CN111770761A

CN111770761A - H1.0k180me2抗体、其制造方法和用途

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Publication number: CN111770761A
Application number: CN201880082764.6A
Authority: CN
Inventors: V·V·伦亚克; J·R·托勒维
Original assignee: Aelan Cell Technologies Inc
Current assignee: Aelan Cell Technologies Inc
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2020-10-13
Also published as: EP3700569A1; US11505621B2; JP2023052165A; JP2021500893A; US20230279147A1; US20200362056A1; WO2019084332A1; EP3700569A4; JP7252953B2

Abstract

本文提供了与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体、制备这种抗体的方法以及使用这种抗体用于治疗和诊断的方法。

Description

H1.0K180ME2抗体、其制造方法和用途

相关申请的交叉引用

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背景技术

细胞染色质是一种动态聚合物，其能够进行多种配置，并且在接受生理学相关输入时易于重构和重组。组蛋白是染色质的主要蛋白质组分，并且双链DNA围绕组蛋白卷绕。组蛋白的变化可差异地改变一些基因的转录机制通路，同时保持其他基因的通路完整。通过组蛋白翻译后修饰(PTM)实现的染色质凝聚差异是染色质包装的基础(Lunyak和Rosenfeld 92008)Hum.Mol.Genet.,17:R28-36；Jenuwein和Allis(2001)Science,293:1074-1080)。组蛋白PTM，例如甲基化，可作为表观遗传密码，并且在与发育、损伤、疾病和衰老紧密相关的细胞应答的许多方面中起关键作用。

存在五个主要的组蛋白家族：H1、H2A、H2B、H3和H4。组蛋白H2A、H2B、H3和H4被称为核心组蛋白，而组蛋白H1和H5被称为接头组蛋白。近年来通过多项研究鉴定的大量H1.0结合蛋白指出了H1.0的蛋白质-蛋白质相互作用的重要作用，并且提出了H1.0结构和功能的新范例，超越了它对染色质构造的影响。

需要在各种细胞环境中检测H1.0甲基化；并且需要敏感的测定来区分各种类型的细胞环境，因为它们与疾病的发展、对损伤的响应和对治疗方案的响应有关。还需要治疗性地解决甲基化H1.0相关疾病和病症。本文提供用于此目的的方法和组合物。

发明内容

本文提供了与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质结合的抗体，其中所述抗体可用于治疗和诊断。还提供了制造这种抗体的方法。

因此，在一方面，本文提供了一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的抗原结合结构域包含：

(a)表4的CDR-L1氨基酸序列中的任一个；

(b)表5的CDR-L2氨基酸序列中的任一个；和

(c)表6的CDR-L3氨基酸序列中的任一个。

在另一方面，本文提供了一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的抗原结合结构域包含：

(a)表7的CDR-H1氨基酸序列中的任一个；

(b)表8的CDR-H2氨基酸序列中的任一个；和

(c)表9的CDR-H3氨基酸序列中的任一个。

在另一方面，本文提供了一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的抗原结合结构域包含表4、5和6的CDR-L氨基酸序列中的任一个，并且包含表7、8和9的CDR-H氨基酸序列中的任一个。

在一方面，本文提供了一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述H1.0K180me2抗体的抗原结合结构域包含：

(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；

(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和

(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。

(a)CDR-H1，其包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的氨基酸序列；

(b)CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和

(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的氨基酸序列。

在另一方面，本文提供了一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在另一方面，本文提供了一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的重链可变结构域包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

在另一方面，本文提供了一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的重链可变结构域包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在另一方面，本文提供了一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的重链可变结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

在另一方面，本文提供了一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的重链可变结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，并且所述抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述抗体是嵌合的或人源化的。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是抗原结合片段。

在一些实施方案中，如果H1.0K180me2蛋白或肽包含除K180以外的甲基化残基，则所述抗体展现出与所述蛋白或肽的结合降低。在一些实施方案中，如果H1.0K180me2蛋白或肽在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K166、K172、K174、K175和/或K177的赖氨酸残基处包含甲基化赖氨酸残基，则所述抗体不结合或仅最低限度结合。

在一些实施方案中，所述抗体与标记缀合。在一些实施方案中，所述抗体附接至固体表面。在一些实施方案中，所述抗体附接珠、柱、树脂或微板。在一些实施方案中，所述抗体与药剂缀合。在一些实施方案中，所述药剂选自：放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA和二抗。

在另一方面，本文提供了编码本文提供的抗体中的任一种的载体。在一些实施方案中，所述载体包含SEQ ID NO:4的核酸或SEQ ID NO:5的核酸。在相关方面，本文提供了包含这些载体中的一种或多种的细胞。

在另一方面，本文提供了一种确定个体是否患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中的方法，所述方法包括：

(a)使来自所述个体的生物样品与本文所述的抗体中的任一种接触；和

(b)测定所述样品中与所述抗体结合的包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质的浓度，其中所述浓度相对于对照降低指示所述个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。在一些实施方案中，所述方法进一步包括如果确定个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗所述个体。

在另一方面，本文提供了一种确定被诊断患有阿尔茨海默病并接受阿尔茨海默病治疗的个体是否将受益于所述治疗或将继续受益于所述治疗的方法，所述方法包括：

(b)确定所述样品中结合所述抗体的包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质的浓度；和

(c)如果所述浓度相对于对照增加，则确定所述个体将受益于所述治疗或将继续受益于所述治疗。在一些实施方案中，所述方法进一步包括如果确定个体将受益于或继续受益于所述治疗，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗所述个体。

在另一方面，本文提供了一种确定被诊断患有阿尔茨海默病的个体是否将受益于候选治疗的方法，其中所述个体尚未开始所述治疗，所述方法包括：

(a)向所述个体给予候选治疗；

(b)在给予候选治疗后，使来自所述个体的生物样品与本文所述的抗体中的任一种接触；和

(c)确定所述样品中与所述抗体结合的包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质的浓度和/或亚细胞定位；和

(d)如果相对于对照所述浓度增加或细胞质亚细胞定位减少，则确定所述个体将受益于所述候选治疗。在一些实施方案中，所述治疗选自：APP合成抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂和调节剂、Aβ聚集抑制剂、Aβ免疫疗法、降胆固醇药物、抗tau药物、胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、非典型抗精神病药、蛋白质S-亚硝基化的阻断剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、雷帕霉素、rapalogue、内源性大麻素、大麻素、神经保护剂、控制钙内流的分子、抗氧化剂、抗炎药物、控制谷氨酸稳态控制的药物、自噬诱导剂、激素、激素调节剂、他汀类、胰岛素、胰岛素载体、多功能纳米载体、维生素、营养补充剂、小RNA分子、肽和超声疗法。

在另一方面，本文提供了一种确定被诊断患有阿尔茨海默病的个体是否将受益于候选治疗的方法，所述方法包括：

(a)在给予候选治疗后，提供来自所述个体的生物样品；

(b)使来自所述个体的生物样品与本文所述的抗体中的任一种接触；和

(a)使来自所述个体的生物样品与候选治疗接触；

(b)使来自所述个体的生物样品与本文所述的抗体中的任一种接触；

(d)如果所述浓度相对于对照增加或细胞质亚细胞定位相对于对照减少，则确定所述个体将受益于所述候选治疗。在一些实施方案中，所述治疗选自：APP合成抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂和调节剂、Aβ聚集抑制剂、Aβ免疫疗法、降胆固醇药物、抗tau药物、胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、非典型抗精神病药、蛋白质S-亚硝基化的阻断剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、雷帕霉素、rapalogue、内源性大麻素、大麻素、神经保护剂、控制钙内流的分子、抗氧化剂、抗炎药物、控制谷氨酸稳态控制的药物、自噬诱导剂、激素、激素调节剂、他汀类、胰岛素、胰岛素载体、多功能纳米载体、维生素、营养补充剂、小RNA分子、肽和超声疗法。

在另一方面，本文提供了一种确定个体是否已暴露于DNA损伤剂的方法，所述方法包括：

(b)测定所述样品中与所述抗体结合的包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质的浓度，其中所述浓度相对于对照增加指示所述个体已暴露于DNA损伤剂。在一些实施方案中，所述DNA损伤剂是辐射。

在另一方面，本文提供了一种确定接受用rapalogue进行的治疗的个体是否响应于这种治疗的方法，所述方法包括：

(a)使来自所述个体的生物样品与本文所述的抗体中的任一种接触；

(c)确定所述个体是否响应于治疗，其中所述浓度相对于对照降低指示所述个体是响应的。

在一些实施方案中，rapalogue选自：雷帕霉素、西罗莫司、雷帕鸣、依维莫司、RA001、飞尼妥、Zortress、坦罗莫司、CCI-779、驮瑞塞尔、地磷莫司、AP23573、MK-8669、Deforolimus、佐他莫司、ABT-578、AZD8055、AZD2014、OSI-027、MLN0128、WYE-132、Torin1、PI-103、P7170、PF-04691502、PF-05212384、PKI-587、GNE477、PKI-180、WJD008、XL765、SAR245409、NVP-BEZ235、BGT226、SF1126、GSK2126458、Ku-0063794、WYE-354、NVP-BEZ235、PF-05212384、XL765、Torin 2、WYE-125132和OSI-027。

在本文提供的诊断方法中的任一种的一些实施方案中，所述浓度的增加或降低高于或低于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。在一些实施方案中，生物样品选自：全血、血浆、血清、唾液、尿液、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液和淋巴液。

在另一方面，本文提供了一种治疗个体中甲基化H1.0相关疾病或病症的方法，所述方法包括向个体给予治疗有效量的本文所述抗体中的任一种。在一些实施方案中，所述疾病或病症选自：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒性应激物暴露、包含衰老细胞积聚的疾病或病症、以及伴随H1.0K180me2蛋白或肽水平升高的疾病或病症。

在另一方面，本文提供了一种清除个体中H1.0K180me2的方法，所述方法包括向个体给予治疗有效量的本文所述的抗体中的任一种。在一些实施方案中，所述个体患有选自以下的疾病或病症：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒素暴露、DNA损伤剂暴露、以及包含衰老细胞积聚的病症。

在另一方面，本文提供了一种用于测量皮下靶分子浓度的透皮贴剂，其包含：

(a)包含本文所述的抗体中的任一种的基底；和

(b)多个微针。

在一些实施方案中，所述贴剂是透皮微针阵列贴剂。在一些实施方案中，所述基底是可弹性拉伸的。

在另一方面，本文提供了一种用于确定个体是否已暴露于辐射或DNA损伤剂的便携式单元，其包含：

(a)样品收集单元；

(b)读取器；

(c)包含本文所述的抗体中的任一种的测定模块；和

(d)多个微针。

在另一方面，本文提供了一种适用于分析物的侧向流测定的测试条，其包含样品接收区，其中所述样品接收区包含本文所述的抗体中的任一种。

在另一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含本文提供的抗体中的任一种。所述药物组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。

在另一方面，本文提供了一种试剂盒，其包含治疗有效量的本文提供的抗体中的任一种。

在另一方面，本文提供了一种制品，其包含任一种本文提供的抗体或组合物。

在另一方面，本文提供了用作药物的任一种本文提供的抗体或组合物。

在另一方面，本文提供了任一种本文提供的抗体或组合物，用于治疗甲基化H1.0相关疾病或病症；任选地其中所述疾病或病症选自：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒性应激物暴露、包含衰老细胞积聚的疾病或病症、以及伴随H1.0K180me2蛋白或肽水平升高的疾病或病症。

在另一方面，本文提供了任一种本文提供的抗体或组合物，用在治疗方法中，其中所述方法包括清除个体中的H1.0K180me2，任选地其中所述个体患有选自以下的疾病或病症：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒素暴露、DNA损伤剂暴露、以及包含衰老细胞积聚的病症。

附图说明

图1图解了产生单克隆抗体的示例性方法。

图2A展示了抗体克隆与H1.0Kme2肽(在对应于人H1.0蛋白的K180的残基处甲基化)的结合效率。图2B展示了抗体克隆与未修饰的H1.0肽(未甲基化)的结合效率。图2C提供了抗体克隆与H1.0Kme2或H1.0肽的结合的原始数据。

图3示出了抗体克隆对在K180上具有0、1或2个甲基修饰的H1.0肽的特异性。

图4A展示了通过G9A甲基转移酶进行的特异性体外H1.0K180甲基化。图4B示出了通过LC/MS测定的通过G9A在H1.0上进行甲基化的位点。图4C示出了通过H1.0K180me2抗体对H1.0K180的甲基化进行的检测。图4D是对体外甲基化H1.0的抗体克隆特异性的分析。

图5A示出了克隆A(SEQ ID NO:6)和克隆B(SEQ ID NO:7)的抗体重链之间的蛋白质序列比对。图5B示出了克隆A(SEQ ID NO:8)和克隆B(SEQ ID NO:9)的抗体轻链之间的蛋白质序列比对。图5C示出了抗体克隆A的DNA(SEQ ID NO:4和5)和蛋白质序列(SEQ ID NO:6和8)。图5D展示了用于重组表达抗体的示例性方法。

图6展示了对抗体的可以增强功能的多种可能修饰。

图7A描绘了抗体克隆A重链的序列(SEQ ID NO:6)，并且以结构信息进行了注释。图7B描绘了抗体克隆A轻链的序列(SEQ ID NO:8)，并且以结构信息进行了注释。图7C描绘了抗体克隆A的预测轻链互补性决定区(CDR)和框架(FW)区(SEQ ID NO:10、11、14、15、18和38-43)。图7D描绘了抗体克隆A的预测重链CDR和FW区(SEQ ID NO:20-23、28-31、36、37和44-56)。

图8示出了示例性使用ELISA以直接检测体液样品中的H1.0K180me2表位。

图9A-9C示出了脑组织和血清中循环H1.0K180me2的年龄相关积聚。示出了小鼠(图9A)和人(图9B)脑组织中H1.0K180me2的蛋白质印迹分析，揭示了其丰度随着生物体年龄而增加。图9C示出了通过总IgG血清水平归一化的在人血清样品中的H1.0K180me2水平。在此图和全文中，符号“α”代表抗体。

图10A-10C展示了测量血清H1.0K180me2作为阿尔茨海默病的生物标记物的实用性。图10A显示了与年龄匹配对照相比时，患有阿尔茨海默病的个体的血清H1.0K180me2降低(通过血清体积归一化)。图10B显示了与年龄匹配对照相比时，患有阿尔茨海默病的个体的血清H1.0K180me2降低(通过总血清IgG水平归一化)。图10C显示了与年龄匹配对照相比时，患有阿尔茨海默病的个体的血清H1.0K180me2降低(通过总血清蛋白浓度归一化)。

图11A示出了通过蛋白质印迹分析，在DNA损伤后立即发生的染色质的H1.0K180的二甲基化(H1.0K180me2)。图11B示出了在DNA损伤后H1.0K180me2的分泌。

图12A和12B示出了对SR、急性DNA损伤和基因毒性应激诱导的衰老的hADSC的LC-MS/MS分析(图12A)和狭缝印迹分析(图12B)，揭示了二甲基化H1.0K180(H1.0K180me2)在基因毒性应激诱导的衰老后从染色质释放(图12A)，并且从细胞中分泌到细胞外基质/细胞培养基中(图12B)。

图13A-13C示出了电离辐射对H1.0K180me2水平的影响。图13A显示了暴露于电离辐射诱导小鼠血清中循环H1.0 K180me2水平增加。图13A和图13B示出了H1.0K180me2的存在(图13A)和定量(图13B)的狭缝印迹分析，其使用对血清中的H1.0K180me2表位具有特异性的抗体。图13C示出了在X射线照射(7Gy)后小鼠血清中H1.0K180me2表位水平的存在的蛋白质印迹分析，其使用对H1.0K180me2表位具有特异性的抗体。

图14示出了博来霉素治疗后SR hADSC(自我更新的人脂肪来源的干细胞)中H1.0K180me2的蛋白质印迹分析，揭示了依维莫司(雷帕霉素的衍生物)可用于在DNA损伤后阻断H1.0K180me2的出现。

具体实施方式

本文提供了H1.0K180me2抗体。这些抗体可用于治疗和诊断用途。这些H1.0K180me2抗体可用于治疗个体中甲基化H1.0相关疾病或病症。这些H1.0K180me2抗体还可用于检测复制性衰老、DNA损伤、基因毒性应激、辐射暴露、阿尔茨海默病，用于监测治疗方案、患者分层、药物筛选，并可用作系统中生物老化的标记物。这些组合物和方法在以下详细描述。

WO 2017/184895描述了与H1.0二甲基化蛋白相关的组合物和方法；并且WO 2017/184873描述了与H1.0蛋白的甲基化相关的组合物和方法。将这些公开案的内容通过引用以其整体并入本文。

I.与组蛋白H1.0K180me2蛋白和肽结合的H1.0K180me2抗体

A.H1.0K180me2抗体

本文提供了特异性结合二甲基化组蛋白H1.0抗原的抗体，其中所述二甲基化组蛋白H1.0抗原是包含二甲基化赖氨酸残基的组蛋白H1.0蛋白或其肽，其中所述赖氨酸残基对应于全长人组蛋白H1.0蛋白(SEQ ID NO:1)的K180，并且其中所述二甲基化K180残基是结合所需的。在以下表1的SEQ ID NO:1中，K180由K*表示。

全文中，二甲基化H1.0抗原可互换地称为H1.0K180me2抗原或H1.0K180me2表位。全文中含H1.0K180me2的蛋白和肽称为“H1.0K180me2蛋白”和“H1.0K180me2肽”。术语“抗H1.0K180me2”或“H1.0K180me2抗体”或“抗H1.0K180me2抗体”可互换地指这些抗体。

如上所述，本文中术语“K180”的使用是指对应于人H1.0蛋白(SEQ ID NO:1)的K180的残基。类似地，术语“K172”称为对应于人H1.0蛋白的K172的残基，术语“K190”称为对应于人H1.0蛋白的K190的残基等。

本公开文本的H1.0K180me2抗体与人和非人哺乳动物H1.0K180me2抗原结合。

如贯穿本文使用的术语“抗体”在最广泛的意义上并且包括单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、抗原结合片段(例如Fab片段、Fab'2片段、CDR或ScFv)以及其他保留对H1.0K180me2抗原的特异性的抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体是保留对H1.0K180me2抗原的特异性的单链抗体。在一个示例性实施方案中，所述抗体是嵌合人x小鼠抗体。在一个示例性实施方案中，所述抗体是嵌合人x兔抗体。在一个示例性实施方案中，所述抗体是人源化小鼠抗体。在一个示例性实施方案中，所述抗体是人源化兔抗体。

在一些实施方案中，本文提供的H1.0K180me2抗体是诊断性抗体。在一些实施方案中，本文提供的H1.0K180me2抗体是治疗性抗体。

在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体是亲和纯化的抗体。

在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体是分离的抗体。

本文提供的H1.0K180me2抗体可以与药剂缀合用于多种目的，所述目的包括但不限于检测、诊断、可视化、定量、分选、治疗和用于生物学测定。

在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体缀合至标记，例如可检测标记、旋转标记、比色标记、放射性标记、酶标记、荧光标记或磁性标记。

在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体附接至固体表面，例如珠(例如磁性、玻璃或塑料珠)、柱、树脂或微板。在一些实施方案中，将抗体包被在微板上。在一些实施方案中，附接至固体表面的抗体与标记缀合；在一些实施方案中，附接至固体表面的抗体是抗原结合片段。

在一些实施方案中，抗体缀合至效应分子，包括但不限于放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA和二抗。

本文提供的H1.0K180me2抗体可结合细胞外H1.0K180me2和/或细胞内H1.0K180me2。

本文提供的抗体可以是任何免疫球蛋白类型，诸如IgG、IgA、IgE、IgD或IgM。在一些实施方案中，所述抗体是IgG亚型，并且可以是IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。

本文提供了对来自任何物种的H1.0K180me2抗原具有特异性的抗体。在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体对人H1.0K180me2具有特异性。在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体与来自其他物种的H1.0K180me2交叉反应。

本文提供的H1.0K180me2抗体对H1.0K180me2抗原具有选择性，例如H1.0K180me2抗体对在K180残基处的二甲基化具有选择性。

本文提供的H1.0K180me2抗体对H1.0K180me2抗原具有特异性，例如H1.0K180me2抗体对在残基K180处的二甲基化具有特异性，并且展现出很少结合或不结合H1.0K180表位(在K180处未甲基化)、H1.0K180me1表位(在K180处单甲基化)或H1.0K180me3表位(在K180处三甲基化)。在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体不结合或仅最低限度结合包含未甲基化K180残基的抗原(图4D)。

本文提供的抗体特异性结合含H1.0K180me2的抗原。在一些实施方案中，含H1.0K180me2的抗原不包含甲基化的任何其他赖氨酸残基。

在一些实施方案中，如果靶标H1.0K180me2抗原包含另外甲基化赖氨酸残基，则H1.0K180me2抗体不结合或仅最低限度结合，例如，其中所述赖氨酸残基对应于人组蛋白H1.0蛋白的K166、K172、K174、K175和/或K177。

在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体不结合或仅最低限度结合包含一种或多种以下残基的抗原：K172me1、K172me2、K172me3、K174me1、K174me2、K174me3、K175me1、K175me2、K175me3、K177me1、K177me2、K177me3、K166me1、K166me2、K166me3、K180me1和/或K180me3。

在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体不结合或仅最低限度结合包含二甲基化K180残基但还包含一种或多种以下残基的抗原：K172me1、K172me2、K172me3、K174me1、K174me2、K174me3、K175me1、K175me2、K175me3、K177me1、K177me2、K177me3、K166me1、K166me2、K166me3、K180me1和/或K180me3。

在一些实施方案中，当H1.0K180me2抗体显示出对抗原的特异性(结合偏好，亲和力)比对不包含任何其他甲基化赖氨酸残基的含H1.0K180me2抗原的特异性少至少1.5倍、2倍、2.5倍、2.7倍、5倍或甚至10倍时，H1.0K180me2抗体不结合或仅最低限度结合抗原。

本公开文本的H1.0K180me2抗体可以在任何培养基中结合H1.0K180me2表位。

在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体显示出对K180处的二甲基化抗原(H1.0K180me2抗原)的特异性(结合偏好，亲和力)为对在K180处的未甲基化抗原(H1.0K180抗原)的特异性的至少1.5倍、2倍、2.5倍、2.7倍、5倍或甚至10倍。(图2A-2B)在一些实施方案中，对H1.0K180me2抗原的特异性通常为非特异性靶分子(例如，缺乏一个或多个特异性识别位点的随机产生的分子)、未甲基化K180残基、三甲基化K180残基或任何其他残基处甲基化的H1.0蛋白的特异性的至少约2倍、约5倍或至少约10倍、20倍、50倍、10^2倍、10^3倍、10^4倍、10^5倍或10^6倍。

在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体显示出的对K180处的二甲基化抗原(H1.0K180me2抗原)的特异性(结合偏好，亲和力)为对K180处的单甲基化抗原(H1.0K180me1抗原)的特异性的至少1.5倍、2倍、2.5倍、2.7倍、5倍或甚至10倍。(图3)在一些实施方案中，对H1.0K180me2抗原的特异性通常为对非特异性靶分子(例如，缺乏一个或多个特异性识别位点的随机产生的分子)、单甲基化K180残基、三甲基化K180残基或任何其他残基处甲基化的H1.0蛋白的特异性的至少约2倍、约5倍或至少约10倍、20倍、50倍、10^2倍、10^3倍、10^4倍、10^5倍或10^6倍。

在某些实施方案中，本文提供的H1.0K180me2抗体具有0.0001nM至1μM范围的解离常数(Kd)。例如，所述抗体的Kd可以是约1μM、约100nM、约50nM、约10nM、约5nM、约1nM、约0.5nM、约0.1nM、约0.05nM、约0.01nM、约0.005nM、约0.001nM、约0.0005nM或甚至约0.0001nM。

H1.0K180me2抗体(例如单克隆H1.0K180me2抗体，mAb)的结构可以被修饰以在所需背景下(图6所示的示例性实施方案)起作用。

图6，a部分。示出了糖修饰的去岩藻糖基化(afucosylated)mAb，所述去岩藻糖基化mAb展现出与IgG Fc受体(FcγR)的结合增强以及ADCC增加。在缺乏岩藻糖基化酶的细胞系中mAb的表达可用于产生去岩藻糖基化mAb。本文所述的任何H1.0K180me2抗体都可以以这种方式修饰。

图6，b部分。mAb的氨基酸序列可以在恒定区中被修饰。这种修饰可以增加mAb与FcγR的结合并且还增加ADCC。本文所述的任何H1.0K180me2抗体都可以以这种方式修饰。

图6，c部分。当ADCC不是所需的机制时，可以取代不同的同种型。IgG4不将ADCC诱导至与IgG1所诱导的相同程度。本文所述的任何H1.0K180me2抗体都可以以这种方式修饰。

图6，d部分。放射性免疫缀合物可以通过将放射性同位素与mAb接头缀合来产生。稳定的接头的使用将防止游离放射性同位素的泄漏。本文所述的任何H1.0K180me2抗体都可以以这种方式修饰。

图6，e部分。抗体药物缀合物可以通过将药物与mAb采用接头缀合来制造。可切割接头或pH敏感接头可用于允许药物与mAb分开发挥作用。这种缀合可以将药物靶向通过抗体指定的细胞或组织，并且由于不能自由循环而限制了毒性。本文所述的任何H1.0K180me2抗体都可以以这种方式修饰。

图6，f部分。mAb的特异性可用于产生嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。这些可以通过将编码mAb可变区的DNA融合到T细胞受体内部信号传导部分的DNA序列中来产生。此嵌合受体可用于引入T细胞中以用于过继性疗法。本文所述的任何H1.0K180me2抗体的抗原结合结构域可用于产生CAR-T细胞。

图6，g部分。通过从抗体去除恒定区并且将剩余的可变区与另一种抗体的分离的可变区交联来创建双特异性抗体。恒定区的去除可以导致半衰期缩短，并且需要连续转输这种交联的抗体以达到所需的暴露水平。本文所述的任何H1.0K180me2抗体都可以以这种方式修饰。

在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体包含克隆A的可变结构域、互补结合区、框架区(下文讨论)。在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体是单克隆人源化抗体或其抗原结合片段，包含克隆A的CDR(下文讨论)。在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体包含克隆B的可变结构域、互补结合区、框架区(下文讨论)。在一些实施方案中，H1.0K180me2抗体是单克隆人源化抗体或其抗原结合片段，包含克隆B的CDR(下文讨论)。

B.H1.0K180me2抗体的产生

多种免疫测定形式可用于选择与H1.0K180me2特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定可用于选择对H1.0K180me2具有特异性的单克隆抗体(关于可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York)。

本文提供的抗体的产生可通过本领域技术人员已知的任何方法进行。例如，在一些实施方案中，所述抗体由重组细胞产生，所述重组细胞被工程化以表达所需抗体的所需可变重(VH)和可变轻(VL)和恒定结构域(例如图5D)。在一些实施方案中，所述抗体由杂交瘤产生。

在一些实施方案中，使用标准方案将任选地与免疫原性载体连接的任何包含H1.0K180me2抗原的肽用于进行免疫。在示例性实施方案中任选地与免疫原性载体连接的包含CAKPVKASKPKKAKPVK(me2)PK(SEQ ID NO:3)的肽用于使用标准方案进行免疫(图1)。可使用本领域技术人员已知的技术评估产生的抗体的质量和效价。

用于开发单克隆抗体的示例性方法在图1中以四个不同的阶段示出。如图所示，阶段I涉及针对与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)缀合的H1.0K180me2肽来免疫兔。在免疫前和免疫后出血之间比较免疫效价。分离外周血单核细胞(PBMC)，并且然后通过流式细胞术分选阳性抗原结合细胞。在阶段II中，从阶段1中分离的细胞中提取总RNA。进行抗体的重链和轻链可变结构域的RT-PCR，并且将scFv扩增子插入载体。然后将这些scFv载体用于产生细胞表面展示文库。在阶段III中，将细胞表面展示文库用H1.0K180me2肽淘选至少一轮。此步骤针对未甲基化H1.0K肽结合进行进一步选择。将结合H1.0K180me2的克隆通过流式细胞术进一步选择，并且后续可以进行测序。在阶段IV中，创建全长重链和轻链以产生完整的重组抗体。可以将这些抗体表达和纯化。这些抗体与H1.0K180me2蛋白的结合随后可以通过ELISA、狭缝印迹和蛋白质印迹进行验证。这在实施例2-4中进一步详细地进行了解释。图4B以及上表1中提供了未甲基化以及甲基化H1.0蛋白的示例性氨基酸序列。(甲基化赖氨酸残基表示为(me1/2/3指示单、二和三甲基化可能性)。

本文所述的本发明组合物还包括编码本文所公开的任何抗体的核酸、包含编码所述抗体的任何核酸的载体和包含任何这种载体的宿主细胞。表2提供了本文提供的抗体的抗原结合片段的示例性核酸序列。本文还提供了含有编码抗体的核苷酸和载体的细胞。在一些实施方案中，所述抗体是分泌的。

本领域技术人员容易理解抗体还可例如在提供序列之后通过许多商业服务中的任一种来制备。

表3-9提供了一些示例性H1.0K180me2抗体的抗原结合片段的氨基酸序列。

表3提供了示例性重链可变(VH)和轻链可变(VL)序列。本文还提供了具有至少85％的VH和VL序列

表4-9提供了轻链的抗原结合结构域(CDR-L)和重链的抗原结合结构域(CDR-H)的示例性互补决定区(CDR)序列(区1、2和3)。如下所提及，VL CDR1区称为CDR-L1；VL CDR2区称为CDR-L2；VL CDR3区称为CDR-L3；VH CDR1区称为CDR-H1；VH CDR2区称为CDR-H2；以及VHCDR3区称为CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的重链可变结构域。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的轻链可变结构域。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的重链可变结构域和SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的轻链可变结构域。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:6的重链可变结构域并且包含SEQ ID NO:8的轻链可变结构域。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2，其中所述抗体包含SEQ ID NO:6的重链可变结构域并且包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:7的重链可变结构域并且包含SEQ ID NO:8的轻链可变结构域。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:7的重链可变结构域并且包含SEQ ID NO:9的轻链可变结构域。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的抗原结合区包含：

(a)表4的CDR-L1氨基酸序列中的任一个；

(b)表5的CDR-L2氨基酸序列中的任一个；和

(c)表6的CDR-L3氨基酸序列中的任一个。

(a)表7的CDR-H1氨基酸序列中的任一个；

(b)表8的CDR-H2氨基酸序列中的任一个；和

(c)表9的CDR-H3氨基酸序列中的任一个。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的抗原结合区包含H1.0K180me2抗原或其肽，其中所述抗体的抗原结合区包含表4、5和6的CDR-L氨基酸序列中的任一个，并且包含表7、8和9的CDR-H氨基酸序列中的任一个。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO:13的CDR-L1。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO.16或SEQ ID NO:17的CDR-L2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO:18或SEQ ID NO:19的CDR-L3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO:13的CDR-L1；SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO.16或SEQ ID NO:17的CDR-L2；和SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的CDR-L3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO:10或SEQ ID NO:11的CDR-L1、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的CDR-L2、或SEQ IDNO:18的CDR-L3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO:12或SEQ ID NO:13的CDR-L1、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17的CDR-L2、或SEQ IDNO:19的CDR-L3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的CDR-H1；SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的CDR-H2；或SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO:10的CDR-L1、SEQ ID NO:14的CDR-L2和SEQ ID NO:18的CDR-L3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO:10的CDR-L1、SEQ ID NO:15的CDR-L2和SEQ ID NO:18的CDR-L3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO:11的CDR-L1、SEQ ID NO:14的CDR-L2和SEQ ID NO:18的CDR-L3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO:11的CDR-L1、SEQ ID NO:15的CDR-L2和SEQ ID NO:18的CDR-L3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO:12的CDR-L1、SEQ ID NO:14的CDR-L2和SEQ ID NO:18的CDR-L3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO:12的CDR-L1、SEQ ID NO:16的CDR-L2和SEQ ID NO:18的CDR-L3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO:12的CDR-L1、SEQ ID NO:17的CDR-L2和SEQ ID NO:18的CDR-L3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO:13的CDR-L1、SEQ ID NO:16的CDR-L2和SEQ ID NO:18的CDR-L3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQID NO:13的CDR-L1、SEQ ID NO:17的CDR-L2和SEQ ID NO:18的CDR-L3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26或SEQ ID NO:27的CDR-H1。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQID NO:34或SEQ ID NO:35的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:36或SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、或SEQ ID NO:27的CDR-H1；包含SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、或SEQ ID NO:35的CDR-H2；并且包含SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:20的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:28的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:20的CDR-H1、包含SEQ ID NO:29的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:20的CDR-H1、并且包含SEQ ID NO:30的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:20的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:31的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:21的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:28的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:21的CDR-H1、包含SEQ ID NO:29的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:21的CDR-H1、并且包含SEQ ID NO:30的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:21的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:31的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:22的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:28的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:22的CDR-H1、包含SEQ ID NO:29的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:22的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:30的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:22的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:31的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:23的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:28的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:23的CDR-H1、包含SEQ ID NO:29的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:23的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:30的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:23的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:31的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:36的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:20的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:28的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:20的CDR-H1、包含SEQ ID NO:29的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:20的CDR-H1、并且包含SEQ ID NO:30的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:20的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:31的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:21的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:28的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:21的CDR-H1、包含SEQ ID NO:29的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:21的CDR-H1、并且包含SEQ ID NO:30的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:21的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:31的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:22的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:28的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:22的CDR-H1、包含SEQ ID NO:29的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:22的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:30的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:22的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:31的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:23的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:28的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:23的CDR-H1、包含SEQ ID NO:29的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:23的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:30的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:23的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:31的CDR-H2并且包含SEQ ID NO:37的CDR-H3。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:24的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:32的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:24的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:33的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:24的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:34的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:24的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:35的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:25的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:32的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:25的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:33的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:25的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:34的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:25的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:35的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:26的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:32的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:26的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:33的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:26的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:34的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:26的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:35的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:27的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:32的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:27的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:33的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:27的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:34的CDR-H2。

在一些实施方案中，本文提供了H1.0K180me2抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO:27的CDR-H1并且包含SEQ ID NO:35的CDR-H2。

表10提供了示例性抗体框架(FW)序列。如下所提及，VL框架区称为LRF1、LRF2和LRF3。同样，VH框架区也称为HRF1、HRF2、HRF3和HRF4。

II.H1.0K180me2抗体的治疗用途

A.甲基化H1.0相关疾病和病症的治疗

本文提供了用于治疗甲基化H1.0相关疾病或病症的治疗性H1.0K180me2抗体。

如本文所用，“甲基化H1.0相关疾病或病症”是其中H1.0K180me2的水平增加、K180处的H1.0蛋白/肽底物的内源性二甲基化增加、H1.0K180me2从染色质的释放增加、H1.0K180me2从细胞核到细胞质的释放增加、H1.0K180me2的细胞质沉积增加、细胞外空间中的H1.0K180me2水平增加、体液(例如血清、尿液、唾液、脑脊液等)中的H1.0K180me2的循环水平增加、和/或对H1.0K180me2具有特异性的自身抗体的水平增加的疾病或病症。

甲基化H1.0相关疾病和病症包括但不限于与衰老细胞增加相关的年龄相关病理、阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒性应激物暴露、包括与外部和内部应激物相关的衰老细胞积聚的病症、以及与高水平的针对H1.0K180me2的自身抗体相关的疾病和病症的自身免疫组。

本文提供了通过结合和清除H1.0K180me2治疗个体中甲基化H1.0相关疾病或病症的方法，其包括向所述个体给予治疗有效量的治疗性H1.0K180m e2抗体。

如本文所用，个体是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园、体育或宠物动物，诸如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。个体可以是雄性或雌性。

个体可以是任何年龄。在本文所述的方法(例如用于治疗阿尔茨海默病)的一些实施方案中，所述个体大于50岁。在本文所述方法的一些实施方案中，所述个体小于50岁。在本文所述方法的一些实施方案中，所述个体为至少50岁、至少55岁、至少60岁、至少65岁、至少70岁、至少75岁或至少80岁。在示例性实施方案中，所述个体为至少60岁。

更具体地说，关于甲基化H1.0相关疾病和病症，以下呈现了示例性适应症。

阿尔茨海默病

在衰老期间，在人的脑组织中细胞质H1.0K180me2的积聚增加，图9B。这些观察与血清学测试中观察到的循环H1.0 K180me2抗原的年龄相关的增加相关(图9C)。此外，当用抗H1.0K180me2、抗H1.0、抗γH2A.X和抗β-肌动蛋白抗体，通过蛋白质印迹分析比较来自1个月(年轻)和24个月(老)小鼠的小鼠脑样品的全细胞裂解物时，在24个月的小鼠中，H1.0K180me2水平升高，与γH2A.X水平升高相关(图9A)。

然而，当将对照群体(无阿尔茨海默病病理)与参考对照(诊断为阿尔茨海默病患者)进行比较时，在诊断患有阿尔茨海默病的个体中，在观察的血清学ELISA测试中H1.0K180me2抗原的循环水平下降(图10A-10C)。图10A示出了在阿尔茨海默病患者和年龄匹配对照中通过狭缝印迹分析测定的H1.0K180me2水平的定量。在阿尔茨海默病患者和年龄匹配对照中通过狭缝印迹分析测定H1.0K180me2水平的定量。图10B示出了通过总IgG血清水平归一化的在人血清中的H1.0K180me2水平。图10C示出了通过总蛋白水平归一化的在人血清中的H1.0K180me2水平。尽管H1.0K180me2的血清浓度足以用于鉴定阿尔茨海默病患者，但使用由总IgG(图10B)或总蛋白(图10C)进行的血清样品归一化允许直接比较个体而不论可改变总体血清浓度的变量(诸如用于获得血清的方案、操作者可变性、患者的水化状态和患者的活动状态)如何。

因此，在阿尔茨海默病的背景下，提供了用治疗有效量的H1.0K180me2抗体(例如细胞穿透抗体或细胞清除抗体)进行的治疗。

DNA损伤和基因毒性应激

在DNA损伤剂的背景下，在用化学治疗剂博来霉素进行的急性DNA损伤后，在染色质上观察到H1.0K180的二甲基化(H1.0K180me2)(图11A)。为了评估H1.0K180甲基化与DNA损伤之间的关系，将SR hADSC(自我更新的人脂肪来源的干细胞)和用DNA损伤剂博来霉素处理2小时的hADSC进行裂解并且分级，以获得染色质结合的级分。用H1.0K180me2抗体进行的蛋白质印迹分析显示DNA损伤后染色质上的H1.0K180的甲基化(图11A)。用博来霉素处理SR hADSC以诱导DNA双链断裂后，H1.0K180me2定位于细胞质。

通过狭缝印迹免疫测定，发现在由博来霉素施加基因毒性损害后，在hADSC的条件培养基中以时间过程依赖性方式检测到H1.0K180me2的存在，其中在48小时内检测到最大H1.0K180me2分泌(图11B)。这表示向细胞外分泌。在处理后48小时开始，以类似于H1.0K180me2的方式，观察到GSI-SEN上DNA片段化因子(DFFB/DFF40/CAD)分泌的增加(图11B)。在急性DNA损伤(ADD)开始后，没有蛋白质以可测量的量分泌。

在基因毒性应激的背景下，H1.0K180me2在基因毒性应激诱导的衰老后(在用DNA损伤剂处理后数天)从染色质中释放(图12A)，并从细胞分泌到细胞外空间中(图12B)。如图12A所示，染色质结合的H1.0从SR和急性DNA损伤中总量的约60％降低至基因毒性应激诱导的衰老后总量的约30％。收集来自用博来霉素处理的SR hADSC的培养基用于采用α-H1.0和α-H1.0K180me2抗体的狭缝印迹分析，以评估H1.0至细胞外基质(ECM)的分泌。在细胞培养基中可检测到分泌的H1.0，并且在博来霉素处理24小时后，也容易地检测到分泌的H1.0K180me2(图12B)。这些结果确认甲基化H1.0K180在基因毒性应激诱导的衰老后从染色质中释放并分泌到ECM中。

因此，在DNA损伤和基因毒性应激的背景下，提供了用治疗有效量的H1.0K180me2抗体(例如细胞穿透抗体或细胞清除抗体)进行的治疗。

辐射暴露

在辐射暴露的背景下，暴露于电离辐射诱导血清中循环H1.0 K180me2的水平增加(图13A和图13B)。检查电离辐射对血清中H1.0K180me2水平的影响。在暴露于7Gy电离辐射之前和之后2小时或48小时从野生型小鼠收集血清。使用α-H1.0K180me2抗体狭缝印迹和免疫印迹，将照射后2小时(小鼠1)或48小时(小鼠2)的H1.0K180me2血清水平与处理前的初始水平进行比较(图13A)。使用每次分析中包括的H1.0K180me2肽的标准曲线计算每个血清样品中H1.0K180me2的浓度。将小鼠血清白蛋白用作上样对照。通过血清白蛋白定量并归一化H1.0K180me2斑点印迹条带。示出了照射后H1.0K180me2的相对增加(图13B)。在照射后，等体积小鼠血清的α-H1.0K180me2抗体蛋白质印迹分析也显示H1.0K180me2增加(图13C)。

因此，在辐射暴露的背景下，提供了用治疗有效量的H1.0K180me2抗体(例如细胞穿透抗体或细胞清除抗体)进行的治疗。

B.治疗性H1.0K180me2抗体

如上文部分(I)(A)中所讨论的，本文提供了识别H1.0K180me2表位并与其选择性和/或特异性结合并且可用于治疗的抗体。

在一些实施方案中，所述治疗性抗体是中和抗体，并且所述抗体中和H1.0K180me2的一种或多种生物活性。例如，所述抗体可结合细胞外H1.0K180me2并且中和其可能具有的任何结合或信号传导活性。在一些实施方案中，所述抗体可清除或阻断细胞或样品中的H1.0K180me2。在一些实施方案中，所述抗体可清除包含H1.0K180me2的细胞。

在一些实施方案中，治疗性抗体可清除衰老细胞。在一些实施方案中，所述抗体可清除引起阿尔茨海默病症状的细胞/组织或蛋白质产物。在一些实施方案中，所述抗体可清除被辐射损伤、DNA损伤剂和其他基因毒素损伤的细胞。在一些实施方案中，所述抗体是细胞穿透抗体。在其他实施方案中，包括受影响的细胞膜并允许本文提供的治疗性H1.0K180me2抗体进入。

在一些实施方案中，本文提供的治疗性抗体具有抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。在其细胞表面上携带Fcγ受体(FcγR或FCGR)的效应细胞(包括细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞或单核细胞)识别并结合抗体与靶细胞结合的Fc区。这种结合可触发细胞内信号传导途径的激活，从而导致细胞死亡。

在一些实施方案中，所述治疗性抗体具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。抗体诱导的CDC通过经典补体级联的蛋白介导，并且通过补体蛋白Clq与抗体的结合而触发。抗体Fc区与Clq结合可诱导补体级联的激活。

在一些实施方案中，所述治疗性抗体具有抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)活性。在其细胞表面上携带Fc受体的吞噬细胞(包括单核细胞和巨噬细胞)识别并结合抗体与靶细胞结合的Fc区。在Fc受体与抗体结合的靶细胞结合后，可启动靶细胞的吞噬作用。

在一些实施方案中，所述治疗性抗体可形成免疫复合物。例如，免疫复合物可以是表达或挤出被抗体覆盖的H1.0K180me2抗原的复合物。

C.组合疗法

本文提供的任何治疗性H1.0K180me2抗体的给予可与体现在H1.0甲基化上的疾病的其他已知药物/治疗组合给予。

在阿尔茨海默病预防的背景下，任何治疗性H1.0K180me2抗体可与包括但不限于以下的阿尔茨海默病预防药物或方案的给予组合给予：APP合成抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂和调节剂、Aβ聚集抑制剂、Aβ免疫疗法、降胆固醇药物、抗tau药物、胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、非典型抗精神病药、蛋白质S-亚硝基化的阻断剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、雷帕霉素、rapalogue、内源性大麻素、大麻素、神经保护剂、控制钙内流的分子、抗氧化剂、抗炎药物、控制谷氨酸稳态控制的药物、自噬诱导剂、激素、激素调节剂、他汀类、胰岛素、胰岛素载体、多功能纳米载体、维生素、营养补充剂、小RNA分子、肽和超声疗法。

E.治疗性H1.0K180me2抗体的给予

本文所述的治疗性H1.0K180me2抗体的体内给予可以在静脉内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心/脑室内或鼻内进行。可给予有效量的治疗剂以用于治疗体现出H1.0甲基化的疾病或病症。治疗剂的适当剂量可基于以下确定：待治疗的疾病或病症的类型、治疗性抗体的类型、疾病或病症的严重程度和病程、个体的临床病症、个体的临床病史和对治疗的响应以及主治医师的判定。在示例性实施方案中，本文提供的任一种H1.0K180me2抗体是静脉内给予的。

对于本文所述的治疗性H1.0K180me2抗体的体内给予，根据给予途径，正常剂量量可从每天约1ng/kg至约1000mg/kg个体体重或更多而变化。为了在若干天或更长时间内重复给予，根据待治疗的甲基化H1.0相关疾病或病症的严重程度，可持续治疗直至实现所需症状抑制。取决于医师所希望实现的药代动力学衰减的模式，剂量方案是可用的。例如，本文提供了每周一至二十次对个体进行给药。在某些实施方案中，给药频率为每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天一次、每周一次、每两周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、或每月一次、每两个月一次、每三个月一次或更长时间。所述疗法的进展可通过常规技术和测定进行监测。给药方案可随时间变化而与所用剂量无关。

E.药物组合物

本申请提供了包含治疗性H1.0K180me2抗体的组合物，所述组合物包括包含本文所述的任何一种或多种治疗性抗体的药物组合物。所述药物组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物是无菌的。

F.治疗性试剂盒和制品

本申请提供了包含本文所述的治疗性H1.0K180me2抗体组合物的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步含有选自以下中的任一种的组分：二级抗体、用于免疫组织化学分析的试剂、药学上可接受的赋形剂和说明书及其任何组合。在一些实施方案中，所述试剂盒包含本文所述治疗性组合物中的一种或多种，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

本申请还提供了包含本文所述治疗性组合物或试剂盒中的任一种的制品。制品的例子包括小瓶(例如密封小瓶)。

III.H1.0K180me2抗体的诊断用途

A.H1.0K180me2抗原的检测

本文提供了特异性结合H1.0K180me2抗原的抗体，其可用于诊断。本文提供的H1.0K180me2抗体需要K180残基的二甲基化用于结合。H1.0K180me2抗体在前述部分I(A)中更详细地进行了讨论。

图8描绘了示例性使用ELISA直接检测体液样品中的H1.0K180me2表位。在此示例性方案中，提供了对H1.0K180me2表位具有特异性的抗体，并将其固定(包被)在微板上。提供含有H1.0K180me2表位用于定量的临床样品。向微板中添加所述样品，并且H1.0K180me2表位与固定的抗体结合。洗去未结合的材料。然后添加检测抗体，例如HRP或任何其他标记的抗体。这些检测性抗体结合捕获表位。洗去未结合的检测抗体。添加检测底物溶液，并测量荧光团或颜色变化。然后将其相对于标准曲线进行定量，以报告临床样品中H1.0K180me2表位的水平。

本文提供了用于检测和定量H1.0K180me2浓度的测定。这种定量可用于检测复制性衰老、DNA损伤、基因毒性应激、辐射暴露、阿尔茨海默病和生物老化。定量还可用于监测治疗方案、药物筛选和将患者分层为如下药物治疗的应答者或无应答者，所述药物治疗旨在恢复细胞活力、防止DNA损伤、增加细胞代谢和自噬、抑制细胞衰老和阻断不溶性蛋白质废物在细胞质中积聚。取决于应用，可在体内、体外、离体、原位或无细胞系统中检测和定量H1.0K180me2。如本文所公开的，例如，定量可涉及使体外生物样品与抗体接触，并且确定在所述样品中结合所述抗体的包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质的浓度和/或亚细胞定位。

H1.0K180me2可通过本领域技术人员熟知的任何数量的方法来检测。本文提供的H1.0K180me2抗体易于用于各种免疫测定。这些免疫测定包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、流式细胞术、侧向流动免疫测定、狭缝印迹、磁免疫测定、放射免疫测定、间接免疫荧光测定、直接免疫荧光测定、包绕光纤免疫测定(SOFIA)、分光光度法、放射线照相术、电泳、免疫电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、高扩散色谱、流体或凝胶沉淀反应、免疫扩散、光谱测定、质谱、定量质谱、任何类型的多重测定以及任何类型的微流体测定。

本文提供的H1.0K180me2抗体可以缀合至标记(例如缀合至标记)，例如可检测标记、旋转标记、比色标记、放射性标记、酶标记、荧光标记或磁性标记。

本文提供的H1.0K180me2抗体可以与可检测标记缀合。可检测基团可以是具有可检测的物理或化学特性的，例如可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、荧光、电、光学或化学方法检测的任何材料。本公开文本中的可用标记包括但不限于磁珠(例如

)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、红色、罗丹明等)、放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，LacZ、CAT、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及通常用作可检测酶的其他酶，无论用作标记物基因产物还是用在ELISA中)、生物素、抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白和比色标记，诸如胶体金色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠和纳米颗粒。在示例性实施方案中，生物素是所述标记。

本文提供的标记可根据本领域熟知的方法直接或间接地偶联至所需的测定组分。如上所指示，可使用广泛多种的标记，其中标记的选择取决于所需要的灵敏度、化合物缀合的容易性、稳定性要求、可用仪表以及处置规定。标记经常通过间接方法附接。通常，配体分子(例如生物素)与所述分子共价结合。然后配体与抗配体(例如链霉抗生物素蛋白)分子结合，所述抗配体分子具有固有可检测性或与信号系统(如可检测酶、荧光化合物或化学发光化合物)共价结合。可使用许多配体和抗配体。当配体具有天然抗配体时(例如生物素)，其可与标记的天然存在的抗配体结合使用。可替代地，任何半抗原或抗原化合物可与抗体组合使用。例如通过与酶或荧光团缀合，组分还可直接缀合至信号产生化合物。作为标记的感兴趣的酶包括但不限于水解酶、磷酸酶、酯酶、糖苷酶或氧转录因子还原酶和过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光化合物包括荧光素和2,3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。

检测标记的方法是本领域技术人员熟知的。因此，例如，当标记是放射性标记时，检测方法包括闪烁计数器或照相胶片(如在放射自显影中)。当标记是荧光标记时，可通过用适当波长的光激发荧光染料并且例如通过显微镜检查、目视检查、通过照相胶片、通过使用电子检测器诸如电荷耦合设备(CCD)或光电倍增管等检测所得荧光来进行检测。类似地，可通过为酶提供适当底物并检测所得反应产物来检测酶标记。最后，可通过观察与标记相关的颜色简单地检测简单的比色标记。因此，在各种油尺测定中，缀合的金经常呈现粉红色，而各种缀合的珠粒呈现珠粒的颜色。

在检测时，可定量特定级分中H1.0K180me2的浓度，例如定量细胞内级分、可溶性和染色质结合级分或细胞质级分中的H1.0K180me2。例如，细胞质级分中H1.0K180me2浓度的增加指示细胞的衰老状态。在一些实施方案中，对完整细胞、培养物中的细胞或切片培养物中的细胞进行成像以可视化H1.0K180me2的定位。例如，H1.0K180me2的非核子定位的增加指示衰老状态。在一些实施方案中，H1.0K180me2释放到胞质液或细胞外基质中指示衰老状态。

可以对任何生物样品进行检测。生物样品包括但不限于源自个体的全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液、淋巴液或其级分。在一些实施方案中，生物样品包含细胞并且所述细胞处于培养物中、悬浮液中、载玻片上、完整组织中、或准备好用于FAC分析的制剂中。

从个体获得生物样品。如本文所用，个体是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园、体育或宠物动物，诸如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。个体可以是雄性或雌性。在一些实施方案中，所述个体是雌性。在一些实施方案中，所述个体是雄性。

在本文提供的诊断方法中，所述个体可以是任何年龄。在进行阿尔茨海默病检测的一些实施方案中，所述个体可以大于50岁。在本文所述方法的一些实施方案中，所述个体小于50岁。在本文所述方法的一些实施方案中，所述个体为至少50岁、至少55岁、至少60岁、至少65岁、至少70岁、至少75岁或至少80岁。在示例性实施方案中，所述个体为至少60岁。

根据本领域技术人员熟知的标准方法获得生物样品。如果需要，则任选地根据需要通过在适当缓冲溶液中稀释或浓缩来预处理样品。可使用许多标准水性缓冲溶液中的任一种，其采用在生理pH下的各种缓冲液(诸如磷酸盐、Tris等)中的一种。

本文所述的直接检测方法可用于定量生物样品中H1.0K180me2的浓度。在一些实施方案中，H1.0K180me2蛋白或肽可串联使用，例如，作为竞争性免疫测定中的阳性对照或竞争剂，并且取决于待进行的测定形式可被标记或不标记。

技术人员将理解，在一些实施方案中，可能有必要将测定的H1.0K180me2抗原的浓度与对照(即参考对照)进行比较。相对比较可允许，例如，确定个体是否患有疾病(例如阿尔茨海默病)或处于发展疾病的风险中或者所述个体是否响应或可响应于特定治疗(例如阿尔茨海默病治疗；或用rapalogue进行的治疗)。对照可以是年龄匹配对照；性别匹配对照；年龄和性别匹配对照；健康对照；未经调整的控制；或代表参考标准汇编的参考标准。还可在治疗(例如阿尔茨海默病治疗或rapalogue治疗)之前或在暴露于例如基因毒素、DNA损伤剂或辐射之前对来自同一个体的样品进行比较。还可对来自未受影响区域(例如来自未受影响组织)的同一个体的样品进行比较。

技术人员将理解，经常需要减少免疫测定中和分析物检测期间的非特异性结合。当所述测定涉及固定在固体基底上的H1.0K180me2抗体时，可能需要最小化与所述基底非特异性结合的量。减少这种非特异性结合的方法是本领域技术人员已知的。通常，这涉及用蛋白质组合物包被基底。在一些实施方案中，可利用蛋白质组合物，诸如牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉和明胶。

可为每个诊断测试设计计算灵敏度、特异性、阳性和阴性预测值(PPV和NPV)以及阳性和阴性似然比(PLR和NLR)。统计方法有助于预测患者中疾病的存在与否。

灵敏度通常是当疾病存在时测试结果将是阳性的概率(真阳性率)。

特异性通常是当疾病不存在时测试结果将是阴性的概率(真阴性率)。

阳性预测值(PPV)通常是当测试是阳性时所述疾病存在的概率，考虑疾病的先期测试患病率(例如阿尔茨海默病的先期测试患病率是10％)。

阴性预测值(NPV)通常是当测试是阴性时所述疾病不存在的概率，考虑AD的先期测试患病率为10％(Prince,M.J.,Am J Epidemiol,1996)。

阳性似然比(LR+或PLR)通常是具有疾病测试阳性的人的概率除以不具有疾病测试阳性的人的概率。如果测试是阳性的，则阳性似然比(PLR)通常指示增加疾病概率的程度。PLR>1指示靶标病症存在的概率增加，PLR<1指示靶标病症存在的概率降低，并且PLR＝1意指所述测试不改变所述疾病的概率。

阴性似然比(LR-或NLR)通常是具有疾病测试阴性的人的概率除以不具有疾病测试阴性的人的概率。如果测试是阴性的，则阴性似然比(NLR)通常指示降低疾病概率的程度。

在一些实施方案中，将对为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值水平进行比较。针对本文提供的每个测试设计示出了ROC曲线、阈值和曲线下面积(AUC)。

在一些实施方案中，本文提供的诊断方法可用于确认测试，例如，明确地确认个体患有疾病，例如阿尔茨海默病。

在其他实施方案中，本文提供的诊断方法可用于其预测值(用于测试、筛选)，例如，确定个体将发展疾病(例如阿尔茨海默病)的可能性。在此类实施方案中，诊断可涉及似然比的计算。

在其他实施方案中，本文提供的诊断方法可用作伴随诊断。在此类实施方案中，诊断可涉及阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)的计算。

在一些实施方案中，本文提供的诊断方法可用于建立诊断优势比(OR)。在此类实施方案中，诊断可涉及灵敏度和特异性的计算，并且是诊断测试的有效性的量度。

本文提供的H1.0K180me2抗体可用于多种诊断目的，如下所讨论。

B.阿尔茨海默病的检测

本文提供了H1.0K180me2抗体(以确定H1.0K180me2水平)，用于筛选个体的阿尔茨海默病，用于鉴定个体是否处于发展阿尔茨海默病的风险中，用于估计个体是否将发展阿尔茨海默病的可能性，用于阿尔茨海默病的诊断，用于阿尔茨海默病的早期检测，用于阿尔茨海默病的预后，用于选择可能响应于用阿尔茨海默病药物或方案进行的阿尔茨海默病治疗的个体，用于诊断患有阿尔茨海默病的那些患者的治疗选择/确定诊断患有阿尔茨海默病的那些患者的治疗选项，用于监测诊断患有阿尔茨海默病并接受用阿尔茨海默病药物或方案进行的持续治疗的那些患者的治疗，或用于筛选阿尔茨海默病药物和方案。

与健康年龄匹配的健康对照相比，阿尔茨海默病患者显示出较低的H1.0K180me2浓度，这指示H1.0K180me2浓度可有效地从健康个体中分离患有阿尔茨海默病的患者(图10A)。尽管H1.0K180me2的血清浓度足以用于鉴定阿尔茨海默病患者，但使用由总IgG(图10B)或总蛋白(图10C)进行的血清样品归一化允许直接比较个体而不论可改变总体血清浓度的变量(诸如用于获得血清的方案、操作者可变性、患者的水化状态和患者的活动状态)如何。例如，观察到健康老年个体中的H1.0K180me2血清水平相对于健康年轻个体是升高的，而患有阿尔茨海默病的患者相对于健康老年个体(>60岁)展现出显著较低的H1.0K180me2归一化血清水平(图10B、10C)。

示例性方法，H1.0K180me2水平：更具体地，在一些实施方案中，本文提供了一种使用H1.0K180me2抗体以测定H1.0K180me2水平的方法，用于筛选阿尔茨海默病的个体、用于鉴定个体处于发展阿尔茨海默病的风险、估计个体是否将发展阿尔茨海默病的可能性、用于检测个体是否患有阿尔茨海默病、用于检测个体中阿尔茨海默病的早期征象以及用于个体中的阿尔茨海默病的预后，所述方法包括：(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2抗体接触；以及(b)确定所述样品中结合所述抗体的H1.0K180me2的浓度，其中相对于对照的浓度的降低指示所述个体患有阿尔茨海默病、处于发展阿尔茨海默病的风险中或具有发展阿尔茨海默病的更大的可能性，并且其中相对于对照的浓度的增加或没有变化可指示所述个体不患有阿尔茨海默病、没有发展阿尔茨海默病的风险或没有发展阿尔茨海默病的更大的可能性。对照包括但不限于健康对照(例如年龄匹配、性别匹配)、代表健康对照汇编的参考标准、或来自早期分离的同一个体的对照样品。在一些实施方案中，测定循环H1.0K180me2的浓度。在一些实施方案中，所述浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。在一些实施方案中，所述方法进一步包括如果确定个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗所述个体。

在相关的实施方案中，将本文提供的方法用于观察研究。观察研究的例子包括但不限于：(a)横断设计(单个时间点设计或时滞横断设计)-测试在单个时间点处收集的每个患者的一个或几个样品/样品；(b)纵向设计-测试在延长的时间段(例如数周、数月、数年)内收集的每个患者的多个样品/样品；(c)回溯设计-测试在所述研究开始之前先前收集的样品(表征的样品)，所述样品的分析物状态和患者临床状态是已知的；(d)勘察设计-测试在所述研究之前或期间收集的样品，但所述样品的分析物状态和患者临床状态两者在所述研究期间建立；以及(e)勘察-回溯设计-测试先前收集的样品，所述样品的临床状态是已知的但分析物状态是未知的且将在所述研究期间建立。

在相关的实施方案中，本文提供的方法旨在用于诊断阿尔茨海默病，其中所述方法可用于确定、验证或确认患者临床病症作为唯一决定因素。在这些实施方案中，这种类型的测试还包括单独的确认性测定(以验证先前测试的结果)和单独的排除测定(以排除特定病症)。

在相关的实施方案中，本文提供的方法旨在提供阿尔茨海默病的“辅助诊断”，其中所述方法可用于提供另外信息以帮助确定或验证患者临床状态。所述测试不一定是唯一决定因素，但可用于评估患者当前状态。

在相关的实施方案中，本文提供的方法旨在用于筛选阿尔茨海默病，其中所述方法可用于确定无症状个体中疾病、病症或其他生理状态的状态。取决于病症的性质和靶标患者群体，筛选方法可常规使用或可限于“处于风险中”的患者。在此背景下，本文所述的方法用于评估患者当前状态。

在相关的实施方案中，本文提供的方法旨在确定阿尔茨海默病的倾向，其中本文所述的方法可用于确定症状前患者中疾病发作的可能性(例如评估未来发展所述疾病的风险)，其中对于处于足够风险(如由测试结果确定)中的患者，可采取预防性干预。

在相关的实施方案中，本文提供的方法旨在用于阿尔茨海默病的预后，其中本文所述的方法可用于测量与临床结果相关的因素，而与治疗无关。本文所述的方法可用于估计疾病的自然进展(例如在不存在治疗的情况下的结果)，或者本文所述的方法被设计用于评估患者的未来状态。

在相关的实施方案中，本文提供的方法旨在用于确定老化群体的生理状态(“老化时钟”)，其中出于鉴定人的老化状况或特征或者伴老化的阿尔茨海默病的风险的目的，本文所述的方法可用于评估个体的生理状态。

在相关的实施方案中，H1.0K180me2抗原的定量和/或H1.0K180me2自身抗体的定量可用于提高阿尔茨海默病筛选、诊断或检测的置信度。

在相关的实施方案中，H1.0K180me2抗原的定量和/或H1.0K180me2自身抗体的定量可与其他脑脊液(CSF)测试(包括但不限于Aβ42、T-tau、p-tau、Aβ₄₂/T-tau比率和Aβ42/p-tau的测量)结合使用。

在相关的实施方案中，H1.0K180me2抗原的定量和/或H1.0K180me2自身抗体的定量可与认知状态测试(例如MMSE(简短精神状态检查)、GDS(总体恶化率)和CDR(临床痴呆评定)测试)的评估结合使用。

在相关的实施方案中，H1.0K180me2抗原的定量和/或H1.0K180me2自身抗体的定量可与神经影像学结合使用。

在本文所述方法的一些实施方案中，H1.0K180me2的水平可针对生物样品中的总IgG归一化或针对生物样品中的总蛋白质归一化。在本文所述方法的一些实施方案中，H1.0K180me2的浓度可确定为与非甲基化的标记的合成H1.0肽的相对比率。

在本文所述方法的实施方案中，所述个体大于50岁。在本文所述方法的一些实施方案中，所述个体小于50岁。在本文所述方法的一些实施方案中，所述个体为至少50岁、至少55岁、至少60岁、至少65岁、至少70岁、至少75岁或至少80岁。在示例性实施方案中，所述个体为至少60岁。

C.阿尔茨海默病的伴随诊断

本文还提供了H1.0K180me2抗体(以确定H1.0K180me2水平)，用于选择可响应于用阿尔茨海默病药物或方案进行的阿尔茨海默病治疗的个体的方法，用于被诊断患有阿尔茨海默病的那些患者的治疗选择/确定被诊断患有阿尔茨海默病的那些患者的治疗选项，用于监测被诊断患有阿尔茨海默病并接受用阿尔茨海默病药物或方案进行的持续治疗的那些患者的治疗，或用于筛选阿尔茨海默病药物和方案。

在这些实施方案中，这些阿尔茨海默病药物和方案/治疗包括但不限于用以下进行的治疗：APP合成抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂和调节剂、Aβ聚集抑制剂、Aβ免疫疗法、降胆固醇药物、抗tau药物、胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、非典型抗精神病药、蛋白质S-亚硝基化的阻断剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、雷帕霉素、rapalogue、内源性大麻素、大麻素、神经保护剂、控制钙内流的分子、抗氧化剂、抗炎药物、控制谷氨酸稳态控制的药物、自噬诱导剂、激素、激素调节剂、他汀类、胰岛素、胰岛素载体、多功能纳米载体、维生素、营养补充剂、小RNA分子、肽或超声疗法。更具体地，APP合成抑制剂(+苯羟基丙氨酸)、β-分泌酶抑制剂(MK-8931、E2609、LY2811376、LY2886721、PF-05297909)、γ-分泌酶抑制剂和调节剂(司马西特LY450139、avagacestat BMS-708163、PF-3084014、ELND006、tarenflurbil、CHF5074)、Aβ聚集抑制剂(tramiprosate(3APS)、氯碘羟喹(PBT1)、PBT2、ELND005(鲨肌醇)、PQ912)、Aβ免疫疗法(GSK933776、AN1802+QS21、ACC-001、阿尔茨海默病-106、巴匹珠单抗、索拉珠单抗、Gantenerumab(RO4909832)、Ponezumab(PF-04360365)、MABT5102A(crenezumab)、BAN2401、静脉注射免疫球蛋白、gantenerumab(R1450或RO4909832))、抗tau药物(锂、Tideglusib(NP031112)、LMTX(亚甲基蓝))、胆碱酯酶抑制剂(

(加兰他敏)、

(雷司替明)和

(多奈哌齐)、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂(

和

和多奈哌齐的组合)、非典型抗精神病药(奥氮平、喹硫平、利培酮)、蛋白质S-亚硝基化的阻断剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、雷帕霉素和rapalogue、内源性大麻素和大麻素、神经保护剂、控制钙内流的分子、抗氧化剂(维生素E、维生素C、α-硫辛酸、辅酶Q)、抗炎分子和药物、控制谷氨酸稳态控制的药物、自噬诱导剂、激素和激素调节剂、他汀类、胰岛素和胰岛素载体(包括鼻内胰岛素、长效胰岛素和沙利度胺)、雷米普利、白藜芦醇、多功能纳米载体、维生素和营养补充剂、小RNA分子、肽和超声疗法。在一些实施方案中，阿尔茨海默病药物和方案在申请FDA的批准，选自FDA注册的药物批准临床试验列表，其可在美国食品和药物管理局的万维网地址获得。

示例性方法，H1.0K180me2水平：在一些实施方案中，本文提供了一种使用H1.0K180me2抗体用于确定被诊断患有阿尔茨海默病的个体是否接受持续治疗、是否将受益于或继续受益于所述持续治疗的方法，其包括：(a)提供来自正在接受持续治疗的个体的生物样品；(b)使所述生物样品与H1.0K180me2抗体接触；(c)测定所述样品中结合所述抗体的H1.0K180me2的浓度；以及(d)选择将受益于或继续受益于治疗的个体，其中所述浓度相对于对照增加指示所述个体将受益于或继续受益于治疗，并且其中所述浓度相对于对照降低或没有变化可能指示所述个体可能将不受益于或不继续受益于或响应于所述治疗。对照包括但不限于来自未接受治疗的患有阿尔茨海默病的个体的样品，或来自在治疗开始之前早期分离的同一个体的对照样品。在一些实施方案中，测定循环H1.0K180me2的浓度。在一些实施方案中，所述浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。

本文还提供了一种使用H1.0K180me2抗体的方法，用于诊断患有阿尔茨海默病的个体的治疗选择，用于确定诊断患有阿尔茨海默病的个体的治疗选项，以及用于确定谁可受益于特定治疗。在一些实施方案中，所述方法包括：(a)在治疗个体的阿尔茨海默病之前，提供来自所述个体的生物样品；(b)使所述生物样品与候选治疗接触；(c)使所述生物样品与H1.0K180me2抗体接触；(d)测定所述样品中结合所述抗体的H1.0K180me2的浓度和/或亚细胞定位；以及(e)选择可能受益于所述治疗的个体，其中相对于对照，所述浓度增加或细胞质亚细胞定位减少指示所述个体可受益于治疗，并且其中相对于对照，所述浓度降低或没有变化或者细胞质亚细胞定位增加或没有变化可指示所述个体将不受益于治疗。在另一个实施方案中，所述方法包括：(a)向个体给予候选治疗；(b)在给予所述治疗之后，提供来自所述个体的生物样品；(c)使所述生物样品与H1.0K180me2抗体接触；(d)测定所述样品中结合所述抗体的H1.0K180me2的浓度和/或亚细胞定位；以及(e)选择可能受益于所述治疗的个体，其中相对于对照，所述浓度增加或细胞质亚细胞定位减少指示所述个体可受益于治疗，并且其中相对于对照，所述浓度降低或没有变化或者细胞质亚细胞定位增加或没有变化可能指示所述个体将不受益于治疗。对照可包括但不限于来自健康个体的样品，或使所述生物样品与安慰剂治疗接触。在一些实施方案中，测定循环H1.0K180me2的浓度。在一些实施方案中，所述浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。

在相关的实施方案中，本文提供的方法可用于确保H1.0K180me2水平保持在生理水平内或在建立的治疗药物范围内。

在相关的实施方案中，本文提供的方法可用于监测阿尔茨海默病，其中出于根据需要调整治疗/干预的目的，所述方法可用于测量H1.0K180me2水平。在相关的实施方案中，本文提供的方法可用于监测接受这种治疗的个体中阿尔茨海默病药物或营养方案或生活方式调整的影响。

在相关的实施方案中，本文提供的方法可用于监测阿尔茨海默病的任何观察性或介入性临床研究中的临床表现，其中(a)观察性研究是指其中所述研究期间获得的测试结果不用于患者管理并且不影响治疗决策的研究；和(b)介入性研究是其中所述研究期间获得的测试结果可影响患者管理决策并可用于指导治疗的研究。

在相关的实施方案中，本文提供的方法可用于连续测量，由此随时间进行多次测定。这些类型的监测方法可用于检测/评估疾病进展/消退、疾病复发、最小残留疾病、对治疗的响应/抗性、和/或由治疗引起的不良作用。可设计这些类型的监测方法以评估个体状态的变化。

在相关的实施方案中，本文提供的方法可用于预测阿尔茨海默病治疗响应或反应，其中本文所述的方法可用于测量确定患者对特定疗法的响应或不良反应的可能性的因素。本文描述了专门设计用作伴随诊断的预测方法。

在相关的实施方案中，所述方法可用于筛选新的阿尔茨海默病药物和方案。

D.衰老的检测

本文提供了H1.0K180me2抗体，用于检测衰老。如本文所提供的，衰老与复制性衰老(REP-SEN)、基因毒性应激诱导的衰老和辐射诱导的衰老相关。

通常，用于检测衰老的方法涉及直接检测H1.0K180me2。对于直接检测H1.0K180me2，所述方法通常包括(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180m e2抗体接触；和(b)测定所述样品中结合所述抗体的H1.0K180me2抗原的浓度，其中所述浓度相对于对照增加指示所述生物样品包含衰老细胞。在一些实施方案中，所述浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。

在一些实施方案中，所述方法可用于鉴定已经历由基因毒素诱导的衰老的个体。在一些实施方案中，基因毒性应激诱导的衰老是个体暴露于DNA损伤剂、药物或毒素(例如辐射、UV-光、博来霉素和任何其他基因毒性药物(包括但不限于曲唑酮、Etotifen、头孢氨苄、尼索地平(Nisoldipme)、CGS 15943、克霉唑、5-壬基色胺、多虑平、培高利特(Pergolide)、帕罗西汀、白藜芦醇、槲皮素、和厚朴酚、7-硝基吲唑、甲地孕酮、氟伏沙明、依托泊苷、维利帕尼(Veliparib)、鲁卡帕尼(Rucaparib)、奥拉帕尼、喜树碱或特比萘芬以及一般的化学治疗药物))的结果。

在一些实施方案中，所述方法可用于鉴定经历化学疗法治疗的个体的衰老，以确保化学疗法是有效的。这些实施方案中的化学治疗剂可选自：阿仑单抗(Campath)、阿利维生素A酸(Panretin)、别嘌呤醇(Zyloprim)、六甲蜜胺(Hexalen)、氨磷汀(Ethyol)、阿那曲唑(Arimidex)、三氧化二砷(Trisenox)、天冬酰胺酶(Elspar)、活BCG(TICE BCG)、贝沙罗汀(Targretin)、博来霉素(Blenoxane)、白消安静脉注射(Busulfex)、白消安口服(Myleran)、卡普睾酮(Methosarb)、卡培他滨(Xeloda)、链脲霉素(Zanosar)、Tale(Sclerosol)、他莫昔芬(Nolvadex)、替莫唑胺(Temodar)、替尼泊苷、VM-26(Vumon)、睾内酯(Teslac)、硫鸟嘌呤、6-TG(硫鸟嘌呤)、噻替派(Thioplex)和拓扑替康(Hycamtin)。

E.DNA损伤的检测

本文提供了H1.0K180me2抗体，其用于检测DNA损伤，例如急性DNA损伤。

如上所述，在DNA损伤剂的背景下，在用化学治疗剂博来霉素进行的急性DNA损伤后，在染色质上观察到H1.0K180的二甲基化(H1.0K180me2)(图11A)。如上所述，在基因毒性应激的背景下，H1.0K180me2在基因毒性应激诱导的衰老后(在用DNA损伤剂处理后数天)从染色质中释放(图12A)，并从细胞分泌到细胞外空间中(图12B)。

通常，用于检测DNA损伤的方法涉及直接检测H1.0K180me2。对于直接检测H1.0K180me2，所述方法通常包括(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2抗体接触；和(b)测定所述样品中结合所述抗体的H1.0K180me2抗原的浓度，其中所述浓度相对于对照增加指示所述生物样品已经历了DNA损伤。在一些实施方案中，所述浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。

在一些实施方案中，DNA损伤是细胞或个体暴露于DNA损伤剂、药物或毒素(例如辐射、博来霉素或其他DNA损伤剂(例如上文讨论的化学治疗药物))的结果。

在一些实施方案中，所述方法可用于在这种基因毒素或DNA损伤剂暴露5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、24小时、48小时、3天、4天或最多5天内测定DNA损伤。

在一些实施方案中，本文提供了一种用于检测DNA损伤的便携式单元。所述单元可包括样品收集单元、读取器和包含H1.0K180me2抗体的测定模块。

F.辐射暴露的检测

本文提供了H1.0K180me2抗体，其用于检测辐射暴露。

通常，用于检测辐射暴露的方法涉及直接检测H1.0K180me2。对于直接检测H1.0K180me2，所述方法通常包括(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2抗体接触；和(b)测定所述样品中结合所述抗体的H1.0K180me2抗原的浓度，其中所述浓度相对于对照增加指示已发生了辐射暴露。在一些实施方案中，所述浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。在一个示例性实施方案中，在7Gy X射线暴露后2小时后H1.0 K170me2抗原浓度的变化为从12umol/L至21umol/L，并且在48小时后为从26umol/L至35umol/L。

在一些实施方案中，所述方法可用于在这种暴露5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、24小时、48小时、3天、4天或最多5天内测定辐射暴露。

在一些实施方案中，所述方法可用于确定军事人员在野战情况下(例如在战斗区中)的这种暴露。

在一些实施方案中，本文提供了一种用于检测辐射损伤的便携式单元。所述单元可包括样品收集单元、读取器和包含H1.0K180me2抗体的测定模块。

G.H1.0K180me2和Rapalogue

雷帕霉素(mTOR)的哺乳动物靶标已成为一种有前途的治疗靶标。雷帕霉素和一些雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物以及其他mTOR抑制剂是FDA批准用于治疗某些疾病状态的药物。

诸位发明人发现H1.0K180me2的检测可用于筛选个体对雷帕霉素、雷帕霉素衍生物、雷帕霉素类似物以及其他mTOR抑制剂(统称为“rapalogue”)的响应性，并且可用于监测基于rapalogue的治疗方案。诸位发明人还发现H1.0K180me2的检测可用于药物筛选目的，用于筛选另外的rapalogue。具体地，这里示出雷帕霉素衍生物和免疫抑制剂依维莫司在DNA损伤后阻断H1.0K180me2的出现(图14)。还观察到，在基因毒性应激暴露之前或与之同时，用rapalogue进行治疗可减轻基因毒性应激物的作用，如通过H1.0K180me2的浓度和/或亚细胞定位的变化所证明。

如本文所用，rapalogue包括FDA批准的rapalogue，以及目前正在经历临床试验的那些rapalogue。FDA批准的rapalogue包括雷帕霉素、西罗莫司、雷帕鸣、依维莫司、RAD001、飞尼妥、Zortress、坦罗莫司、CCI-779、驮瑞塞尔、地磷莫司、AP23573、MK-8669、Deforolimus、佐他莫司和ABT-578。其他Rapalogue AZD8055、AZD2014、OSI-027、MLN0128、WYE-132、Torin1、PI-103、P7170、PF-04691502、PF-05212384、PKI-587、GNE477、PKI-180、WJD008、XL765、SAR245409、NVP-BEZ235、BGT226、SF1126、GSK2126458、Ku-0063794、WYE-354、NVP-BEZ235、PF-05212384、XL765、Torin 2、WYE-125132和OSI-027。

本文总体上提供了一种用于监测正在诊断患有癌症、免疫缺陷、糖尿病、关节炎、阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫疾病和其他年龄相关病理的个体中进行的基于rapalogue的治疗的效果的方法。

因此，在一些实施方案中，本文提供了一种确定接受用rapalogue进行的治疗的个体是否响应于这种治疗的方法，其包括：(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2抗体接触；(b)测定所述样品中结合所述抗体的H1.0K180me2的浓度和/或定位；以及(c)确定所述个体是否响应于治疗，其中相对于对照，所建立浓度降低或定位改变指示所述个体响应于rapalogue。在一些实施方案中，如果H1.0K180me2的细胞外浓度相对于对照增加，则确定rapalogue治疗无效或需要修改。在一些实施方案中，如果H1.0K180me2的细胞质定位相对于对照增加，则确定rapalogue治疗无效或需要修改。在一些实施方案中，所述减少是相对于年龄匹配对照，其未被诊断患有要给予rapalogue的相关疾病。在一些实施方案中，如果H1.0K180me2蛋白的细胞外或细胞质浓度相对于对照降低，则确定所述治疗有效并应继续。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使用所述信息来修改治疗类型、疗程、持续时间和/或剂量。在一些实施方案中，测定循环H1.0K180me2的浓度。在一些实施方案中，所述浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。

在一些实施方案中，本文提供了一种用于选择诊断患有或怀疑患有癌症、免疫缺陷、糖尿病、阿尔茨海默病和其他神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫疾病、关节炎和其他年龄相关病理的，可能受益于rapalogue治疗的个体，或确定个体是否可响应于用rapalogue进行的治疗的方法。在一些实施方案中，此方法包括提供来自所述个体的生物样品；在体外、离体、切片培养或组织培养中用rapalogue处理所述样品；以及测定所述样品中H1.0K180me2的浓度和/或亚细胞定位。在一些实施方案中，通过使用H1.0K180me2抗体测量样品中H1.0K180me2的浓度来测定H1.0K180me2的浓度。在一些实施方案中，如果H1.0K180me2的细胞质或细胞外浓度相对于对照增加，则确定rapalogue治疗可能无效。在一些实施方案中，如果H1.0K180me2的细胞质定位相对于对照增加，则确定rapalogue治疗可能无效。在一些实施方案中，所述减少是相对于年龄匹配对照，其未被诊断为个体可接受rapalogue治疗的疾病。在一些实施方案中，如果相对于对照，H1.0K180me2蛋白的细胞质或细胞外浓度降低，则确定所述治疗可能有效。在一些实施方案中，所述浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。

在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括使用所述信息来修改治疗类型、疗程、持续时间和/或剂量。

在其他实施方案中，本文提供了H1.0K180me2检测的用途，用于监测待鉴定的新rapalogue的能力(药物筛选应用)。

H.生物老化的检测

本文提供了H1.0K180me2抗体，其用于检测生物老化。如本文所提供的，预期生物老化标记物或老化的生物标记物将在生物学研究中发现许多用途，因为年龄是大多数生物体的基本特征。

在实足年龄与生物学年龄之间可能存在差异。一些个体老化更快速，而其他个体由于良好的习惯、基因和/或缺乏环境应激，老化更缓慢，从而使他们更长时间地更健康并且“看起来更年轻”。能够跟踪一个人的生物学年龄可能有助于改变生活方式(类似于跟踪身体质量指数)或有助于部署抗衰老程序。

通过老化标记物精确测量生物学年龄可用于测试生物老化的年龄相关疾病理论，诸如(i)诊断各种年龄相关疾病和定义癌症亚型，(ii)预测/预后诊断各种疾病的发作，以及用作(iii)用于评估治疗干预(包括再生方法)的替代标记物。

通常，用于检测生物老化的方法涉及直接检测H1.0K180me2。对于直接检测H1.0K180me2，所述方法通常包括(a)使来自个体的生物样品与H1.0K180me2抗体接触；和(b)测定所述样品中结合所述抗体的H1.0K180me2抗原的浓度，其中所述浓度相对于对照增加指示所述生物样品来自已经历了生物老化的个体。在一些实施方案中，所述浓度的变化是相对于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。

K.诊断试剂盒和制品

本文提供了可用于检测H1.0K180me2的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含一种或多种如本文所述的H1.0K180me2抗体。在某些实施方案中，所述抗体。此外，所述试剂盒可任选地包括用于进行本文所述任何方法的说明材料。虽然所述说明材料通常包含书写或印刷材料，但其并不限于此。本文涵盖了能够存储这种说明并将其传达给终端用户的任何媒介。此类媒介包括但不限于电子存储媒介(例如，磁盘、磁带、磁片盒、芯片)、光学媒介(例如，CD ROM)等。此类媒介可包括提供这种说明材料的互联网站的网址。

所述试剂盒还可包括另外组分以促进设计试剂盒所为的特定应用。因此，例如，当试剂盒含有被标记的抗H1.0K180me2时，所述试剂盒可另外含有用于检测所述标记的试剂(例如，用于酶标记的酶底物、用于检测荧光标记的滤光镜组、适当的二级标记等)。所述试剂盒可另外包括缓冲剂和常规用于实施特定方法的其他试剂。

可用于免疫测定以检测H1.0K180me2的示例性试剂盒可包括H1.0K180me2蛋白或肽。此肽可例如用作竞争性免疫测定中的阳性对照或竞争剂，并且取决于待进行的测定形式可被标记或不标记。

除抗H1.0K180me2肽之外，可用于免疫测定以检测H1.0K180me2的另一种示例性试剂盒可包括H1.0K180me2抗体。此抗体可例如用作竞争性免疫测定中的阳性对照或竞争剂，并且取决于待进行的测定形式可被标记或不标记。

本文还提供了用于测量皮下靶标H1.0K180me2蛋白和肽浓度的透皮贴剂，其包含：包含H1.0K180me2抗体的基底；和多个微针。在一些实施方案中，所述贴剂是透皮微针阵列贴剂。在一些实施方案中，所述贴剂的基底是可弹性拉伸的。在一些实施方案中，本文提供了包含贴剂(其包含本文提供的抗体或肽)以及任选的使用说明的试剂盒。在一些实施方案中，所述贴剂可用于检测和测量生物样品中H1.0K180me2抗体的浓度(出于检测复制性衰老、DNA损伤、基因毒性应激、辐射暴露和阿尔茨海默病的目的)，可用于监测治疗方案，和可用于药物筛选。

本文还提供了一种便携式单元，其用于检测，例如用于检测DNA损伤或辐射暴露。所述单元可包括样品收集单元、读取器和包含H1.0K180me2抗体的测定模块。

本文还提供了适用于分析物的侧向流测定的侧向流条或测试条，其包含样品接收区，其中所述样品接收区包含H1.0K180me2抗体。在一些实施方案中，所述抗体与标记缀合。

列举的实施方案

可以通过参考以下列举的说明性实施方案来定义本发明。

实施方案1.一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的抗原结合结构域包含：

-表4的CDR-L1氨基酸序列中的任一个；

-表5的CDR-L2氨基酸序列中的任一个；和

-表6的CDR-L3氨基酸序列中的任一个。

实施方案2.一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的抗原结合结构域包含：

-表7的CDR-H1氨基酸序列中的任一个；

-表8的CDR-H2氨基酸序列中的任一个；和

-表9的CDR-H3氨基酸序列中的任一个。

实施方案3.一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的抗原结合结构域包含表4、5和6的CDR-L氨基酸序列中的任一个，并且包含表7、8和9的CDR-H氨基酸序列中的任一个。

实施方案4.根据实施方案1所述的抗体，其中所述抗体的抗原结合结构域包含

-CDR-L1，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；

-CDR-L2，其包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和

-CDR-L3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。

实施方案5.根据实施方案1所述的抗体，其中所述抗体的抗原结合结构域包含

-CDR-H1，其包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23的氨基酸序列；

-CDR-H2，其包含SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31的氨基酸序列；和

-CDR-H3，其包含SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的氨基酸序列。

实施方案6.一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

实施方案7.一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的重链可变结构域包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

实施方案8.一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的重链可变结构域包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及所述抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

实施方案9.根据实施方案8所述的抗体，其中所述抗体的重链可变结构域包含SEQID NO:6的氨基酸序列，以及所述抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

实施方案10.根据实施方案8所述的抗体，其中所述抗体的重链可变结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及所述抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

实施方案11.根据实施方案1至10中任一项所述的抗体，其中所述抗体是嵌合的或人源化的。

实施方案12.根据实施方案1至10中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

实施方案13.根据实施方案1至10中任一项所述的抗体，其中所述抗体是抗原结合片段。

实施方案14.根据实施方案1至13中任一项所述的抗体，其中如果H1.0K180me2蛋白或肽包含除K180以外的甲基化残基，则所述抗体展现出与所述蛋白或肽的结合降低。

15.根据实施方案1至14中任一项所述的抗体，其中如果H1.0K180me2蛋白或肽在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K166、K172、K174、K175和/或K177的赖氨酸残基处包含甲基化赖氨酸残基，则所述抗体不结合或仅最低限度结合。

实施方案16.根据实施方案1至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体与标记缀合。

实施方案17.根据实施方案16中任一项所述的抗体，其中所述抗体附接至固体表面。

实施方案18.根据实施方案17所述的抗体，其中所述抗体附接珠、柱、树脂或微板。

实施方案19.根据实施方案1至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体与药剂缀合。

实施方案20.根据实施方案19所述的抗体，其中所述药剂选自：放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA和二抗。

实施方案21.一种确定个体是否患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中的方法，所述方法包括：

-使来自所述个体的生物样品与根据实施方案1至18中任一项所述的抗体接触；和

-测定所述样品中与所述抗体结合的包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质的浓度，其中所述浓度相对于对照降低指示所述个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。

实施方案22.根据实施方案21所述的方法，其进一步包括如果确定所述个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗所述个体。

实施方案23.一种确定被诊断患有阿尔茨海默病并接受阿尔茨海默病治疗的个体是否将受益于所述治疗或将继续受益于所述治疗的方法，所述方法包括：

-确定所述样品中与所述抗体结合的包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质的浓度；和

-如果所述浓度相对于对照增加，则确定所述个体将受益于所述治疗或将继续受益于所述治疗。

实施方案24.根据实施方案23所述的方法，其进一步包括如果确定所述个体将受益于或继续受益于所述治疗，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗所述个体。

实施方案25.一种确定被诊断患有阿尔茨海默病的个体是否将受益于候选治疗的方法，其中所述个体尚未开始所述治疗，所述方法包括：

-向所述个体给予候选治疗；

-在给予所述候选治疗后，使来自所述个体的生物样品与根据实施方案1至18中任一项所述的抗体接触；和

-确定所述样品中与所述抗体结合的包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质的浓度和/或亚细胞定位；和

-如果相对于对照所述浓度增加或细胞质亚细胞定位减少，则确定所述个体将受益于所述候选治疗。

26.一种确定被诊断患有阿尔茨海默病的个体是否将受益于候选治疗的方法，其中所述个体尚未开始所述治疗，所述方法包括：

-使来自所述个体的生物样品与候选治疗接触；

-使来自所述个体的生物样品与根据实施方案1至18中任一项所述的抗体接触；

-如果所述浓度相对于对照增加或细胞质亚细胞定位相对于对照减少，则确定所述个体将受益于所述候选治疗。

实施方案27.根据实施方案25-26中任一项所述的方法，其中所述治疗选自：APP合成抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂和调节剂、Aβ聚集抑制剂、Aβ免疫疗法、降胆固醇药物、抗tau药物、胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、非典型抗精神病药、蛋白质S-亚硝基化的阻断剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、雷帕霉素、rapalogue、内源性大麻素、大麻素、神经保护剂、控制钙内流的分子、抗氧化剂、抗炎药物、控制谷氨酸稳态控制的药物、自噬诱导剂、激素、激素调节剂、他汀类、胰岛素、胰岛素载体、多功能纳米载体、维生素、营养补充剂、小RNA分子、肽和超声疗法。

实施方案28.一种确定个体是否已暴露于DNA损伤剂的方法，其包括：-使来自所述个体的生物样品与根据实施方案1至18中任一项所述的抗体接触；和

-测定所述样品中与所述抗体结合的包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质的浓度，其中所述浓度相对于对照增加指示所述个体已暴露于DNA损伤剂。

实施方案29.根据实施方案28所述的方法，其中所述DNA损伤剂是辐射。

实施方案30.一种确定接受用rapalogue进行的治疗的个体是否响应于这种治疗的方法，其包括：

-确定所述个体是否响应于治疗，其中所述浓度相对于对照降低指示所述个体是响应的。

实施方案31.根据实施方案30所述的方法，其中所述降低低于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。

实施方案32.根据实施方案30所述的方法，其中所述rapalogue选自：雷帕霉素、西罗莫司、雷帕鸣、依维莫司、RA 001、飞尼妥、Zortress、坦罗莫司、CCI-779、驮瑞塞尔、地磷莫司、AP23573、MK-8669、Deforolimus、佐他莫司、ABT-578、AZD8055、AZD2014、OSI-027、MLN0128、WYE-132、Torin1、PI-103、P7170、PF-04691502、PF-05212384、PKI-587、GNE477、PKI-180、WJD008、XL765、SAR245409、NVP-BEZ235、BGT226、SF1126、GSK2126458、Ku-0063794、WYE-354、NVP-BEZ235、PF-05212384、XL765、Torin 2、WYE-125132和OSI-027。

实施方案33.根据实施方案21至32中任一项所述的方法，其中所述浓度的增加或降低高于或低于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。

实施方案34.根据实施方案21至33中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自：全血、血浆、血清、唾液、尿液、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液和淋巴液。

实施方案35.一种用于测量皮下靶分子浓度的透皮贴剂，其包含：

-包含根据实施方案1至18中任一项所述的抗体的基底；和

-多个微针。

实施方案36.根据实施方案35所述的贴剂，其中所述贴剂是透皮微针阵列贴剂。

实施方案37.根据实施方案35所述的贴剂，其中所述基底是可弹性拉伸的。

实施方案38.一种用于确定个体是否已暴露于辐射或DNA损伤剂的便携式单元，其包括：

-样品收集单元；

-读取器；

-包含根据实施方案1至18中任一项所述的抗体的测定模块；和

-多个微针。

实施方案39.一种适用于分析物的侧向流测定的测试条，其包含样品接收区，其中所述样品接收区包含根据实施方案1至18中任一项所述的抗体。

实施方案40.一种治疗个体中甲基化H1.0相关疾病或病症的方法，所述方法包括向所述个体给予治疗有效量的根据实施方案1至20中任一项所述的抗体。

实施方案41.根据实施方案40所述的方法，其中所述疾病或病症选自：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒性应激物暴露、包含衰老细胞积聚的疾病或病症、以及伴随H1.0K180me2蛋白或肽水平升高的疾病或病症。

实施方案42.一种清除个体中H1.0K180me2的方法，所述方法包括向所述个体给予治疗有效量的根据实施方案1至20中任一项所述的抗体。

实施方案43.根据实施方案42所述的方法，其中所述个体患有选自以下的疾病或病症：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒素暴露、DNA损伤剂暴露、以及包含衰老细胞积聚的病症。

实施方案44.一种药物组合物，其包含根据实施方案1至20中任一项所述的抗体和药学上可接受的赋形剂。

实施方案45.一种试剂盒，其包含治疗有效量的根据实施方案1至18中任一项所述的抗体中的任一种。

实施方案46.一种制品，其包含根据实施方案1至20和35至45所述的组合物中的任一种。

实施方案47.一种编码与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体的载体，其包含SEQ ID NO:4的核酸。

实施方案48.一种编码与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体的载体，其包含SEQ ID NO:5的核酸。

实施方案49.一种细胞，其包含根据实施方案47至48中任一项所述的载体。

包括以下实施例用于说明性目的，而不旨在限制本发明的范围。

实施例

实施例1：重组抗体开发流程

将图1所示的抗体开发流程分为四个阶段(阶段I-IV)。在阶段I中，将两只新西兰兔免疫以进行抗体生产。将注射剂作为在完全弗氏佐剂(CFA)或不完全弗氏佐剂(IFA)中的钥孔戚血蓝蛋白(KLH)缀合的H1.0K180me2肽(KLH-CAKPVKASKPKKAKPVK(me2)PK(SEQ IDNO:72))的乳剂皮下(SQ)给予。在10个SQ部位处用0.5mg于CFA中的抗原((KLH)缀合的H1.0K180me2肽)进行初始免疫。在10-11周的时间内以常规间隔进行6次随后的加强免疫。4个SQ部位处的加强剂由0.25mg于IFA中的抗原组成。在第6周和第8周对兔进行放血。通过比较免疫前和免疫后血液，使用ELISA评估免疫效价。一旦记录了针对免疫抗原的适当ELISA阳性效价，便从一只或两只兔收集外周血单核细胞(PBMC)。随后使用双重筛选方案通过流式细胞术分离B细胞，所述方案确保仅分离兔lgG和抗原特异性B细胞。

在阶段II期间，从分选的抗原阳性B细胞中分离总RNA。随后通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)创建单链可变片段(scFv)表面展示文库。此scFv文库代表了能够结合H1.0K180me2抗原的兔IgG抗体的所有可变结构域区。

阶段III由多轮文库筛选组成，以提高文库对H1.0K180me2的特异性。这是通过淘选和流式细胞术完成的，以分离对生物素缀合的H1.0K180me2肽(生物素-CAKPVKASKPKKAKPVK(me2)PK(SEQ ID NO:73))展现出最高特异性的scFv结构域，同时选择对未甲基化H1.0肽(生物素-CAKPVKASKPKKAKPVKPK(SEQ ID NO:74))展现出特异性的scFv结构域。

在移至阶段IV之前，通过Sanger测序，对于对H1.0K180me2具有最高特异性的scFv结构域进行测序。在阶段IV期间，产生了掺入scFv结构域的全长IgG重链和轻链克隆，然后表达了竞争性全长重组兔单克隆IgG抗体。然后使用ELISA、狭缝印迹免疫测定和蛋白质印迹验证这些抗体对H1.0K180me2的特异性。总共创建了5个不同的抗体克隆，按照它们对H1.0K180me2的特异性排序，分类为以下A到E：

(a)克隆A(RW24)

(b)克隆B(RW6)

(c)克隆C(RW37)

(d)克隆D(RW28)

(e)克隆E(RW36)

阶段I-IV总结于下表11中。

表11：H1.0K180me2单克隆抗体-示例性开发流程

实施例2：通过ELISA分析兔抗体克隆的抗体效价

使用ELISA确定重组兔抗H1.0K180me2单克隆IgG抗体克隆对H1.0K180me2肽的特异性，如图2A所示。用H1.0K180me2肽包被孔；用50ul的肽溶液(5ug/ml)包被每个孔。将100ul的每种克隆抗体以2X稀释系列添加到孔中。通过将抗体浓度相对于450nm处测量的O.D作图来产生每种肽的曲线。为了直接比较不同克隆的结合效率，选择了一个阈值截止值，所述阈值截止值(O.D.1.5处的水平虚线)与每个克隆滴定曲线的线性范围相交。对每个克隆，将满足阈值所需的抗体的浓度进行比较，并且在图例中给出。克隆A(RW24)对H1.0K180me2肽具有最高的结合亲和力。

抗体克隆与未修饰的H1.0肽的非特异性结合也如上通过ELISA确定，如图2B所示。克隆D(RW28)和E(RW36)都以高亲和力与未修饰的H1.0肽结合。在上述计算的阈值浓度下，克隆A(RW24)结合H1.0K180me2肽的效率为结合未修饰的H1.0肽的效率的20倍，克隆B(RW6)：23倍、克隆C(RW37)：22倍、克隆D(RW28)：2倍、克隆E(RW36)：5倍。

图2C提供了用于产生图2A和2B的ELISA图的原始数据。

实施例3：通过狭缝印迹分析兔抗体克隆的特异性

使用狭缝印迹分析确定上述产生的重组兔抗H1.0K180me2单克隆IgG抗体克隆的特异性，如图3所示。使用真空歧管狭缝印迹以稀释系列(100pmol、50pmol、25pmol)将组蛋白H1.0肽(未修饰的、K180me1、K180me2)转移到膜上。然后使用抗体克隆对膜进行免疫印迹，以鉴定与未修饰或单甲基化H1.0肽的潜在交叉反应性。即使以低浓度，克隆A、B和C对于H1.0K180me2也具有高度特异性。对于这些克隆，未观察到与未修饰的肽或H1.0K180me1肽的交叉反应性。除H1.0K180me2外，克隆D和E都能够检测H1.0K180me1肽，这表明缺乏对H1.0K180me2的抗体特异性。

实施例4：通过体外甲基化H1.0K180me2分析抗体克隆的特异性

图4A显示了体外甲基化方法的概述。甲基化反应包括重组G9A(甲基转移酶)、未标记的甲基供体(S-腺苷-L-甲硫氨酸)和重组人H1.0蛋白，将它们在37℃下孵育1小时。在此孵育期间，G9A能够甲基化全长H1.0蛋白，包括添加K180me2。随后可以使用抗H1.0K180me2兔多克隆抗体鉴定H1.0K180me2，以确认甲基化。

为了鉴定全长H1.0蛋白上通过G9A甲基化的精确位置，随后通过LC-MS分析上述反应，并且鉴定了甲基化位点。图4B显示了全长H1.0蛋白的序列，并且“me”圆的数目代表赖氨酸残基的甲基化状态(单或二甲基化)。在重组的全长H1.0的存在下，G9A特异性甲基化了几种C-末端赖氨酸残基，包括H1.0K180me2。

图4C展示了采用渐增量的G9A的情况下重组全长组蛋白H1.0的体外甲基化测定，以及用兔抗H1.0K180me2多克隆抗体的检测。上图展现了随着G9A浓度的渐增而增加的H1.0K180甲基化。

图4D示出了对体外甲基化H1.0具有特异性的克隆的分析。克隆A能够识别体外的甲基化H1.0，而在不存在G9A蛋白的情况下，与未甲基化全长H1.0的非特异性结合极少。所有其他克隆均识别未甲基化H1.0，并且显示对甲基化全长H1.0没有特异性。

实施例5：克隆A(RW24)和B(RW6)的序列分析

对目的克隆进行测序。

图5A是克隆A和B的重链可变结构域蛋白序列的EMBOSS NEEDLE(Li W.The EMBL-EBI bioinformatics web and programmatic tools framework.Nucleic AcidsResearch[2015年4月6日,43(W1):W580-4)成对序列比对。所述重链序列享有61％同一性和70％相似性。

图5B是克隆A和B的轻链可变结构域蛋白序列的EMBOSS NEEDLE成对序列比对。所述轻链序列享有83％同一性和88％相似性。

图5C提供了克隆A(RW24)的轻和重链可变结构域的DNA和蛋白序列。

图5D是为了创建全长重组IgG抗体，构建掺有可变结构域DNA序列的全长轻和重链表达载体的方法的示意图。

实施例6：用Chothia预测软件绘制克隆A重链的框架和CDR区

图7A和7B(左图)显示的是用Chothia(预测抗体结构的程序)对克隆A重链和克隆A轻链的分析。重链或轻链的每个残基都显示在顶部框中，并且在每个相应残基下方的框中通过Chothia指定了残基编号。以浅灰色显示的是克隆A重链或轻链的预测框架区。以深灰色显示的是预测的CDR。星号指示预测的CK2磷酸化位点。箭头指示每个位置的异常残基。

图7B(右图)示出了对于所有进行的Chothia预测，预测在位置L1处的残基分布。在克隆A轻链的例子中，L1位置是天冬氨酸，对于预测位于L1位置的所有氨基酸而言，所述天冬氨酸具有最高的相对频率。

图7C描绘了使用Chothia、AbM、Kabat和Contact算法/编号方案，抗体克隆A的预测的轻链互补决定区和框架区。

图7D描绘了使用Chothia、AbM、Kabat和Contact算法/编号方案，抗体克隆A的预测的重链互补决定区和框架区。

序列表

<110> AELAN CELL TECHNOLOGIES, INC.

<120> H1.0K180ME2抗体、其制造方法及用途

<130> ALNC-010/01WO 328515-2029

<150> US 62/577,041

<151> 2017-10-25

<160> 74

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 192

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 组蛋白H1.0蛋白

<400> 1

Met Thr Glu Asn Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ala Lys Pro Lys Arg Ala

1 5 10 15

Lys Ala Ser Lys Lys Ser Thr Asp His Pro Lys Tyr Ser Asp Met Ile

20 25 30

Val Ala Ala Ile Gln Ala Glu Lys Asn Arg Ala Gly Ser Ser Arg Gln

35 40 45

Ser Ile Gln Lys Tyr Ile Lys Ser His Tyr Lys Val Gly Glu Asn Ala

50 55 60

Asp Ser Gln Ile Lys Leu Ser Ile Lys Arg Leu Val Thr Thr Gly Val

65 70 75 80

Leu Lys Gln Thr Lys Gly Val Gly Ala Ser Gly Ser Phe Arg Leu Ala

85 90 95

Lys Ser Asp Glu Pro Lys Lys Ser Val Ala Phe Lys Lys Thr Lys Lys

100 105 110

Glu Ile Lys Lys Val Ala Thr Pro Lys Lys Ala Ser Lys Pro Lys Lys

115 120 125

Ala Ala Ser Lys Ala Pro Thr Lys Lys Pro Lys Ala Thr Pro Val Lys

130 135 140

Lys Ala Lys Lys Lys Leu Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys Pro

145 150 155 160

Lys Thr Val Lys Pro Val Lys Ala Ser Lys Pro Lys Lys Ala Lys Pro

165 170 175

Val Lys Pro Lys Ala Lys Ser Ser Ala Lys Arg Ala Gly Lys Lys Lys

180 185 190

<210> 2

<211> 192

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 组蛋白H1.0蛋白

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (157)..(157)

<223> Lys是二甲基化的

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (169)..(169)

<223> Lys是二甲基化的

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (172)..(172)

<223> Lys是甲基化的

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (175)..(175)

<223> Lys是二甲基化的

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (180)..(180)

<223> Lys是二甲基化的

<400> 2

Met Thr Glu Asn Ser Thr Ser Ala Pro Ala Ala Lys Pro Lys Arg Ala

1 5 10 15

Lys Ala Ser Lys Lys Ser Thr Asp His Pro Lys Tyr Ser Asp Met Ile

20 25 30

Val Ala Ala Ile Gln Ala Glu Lys Asn Arg Ala Gly Ser Ser Arg Gln

35 40 45

Ser Ile Gln Lys Tyr Ile Lys Ser His Tyr Lys Val Gly Glu Asn Ala

50 55 60

Asp Ser Gln Ile Lys Leu Ser Ile Lys Arg Leu Val Thr Thr Gly Val

65 70 75 80

Leu Lys Gln Thr Lys Gly Val Gly Ala Ser Gly Ser Phe Arg Leu Ala

85 90 95

Lys Ser Asp Glu Pro Lys Lys Ser Val Ala Phe Lys Lys Thr Lys Lys

100 105 110

Glu Ile Lys Lys Val Ala Thr Pro Lys Lys Ala Ser Lys Pro Lys Lys

115 120 125

Ala Ala Ser Lys Ala Pro Thr Lys Lys Pro Lys Ala Thr Pro Val Lys

130 135 140

Lys Ala Lys Lys Lys Leu Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys Pro

145 150 155 160

Lys Thr Val Lys Pro Val Lys Ala Ser Lys Pro Lys Lys Ala Lys Pro

165 170 175

Val Lys Pro Lys Ala Lys Ser Ser Ala Lys Arg Ala Gly Lys Lys Lys

180 185 190

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 肽抗原

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (17)..(17)

<223> Lys是二甲基化的

<400> 3

Cys Ala Lys Pro Val Lys Ala Ser Lys Pro Lys Lys Ala Lys Pro Val

1 5 10 15

Lys Pro Lys

<210> 4

<211> 364

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A重链可变结构域-核苷酸

<400> 4

cagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60

tgcacggtct ctggattctc cctcaataac tatgtgatga tgtgggtccg ccaggctcca 120

ggggaggggc tggaatggat cgctgccatt actactggcg gtaccacata ctacgcgaac 180

tgggcgaaag gccgattcac catctccaaa acctcgacca cggtggatct gaaaatcatc 240

agtccgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgcgcca gagatcttta tggtgatact 300

agtgatgata tttgggatgc ttttgatccc tggggcccag gcaccctggt caccgtctcc 360

tcag 364

<210> 5

<211> 299

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A轻链可变结构域-核苷酸

<400> 5

gaccctgtgc tgacccagac tccatcgtcc gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60

atcagttgcc agtccagtga gagtgtttat aagaataaca acttagcctg gtatcagcag 120

aaaccagggc agcctcccaa gctcctgatc tattctgcat ccactctggc atctggggtc 180

ccatcgcggt tcaaaggcag tggatctggg acacagtcac tctcaccatc agtggcgtgc 240

agtgtgacga tgctgccact tactactgtc taggagtata tagtgatatt tttgctttc 299

<210> 6

<211> 121

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A重链可变结构域

<400> 6

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Tyr Val

20 25 30

Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Ala

35 40 45

Ala Ile Thr Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ile

65 70 75 80

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Leu

85 90 95

Tyr Gly Asp Thr Ser Asp Asp Ile Trp Asp Ala Phe Asp Pro Trp Gly

100 105 110

Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7

<211> 103

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B重链可变结构域

<400> 7

Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Tyr

20 25 30

Thr Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Ser Gly Thr Gly Thr Pro Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Gly Leu Lys Met Thr

65 70 75 80

Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Tyr

85 90 95

Pro Gly Ile Asp Ala Asn Asn

100

<210> 8

<211> 100

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A轻链可变结构域

<400> 8

Asp Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Lys Asn

20 25 30

Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Val Tyr Ser Asp

85 90 95

Ile Phe Ala Phe

100

<210> 9

<211> 101

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B轻链可变结构域

<400> 9

Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu

65 70 75 80

Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Asp Tyr Asp Val

85 90 95

Tyr Ile Ala Ala Phe

100

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A CDR-L1

<400> 10

Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Lys Asn Asn Asn Leu Ala

1 5 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A CDR-L1

<400> 11

Tyr Lys Asn Asn Asn Leu Ala Trp Tyr

1 5

<210> 12

<211> 13

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B CDR-L1

<400> 12

Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn Asn Tyr Leu Gly

1 5 10

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B CDR-L1

<400> 13

Tyr Asn Asn Asn Tyr Leu Gly Trp Tyr

1 5

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A CDR-L2

<400> 14

Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A CDR-L2

<400> 15

Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Ala

1 5 10

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B CDR-L2

<400> 16

Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B CDR-L2

<400> 17

Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala

1 5 10

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A CDR-L3

<400> 18

Leu Gly Val Tyr Ser Asp Ile Phe Ala Phe

1 5 10

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B CDR-L3

<400> 19

Gly Gly Asp Tyr Asp Val Tyr Ile Ala Ala

1 5 10

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A CDR-H1

<400> 20

Gly Phe Ser Leu Asn Asn Tyr

1 5

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A CDR-H1

<400> 21

Gly Phe Ser Leu Asn Asn Tyr Val Met Met

1 5 10

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A CDR-H1

<400> 22

Asn Tyr Val Met Met

1 5

<210> 23

<211> 6

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A CDR-H1

<400> 23

Asn Asn Tyr Val Met Met

1 5

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B CDR-H1

<400> 24

Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr

1 5

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B CDR-H1

<400> 25

Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr Tyr Thr Thr

1 5 10

<210> 26

<211> 5

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B CDR-H1

<400> 26

Asp Tyr Tyr Thr Thr

1 5

<210> 27

<211> 6

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B CDR-H1

<400> 27

Ser Asp Tyr Tyr Thr Thr

1 5

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A CDR-H2

<400> 28

Thr Thr Gly Gly Thr

1 5

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A CDR-H2

<400> 29

Ala Ile Thr Thr Gly Gly Thr Thr Tyr

1 5

<210> 30

<211> 16

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A CDR-H2

<400> 30

Ala Ile Thr Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 31

<211> 12

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A CDR-H2

<400> 31

Trp Ile Ala Ala Ile Thr Thr Gly Gly Thr Thr Tyr

1 5 10

<210> 32

<211> 5

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B CDR-H2

<400> 32

Ser Gly Thr Gly Thr

1 5

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B CDR-H2

<400> 33

Tyr Ile Ser Gly Thr Gly Thr Pro Tyr

1 5

<210> 34

<211> 16

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B CDR-H2

<400> 34

Tyr Ile Ser Gly Thr Gly Thr Pro Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 35

<211> 12

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B CDR-H2

<400> 35

Tyr Ile Gly Tyr Ile Ser Gly Thr Gly Thr Pro Tyr

1 5 10

<210> 36

<211> 16

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A CDR-H3

<400> 36

Asp Leu Tyr Gly Asp Thr Ser Asp Asp Ile Trp Asp Ala Phe Asp Pro

1 5 10 15

<210> 37

<211> 18

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A CDR-H3

<400> 37

Ala Arg Asp Leu Tyr Gly Asp Thr Ser Asp Asp Ile Trp Asp Ala Phe

1 5 10 15

Asp Pro

<210> 38

<211> 23

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A LFR1

<400> 38

Asp Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys

20

<210> 39

<211> 29

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A LFR1

<400> 39

Asp Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val

20 25

<210> 40

<211> 15

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A LFR2

<400> 40

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A LFR2

<400> 41

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

1 5

<210> 42

<211> 32

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A LFR3

<400> 42

Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 43

<211> 33

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A LFR3

<400> 43

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe

1 5 10 15

Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

20 25 30

Cys

<210> 44

<211> 24

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A HFR1

<400> 44

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser

20

<210> 45

<211> 29

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A HFR1

<400> 45

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn

20 25

<210> 46

<211> 28

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A HFR1

<400> 46

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu

20 25

<210> 47

<211> 19

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A HFR2

<400> 47

Val Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile

1 5 10 15

Ala Ala Ile

<210> 48

<211> 14

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A HFR2

<400> 48

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile Ala

1 5 10

<210> 49

<211> 11

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A HFR2

<400> 49

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu

1 5 10

<210> 50

<211> 39

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A HFR3

<400> 50

Thr Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr

1 5 10 15

Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ile Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg

35

<210> 51

<211> 37

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A HFR3

<400> 51

Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr

1 5 10 15

Thr Val Asp Leu Lys Ile Ile Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr

20 25 30

Tyr Phe Cys Ala Arg

35

<210> 52

<211> 30

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A HFR3

<400> 52

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile Ile

1 5 10 15

Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 53

<211> 35

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A HFR3

<400> 53

Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr

1 5 10 15

Thr Val Asp Leu Lys Ile Ile Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr

20 25 30

Tyr Phe Cys

35

<210> 54

<211> 11

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A HFR4

<400> 54

Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 55

<211> 12

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆A HFR4

<400> 55

Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 56

<211> 23

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B LFR1

<400> 56

Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys

20

<210> 57

<211> 29

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B LFR1

<400> 57

Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val

20 25

<210> 58

<211> 15

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B LFR2

<400> 58

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 10 15

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B LFR2

<400> 59

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

1 5

<210> 60

<211> 32

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B LFR3

<400> 60

Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr

1 5 10 15

Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

20 25 30

<210> 61

<211> 33

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B LFR3

<400> 61

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe

1 5 10 15

Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr

20 25 30

Cys

<210> 62

<211> 24

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B HFR1

<400> 62

Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser

20

<210> 63

<211> 29

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B HFR1

<400> 63

Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser

20 25

<210> 64

<211> 28

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B HFR1

<400> 64

Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu

20 25

<210> 65

<211> 19

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B HFR2

<400> 65

Tyr Thr Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Tyr Ile

1 5 10 15

Gly Tyr Ile

<210> 66

<211> 14

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B HFR2

<400> 66

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Tyr Ile Gly

1 5 10

<210> 67

<211> 11

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B HFR2

<400> 67

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu

1 5 10

<210> 68

<211> 39

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B HFR3

<400> 68

Pro Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr

1 5 10 15

Ser Thr Thr Val Gly Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg

35

<210> 69

<211> 37

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B HFR3

<400> 69

Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr

1 5 10 15

Thr Val Gly Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr

20 25 30

Tyr Phe Cys Ala Arg

35

<210> 70

<211> 30

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B HFR3

<400> 70

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Gly Leu Lys Met Thr

1 5 10 15

Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 71

<211> 35

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 克隆B HFR3

<400> 71

Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr

1 5 10 15

Thr Val Gly Leu Lys Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr

20 25 30

Tyr Phe Cys

35

<210> 72

<211> 19

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 钥孔戚血蓝蛋白 (KLH)缀合的H1.0K180me2肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> 与钥孔戚血蓝蛋白缀合

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (17)..(17)

<223> Lys是二甲基化的

<400> 72

Cys Ala Lys Pro Val Lys Ala Ser Lys Pro Lys Lys Ala Lys Pro Val

1 5 10 15

Lys Pro Lys

<210> 73

<211> 19

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 生物素缀合的H1.0K180me2肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> 与生物素部分缀合

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (17)..(17)

<223> Lys是二甲基化的

<400> 73

Cys Ala Lys Pro Val Lys Ala Ser Lys Pro Lys Lys Ala Lys Pro Val

1 5 10 15

Lys Pro Lys

<210> 74

<211> 19

<212> PRT

<213> 未知

<220>

<223> 生物素缀合的未甲基化的H1.0肽

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (1)..(1)

<223> 与生物素部分缀合

<400> 74

Cys Ala Lys Pro Val Lys Ala Ser Lys Pro Lys Lys Ala Lys Pro Val

1 5 10 15

Lys Pro Lys

Claims

1.一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的抗原结合结构域包含：

(a)表4的CDR-L1氨基酸序列中的任一个；

(b)表5的CDR-L2氨基酸序列中的任一个；和

(c)表6的CDR-L3氨基酸序列中的任一个。

2.一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的抗原结合结构域包含：

(a)表7的CDR-H1氨基酸序列中的任一个；

(b)表8的CDR-H2氨基酸序列中的任一个；和

(c)表9的CDR-H3氨基酸序列中的任一个。

3.一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的抗原结合结构域包含表4、5和6的CDR-L氨基酸序列中的任一个，并且包含表7、8和9的CDR-H氨基酸序列中的任一个。

4.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体的抗原结合结构域包含

(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的氨基酸序列；

(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的氨基酸序列；和

(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。

5.根据权利要求1或权利要求4所述的抗体，其中所述抗体的抗原结合结构域包含

(c)CDR-H3，其包含SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37的氨基酸序列。

6.一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

7.一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的重链可变结构域包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。

8.一种与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体，其中所述抗体的重链可变结构域包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及所述抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

9.根据权利要求8所述的抗体，其中所述抗体的重链可变结构域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，以及所述抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

10.根据权利要求8所述的抗体，其中所述抗体的重链可变结构域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，以及所述抗体的轻链可变结构域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体，其中所述抗体是嵌合的或人源化的。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。

13.根据权利要求1至11中任一项所述的抗体，其中所述抗体是抗原结合片段。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的抗体，其中如果H1.0K180me2蛋白或肽包含除K180以外的甲基化残基，则所述抗体展现出与所述蛋白或肽的结合降低。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的抗体，其中如果H1.0K180me2蛋白或肽在对应于人组蛋白H1.0蛋白的K166、K172、K174、K175和/或K177的赖氨酸残基处包含甲基化赖氨酸残基，则所述抗体不结合或仅最低限度结合。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体与标记缀合。

17.根据权利要求16中任一项所述的抗体，其中所述抗体附接至固体表面。

18.根据权利要求17所述的抗体，其中所述抗体附接至珠、柱、树脂或微板。

19.根据权利要求1至15中任一项所述的抗体，其中所述抗体与药剂缀合。

20.根据权利要求19所述的抗体，其中所述药剂选自：放射性核素、细胞毒素、化学治疗剂、药物、前药、毒素、酶、免疫调节剂、促凋亡剂、细胞因子、激素、寡核苷酸、反义分子、siRNA和二抗。

21.一种确定个体是否患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中的方法，所述方法包括：

(a)使来自所述个体的生物样品与根据权利要求1至18中任一项所述的抗体接触；和

(b)测定所述样品中与所述抗体结合的包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质的浓度，其中所述浓度相对于对照降低指示所述个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中。

22.根据权利要求21所述的方法，其进一步包括如果确定所述个体患有阿尔茨海默病或处于发展阿尔茨海默病的风险中，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗所述个体。

23.一种确定被诊断患有阿尔茨海默病并接受阿尔茨海默病治疗的个体是否将受益于所述治疗或将继续受益于所述治疗的方法，所述方法包括：

(c)如果所述浓度相对于对照增加，则确定所述个体将受益于所述治疗或将继续受益于所述治疗。

24.根据权利要求23所述的方法，其进一步包括如果确定所述个体将受益于或继续受益于所述治疗，则用阿尔茨海默病药物或方案治疗所述个体。

25.一种确定被诊断患有阿尔茨海默病的个体是否将受益于候选治疗的方法，其中所述个体尚未开始所述治疗，所述方法包括：

(a)向所述个体给予候选治疗；

(b)在给予所述候选治疗后，使来自所述个体的生物样品与根据权利要求1至18中任一项所述的抗体接触；和

(d)如果相对于对照所述浓度增加或细胞质亚细胞定位减少，则确定所述个体将受益于所述候选治疗。

(a)使来自所述个体的生物样品与候选治疗接触；

(b)使来自所述个体的生物样品与根据权利要求1至18中任一项所述的抗体接触；

(d)如果所述浓度相对于对照增加或细胞质亚细胞定位相对于对照减少，则确定所述个体将受益于所述候选治疗。

27.根据权利要求25-26中任一项所述的方法，其中所述治疗选自：APP合成抑制剂、β-分泌酶抑制剂、γ-分泌酶抑制剂和调节剂、Aβ聚集抑制剂、Aβ免疫疗法、降胆固醇药物、抗tau药物、胆碱酯酶抑制剂、N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、非典型抗精神病药、蛋白质S-亚硝基化的阻断剂、胰高血糖素样肽-1受体激动剂、雷帕霉素、rapalogue、内源性大麻素、大麻素、神经保护剂、控制钙内流的分子、抗氧化剂、抗炎药物、控制谷氨酸稳态控制的药物、自噬诱导剂、激素、激素调节剂、他汀类、胰岛素、胰岛素载体、多功能纳米载体、维生素、营养补充剂、小RNA分子、肽和超声疗法。

28.一种确定个体是否已暴露于DNA损伤剂的方法，其包括：

(b)测定所述样品中与所述抗体结合的包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质的浓度，其中所述浓度相对于对照增加指示所述个体已暴露于DNA损伤剂。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述DNA损伤剂是辐射。

30.一种确定接受用rapalogue进行的治疗的个体是否响应于这种治疗的方法，其包括：

(a)使来自所述个体的生物样品与根据权利要求1至18中任一项所述的抗体接触；

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述降低低于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。

32.根据权利要求30所述的方法，其中所述rapalogue选自：雷帕霉素、西罗莫司、雷帕鸣、依维莫司、RA 001、飞尼妥、Zortress、坦罗莫司、CCI-779、驮瑞塞尔、地磷莫司、AP23573、MK-8669、Deforolimus、佐他莫司、ABT-578、AZD8055、AZD2014、OSI-027、MLN0128、WYE-132、Torin1、PI-103、P7170、PF-04691502、PF-05212384、PKI-587、GNE477、PKI-180、WJD008、XL765、SAR245409、NVP-BEZ235、BGT226、SF1126、GSK2126458、Ku-0063794、WYE-354、NVP-BEZ235、PF-05212384、XL765、Torin 2、WYE-125132和OSI-027。

33.根据权利要求21至32中任一项所述的方法，其中所述浓度的增加或降低高于或低于为了获得最佳特异性和灵敏度由接受者操作特征曲线分析建立的阈值。

34.根据权利要求21至33中任一项所述的方法，其中所述生物样品选自：全血、血浆、血清、唾液、尿液、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸物、胸腔积液、组织、细胞、活组织检查、间质液和淋巴液。

35.一种用于测量皮下靶分子浓度的透皮贴剂，其包含：

(a)含有根据权利要求1至18中任一项所述的抗体的基底；和

(b)多个微针。

36.根据权利要求35所述的贴剂，其中所述贴剂是透皮微针阵列贴剂。

37.根据权利要求35或权利要求36所述的贴剂，其中所述基底是可弹性拉伸的。

38.一种用于确定个体是否已暴露于辐射或DNA损伤剂的便携式单元，其包括：

(a)样品收集单元；

(b)读取器；

(c)包含权利要求1至18中任一项所述的抗体的测定模块；和

(d)多个微针。

39.一种适用于分析物的侧向流测定的测试条，其包含样品接收区，其中所述样品接收区包含根据权利要求1至18中任一项所述的抗体。

40.一种治疗个体中甲基化H1.0相关疾病或病症的方法，所述方法包括向所述个体给予治疗有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的抗体。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述疾病或病症选自：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒性应激物暴露、包含衰老细胞积聚的疾病或病症、以及伴随H1.0K180me2蛋白或肽水平升高的疾病或病症。

42.一种清除个体中H1.0K180me2的方法，所述方法包括向所述个体给予治疗有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的抗体。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述个体患有选自以下的疾病或病症：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒素暴露、DNA损伤剂暴露、以及包含衰老细胞积聚的病症。

44.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至20中任一项所述的抗体和药学上可接受的赋形剂。

45.一种试剂盒，其包含治疗有效量的根据权利要求1至18中任一项所述的抗体中的任一种。

46.一种制品，其包含根据权利要求1至20和35至45所述的组合物中的任一种。

47.一种编码与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体的载体，其包含SEQ ID NO:4的核酸。

48.一种编码与包含H1.0K180me2抗原或其肽的蛋白质特异性结合的抗体的载体，其包含SEQ ID NO:5的核酸。

49.一种细胞，其包含根据权利要求47至48中任一项所述的载体。

50.一种用作药物的根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或根据权利要求44所述的药物组合物。

51.根据权利要求1至20中任一项所述的抗体或根据权利要求44所述的药物组合物，用在治疗甲基化H1.0相关疾病或病症中；任选地其中所述疾病或病症选自：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒性应激物暴露、包含衰老细胞积聚的疾病或病症、以及伴随H1.0K180me2蛋白或肽水平升高的疾病或病症。

52.根据权利要求1-20中任一项所述的抗体或根据权利要求44所述的药物组合物，用在治疗方法中，其中所述方法包括清除个体中的H1.0K180me2，任选地其中所述个体患有选自以下的疾病或病症：阿尔茨海默病、辐射暴露、基因毒素暴露、DNA损伤剂暴露、以及包含衰老细胞积聚的病症。