgos clínicos (se pueden
objetivar mediante sonografía, p. ej.); es decir, se encontró una
concentración sérica elevada de nucleosomas y una PCR elevada en el
estadio agudo de la enfermedad y ambos valores disminuyeron en
paralelo cuando el estado clínico mejoró (Fig.8).
El curso de los pacientes sometidos a
quimioterapia solo se puede valorar de forma individual y con
conocimiento de los antecedentes clínicos del paciente. Tras el
inicio del tratamiento, en la mayoría de los pacientes observados
fue característico un pronunciado incremento de la concentración
sérica de nucleosomas con una latencia dependiente de fármaco
diferente (24-72 horas). Más adelante en el curso, a
menudo los valores volvían a descender. Las infecciones u otros
efectos secundarios causaron, entre otros, un aumento transitorio de
la concentración de nucleosomas y complicaron la evaluación del
progreso (Fig. 9).
Ni el valor preterapéutico, ni la tasa de
incremento, ni el nivel máximo de incremento se correlacionaron con
la respuesta al tratamiento. Se observó regularmente entre los
ciclos un descenso de la concentración de nucleosomas independiente
del curso posterior de la enfermedad. Finalmente, como criterio para
valorar el curso del tratamiento, es útil la comparación de los
valores basales de nucleosomas, que en cada caso se midieron al
inicio de un nuevo ciclo de tratamiento: en los 8 pacientes con una
remisión parcial o completa, se observó un descenso de la
concentración basal de nucleosomas mientras que sólo se observó un
incremento en aquellos pacientes con una progresión de la
enfermedad (Fig. 14).
En los pacientes sometidos a radioterapia,
habitualmente se observaba un incremento rápido en la concentración
sérica de nucleosomas al inicio de la radioterapia debido a una
inducción masiva de la apoptosis. El periodo de latencia de
6-24 horas fue menor que en el caso de la
quimioterapia. Además, se hizo evidente en algunos pacientes un
descenso intermedio de la concentración sérica de nucleosomas
después de 3 o 6 horas, antes de volver a descender rápidamente. En
el seguimiento, a veces tras unos valores persistentemente elevados,
se observó un descenso en muchos casos que a menudo se asoció a una
regresión del tumor, que más adelante se pudo confirmar a través de
métodos de diagnóstico por la imagen (Fig. 10).
Durante la radioterapia se evidenció una
correlación entre la concentración preterapéutica de nucleosomas y
la concentración máxima de nucleosomas: 7 de 16 pacientes
presentaron valores preterapéuticos y máximos similarmente elevados
superiores a 500 UA, 5 de 16 presentaron valores similarmente bajos
inferiores a 100 UA, 4 de 16 mostraron un fuerte incremento desde
considerablemente por debajo de 500 UA hasta considerablemente por
encima de 500 UA. Ni la concentración preterapéutica de nucleosomas
ni la concentración máxima de nucleosomas se correlacionaban con la
respuesta al tratamiento (remisión del tumor).
En 9 de 10 pacientes con remisión parcial o
completa fue posible observar el inicio de un descenso en la
concentración sérica de nucleosomas a las 24 horas de haber
alcanzado el valor máximo.
Por el contrario, en 3 de 5 pacientes en los que
se observó una progresión de la enfermedad, el descenso en la
concentración sérica de nucleosomas comenzó más de siete días
después de alcanzar el valor máximo; en uno de los cinco pacientes
tuvo lugar entre 2 y 7 días y en un paciente a las 24 horas. Hubo un
paciente sin cambios en la enfermedad estable que también presentó
el inicio de un descenso de la concentración de nucleosomas en
menos de 24 horas.
Además, la respuesta al tratamiento se
correlacionaba con el valor final del descenso de la concentración
sérica de nucleosomas: en 9 de 10 pacientes con remisión parcial o
completa del tumor los valores mínimos eran inferiores a 100 UA,
mientras que eran superiores 100 UA en 4 de 5 pacientes con
progresión. El paciente sin cambios en la enfermedad bajo el
tratamiento presentó un valor mínimo inferior a 100 UA (Fig.
15).
En pacientes con infarto cerebral (ictus), se
tomaron muestras de sangre inmediatamente después de la admisión en
el hospital (hasta unas 6 horas después del episodio) y a intervalos
diarios, y se determinó la concentración sérica de nucleosomas. Las
tres personas examinadas presentaron inmediatamente después del
infarto diferentes valores que, pasados de uno a tres días,
descendieron hasta los niveles característicos de personas sanas.
En un paciente se observó un incremento transitorio en los valores
séricos de nucleosomas (Fig. 11).
En un paciente con linfoma cerebral se examinó
la concentración de nucleosomas en el líquido cefalorraquídeo. Este
se extrajo de la columna vertebral para aliviar la presión excesiva
intermitente del líquido cefalorraquídeo, que iba acompañada por un
deterioro del estado clínico del paciente, y se mezcló con EDTA 10
mM que corresponde con el tratamiento del suero.
También se hallaron nucleosomas en el líquido
cefalorraquídeo en concentraciones medibles. Un aumento en los
valores de nucleosomas en el líquido cefalorraquídeo iba acompañado
por un deterioro clínico, mientras que se encontraron valores bajos
cuando el estado clínico del paciente era estable (Fig. 12).
Fig.
1
Tanto la curva estándar como la curva de
dilución del suero son líneas rectas lineales que pasan por el
origen. La dilución menor del material estándar (1:24 con la mezcla
de tampón de incubación) alcanza una densidad óptica que se
encuentra en el rango superior de medición del fotómetro (a 2500 mU)
tras 30 min. La dilución estandarizada de los sueros (1:4 con una
mezcla de tampón de incubación) solamente superaba el rango de
medición en casos excepcionales.
Fig.
2
La concentración sérica de nucleosomas es
considerablemente mayor que la plasmática. La estabilidad de la
concentración de nucleosomas medida se optimiza añadiendo EDTA 10 mM
(pH 8) inmediatamente después de la centrifugación (temperatura de
conservación de las muestras: -20ºC).
Fig.
3
Cuando se valora un suero que presenta un bajo
contenido en nucleosomas de una persona de ensayo sana con un suero
ligeramente hemolizado, la señal medida aumenta en función de la
dosis.
\newpage
Fig.
4
Los sueros que, tras la centrifugación, se
conservaron a 4ºC y a los que se añadió EDTA 10 mM
(S1-3) después de varios periodos de latencia
muestran un descenso de los valores medidos que depende del tiempo
de retraso mientras que los sueros a los que se añadió EDTA 10 mM
inmediatamente después de la centrifugación y que seguidamente se
almacenaron durante varios periodos a 4ºC (EI-3)
muestran unos valores medidos estables (véase el
texto).
texto).
Fig.
5
Los sueros con concentraciones de nucleosomas
bajas, medias o elevadas muestran una buena estabilidad a lo largo
de al menos seis meses después de la adición de EDTA 10 mM (pH 8) y
de la conservación a -20ºC.
Fig.
6
Se añaden anticuerpos antihistonas no biotinados
mediante valoración en concentraciones crecientes al inmunorreactivo
estándar que contiene anticuerpos antihistonas biotinados. La señal
medida que disminuye en función de la concentración hasta los
valores normales de las personas sanas (100 UA) refleja la
cuantificación exclusiva de complejos que se forman a partir de
anticuerpos antihistonas biotinados, nucleosomas y anticuerpos
antiDNA marcados con peroxidasa.
Figs. 7a, 7b y
7c
Cerca del 95% de las concentraciones séricas de
nucleosomas medidas de personas de ensayo sanas están por debajo de
100 UA; tanto en pacientes con enfermedades benignas como en
pacientes con tumores sólidos, todos los niveles de los valores se
encuentran para las concentraciones de nucleosomas. De esta forma se
pueden observar diferencias reconocibles entre diferentes tipos de
tumores (véase también el texto).
Fig.
8
En esta paciente con una colangitis y
colestasis, la concentración de nucleosomas inicialmente aumentó en
paralelo con la proteína C reactiva y luego disminuyó durante el
tratamiento con antibiótico, lo que fue acompañado de una mejoría
del estado clínico de la paciente.
Fig.
9
En este paciente que estaba siendo tratado por
un carcinoma pancreático metastatizante, la concentración sérica de
nucleosomas aumentó rápidamente al inicio de un ciclo con 1000
mg/m^{2} de gemcitabina (días 1, 8 y 15) y 50 mg/m^{2} de
cisplatino (días 1 y 15)(1) y entonces disminuyó lentamente. Debido
a un deterioro clínico progresivo, se inició un nuevo protocolo de
tratamiento con ácido fólico 300 mg/m^{2} y
5-fluorouracilo 500 mg/m^{2} (en cada uno de los
días 1 a 5)(2). También en este caso hubo un incremento inicial
rápido de la concentración de nucleosomas, pero el descenso solo
fue parcial. La enfermedad siguió un curso progresivo que también
se observó con el incremento continuo de CEA.
Fig.
10
En este paciente con un carcinoma bronquial
metastatizante, ya en el primer día del tratamiento con radiación
(dosis total de 60 Gy, dosis diaria fraccionada de 2,0 Gy, volumen
de radiación 9,91) hubo un incremento rápido y sustancial de la
concentración sérica de nucleosomas tras un descenso intermitente.
Los valores solamente disminuyeron después de varias semanas, a la
vez que tuvo lugar una regresión del tumor radiológicamente
demostrable. Debido a una infección la concentración de nucleosomas
aumentó ligeramente en el día 40 y luego volvió a descender. Con la
aparición de metástasis múltiples y un derrame pleural maligno, de
nuevo se midieron concentraciones más elevadas de nucleosomas en
suero.
\newpage
Fig.
11
Tres pacientes con diferentes cursos de
concentración sérica de nucleosomas después de un insulto cerebral
(ictus).
Fig.
12
En este paciente con una infección del linfoma
cerebral, la concentración de nucleosomas en el líquido
cefalorraquídeo se determinó durante el curso de la enfermedad. Se
observó un aumento de los valores de nucleosomas en el líquido
cefalorraquídeo en el momento en que hubo un deterioro del estado
clínico del paciente (días 15 a 19), mientras que los valores
fueron bajos cuando el estado era estable.
Fig.
13
Mediana (M), media (x), desviación estándar
(\sigma), valores de concentración sérica de nucleosomas (CNS)
superiores a 100 UA y a 500 UA en personas de ensayo sanas y en
pacientes con enfermedades benignas y malignas.
Fig.
14
Correlación del curso clínico de pacientes
durante la quimioterapia con la concentración basal de nucleosomas
en suero determinada en cada caso al inicio de un nuevo ciclo de
quimioterapia.
Fig.
15
Correlación del curso clínico de pacientes
durante la radioterapia con: a) el retraso en el descenso de la
concentración sérica de nucleosomas una vez alcanzado el valor
máximo durante el tratamiento, y b) la concentración mínima de
nucleosomas en suero durante el tratamiento o una vez concluido.
Claims (6)
1. Un método para la determinación de la
concentración de nucleosomas en muestras de suero tomadas de
pacientes en los que una enfermedad o un tratamiento inducen la
apoptosis; método que se caracteriza porque las muestras de
suero son estabilizadas mediante inhibición de endonucleasas
dependientes de Ca^{2+} y Mg^{2+} y endonucleasas con un pH
ácido óptimo utilizando EDTA.
2. Un método según la reivindicación 1,
caracterizado porque los pacientes son pacientes que padecen
un tumor, pacientes sujetos a un tratamiento de quimioterapia o
radioterapia, pacientes con procesos inflamatorios agudos durante
el tratamiento antibiótico, pacientes tras un episodio isquémico
agudo o pacientes sometidos a un tratamiento de hipertermia, y por
que la concentración de nucleosomas en muestras de suero tomadas de
los pacientes está correlacionada con la efectividad del
tratamiento, por lo que sirve como seguimiento del mismo.
3. Un método como el reivindicado en una de
las reivindicaciones 1 o 2, en el que las muestras de suero se
toman en varios tiempos diferentes y son determinadas.
4. Un método como el reivindicado en una de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que
a) el suero de un paciente afectado de un tumor
se incuba con un anticuerpo antihistonas y con un anticuerpo
antiDNA, donde uno de los anticuerpos está unido a una fase sólida
antes, durante o después de esta incubación y el otro anticuerpo es
un anticuerpo marcado
b) las fases líquida y sólida se separan y
c) se determina el marcaje en una de las dos
fases para determinar la concentración de nucleosomas en las
muestras de suero de los pacientes con tumor.
5. Un equipo para la determinación de
nucleosomas como el reivindicado en la reivindicación 4, que
contiene un anticuerpo antihistonas y un anticuerpo antiDNA, equipo
en el que uno de los anticuerpos está unido a una fase sólida
antes, durante o después de esta incubación y el otro anticuerpo es
un anticuerpo marcado y que contiene más EDTA como agente
estabilizante para inhibir las endonucleasas dependientes de
Ca^{2+} y Mg^{2+} y endonucleasas con un pH ácido óptimo.
6. La utilización del equipo del modo que se
reivindica en la reivindicación 5 para hacer un seguimiento de la
respuesta al tratamiento en pacientes en los que una enfermedad o un
tratamiento ha inducido la apoptosis.
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