CN111819195A - 用于纯化抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纯化重组多肽并分离掉宿主细胞蛋白(HCP)的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和HCP的溶液施加至超抗原色谱固体支持物，(b)用包含辛酸盐和精氨酸的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽，其中所述重组多肽是抗ICOS抗体或其抗原结合片段。

Description

用于纯化抗体的方法
发明领域
本发明涉及蛋白纯化领域，特别是使用固定至固体支持物的超抗原、诸如蛋白A、蛋白G或蛋白L纯化抗ICOS抗体。具体而言，本发明涉及洗涤缓冲液组分和在洗涤步骤期间使用洗涤缓冲液除去宿主细胞杂质、使期望的蛋白产物损失最小化的方法。
发明背景
对于癌症治疗，增强抗肿瘤T细胞功能和诱导T细胞增殖是强大和新的方法。目前销售三种免疫-肿瘤学抗体(例如，免疫-调节剂)。认为抗CTLA-4(YERVOY/伊匹单抗(Ipilimumab))在T细胞引发点加强免疫应答，并且抗PD-1抗体(OPDIVO/尼沃单抗(Nivolumab)和KEYTRUDA/派姆单抗(Pembrolizumab))被认为通过缓解已经被引发和活化的肿瘤特异性T细胞中的抑制性检查点而在局部肿瘤微环境中起作用。
ICOS是与CD28/CTLA-4-Ig超家族具有结构和功能相关性的共刺激性T细胞受体(Hutloff, 等人, "ICOS is an inducible T-cell co-stimulator structurally andfunctionally related to CD28", Nature, 397: 263-266 (1999))。ICOS的活化经由通过ICOS-L(B7RP-1/B7-H2)的结合而发生。B7-1和B7-2(CD28和CTLA4的配体)都不结合或活化ICOS。然而，已经显示ICOS-L微弱结合CD28和CTLA-4两者(Yao S等人, “B7-H2 is acostimulatory ligand for CD28 in human”, Immunity, 34(5); 729-40 (2011))。ICOS的表达似乎限于T细胞。ICOS表达水平在不同的T细胞亚群之间和T细胞活化状态上变化。已经显示ICOS表达在静息TH17、T滤泡辅助(TFH)和调节性T(Treg)细胞上；然而，不同于CD28；ICOS在幼稚TH1和TH2效应子T细胞群体上并不高度表达(Paulos CM等人, “The induciblecostimulator (ICOS) is critical for the development of human Th17 cells”, SciTransl Med, 2(55); 55ra78 (2010))。在通过TCR接合而活化后，ICOS表达在CD4+和CD8+效应子T细胞上被高度诱导(Wakamatsu E,等人, “Convergent and divergent effectsof costimulatory molecules in conventional and regulatory CD4+ T cells”, ProcNatal Acad Sci USA, 110(3); 1023-8 (2013))。通过ICOS受体的共刺激信号传导仅发生在接受同时TCR活化信号的T细胞中(Sharpe AH和Freeman GJ. “The B7-CD28Superfamily”, Nat. Rev Immunol, 2(2); 116-26 (2002))。在活化的抗原特异性T细胞中，ICOS调节TH1和TH2细胞因子(包括IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-4、IL-13和其他)的产生。ICOS也刺激效应子T细胞增殖，尽管程度小于CD28 (Sharpe AH和Freeman GJ. “The B7-CD28 Superfamily”, Nat. Rev Immunol, 2(2); 116-26 (2002))。
越来越多的文献支持活化在CD4+和CD8+效应子T细胞上的ICOS具有抗肿瘤潜能的想法。在具有SA-1(肉瘤)、Meth A(纤维肉瘤)、EMT6(乳腺癌)和P815(肥大细胞瘤)和EL-4(浆细胞瘤)同基因肿瘤的小鼠中，ICOS-L-Fc融合蛋白引起肿瘤生长延迟和肿瘤完全消除，而在已知是低免疫原性的B16-F10(黑色素瘤)肿瘤模型中没有观察到活性(Ara G等人,“Potent activity of soluble B7RP-1-Fc in therapy of murine tumors insyngeneic hosts”, Int. J Cancer, 103(4); 501-7 (2003))。ICOS-L-Fc的抗肿瘤活性取决于完整的免疫应答，因为活性在裸小鼠中生长的肿瘤中完全丧失。来自ICOS-L-Fc处理的小鼠的肿瘤的分析表明，响应于治疗的肿瘤中CD4+和CD8+ T细胞浸润的显著增加，支持ICOS-L-Fc在这些模型中的免疫刺激作用。
使用ICOS-/-和ICOS-L-/-小鼠的另一报告表明，在B16/Bl6黑色素瘤同基因肿瘤模型中，在介导抗CTLA4抗体的抗肿瘤活性中需要ICOS信号传导(Fu T等人, “The ICOS/ICOSL pathway is required for optimal antitumor responses mediated by anti-CTLA-4 therapy”, Cancer Res, 71(16); 5445-54 (2011))。与野生型小鼠相比，在抗CTLA4抗体治疗后，缺乏ICOS或ICOS-L的小鼠具有显著降低的存活率。在一项分开的研究中，转导B16/Bl6肿瘤细胞以过表达重组鼠ICOS-L。与用对照蛋白转导的B16/Bl6肿瘤细胞相比，发现这些肿瘤对抗CTLA4治疗显著更敏感(Allison J等人, “Combinationimmunotherapy for the treatment of cancer”, WO2011/041613 A2 (2009))。这些研究提供了单独和与其他免疫调节性抗体组合的ICOS激动剂的抗肿瘤潜能的证据。
来自用抗CTLA4抗体治疗的患者的新出现的数据也指向ICOS+效应子T细胞在介导抗肿瘤免疫应答中的积极作用。具有转移性黑色素瘤(Giacomo AMD等人, “Long-termsurvival and immunological parameters in metastatic melanoma patients whorespond to ipilimumab 10 mg/kg within an expanded access program”, CancerImmunol Immunother., 62(6); 1021-8 (2013))；尿路上皮癌(Carthon BC等人,“Preoperative CTLA-4 blockade: Tolerability and immune monitoring in thesetting of a presurgical clinical trial” Clin Cancer Res., 16(10); 2861-71(2010))；乳腺癌(Vonderheide RH等人, “Tremelimumab in combination withexemestane in patients with advanced breast cancer and treatment-associatedmodulation of inducible costimulator expression on patient T cells”, ClinCancer Res., 16(13); 3485-94 (2010))；和前列腺癌的患者(其在伊匹单抗治疗后具有循环和肿瘤浸润的CD4+ICOS+和CD8+ICOS+ T细胞的增加的绝对计数)与其中观察到的增加很少或没有增加的患者相比具有显著更好的治疗相关结果。重要的是，显示伊匹单抗改变ICOS+ T效应子:Treg比率，将治疗前Tregs的丰度逆转为治疗后T效应子相比于Treg的显著丰度(Liakou CI等人, “CTLA-4 blockade increases IFN-gamma producing CD4+ICOShicells to shift the ratio of effector to regulatory T cells in cancerpatients”, Proc Natl Acad Sci USA. 105(39); 14987-92 (2008))和(Vonderheide RH等人, Clin Cancer Res., 16(13); 3485-94 (2010))。因此，ICOS阳性T效应子细胞是伊匹单抗应答的阳性预测性生物标志物，其指向用激动剂ICOS抗体活化该细胞群的潜在优势。因此，在癌症的治疗中需要另外的T细胞增殖诱导分子，诸如抗ICOS抗体。
在一些情况下，抗体(诸如抗ICOS抗体)的纯化可以涉及除去宿主细胞蛋白(HCP)杂质。在生物制药的下游处理中，必须除去宿主细胞蛋白(HCP)杂质 – 被FDA归类为“工艺相关的”杂质 – 至足够低的水平。在典型的下游处理期间，对于一些单克隆抗体(mAb)产品，HCP的充分清除可能尤其有挑战性。大多数mAb下游工艺采用‘平台’方法；典型的mAb下游平台由以下组成：蛋白A亲和色谱捕获，随后为一至三个非亲和力抛光步骤。蛋白A亲和力捕获步骤是平台的主要角色(workhorse)，并且提供大部分的HCP清除。随后的抛光步骤通常是离子交换、疏水相互作用或多模式色谱。
对于许多mAb产品，在第一抛光色谱步骤之后，HCP浓度足够低。然而，存在许多mAb，对于其，专门执行第二抛光色谱步骤以除去另外HCP；这可能需要大量的工艺开发努力，并导致更大的工艺复杂性。先前的研究已经鉴定了与mAb产物分子具有有吸引力相互作用的HCP杂质的亚群(Levy等人, (2014) Biotechnol. Bioeng. 111(5):904-912;Aboulaich等人, (2014) Biotechnol. Prog. 30(5):1114-1124)。通过蛋白A步骤逃逸清除的大多数HCP是由于产物-缔合，而不是共洗脱或吸附至蛋白A配体或基础基质。难以除去的HCP的群体相对小 - 与细胞培养物中存在的HCP的各种群体相比 – 并且对于不同的mAb产物是类似的。
尽管困难的HCP杂质的群体对于所有mAb产物在很大程度上是相同的，但各种程度的HCP-mAb相互作用可以显著影响蛋白A步骤间的总HCP清除率；对mAb产物的氨基酸序列的非常微小的变化可以影响蛋白A和抛光步骤中的HCP-mAb相互作用。对HCP-mAb缔合的潜能具有明显影响的负载至蛋白A柱上的HCP的群体可以受到细胞龄期(cell age)、收获方法和条件的影响，并且在不同宿主细胞系之间已观察到小差异。除了产物-缔合以外，对于大多数蛋白A树脂，还存在低水平的HCP杂质，其结合基础基质并与产物共洗脱。受控孔玻璃树脂具有高得多水平的结合至基础基质的HCP。
一种特定的洗涤添加剂辛酸钠先前已被鉴定为用于破坏HCP-mAb缔合并导致蛋白A洗脱液中的低HCP浓度的最成功者之一。辛酸钠(也称为辛酸钠)是八碳饱和脂肪酸，其被发现在近似360 mM的临界胶束浓度在小鼠中无毒。先前的研究已使用50 mM辛酸钠(Aboulaich等人, (2014) Biotechnol. Prog. 30(5):1114-1124)、具有各种NaCl和pH的40 mM辛酸钠(Chollangi等人, (2015) Biotechnol. Bioeng. 112(11):2292-2304)和最高达80 mM辛酸钠(Herzer等人, (2015) Biotechnol. Bioeng. 112(7):1417-1428)(以提高HCP清除率)以及具有高pH与NaCl的50 mM辛酸钠用于总HCP清除和除去蛋白水解HCP杂质(Bee等人, (2015) Biotechnol. Prog. 31(5):1360-1369)。先前已针对含有最多达100mM辛酸钠的蛋白A洗涤液申请了专利申请(WO2014/141150；WO2014/186350)。另外，辛酸已经被用于蛋白A捕获步骤之前和之后的非色谱工艺中沉淀宿主细胞蛋白杂质(Brodsky等人, (2012) Biotechnol. Bioeng. 109(10): 2589-2598; Zheng等人, (2015)Biotechnol. Prog. 31(6):1515-1525; Herzer等人, (2015) Biotechnol. Bioeng. 112(7):1417-1428)。
本领域需要提供从宿主细胞蛋白纯化蛋白、特别是抗ICOS抗体的改进方法。
发明概述
在一个方面，本发明提供了纯化重组多肽并分离掉宿主细胞蛋白(HCP)的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和HCP的溶液施加至超抗原色谱固体支持物，(b)用包含辛酸盐和精氨酸的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽，其中所述重组多肽是抗ICOS抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含大于约50 mM辛酸盐和大于约0.5 M精氨酸。
在另一个实施方案中，所述抗ICOS抗体包含以下中的一者或多者：如SEQ ID NO:1中所示的CDRH1；如SEQ ID NO:2中所示的CDRH2；如SEQ ID NO:3中所示的CDRH3；如SEQ IDNO:4中所示的CDRL1；如SEQ ID NO:5中所示的CDRL2和/或如SEQ ID NO:6中所示的CDRL3或每个CDR的直接等同物，其中直接等同物在所述CDR中具有不多于两个氨基酸取代。
在另一个实施方案中，所述抗ICOS抗体包含：包含与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的VH结构域，和/或包含与如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中所述抗ICOS抗体特异性结合人ICOS。
在又另一个实施方案中，所述抗ICOS抗体是ICOS激动剂。在另一个实施方案中，所述辛酸盐是辛酸钠。
在又另一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约75 mM至约300 mM辛酸盐。
在另一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约0.75 M至约1.5 M精氨酸。
在另一个实施方案中，所述HCP源自哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述HCP是磷脂酶B-样2蛋白。
在另一个实施方案中，所述洗涤缓冲液的pH在pH 7至pH 9之间。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液的pH在pH 7.5至pH 8.5之间。
在一个实施方案中，所述抗ICOS抗体是单克隆抗体(mAb)。
在一个实施方案中，所述抗ICOS抗体是IgG1或IgG4。在一个实施方案中，所述抗ICOS抗体是IgG4。
在另一个实施方案中，所述超抗原选自蛋白A、蛋白G和蛋白L。
在一个实施方案中，在从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽的步骤之后，HCP的量小于约200 ng HCP/mg产物。
在另一个方面，提供了纯化抗ICOS抗体或其抗原结合片段并分离掉磷脂酶B-样2蛋白的方法，所述方法包括：(a)将包含所述抗ICOS抗体或其抗原结合片段和磷脂酶B-样2蛋白的溶液施加至超抗原色谱固体支持物，(b)用包含约100 mM辛酸盐和约1.1 M精氨酸的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述抗ICOS抗体或其抗原结合片段。
附图简述
图1：使用mAb1作为模型且洗涤液中辛酸钠的浓度不同的蛋白A洗脱液中的百分比产率(三角形，▲)和HCP浓度(正方形，■)。
图2：洗涤缓冲液中5种浓度的辛酸钠，在洗脱、剥离和洗涤级分中负载的mAb1的百分比。
图3：在不同辛酸钠浓度的溶液中MabSelect SuRe树脂的mAb1吸附的Langmuir等温线拟合。
图4：用100 mM和250 mM辛酸钠洗涤缓冲液的5种mAb的蛋白A洗脱液HCP浓度。
图5：用各种pH的含有不同浓度的辛酸钠和精氨酸的洗涤缓冲液的mAb2的蛋白A洗脱液HCP浓度。注：所有洗涤缓冲液都含有300 mM乙酸钠。
图6：用各种pH的含有不同浓度的辛酸钠和精氨酸的洗涤缓冲液的两种不同mAb1进料流的蛋白A洗脱液HCP浓度。注：所有洗涤缓冲液都含有300 mM乙酸钠。
图7：用各种pH的含有不同浓度的辛酸钠和精氨酸的洗涤缓冲液的mAb5进料流的蛋白A洗脱液PLBL2浓度。
图8：用各种pH的含有不同浓度的辛酸钠和精氨酸的洗涤缓冲液的mAb5进料流的蛋白A洗脱液HCP浓度。
图9：用各种pH的含有不同浓度的辛酸钠和精氨酸的洗涤缓冲液的mAb5进料流的蛋白A步骤产率。
图10：对于含有辛酸钠和精氨酸或赖氨酸的洗涤液的mAb3蛋白A洗脱液中的组织蛋白酶L活性。
图11：单克隆抗体工艺中间体的抗体片段化百分比。
图12：仅辛酸盐相比于辛酸盐加精氨酸洗涤缓冲液的HCP浓度。
图13：在25℃保持最长达10天的单克隆抗体散装原料药的抗体片段化百分比。
详述
应当理解，本发明不限于具体的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，其当然可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅为了描述具体实施方案的目的，而不是意欲限制。如本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该”包括多个/种指示物，除非上下文清楚地另外指示。因此，例如，提及“多肽”包括两种或更多种多肽的组合等。
术语“包含”涵盖“包括”或“由...组成”，例如“包含”X的组合物可以仅由X组成，或者可以包括另外的物质，例如X + Y。术语“基本上由…组成”将特征的范围限于指定的材料或步骤以及不实质性影响请求保护的特征的一种或多种基本特征的那些。术语“由...组成”排除任何另外的一种或多种组分的存在。
当是指可测量的值诸如量、时间持续时间等时，如本文所用的“约”意指涵盖距指定值的±20%或±10%(包括±5%、±1%和±0.1%)的变异，因为此类变异对于进行公开的方法是适当的。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等效的所有那些都可用于本发明测试的实践中，但本文描述优选的材料和方法。在描述和请求保护本发明中，将使用以下术语。
本文可互换使用“多肽”、“肽”和“蛋白”，是指氨基酸残基的聚合物。多肽可以是天然(组织来源的)起源的、重组的或由原核或真核细胞制备物天然表达的，或者是经由合成方法化学产生的。该术语适用于氨基酸聚合物(其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物)，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但发挥功能的方式与天然存在的氨基酸类似的化学化合物。科学和专利文献充分地描述了非天然残基；下面描述可用作天然氨基酸残基的模拟物的几种示例性非天然组合物和指导。芳族氨基酸的模拟物可通过由以下替代而生成：例如D-或L-萘基丙氨酸(naphylalanine)；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2噻吩基丙氨酸(thieneylalanine)；D-或L-1、-2,3-或4-芘基丙氨酸(pyreneylalanine)；D-或L-3噻吩基丙氨酸(thieneylalanine)；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或 L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸:D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯丙氨酸:D-对-氟-苯丙氨酸；D-或L-对-联苯基苯丙氨酸；K-或L-对-甲氧基-联苯基苯丙氨酸:D-或L-2-吲哚(烷基)丙氨酸；和D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基可以是取代或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、sec-isotyl、异戊基或非酸性氨基酸。非天然氨基酸的芳族环包括，例如噻唑基、噻吩基(thiophenyl)、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳族环。
如本文所用的“肽”包括作为本文具体例举的那些肽的保守变体的肽。如本文所用的“保守变体”表示用另一生物学相似的残基替代氨基酸残基。保守变体的实例包括但不限于，一个疏水性残基、诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、正亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个，或一个极性残基取代另一个，诸如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺等。可以彼此取代的中性亲水性氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸。
“保守变体”还包括使用取代的氨基酸代替未取代的母体氨基酸，条件是针对取代的多肽的抗体也与未取代的多肽免疫反应。此类保守取代在本文所述的蛋白的种类的定义内。
如本文所用的“阳离子的”是指在pH 7.4具有净正电荷的任何肽。肽的生物活性可以通过本领域技术人员已知和本文所述的标准方法测定。
当关于蛋白使用时，“重组”表示该蛋白已通过异源核酸或蛋白的引入或天然核酸或蛋白的改变进行修饰。
如本文所用，“治疗性蛋白”是指可以向哺乳动物施用以引发(例如)研究者或临床医生寻找的组织、系统、动物或人类的生物学或医学应答的任何蛋白和/或多肽。治疗性蛋白可以引发多于一种生物学或医学应答。此外，术语“治疗有效量”意指与未接受此类量的相应的受试者相比导致(但不限于)疾病、病症或副作用的治愈、预防或减轻或者疾病或病症的进展速率降低的任何量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量以及在患者中有效地引起增强或有助于第二种药剂的治疗作用的生理功能的量。
本文鉴定的所有“氨基酸”残基呈天然的L-构型。与标准多肽命名法一致，氨基酸残基的缩写如下表中所示。
表1：氨基酸缩写。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
应当注意，所有氨基酸残基序列在本文中通过其从左至右的方向为从氨基-末端至羧基-末端的常规方向的式代表。
纯化方法
在一个方面，本发明涉及纯化重组多肽并分离掉宿主细胞蛋白(HCP)的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和HCP的溶液施加至超抗原色谱固体支持物；(b)用包含辛酸盐和精氨酸的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽。
在一个方面，本发明涉及纯化重组多肽并分离掉宿主细胞蛋白(HCP)的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和HCP的溶液施加至超抗原色谱固体支持物；(b)用包含大于约50 mM辛酸盐和大于约0.5 M精氨酸的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽。
在一个方面，本发明涉及纯化重组多肽并分离掉宿主细胞蛋白(HCP)的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和HCP的溶液施加至超抗原色谱固体支持物；(b)用包含大于250 mM的浓度的辛酸盐的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽。
在一个方面，本发明涉及纯化重组多肽并分离掉宿主细胞蛋白(HCP)的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和HCP的溶液施加至超抗原色谱固体支持物，(b)用包含约150mM至约850mM辛酸盐的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽。
在另一个方面，本发明涉及纯化重组多肽并分离掉宿主细胞蛋白(HCP)的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和HCP的溶液施加至超抗原色谱固体支持物；(b1)用包含辛酸盐的第一洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；(b2)用包含精氨酸的第二洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽。
在另一个方面，本发明涉及纯化重组多肽并分离掉宿主细胞蛋白(HCP)的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和HCP的溶液施加至超抗原色谱固体支持物；(b1)用包含精氨酸的第一洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；(b2)用包含辛酸盐的第二洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽。
在步骤(a)中将溶液施加(或负载)至超抗原色谱固体支持物之后，重组多肽将吸附至固定在固体支持物上的超抗原。然后可以通过使固定的含有吸附的重组多肽的超抗原与如本文所述的洗涤缓冲液接触来除去HCP杂质。
“超抗原”是指在不同于这些蛋白的靶标-配体结合位点的位点处与免疫球蛋白超家族的成员相互作用的通用配体。葡萄球菌肠毒素是与T细胞受体相互作用的超抗原的实例。结合抗体的超抗原包括但不限于结合IgG恒定区的蛋白G (Bjorck和Kronvall (1984)J. Immunol., 133:969)；结合IgG恒定区和VH结构域的蛋白A (Forsgren和Sjoquist,(1966) J. Immunol., 97:822)；和结合VL结构域的蛋白L (Bjorck, (1988) J. Immunol., 140:1194)。因此，在一个实施方案中，所述超抗原选自蛋白A、蛋白G和蛋白L。
当在本文中使用时，术语“蛋白A”涵盖从其天然来源(例如，金黄色葡萄球菌的细胞壁)回收的蛋白A，合成产生的(例如通过肽合成或通过重组技术)的蛋白A及其保留结合具有CH2/CH3区域的蛋白的能力的变体。蛋白A可以从例如Repligen或Pharmacia商购。
如本文所用，“亲和色谱法”是一种色谱方法，其利用生物分子之间的特异性、可逆相互作用，而不是生物分子的一般特性，诸如等电点、疏水性或大小，来实现色谱分离。“蛋白A亲和色谱”或“蛋白A色谱”是指一种特异性亲和色谱方法，其利用蛋白A的IgG结合结构域对于免疫球蛋白分子的Fc部分的亲和力。该Fc部分包含人或动物免疫球蛋白恒定结构域CH2和CH3或与这些基本上相似的免疫球蛋白结构域。在实践中，蛋白A色谱法涉及使用固定至固体支持物的蛋白A。参见Gagnon, Protein A Affinity Chromatography,Purification Tools for Monoclonal Antibodies, pp. 155-198, ValidatedBiosystems, (1996)。蛋白G和蛋白L也可用于亲和色谱法。固体支持物是蛋白A附着在其上的非水性基质(例如，柱、树脂、基质、珠粒、凝胶等)。此类支持物包括琼脂糖、琼脂糖凝胶、玻璃、二氧化硅、聚苯乙烯、胶绵炭、沙子、聚甲基丙烯酸酯、交联的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)和具有葡聚糖表面增量剂的琼脂糖和任何其他合适的材料。此类材料是本领域中众所周知的。可以使用任何合适的方法将超抗原固定至固体支持物。用于将蛋白固定至合适的固体支持物的方法是本领域中众所周知的。参见例如Ostrove, in Guide to ProteinPurification, Methods in Enzymology, (1990) 182: 357-371。具有和不具有固定的蛋白A或蛋白L的此类固体支持物可容易地得自许多商业来源，诸如Vector Laboratory(Burlingame, Calif.)，Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Calif.)，BioRad(Hercules, Calif.)，Amersham Biosciences (GE Healthcare的一部分, Uppsala,Sweden)和Millipore (Billerica, Mass.)。
本文所述的方法可以包括一个或多个另外的纯化步骤，诸如一个或多个另外的色谱步骤。在一个实施方案中，所述一个或多个另外的色谱步骤选自：阴离子交换色谱、阳离子交换色谱和混合模式色谱，特别是阴离子交换色谱。
在一个实施方案中，该方法另外包括过滤通过本文所述的方法的步骤(c)产生的洗脱液。
在一个实施方案中，该方法在步骤(c)之后进一步包括以下步骤：(d)用30mM乙酸，100mM HCl将含有回收的蛋白的溶液滴定至约pH 3.5；(e)使步骤(d)的溶液在约pH 3.5下保持约30至约60分钟；和(f)用1M Tris将步骤(e)的溶液的pH调节至约pH 7.5。在一个实施方案中，该方法进一步包括过滤通过步骤(f)产生的溶液。
在一个实施方案中，在步骤(a)中施加至柱的重组蛋白的量(即负载比率)为35mg/ml或更少，诸如30 mg/ml或更少，20 mg/ml或更少，15 mg/ml或更少或10 mg/ml或更少。将理解的是，“负载比率”是指每毫升(ml)树脂的蛋白(例如单克隆抗体)的毫克数(mg)。
洗涤缓冲液
“缓冲液”是通过其酸-碱共轭物组分的作用而抵抗的pH的变化的缓冲溶液。“平衡缓冲液”是指用于制备用于色谱的固相的溶液。“负载缓冲液”是指用于将蛋白和杂质的混合物负载至固相(即色谱基质)上的溶液。平衡缓冲液和负载缓冲液可以相同。“洗涤缓冲液”是指在完成负载后用于从固相除去剩余杂质的溶液。“洗脱缓冲液”用于从色谱基质除去靶标蛋白。
“盐”是通过酸和碱的相互作用形成的化合物。
在本发明的一个方面，所述洗涤缓冲液包含脂族羧酸盐。所述脂族羧酸盐可以是直链或支链的。在某些实施方案中，所述脂族羧酸盐是脂族羧酸或其盐，或所述脂族羧酸盐的来源是脂族羧酸或其盐。在某些实施方案中，所述脂族羧酸盐是直链的，并且选自：甲酸(methanoic acid)(甲酸(formic acid))，乙酸(ethanoic acid)(乙酸(acetic acid))，丙酸(propanoic acid)(丙酸(propionic acid))，丁酸(butanoic acid)(丁酸(butyricacid))，戊酸(pentanoic acid)(戊酸(valeric acid))，己酸(hexanoic acid)(己酸(caproic acid))，庚酸(heptanoic acid)(庚酸(enanthic acid))，辛酸(octanoic acid)(辛酸(caprylic acid))，壬酸(nonanoic acid)(壬酸(pelargonic acid))，癸酸(decanoic acid)(癸酸(capric acid))，十一烷酸(undecanoic acid)(十一烷酸(undecylic acid))，十二烷酸(dodecanoic acid)(月桂酸(lauric acid))，十三烷酸(tridecanoic acid)(十三烷酸(tridecylic acid))，十四烷酸(tetradecanoic acid)(肉豆蔻酸(myristic acid))，十五烷酸(pentadecanoic acid)，十六烷酸(hexadecanoicacid)(棕榈酸(palmitic acid))，十七烷酸(heptadecanoic acid)(十七烷酸(margaricacid))，十八烷酸(octadecanoic acid)(硬脂酸(stearic acid))和二十烷酸(icosanoicacid)(花生二酸(arachididic acid))或其任何盐。因此，所述脂族羧酸盐可以包含长度为1-20个碳的碳主链。在一个实施方案中，所述脂族羧酸盐包含6-12个碳主链。在一个实施方案中，所述脂族羧酸盐选自己酸盐、庚酸盐、辛酸盐、癸酸酯和十二酸盐。在一个进一步实施方案中，所述脂族羧酸盐是辛酸盐。
在一个实施方案中，所述脂族羧酸盐的来源选自脂族羧酸、脂族羧酸的钠盐、脂族羧酸的钾盐和脂族羧酸的铵盐。在一个实施方案中，所述脂族羧酸盐的来源是脂族羧酸的钠盐。在一个进一步实施方案中，所述洗涤缓冲液包含辛酸钠、癸酸钠或十二烷酸钠，特别是辛酸钠。
在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含大于约50 mM辛酸盐。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含大于约200 mM辛酸盐。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含大于约250 mM辛酸盐。在一个进一步实施方案中，所述洗涤缓冲液包含至少约50 mM辛酸盐，诸如至少约75 mM、约100 mM、约150 mM、约200 mM、约250 mM或约300 mM辛酸盐。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含小于约850 mM辛酸盐，诸如小于约800 mM、约750 mM、约700mM、约650 mM、约600 mM、约550 mM、约500 mM、约450 mM、约400 mM、约350 mM、约300 mM辛酸盐。在另一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约100 mM、约125 mM、约150 mM、约175mM、约200 mM或约250 mM辛酸盐。
在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含大于约50 mM辛酸钠。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含大于约200 mM辛酸钠。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含大于约250 mM辛酸钠。在一个进一步实施方案中，所述洗涤缓冲液包含至少约50 mM辛酸钠，诸如至少约75 mM、约100 mM、约150 mM、约200 mM、约250 mM或约300 mM辛酸钠。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含小于约850 mM辛酸钠，诸如小于约800 mM、约750 mM、约700mM、约650 mM、约600 mM、约550 mM、约500 mM、约450 mM、约400 mM、约350 mM、约300 mM辛酸钠。在另一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约100 mM、约125 mM、约150 mM、约175mM、约200 mM或约250 mM辛酸钠。
在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约50 mM至约750 mM辛酸盐；约50 mM至约500 mM辛酸盐；约75 mM至约400 mM辛酸盐；约75 mM至约350 mM辛酸盐；约75 mM至约300mM辛酸盐；约75 mM至约200 mM辛酸盐；大于约250 mM至约750 mM辛酸盐；大于约250 mM至约500 mM辛酸盐；大于约250 mM至约400 mM辛酸盐；大于约250 mM至约350 mM辛酸盐；或大于约250 mM至约300 mM辛酸盐。
在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约50 mM至约750 mM辛酸钠；约50 mM至约500 mM辛酸钠；约75 mM至约400 mM辛酸钠；约75 mM至约350 mM辛酸钠；约75 mM至约300mM辛酸钠；约75 mM至约200 mM辛酸钠；大于约250 mM至约750 mM辛酸钠；大于约250 mM至约500 mM辛酸钠；大于约250 mM至约400 mM辛酸钠；大于约250 mM至约350 mM辛酸钠；或大于约250 mM至约300 mM辛酸钠。
在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含有机酸、有机酸的共轭碱的碱金属或铵盐和有机碱。在一个实施方案中，在不添加NaCl的情况下制备洗涤缓冲液。
在一个实施方案中，所述有机酸的共轭碱是有机酸的共轭碱的钠、钾或铵盐。在一个实施方案中，所述有机酸是乙酸，且乙酸的共轭碱是钠盐(即乙酸钠)。
在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液另外包含约1 mM至约500 mM乙酸。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约45 mM乙酸。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液另外包含约1 mM至约500 mM Tris碱。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约55 mM Tris碱。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液另外包含约1 mM至约500 mM乙酸钠。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约300 mM乙酸钠。
在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液的pH在约pH 7至约pH 9之间；例如约pH 7.5至约pH 8.5。
在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约0.25 M至约1.5 M精氨酸。在一个进一步实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约0.25 M至约2 M精氨酸。在一个进一步实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约0.5 M至约2 M精氨酸。在又另一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约0.75 M至约1.5 M精氨酸。在一个进一步实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约1 M、约1.1 M、约1.2 M、约1.3 M、约1.4 M、约1.5 M、约1.6 M、约1.7 M、约1.8 M、约1.9 M或约2 M精氨酸。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约0.5 M至约2 M精氨酸，特别是约0.75 M至约2 M精氨酸。在一个进一步实施方案中，所述洗涤缓冲液包含大于约1 M精氨酸。
将理解的是，提及“精氨酸”不仅是指天然氨基酸，而且涵盖精氨酸衍生物或其盐，诸如精氨酸HCl、乙酰基精氨酸、胍丁胺、arginic acid、N-α-丁酰基-L-精氨酸或N-α-戊酰基精氨酸。
或者，可以将精氨酸包括在初始洗涤缓冲液中(即，同时使用)。因此，在一个方面，本发明提供了纯化重组多肽并分离掉宿主细胞蛋白(HCP)的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和HCP的溶液施加至超抗原色谱固体支持物，(b)用包含约100 mM至约850mM辛酸盐和约0.25 M至约1.5 M精氨酸的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽。如本文所述的实施例中所示，包含辛酸盐和精氨酸的组合的超抗原色谱洗涤液具有提高的宿主细胞蛋白清除率的意料之外的协同作用，特别是对于除去PLBL2和组织蛋白酶L而言，所述PLBL2和组织蛋白酶L是两种特别难以除去的宿主细胞蛋白。
在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约100 mM至约750 mM辛酸盐；约100 mM至约500 mM辛酸盐；约100 mM至约400 mM辛酸盐；约100 mM至约350 mM辛酸盐；或约100 mM至约300 mM辛酸盐；和/或约0.25 M至约2 M精氨酸，约0.5 M至约1.5 M精氨酸；或约0.5 M至约1 M精氨酸。
在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约100 mM至约750 mM辛酸钠；约100 mM至约500 mM辛酸钠；约100 mM至约400 mM辛酸钠；约100 mM至约350 mM辛酸钠；或约100 mM至约300 mM辛酸钠；和/或约0.25 M至约2 M精氨酸；约0.5 M至约1.5 M精氨酸；或约0.5 M至约1 M精氨酸。
在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液包含约0.5 M至约2 M精氨酸和约50 mM至约750 mM辛酸钠；约0.5 M至约1.5 M精氨酸和约50 mM至约500 mM辛酸钠；或约0.5 M至约1.5M精氨酸和约50 mM至约250 mM辛酸钠。
在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液进一步包含约0.5 M至约1 M赖氨酸，诸如约0.75 M赖氨酸。在该实施方案中，将所述赖氨酸包括在初始洗涤缓冲液中(即，同时使用)。在一个替代实施方案中，将所述赖氨酸包括在分开的洗涤缓冲液中(即依次使用)。如本文提供的实施例中所示，显示赖氨酸的添加成功地减少洗脱体积。
重组多肽
如本文所用的术语“结合蛋白”是指能够结合抗原的抗体和其他蛋白构建体，诸如结构域。
术语“抗体”在本文中以最广泛意义用来指具有免疫球蛋白样结构域(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)的分子，并且包括单克隆、重组、多克隆、嵌合、人、人源化、多特异性的抗体，包括双特异性抗体和异源缀合物抗体；单一可变结构域(例如VH、VHH、VL、结构域抗体(dAbTM))、抗原结合抗体片段、Fab、F(ab’)2、Fv、二硫化物连接的Fv、单链Fv、二硫化物连接的scFv、双抗体、TANDABS™等，以及上述任一种的修饰版本。
替代抗体形式包括替代骨架，其中抗原结合蛋白的一个或多个CDR可以被排列在合适的非免疫球蛋白支架或骨架(诸如亲合体、SpA支架、LDL受体A类结构域、亲和多聚体(avimer)或EGF结构域)上。
在一个实施方案中，所述多肽是抗原结合多肽。在一个实施方案中，所述抗原结合多肽选自抗体、抗体片段、免疫球蛋白单可变结构域(dAb)、mAbdAb、Fab、F(ab')2、Fv、二硫化物连接的Fv、scFv、闭合构象多特异性抗体、二硫化物连接的scFv、双抗体或可溶性受体。在一个进一步实施方案中，所述抗原结合蛋白是抗体，例如单克隆抗体(mAb)。术语，重组多肽、产物分子和mAb在本文中可互换使用。该抗体可以是例如嵌合、人源化或结构域抗体。
术语Fv、Fc、Fd、Fab或F(ab)2以其标准含义使用(参见，例如，Harlow等人,Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988))。
“嵌合抗体”是指一种类型的工程改造的抗体，其含有衍生自供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)，其与衍生自受体抗体的轻链和重链恒定区缔合。
“人源化抗体”是指其CDR衍生自非人供体免疫球蛋白的一种类型的工程改造的抗体，该分子的剩余免疫球蛋白衍生部分衍生自一种(或多种)人免疫球蛋白。另外，可以改变框架支持残基以保持结合亲和力(参见例如，Queen等人, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10032, Hodgson等人, (1991) Bio/Technology, 9:421)。合适的人受体抗体可以是通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性选自常规数据库、例如KABAT.RTM.数据库、Los Alamos数据库和Swiss Protein数据库的抗体。特征在于与供体抗体的框架区的同源性(基于氨基酸)的人抗体可以合适于提供重链恒定区和/或重链可变框架区用于插入供体CDR。可以类似的方式选择能够提供轻链恒定区或可变框架区的合适的受体抗体。应当注意，不需要受体抗体的重链和轻链源于相同的受体抗体。现有技术描述了生产此类人源化抗体的几种方式-例如参见EP-A-0239400和EP-A-054951。
术语“供体抗体”是指这样的抗体(单克隆和/或重组)，其将其可变区、CDR或其他功能片段或其类似物的氨基酸序列贡献给第一免疫球蛋白配偶体，以便提供改变的免疫球蛋白编码区；和所得的表达改变的抗体，其具有供体抗体特征性的抗原特异性和中和活性。术语“受体抗体”是指与供体抗体异源的抗体(单克隆和/或重组)，其向第一免疫球蛋白配偶体贡献编码其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区的氨基酸序列的全部(或任何部分，但在一些实施方案中，全部)。在某些实施方案中，人抗体可以是受体抗体。
“CDR”被定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其为免疫球蛋白重链和轻链的高可变区。参见，例如，Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第4版, U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes ofHealth (1987)。在免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链CDR(或CDR区)和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，如本文所用的“CDR”是指全部三个重链CDR或全部三个轻链CDR(或全部重链CDR和轻链CDR两者，如果适当)。抗体的结构和蛋白折叠可能意味着其他残基被认为是抗原结合区的一部分，并且技术人员会理解为如此(参见例如Chothia等人, (1989) Nature342:877-883)。
如本文所用的术语“VH”和“VL”分别是指抗原结合蛋白的重链可变区和轻链可变区。
在整个本说明书中，可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基根据Kabat编号惯例编号。类似地，实施例中使用的术语“CDR”、“CDRL1”、“CDRL2”、“CDRL3”、“CDRH1”、“CDRH2”、“CDRH3”遵循Kabat编号惯例。对于进一步信息，参见Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and HumanServices，National Institutes of Health(1991)。
对于本领域技术人员显而易见的是，存在可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基的替代编号惯例。也存在CDR序列的替代编号惯例，例如在Chothia等人(1989)Nature 342: 877-883中阐述的那些。抗体的结构和蛋白折叠可以意味着其他残基被认为是CDR序列的一部分，并且技术人员会理解为如此。
技术人员可获得的CDR序列的其他编号惯例包括“AbM”(University of Bath)和“接触(contact)”(University College London)方法。可使用Kabat、Chothia、AbM和接触方法中的至少两种确定最小重叠区域以提供“最小结合单元”。最小结合单元可以是CDR的子部分。
查询核酸序列和主题核酸序列之间的“同一性百分比”为“同一性”值，其表示为百分比，其是在进行成对BLASTN比对后，当主题核酸序列与查询核酸序列具有100%查询覆盖率时，通过BLASTN算法计算的。查询核酸序列和主题核酸序列之间的此类成对BLASTN比对通过使用在National Center for Biotechnology Institute的网站上可得的BLASTN算法的默认设置进行，其中关闭低复杂度区域的过滤器。
查询氨基酸序列和主题氨基酸序列之间的“同一性百分比”为“同一性”值，其表示为百分比，其是在进行成对BLASTNP比对后，当主题氨基酸序列与查询氨基酸序列具有100%查询覆盖率时，通过BLASTNP算法计算的。查询氨基酸序列和主题氨基酸序列之间的此类成对BLASTNP比对通过使用在National Center for Biotechnology Institute的网站上可得的BLASTNP算法的默认设置进行，其中关闭低复杂度区域的过滤器。
查询序列可以与主题序列具有100%同一性，或者与主题序列相比，其可以包括最多达特定整数数目的氨基酸或核苷酸改变，使得%同一性小于100%。例如，查询序列与主题序列具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。此类改变包括至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守和非保守取代)或插入，并且其中所述改变可以发生在查询序列的氨基或羧基末端位置，或那些末端位置之间的任何位置，其单独地散布在查询序列中的氨基酸或核苷酸间，或在查询序列内的一个或多个连续组中。
可以在查询序列的整个长度(包括CDR)上确定%同一性。或者，%同一性可以排除CDR，例如CDR与主题序列具有100%同一性，并且%同一性变化在查询序列的剩余部分中，使得CDR序列是固定的/完整的。
如本文所用，术语“结构域”是指折叠的蛋白结构，其具有独立于蛋白的剩余部分的三级结构。通常，结构域负责蛋白的离散的功能特性，并且在许多情况下可以被添加、除去或转移至其他蛋白，而不损失蛋白和/或结构域的剩余部分的功能。“抗体单一可变结构域”是包含抗体可变结构域特征性序列的折叠的多肽结构域。因此，其包括完整抗体可变结构域以及修饰的可变结构域(例如，其中一个或多个环已经被抗体可变结构域的非特征序列替代)，或已被截短或包含N-或C-末端延伸的抗体可变结构域，以及至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。
短语“免疫球蛋白单一可变结构域”是指不依赖不同的V区域或结构域而特异性结合抗原或表位的抗体可变结构域(VH、VHH、VL)。免疫球蛋白单一可变结构域可以与其他、不同的可变区或可变结构域以一种形式(例如同型多聚体或异型多聚体)存在，其中其他区域或结构域不是单一免疫球蛋白可变结构域的抗原结合所需的(即，其中该免疫球蛋白单一可变结构域不依赖于另外的可变结构域而结合抗原)。当本文使用术语时，“结构域抗体”或“dAb”与能够结合抗原的“免疫球蛋白单一可变结构域”是相同的。免疫球蛋白单一可变结构域可以是人抗体可变结构域，但也包括来自其他物种的单一抗体可变结构域，诸如啮齿动物(例如，如WO 00/29004中所公开)、铰口鲨和骆驼科VHH dAbs (纳米抗体)。骆驼科VHH是源自产生天然缺乏轻链的重链抗体的物种(包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼)的免疫球蛋白单一可变结构域多肽。此类VHH结构域可以根据本领域中可得的标准技术人源化，并且此类结构域仍然被认为是根据本发明的“结构域抗体”。如本文所用，"VH包括骆驼科VHH结构域。NARV是另一种类型的免疫球蛋白单一可变结构域，其在包括铰口鲨的软骨鱼中鉴定。这些结构域也被称为新型抗原受体可变区(通常缩写为V(NAR)或NARV)。对于进一步的细节，参见Mol. Immunol. (2006) 44, 656-665和US2005/0043519。
术语“mAbdAb”和“dAbmAb”在本文中用于指包含单克隆抗体和至少一种单结构域抗体的抗原-结合蛋白。两个术语可以可互换使用，并且意欲具有与本文所用相同的含义。
经常，纯化重组多肽并分离掉宿主细胞蛋白导致重组多肽的片段化。申请人已发现，当利用本文所述的纯化方法时，重组多肽片段化的量显著减少。在一个实施方案中，洗脱的重组多肽含有小于约10%、约9%、约8%、约7%、约6%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%片段化的重组多肽。在另一个实施方案中，所述重组多肽是抗体，且洗脱的抗体包含小于约10%、约9%、约8%、约7%、约6%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%片段化的抗体。
ICOS抗体
如本文所用，“ICOS”意指任何诱导型T细胞共刺激剂蛋白。ICOS(诱导型T细胞共刺激剂)的替代名称包括AILIM；CD278；CVID1、JTT-1或JTT-2、MGC39850或8F4。ICOS是在活化的T细胞上表达的CD28-超家族共刺激性分子。由该基因编码的蛋白属于CD28和CTLA-4细胞表面受体家族。其形成同型二聚体并在细胞-细胞信号传导、免疫应答和细胞增殖的调节中发挥重要作用。人ICOS(同种型2)(登录号: UniProtKB - Q9Y6W8-2)的氨基酸序列在下面显示为SEQ ID NO:9。
Figure 961361DEST_PATH_IMAGE002
人ICOS(同种型1)(登录号: UniProtKB - Q9Y6W8-1)的氨基酸序列在下面显示为SEQ ID NO:10。
Figure 471977DEST_PATH_IMAGE003
ICOS的活化经由通过ICOS-L(B7RP-1/B7-H2)的结合而发生。B7-1和B7-2(CD28和CTLA4的配体)都不结合或活化ICOS。然而，已经显示ICOS-L微弱结合CD28和CTLA-4两者(Yao S等人, “B7-H2 is a costimulatory ligand for CD28 in human”, Immunity, 34(5); 729-40 (2011))。ICOS的表达似乎限于T细胞。ICOS表达水平在不同的T细胞亚群和T细胞活化状态之间变化。已经显示ICOS表达在静息TH17、T滤泡辅助(TFH)和调节性T(Treg)细胞上；然而，不同于CD28；ICOS在幼稚TH1和TH2效应子T细胞群体上并不高度表达(PaulosCM等人, “The inducible costimulator (ICOS) is critical for the development ofhuman Th17 cells”, Sci Transl Med, 2(55); 55ra78 (2010))。在通过TCR接合而活化后，ICOS表达在CD4+和CD8+效应子T细胞上被高度诱导(Wakamatsu E,等人, “Convergentand divergent effects of costimulatory molecules in conventional andregulatory CD4+ T cells”, Proc Natal Acad Sci USA, 110(3); 1023-8 (2013))。通过ICOS受体的共刺激信号传导仅发生在接受同时TCR活化信号的T细胞中(Sharpe AH和Freeman GJ. “The B7-CD28 Superfamily”, Nat. Rev Immunol, 2(2); 116-26(2002))。在活化的抗原特异性T细胞中，ICOS调节TH1和TH2细胞因子(包括IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-4、IL-13和其他)的产生。ICOS也刺激效应子T细胞增殖，尽管程度小于CD28(Sharpe AH和Freeman GJ. “The B7-CD28 Superfamily”, Nat. Rev Immunol, 2(2);116-26 (2002))。针对ICOS的抗体及其在疾病治疗中的使用方法描述于例如WO 2012/131004、US20110243929、US20160304610和US20160215059中。US20160215059通过引用并入本文。US20160304610中描述的示例性抗体包括37A10S71。37A10S713的重链、轻链和CDR序列在下面作为SEQ ID NO: 11-18再现。
Figure 454976DEST_PATH_IMAGE004
Figure 850186DEST_PATH_IMAGE005
如本文所用的术语“ICOS结合蛋白”是指能够结合ICOS的抗体和其他蛋白构建体，诸如结构域。在一些情况下，ICOS是人ICOS。术语“ICOS结合蛋白”可以与“ICOS抗原结合蛋白”可互换使用。因此，如本领域中所理解，抗ICOS抗体和/或ICOS抗原结合蛋白将被认为是ICOS结合蛋白。如本文所用，“抗原结合蛋白”是结合抗原(诸如ICOS)的任何蛋白，包括但不限于本文所述的抗体、结构域和其他构建体。如本文所用，ICOS结合蛋白的“抗原结合部分”将包括ICOS结合蛋白的能够结合ICOS的任何部分，包括但不限于抗原结合抗体片段。
在一个实施方案中，本发明的ICOS抗体包含以下CDR中的任何一个或组合：
Figure 740257DEST_PATH_IMAGE006
在一些实施方案中，本发明的抗ICOS抗体包含重链可变区，其与SEQ ID NO:7具有至少90%序列同一性。合适地，本发明的ICOS结合蛋白可包含重链可变区，其与SEQ ID NO:7具有约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。
人源化重链(VH)可变区(H2)：
Figure 156195DEST_PATH_IMAGE007
在本发明的一个实施方案中，所述 ICOS抗体在具有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的轻链可变区中包含CDRL1 (SEQ ID NO:4)、CDRL2 (SEQ ID NO:5)和CDRL3 (SEQ IDNO:6)。包含SEQ ID NO:8中所示的人源化轻链可变区的本发明的ICOS结合蛋白被命名为“L5”。因此，包含SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:8的轻链可变区的本发明的ICOS结合蛋白在本文中可被命名为H2L5。在本文的实施例中，mAb5包含SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:8的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明的ICOS结合蛋白包含轻链可变区，其与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性。合适地，本发明的ICOS结合蛋白可包含轻链可变区，其与SEQ ID NO:8具有约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。
人源化轻链(VL)可变区(L5)
Figure 626490DEST_PATH_IMAGE008
CDR或最小结合单元可以通过至少一个氨基酸取代、缺失或添加进行修饰，其中变体抗原结合蛋白基本上保留未修饰蛋白(诸如包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的抗体)的生物学特征。
应理解，CDR H1、H2、H3、L1、L2、L3各自都可以单独或与任何其他CDR组合以任何排列或组合进行修饰。在一个实施方案中，通过取代、缺失或添加最多达3个氨基酸(例如1或2个氨基酸，例如1个氨基酸)来修饰CDR。典型地，所述修饰是取代，尤其是保守取代，例如如下表1中所示。
表1
侧链 成员
疏水的 Met、Ala、Val、Leu、Ile
中性亲水的 Cys、Ser、Thr
酸性的 Asp、Glu
碱性的 Asn、Gln、His、Lys、Arg
影响链取向的残基 Gly、Pro
芳族的 Trp、Tyr、Phe
抗体的亚类部分决定次级效应子功能，诸如补体活化或Fc受体(FcR)结合和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)(Huber,等人, Nature 229(5284): 419-20 (1971);Brunhouse,等人, Mol Immunol 16(11): 907-17 (1979))。在鉴定用于具体应用的最佳抗体类型中，可以考虑抗体的效应子功能。例如，hIgG1抗体具有相对长的半衰期，在固定补体方面非常有效，并且它们结合FcγRI和FcγRII结两者。相比之下，人IgG4抗体具有较短的半衰期，不固定补体并且对FcR具有较低的亲和力。在IgG4的Fc区中用脯氨酸替代丝氨酸228(S228P)降低用hIgG4观察到的异质性并延长血清半衰期(Kabat,等人, “Sequences ofproteins of immunological interest” 第5版 (1991); Angal,等人, Mol Immunol 30(1): 105-8 (1993))。用谷氨酸替代亮氨酸235(L235E)的第二个突变消除残余FcR结合和补体结合活性(Alegre, 等人, J Immunol 148(11): 3461-8 (1992))。所得的具有两个突变的抗体被称为IgG4PE。hIgG4氨基酸的编号源自EU编号参考资料：Edelman, G.M.等人,Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969). PMID: 5257969。在本发明的一个实施方案中，ICOS抗体是IgG4同种型。在一个实施方案中，ICOS抗体包含IgG4 Fc区，所述IgG4 Fc区包含替代S228P和L235E，可以具有名称IgG4PE。在本文的实施例中，mAb5含有包含突变S228P和L235E的IgG4 Fc区。
如本文所用，“ICOS-L”和“ICOS配体”可互换使用，并且是指人ICOS的膜结合的天然配体。ICOS配体是在人中由ICOSLG基因编码的蛋白。ICOSLG也已被命名为CD275(分化簇275)。ICOS-L的替代名称包括B7RP-1和B7-H2。
宿主细胞蛋白
“杂质”是指在超抗原色谱之前负载样品中存在或超抗原色谱之后洗脱液中存在的任何外来或不期望的分子。可能存在“工艺杂质”。这些是由于其中产生目标蛋白的工艺而存在的杂质。例如，这些包括宿主细胞蛋白(HCP)、RNA和DNA。“HCP”是指宿主细胞在细胞培养或发酵期间产生的与目标蛋白无关的蛋白，包括细胞内和/或分泌的蛋白。宿主细胞蛋白的实例是蛋白酶，如果在纯化期间和之后仍然存在，则所述蛋白酶可以引起对目标蛋白的损害。例如，如果蛋白酶保留在包含目标蛋白的样品中，则其可以产生产品相关的物质或最初不存在的杂质。在纯化工艺期间和/或在最终制剂中，蛋白酶的存在可以随着时间引起目标蛋白的衰减，例如片段化。
在一个实施方案中，所述宿主细胞蛋白从哺乳动物细胞或细菌细胞产生/衍生。在一个进一步实施方案中，所述哺乳动物细胞选自人或啮齿动物(诸如仓鼠或小鼠)细胞。在又一个进一步实施方案中，人细胞是HEK细胞，仓鼠细胞是CHO细胞或小鼠细胞是NS0细胞。
在某些实施方案中，所述宿主细胞选自CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、K562细胞、BHK细胞、PER.C6细胞和HEK细胞(即，所述宿主细胞蛋白源自这些宿主细胞)。或者，所述宿主细胞可以是选自大肠杆菌(例如，W3110、BL21)、枯草芽孢杆菌和/或其他合适细菌的细菌细胞；真核细胞，诸如真菌或酵母细胞(例如，巴斯德毕赤酵母、曲霉属物种、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、粗糙脉孢菌)。
“溶液”可以是细胞培养基，例如细胞培养进料流。所述进料流可以是过滤的。所述溶液可以是澄清的未处理培养液(CUB)(或澄清的发酵培养液/上清液)。CUB也称为细胞培养上清液，其中任何细胞和/或细胞碎片都通过澄清除去。所述溶液可以是表达蛋白的细胞的裂解制备物(例如溶液是裂解物)。
工艺杂质还包括用于使细胞生长或确保目标蛋白表达的组分，例如溶剂(例如用于培养酵母细胞的甲醇)，抗生素，甲氨蝶呤(MTX)，培养基组分，絮凝剂等。还包括作为在先前的步骤期间渗入样品中的超抗原固相的一部分的分子，例如，蛋白A、蛋白G或蛋白L。
杂质还包括“产物相关的变体”，其包括保留其活性、但其结构不同的蛋白，以及由于其结构的差异而失去其活性的蛋白。这些产物相关的变体包括，例如，高分子量物质(HMWs)、低分子量物质(LMWs)、聚集蛋白、前体、降解蛋白、错折叠蛋白、二硫键键合不足的蛋白、片段和脱酰胺物质。
可以测量洗脱液中这些杂质中的任一种的存在，以确定洗涤步骤是否已经成功。例如，我们已经显示HCP水平(表示为ng HCP/mg产物)的降低(参见实施例)。或者，检测到的HCP可以表示为“百万分之一”或“ppm”(其等同于ng/mg)，或“ ppb”(“十亿分之一”)(其等同于pg/mg)。
在一个实施方案中，在步骤(c)之后，HCP的量小于约200 ng HCP/mg产物(即ng/mg)；小于约150 ng/mg；小于约100 ng/mg；小于约50 ng/mg；或小于约20 ng/mg。
当与没有脂族羧酸盐的对照洗涤步骤相比时，和/或当与纯化前的溶液(例如，澄清的未处理的培养液)相比时，也可以显示减少。
在一个实施方案中，在步骤(c)之后，HCP的相对降低倍数 –与先前公开的100 mM辛酸盐洗涤液(例如，参见WO2014/141150)相比 –为约2倍至约50倍。因此，在一个实施方案中，在步骤(c)之后，与基本上由100 mM辛酸盐组成的洗涤缓冲液相比，HCP的相对降低倍数为约2倍至约50倍。在一个进一步实施方案中，相对降低倍数为至少约2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍或50倍。为了避免疑问，提及“基本上由100 mM辛酸盐组成的洗涤缓冲液”不排除存在不实质上影响100 mM辛酸盐洗涤液的基本特征的另外组分，例如缓冲盐和/或乙酸钠。
在一个实施方案中，在本发明的洗涤步骤之后，来自洗脱液的目标蛋白的回收率为100%、99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、70%、60%、50%或更少，包括100%至50%的范围内的任何离散值或由该范围内的任何对离散值所限定的任何子范围。在一个实施方案中，来自洗脱液的目标蛋白的回收率为超过70%，诸如超过75%、80%、85%、90%、95%或99%。洗脱液中的百分比(%)回收率通过如下计算：根据下式确定洗脱液中目标蛋白的量相对于施加至柱的目标蛋白的量的百分比：
百分比回收率 = 洗脱液中的产物量 ÷ 施加至柱的产物量X 100。
洗脱液中存在的杂质(即宿主细胞蛋白)的量可以通过ELISA、OCTET或测定一种或多种上述杂质的水平的其他方法测定。在本文所述的实施例中，ELISA方法用于测定样品中的HCP的水平。
在一个实施方案中，所述宿主细胞蛋白选自PLBL2(磷脂酶B-样2蛋白)和/或组织蛋白酶L。
在一个实施方案中，所述宿主细胞蛋白是PLBL2。因此，在本发明的一个方面，提供了纯化重组多肽并分离掉磷脂酶B-样2蛋白(PLBL2)的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和PLBL2的溶液施加至超抗原色谱固体支持物，(b)用包含约150 mM至约850 mM辛酸盐的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽。
在本发明的另一个方面，提供了纯化重组多肽并分离掉磷脂酶B-样2蛋白(PLBL2)的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和PLBL2的溶液施加至超抗原色谱固体支持物，(b)用包含约55 mM至约850 mM辛酸盐和约0.25 M至约1.5 M精氨酸的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽。
在本发明的另一个方面，提供了纯化重组多肽并分离掉磷脂酶B-样2蛋白(PLBL2)的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和PLBL2的溶液施加至超抗原色谱固体支持物，(b)用包含约100 mM辛酸盐和约1.1 M精氨酸的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽。
已经发现PLBL2是HCP杂质，其由于与产物分子的明显结合，在抗体、特别是mAb5(参见实施例)的下游处理期间难以除去。因此，在一个实施方案中，所述重组多肽是抗体，诸如IgG抗体，特别是IgG4抗体。可以使用本领域中已知的方法，诸如通过ELISA，例如实施例中描述或WO2015/038884中公开的PLBL2-特异性ELISA，来测量PLBL2量。
组织蛋白酶L蛋白酶在CHO细胞培养期间产生，并且其可以潜在地降解抗体，诸如mAb3产物分子(参见实施例)。因此，在一个实施方案中，所述重组多肽是抗体，诸如IgG抗体，特别是IgG1抗体。
在一个实施方案中，所述宿主细胞蛋白是组织蛋白酶L。在该实施方案中，可以通过步骤(c)的洗脱液中降低的组织蛋白酶L活性(例如，用PromoKine PK-CA577-K142)来测量纯化重组多肽并分离掉组织蛋白酶L。
在本发明的一个方面，提供了纯化重组多肽并分离掉组织蛋白酶L的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和组织蛋白酶L的溶液施加至超抗原色谱固体支持物，(b)用包含约150 mM至约850 mM辛酸盐的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽。
在本发明的另一个方面，提供了纯化重组多肽并分离掉组织蛋白酶L的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和组织蛋白酶L的溶液施加至超抗原色谱固体支持物，(b)用包含约55 mM至约850 mM辛酸盐和约0.25 M至约1.5 M精氨酸的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽。
在本发明的另一个方面，提供了纯化重组多肽并分离掉组织蛋白酶L的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和组织蛋白酶L的溶液施加至超抗原色谱固体支持物，(b)用包含约150 mM辛酸盐和约1.1 M精氨酸的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽。
在本发明的一个方面，提供了通过本文定义的纯化方法中的任一种获得的纯化的重组多肽。
本发明现在将参考以下非限制性实施例进行描述。
聚山梨醇酯降解
聚山梨醇酯，诸如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80是广泛用于稳定最终制剂产品中的蛋白药物的非离子型表面活性剂。聚山梨醇酯可以被药物产品中的残余酶降解，这可能影响产品的最终保质期。不受理论的束缚，本文描述的方法通过减少最终产物中残余的宿主细胞蛋白的量来减少降解的聚山梨醇酯的量。在一个实施方案中，降解的聚山梨醇酯的量小于约50%、约40%、约30%、约20%、约10%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%。
实施例1：蛋白A洗涤液中pH和辛酸钠浓度的筛选和优化
引言
在本文所述的工作中，对于所有mAb产物，通过两柱工艺(蛋白A、随后为阴离子交换)优化蛋白A洗涤液，以实现足够的HCP除去。现有的平台工艺通常需要第二抛光步骤来达到所需的HCP水平。消除色谱步骤简化工艺，使得能够开发更快的工艺，并且可以减轻设施安装风险。洗涤优化的策略是通过破坏HCP-mAb相互作用来提高HCP清除率。筛选各种洗涤添加剂和洗涤pH，且然后针对蛋白A工艺中的总HCP除去进行优化。
材料和方法
正辛酸钠、冰醋酸、乙酸钠、氢氧化钠、苯甲醇和trizma碱购自Sigma-AldrichChemical Co. (St. Louis, MO)。使用水制备溶液，其使用Millipore Milli-Q®系统进一步纯化。使用3 M tris碱或3 M乙酸进行任何pH调节。
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养用于mAb产生
澄清的未过滤培养液(CUB)含有几种GSK mAb产物之一，所述GSK mAb产物诸如mAb1(IgG1，pI = 8.7，MW = 149 kDa)，mAb2 (IgG1，pI = 8.3，MW = 149 kDa)，mAb3 (IgG1，pI= 7.9，MW = 149 kDa)，mAb4 (IgG1，pI = 8.6，MW = 148 kDa)，或mAb5 (IgG4，pI = 7.1，MW = 145 kDa)。mAb5包含SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:8的轻链可变区，并且含有包含突变S228P和L235E的IgG4 Fc区。使用相似的方法来生产和收获本研究中使用的所有mAb。例如，通过在2升反应器中接种表达mAb1的DG44细胞(活细胞计数为1.23-1.24 MM/mL，且活力为~93.8%)来制备mAb1。然后将培养物在~34℃、pH ~6.9和6 g/L葡萄糖下维持16天。将搅拌速度维持在~300 rpm。培养后，将含有未澄清的细胞和mAb的培养液以10,000g分批离心20分钟。然后将培养液通过来自Nalgene的0.45 µM和0.2 µM SFCA过滤器进行真空过滤。
蛋白A纯化
将来自GE Healthcare的MabSelect SuReTM (MSS)蛋白A树脂填充入0.5 cm直径柱中，至25 cm的最终床高度。重力沉降后，使用ÄKTA Avant 25将树脂在0.4 M NaCl中以475 cm/hr的线性流速进行流动填充2小时。通过2M NaCl的100μL注射来评价填充质量，以证实不对称性为1.0 +/- 0.2，并且每米至少1000个板。所有蛋白A实验都使用35 mg mAb/mL树脂的负载比，并且所有工艺流速都等于300 cm/hr的线性速度。蛋白A色谱方法和缓冲液描述于表2中。
表2：蛋白A色谱的操作条件(WO2014/141150)。
色谱步骤： 组成： 组成：
1. 平衡 55 mM Tris碱，45 mM乙酸，pH 7.5 3 CV
2. 样品负载 澄清的未处理体积(CUB)，负载比率 = 35 mg/mL
3. 含有辛酸盐的洗涤液： 55 mM Tris碱，45 mM乙酸，指示浓度的辛酸钠，指示pH 变化的
4. 平衡 55 mM Tris碱，45 mM乙酸，pH 7.5 3 CV
5. 洗脱 1.8 mM乙酸钠，28.2 mM乙酸，pH 3.6 3 CV
6. 剥离 300 mM乙酸，pH 2.6 3 CV
7. 中和 55 mM Tris碱，45 mM乙酸，pH 7.5 1 CV
8. 清洗 0.1 M氢氧化钠 3 CV
9. 储存 33 mM乙酸，167 mM乙酸钠，2%苯甲醇(V/V) pH 5.5 3 CV
洗涤优化
先前的研究已经显示，许多难以除去的HCP杂质与mAb直接缔合(Levy等人, (2014)Biotechnol. Bioeng. 111(5):904-912; Aboulaich等人, (2014) Biotechnol. Prog.30(5):1114-1124)；在蛋白A洗涤步骤期间，破坏HCP-mAb相互作用的溶液条件可能提供提高的HCP清除率，并且在这项工作中，为此目的筛选并优化各种洗涤溶液。具体地，在样品负载后，使用含有不同浓度的辛酸钠的洗涤溶液(在各种pH下)，以便在洗脱前从蛋白A-吸附的mAb清除HCP。为了评估和定量每次洗涤的HCP除去的效率，如下面的ELISA方法部分中所述开发内部HCP ELISA。先前发现辛酸钠当用于蛋白A洗涤液中时提供稳健的HCP清除率。然而，先前的研究限于低于100 mM的辛酸钠浓度和pH 7.5；进行初始范围界定研究，随后进行球形中心复合设计研究，以表征辛酸钠蛋白A洗涤液在浓度和pH范围内的行为。这些设计显示于下表3和4中。根据下面的统计分析方法部分，完成统计建模。
分析
蛋白A产率
通过使用Nanodrop 2000c (Thermo Scientific)测量洗脱液中的mAb浓度来测定蛋白A产率。将每个洗脱液样品的三个Nanodrop读数平均化，以测定蛋白浓度；通过将mAb浓度乘以洗脱液体积(由色谱图确定)，计算蛋白A洗脱液中的总mAb含量。使用Agilent 1100系列HPLC上的POROS® A 20 µM柱测定负载物中的mAb浓度。将分析蛋白A上每个CUB样品的原始数据与每种特定mAb的浓度已知的标准品进行比较，以计算滴度。将总负载体积乘以测量的滴定以计算负载的mAb的总质量，并且通过将洗脱液中的总mAb除以负载物中的总mAb来计算产率。
宿主细胞蛋白(HCP)浓度测量：HCP ELISA
内部开发了使用HCP ELISA的宿主细胞蛋白分析，以定量CHO-来源的产物样品中的免疫原性HCP的总量(Mihara等人, (2015) J. Pharm. Sci. 104: 3991–3996)。使用定制的山羊抗CHO HCP多克隆抗体和内部生产的HCP参考标准品开发该HCP ELISA，用于跨CHO-来源的产物的多产物使用。
统计分析
为了在HCP清除率和产率方面分析洗涤性能，进行范围界定实验和中心复合设计研究。所述因子均按比例缩放为-1, 1单位标尺，并且将通用线性模型拟合至数据。将单独的模型拟合至每次应答。一旦选择最终模型，评价对残余物的模型假设，并根据需要进行转换。所有模型项都针对5%显著性水平进行评价，并从完整模型(包括所有二次因子项)开始进行向后消除。
MabSelect SuRe平衡等温测量
将MabSelect SuReTM树脂缓冲液交换至去离子水中以生成~50%浆料。将浆料添加至ResiQuot，用室内真空管线干燥，并将20.8 µL树脂塞分配至96-深孔板中。在分开的96-孔板中，用100、250和500 mM辛酸钠生成0和10 mg/mL之间的蛋白溶液。测量每种溶液的蛋白浓度，随后向每个树脂塞中添加1 mL。用搅拌使树脂-蛋白混合物平衡过夜。通过直接过滤至UV 96-孔板中来除去树脂，并测量最终浓度。用以下公式计算吸附蛋白浓度q：
Figure 825390DEST_PATH_IMAGE009
。
结果和讨论
该部分中呈现的结果表明，与先前公开的基于辛酸钠的蛋白A洗涤缓冲液相比，高浓度的辛酸钠(> 100 mM)在蛋白A色谱期间除去显著更多的宿主细胞蛋白(HCP)。使用几种具有相对高HCP水平的mAb作为模型证明了这一点，并通过统计实验设计进行证实；测试的mAb的CUB(蛋白A负载量)具有在106和107 ng/mg之间的HCP浓度。
该工作的主要目标是评价洗涤缓冲液的辛酸钠浓度和pH对蛋白A色谱步骤中HCP清除率的影响。主要目标是双重的。第一个是理解在辛酸钠浓度和pH的整个工作范围内对HCP的影响。使用范围界定设计来探索两种参数的整个范围(表3)；最大辛酸钠浓度为1 M，并且pH范围为7-9。第二个目标是针对HCP清除率优化辛酸钠浓度和pH，同时维持可接受的步骤产率。球形中心复合设计(CCD，表4)用于此优化。范围界定和CCD研究两者均使用mAb1作为模型mAb。对另外mAb测试来自这些初始研究的发现。下面呈现来自范围界定和CCD两者的结果。
表3：探索蛋白A洗涤液中最高达1 M的辛酸钠浓度和7.0至9.0的pH的范围界定研究设计。
洗涤编号 辛酸钠浓度(mM) pH
1 0 7.0
2 250 7.5
3 500 8.0
4 750 8.5
5 1000 9.0
表4：优化蛋白A洗涤液中的辛酸钠浓度和pH的球形中心复合实验设计。
洗涤编号 辛酸钠浓度(mM) pH
1 150 8.0
2 250 7.0
3 250 8.5
4 500 8.7
5 500 8.0
6 500 7.3
7 750 8.5
8 750 7.5
9 850 8.0
从CCD研究获得的结果呈现于表5中。总体而言，蛋白A洗涤缓冲液的pH对HCP清除率的影响最小。在测试的整个pH范围内，含有500 mM或750 mM辛酸钠的洗涤液具有几乎相同的HCP水平。如方法部分中所述进行统计分析。简而言之，将分开的模型拟合至每个应答(产率和HCP)，并使用F-检验针对5%显著性评价模型项。F-检验证实洗涤pH对HCP浓度没有统计学显著的影响。相似的分析也证实，pH不是百分比产率的重要因素。
表5：蛋白A洗涤溶液的辛酸钠浓度和pH的中心复合设计的结果(用mAb1测试)。
辛酸钠浓度(mM) pH HCP (ng/mg) %产率
150 8.0 205.8 98.7
250 7.5 69.9 87.5
250 8.5 31.4 94.3
500 7.3 17.1 77.4
500 8.0 18.2 75.7
500 8.7 19.0 76.0
750 7.5 17.2 73.7
750 8.5 13.6 74.1
850 8.0 15.5 70.1
CCD结果的统计分析证实，辛酸钠浓度对于HCP清除率和产率百分比两者均为重要因素 – 对于线性和二次项两者。当辛酸钠浓度从0增加至1 M时，HCP浓度(ng/mg)降低两个数量级(图1 - 百分比产率(三角形，▲)和HCP浓度(正方形，■))。然而，随着辛酸钠浓度增加超过250 mM，产率将从90%以上降至70%(图1)。250 mM辛酸钠以上的步骤产率的这种大幅下降可能是由于辛酸盐胶束的形成。实验确定蛋白A洗涤缓冲液中的辛酸盐临界胶束浓度(CMC)为340 mM。当辛酸钠的浓度从250 mM增加至500 mM时，产率降低15%，且HCP仅降低2.8%。这可能表明辛酸钠的游离形式是用于除去HCP的活性形式，而高于CMC的任何浓度都显示递减的回复，因为辛酸盐胶束引起产率损失。
实施例2：产率损失和潜在的缓解策略的研究
高于CMC的百分比产率的降低表明，辛酸盐胶束 - 而不是辛酸盐的游离形式 - 可能降低蛋白A步骤中的产率。为了确定产率损失的性质，对于用各种辛酸钠洗涤液的蛋白A工艺，在洗脱液、剥离液和洗涤液级分中测量mAb浓度(图2)。该结果表明，在高辛酸钠浓度下的产率损失是由于洗涤步骤期间的解吸。
为了进一步表征高辛酸钠洗涤期间的产率损失，测量平衡结合等温线，以确定高辛酸钠浓度下的mAb容量损失(图3)。先前公开的辛酸盐洗涤液 – 含有100 mM辛酸钠 – 当与Langmuir等温线拟合时，具有57 g/L的最大结合容量。在250 mM辛酸钠，吸附等温线是相似的，但在500 mM辛酸钠，Langmuir等温线拟合不佳。该结果证实，高浓度辛酸钠洗涤液降低蛋白A树脂的结合容量并引起产率损失。
在确定产率损失的来源之后，研究减少产率损失的方法。研究的两种策略是减少洗涤体积和减少负载比率。在4、6和8个CV下测试250 mM辛酸钠洗涤液。将洗涤长度从8个CV减少至4个CV仅提供了产率的2%增加(表6)，并且HCP浓度仅从31.0 ng/mg增加至35.8 ng/mg。这表明高辛酸钠洗涤液可以达到可接受的HCP水平，且体积小于在初始范围界定和CCD研究期间所测试的体积，并且还表明较小的洗涤体积不能补偿高辛酸钠浓度时减小的结合容量。
表6：使用mAb1作为模型，不同体积的250 mM辛酸钠洗涤液的HCP浓度和蛋白步骤产率。
Figure 838477DEST_PATH_IMAGE010
还研究了蛋白A捕获期间降低的负载比率，作为高浓度辛酸钠洗涤期间的产率损失的缓解(表7)。当负载比率从30 mg/ml降低至10 mg/ml时，对于250 mM和500 mM辛酸钠洗涤液，产率分别增加4.7%和7.7%。负载比率对蛋白A洗脱液中的HCP浓度的影响最小。
表7：使用mAb1作为模型，对于250 mM和500 mM辛酸钠洗涤液两者，各种蛋白A负载比率的HCP浓度和蛋白A步骤产率。
Figure 159737DEST_PATH_IMAGE011
实施例3：用另外mAb的改善洗涤的性能
仅使用mAb1作为模型产物完成先前的蛋白A洗涤优化研究。CCD研究证实，pH不是HCP除去的重要因素。统计分析和随后的产率研究表明，辛酸钠浓度在最高达400 mM时最佳。为了证实与先前开发的100 mM辛酸钠洗涤液相比250 mM辛酸钠洗涤液的提高的HCP除去，在本部分中研究另外mAb。对于含有100或250 mM辛酸钠的洗涤液，比较5种mAb的蛋白A洗脱液中的HCP浓度(图4)。一种mAb (mAb3)源自两个分开的上游工艺：具有较高HCP水平的高细胞密度工艺和与研究的其他分子相当的标准工艺。
除mAb2外，当使用250 mM辛酸钠洗涤液时，此处测试的所有mAb在蛋白A洗脱液中都小于100 ng/mg。在大多数情况下，仅通过增加洗涤液中的辛酸钠浓度，HCP浓度提高近似一个数量级。此外，随着辛酸钠浓度升高，这些mAb具有可接受的步骤产率和产物质量。
实施例4：向基于辛酸钠的蛋白A洗涤液中添加精氨酸
精氨酸 – 一种氨基酸 – 与辛酸钠(一种脂肪酸)相比具有非常不同的物理和化学特性。据推测，这两种添加剂之间的结构差异可能导致正交的HCP除去机制，即精氨酸和辛酸盐的混合物可以比仅含有单一组分的洗涤液具有更好的HCP除去。完成以下研究以评价辛酸盐/精氨酸混合物的总HCP除去和特定HCP除去。
用辛酸盐/精氨酸蛋白A洗涤缓冲液的总HCP清除率
用mAb1和mAb2测试含有辛酸钠和精氨酸的组合的蛋白A洗涤缓冲液。mAb2的结果呈现于图5中。仅含有100 mM辛酸钠或750 mM精氨酸的蛋白A洗涤缓冲液导致HCP浓度在700和1300 ng/mg之间。将辛酸钠浓度增加至250 mM导致HCP清除率的大大提高 – 与前文讨论的‘高辛酸钠’结果一致。在pH 8.5的含有250 mM辛酸钠的洗涤液导致蛋白A洗脱液中的273ng/mg HCP。向基于辛酸盐的蛋白A洗涤液中添加精氨酸进一步提高HCP除去：在pH 7.5或8.5，250 mM辛酸钠与750 mM精氨酸分别导致209和144 ng/mg的HCP浓度。
用mAb1完成类似的辛酸盐/精氨酸研究。mAb1源自两个分开的上游工艺：‘标准’分批进料生物反应器和高细胞密度工艺。高细胞密度工艺导致更高的产物滴度和HCP浓度。其作为‘最坏情况’进料材料包括在本研究中。结果呈现于图6中。
总体而言，mAb1结果与图5中呈现的mAb2发现相似。对于标准mAb1进料流和高密度材料两者，通过将辛酸钠从100 mM增加至250 mM，HCP清除率提高。另外，500 mM精氨酸比仅辛酸钠洗涤液具有更好的HCP清除率。然而，用辛酸钠和精氨酸两者 – 作为混合物或通过应用依次洗涤 – 进行洗涤，显示相比于单独任一组分的HCP清除率的提高。最佳性能是pH8.5的含有250 mM辛酸钠和750 mM精氨酸的洗涤液。对于高密度和标准mAb1，高辛酸钠和精氨酸的这种组合分别产生113和67 ng/mg的蛋白A洗脱液。
实施例5：辛酸盐/精氨酸蛋白A洗涤液以除去PLBL2
PLBL2是一种特定的HCP杂质，由于与产物分子的明显结合，其在mAb5 (一种IgG4)的下游处理期间难以除去。mAb5包含SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:8的轻链可变区，并且含有包含突变S228P和L235E的IgG4 Fc区。先前已发现这种特定的HCP杂质在下游处理期间结合IgG4产物。在HCP ELISA分析期间，PLBL2也引起‘稀释非线性’。在mAb5的蛋白A步骤期间，测试含有高辛酸钠浓度和/或精氨酸的蛋白A洗涤液的PLBL2除去。
用最高达750 mM的辛酸钠浓度、从7.5和8.5的pH以及最高达1 M的精氨酸浓度，测试洗涤液。对于每次蛋白A洗涤试验，报告总PLBL2浓度(图7，使用PLBL2-特异性ELISA测量)连同总HCP(图8)和步骤产率(图9)。
对于不同的测试洗涤液，PLBL2浓度从接近1至600 ng/mg不等。不含精氨酸且含有少于100 mM辛酸钠的洗涤液表现最差，并且产生具有近似600 ng/mg PLBL2的蛋白A洗脱液。将辛酸钠浓度增加至250 mM使PLBL2降低至~100 ng/mg；大于250 mM的辛酸钠浓度继续使PLBL2降低至~50 ng/mg，但也导致产率损失。总HCP通常也随着辛酸钠增加而降低。
在PLBL2清除率的方面，含有精氨酸的蛋白A洗涤液是最成功的，并且它们也表明总HCP的良好除去。没有辛酸钠的1000 mM精氨酸导致~10 ng/mg PLBL2和62 ng/mg HCP。高浓度的精氨酸不引起显著的产率损失。
辛酸钠和精氨酸的组合是对于mAb5最有效的洗涤液。具体地，pH 7.5或8.5的具有1 M精氨酸的250 mM辛酸钠导致2-3 ng/mg PLBL2和~20-30 ng/mg HCP，同时维持~90%步骤产率。含有1 M精氨酸和100 mM辛酸钠的洗涤液也是成功的，但导致略微更高的PLBL2和HCP浓度。
实施例6：用于组织蛋白酶L活性降低的辛酸盐/精氨酸洗涤液
用mAb3测试含有辛酸钠和精氨酸的蛋白A洗涤液的组织蛋白酶L清除能力。组织蛋白酶L蛋白酶是在CHO细胞培养期间产生的，并且其可能降解mAb3产物分子。已经表明在蛋白A工艺期间没有从mAb3除去组织蛋白酶L。测试含有100 mM辛酸钠、250 mM辛酸钠、100 mM辛酸钠与1000 mM精氨酸和100 mM辛酸钠与750 mM赖氨酸的洗涤液。
对于该特定产物，含有250 mM辛酸钠的洗涤液导致意料之外的蛋白A洗脱行为：低pH洗脱 – 通常在~2个柱体积中完成 – 扩展超过10个柱体积。另外，当测试250 mM辛酸钠洗涤液时，mAb3蛋白A洗脱液具有非常高的聚集物(通过SEC测量)。对于用高辛酸钠洗涤液测试的任何其他产物，没有观察到此行为。
含有精氨酸或赖氨酸的蛋白A洗涤液不具有用单独的250 mM辛酸钠观察到的扩展洗脱行为。对于三种不同的洗涤液的蛋白A洗脱液(100 mM辛酸盐(“平台msss洗脱液”)；250mM辛酸盐，1M精氨酸(“cap/arg msss洗脱液”)；250 mM辛酸盐，750 mM赖氨酸(“cap/lysmsss洗脱液”))中测量的组织蛋白酶L活性报告于图10中；蛋白A洗脱体积列于表8中。对于100 mM辛酸钠、1000 mM精氨酸洗涤液，测量的活性显著降低，并且随后的稳定性研究表明，与100 mM辛酸钠洗涤液相比，使用该洗涤液制备的材料的片段化减少。添加750 mM赖氨酸而不是精氨酸成功地减少大洗脱体积，但并未显著降低组织蛋白酶L活性。辛酸钠和1000mM精氨酸的组合提供了提高的组织蛋白酶L和总HCP清除率，同时维持合理的洗脱体积和可接受的产物质量属性。
表8：用不同洗涤溶液的mAb3的蛋白A洗脱液体积。
Figure 382908DEST_PATH_IMAGE012
实施例7：除去HCP的辛酸盐/精氨酸蛋白A洗涤液
用mAb3测试含有辛酸钠和精氨酸的蛋白A洗涤液的HCP清除能力。洗涤缓冲液浓度和所得的HCP浓度概述于下表9中。对于mAb3，将精氨酸/辛酸盐洗涤液与仅辛酸盐洗涤液进行比较。
150 mM辛酸盐洗涤液提供了比100 mM辛酸盐洗涤液显著更高的HCP清除率。1.1 M精氨酸和150 mM辛酸盐的组合进一步使HCP清除率提高显著倍数。蛋白A步骤期间提高的HCP清除率使得能够除去仅辛酸盐工艺中所需的最终抛光色谱步骤。
表9
辛酸盐(mM) 精氨酸(M) HCP (ng/mg)
150 1.1 97.3
150 0 556.0
100 0 907.0
实施例8：mAb3片段化的减少
测试用含有辛酸钠和精氨酸的洗涤液的mAb3的蛋白A纯化在纯化期间的抗体片段化。生成数据(图11-13)，包括3批含有100mM辛酸盐洗涤液的洗涤缓冲液，和2批含有150M辛酸盐加1.1M精氨酸的洗涤缓冲液。
图11显示整个下游工艺中抗体片段化的百分比(用SEC HPLC测量)。图12表明整个工艺中的HCP浓度。辛酸盐/精氨酸批次在该工艺期间没有显著的抗体片段化形成，而仅辛酸盐批次在第三抛光步骤(辛酸盐/精氨酸洗涤不需要)后具有显著的抗体片段化生成。
另外，比较通过两种工艺(仅辛酸盐和辛酸盐+精氨酸)产生的散装原料药的稳定性。来自辛酸盐+精氨酸工艺的散装原料药在25摄氏度下在10天内没有生成抗体片段化；来自仅辛酸盐工艺的散装原料药在25摄氏度下在10天期间生成显著的抗体片段化(图13)。
由于组织蛋白酶L的清除率提高，洗涤缓冲液中辛酸盐和精氨酸的组合显著减少整个下游工艺中抗体片段化的生成。
结论
通过修改洗涤缓冲液以使HCP-mAb相互作用最小化，优化跨蛋白A步骤的HCP清除率。初始筛选研究得出结论，蛋白A洗涤缓冲液的pH值 – 从7至9不等 – 没有显著影响HCP清除率或步骤产率。辛酸钠浓度对步骤产率和HCP除去两者均具有强烈的影响。在非常高的辛酸钠浓度(高于CMC)下，HCP清除率是最佳的，但步骤产率非常低。该研究发现，与先前使用的100mM辛酸钠洗涤液相比，利用含有250 mM辛酸钠的蛋白A洗涤液提供HCP清除率的大大提高，同时维持可接受的步骤产率。该研究还发现，与仅含有辛酸钠的洗涤液相比，含有250 mM辛酸钠和500-1000 mM精氨酸的组合的蛋白A洗涤液具有更大的HCP清除率。发现含有辛酸钠和精氨酸的蛋白A洗涤液分别成功地从mAb3和mAb5除去组织蛋白酶L和PLBL2 – 两种特别困难的HCP杂质。
将理解的是，本文描述的实施方案可以应用于本发明的所有方面。此外，在本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，都好像完全阐述的一样通过引用并入本文。
Figure IDA0002669071790000011
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Claims (18)

1.纯化重组多肽并分离掉宿主细胞蛋白(HCP)的方法，所述方法包括：(a)将包含所述重组多肽和HCP的溶液施加至超抗原色谱固体支持物，(b)用包含辛酸盐和精氨酸的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述重组多肽，其中所述重组多肽是抗ICOS抗体或其抗原结合片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含大于约50 mM辛酸盐和大于约0.5 M精氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述抗ICOS抗体包含以下中的一者或多者：如SEQ ID NO:1中所示的CDRH1；如SEQ ID NO:2中所示的CDRH2；如SEQ ID NO:3中所示的CDRH3；如SEQ ID NO:4中所示的CDRL1；如SEQ ID NO:5中所示的CDRL2和/或如SEQ ID NO:6中所示的CDRL3或每个CDR的直接等同物，其中直接等同物在所述CDR中具有不多于两个氨基酸取代。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述抗ICOS抗体包含：包含与SEQ IDNO:7中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的VH结构域，和/或包含与如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的VL结构域，其中所述抗ICOS抗体特异性结合人ICOS。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述抗ICOS抗体是ICOS激动剂。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述辛酸盐是辛酸钠。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含约75mM至约300mM辛酸盐。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述洗涤缓冲液包含约0.75 M至约1.5 M精氨酸。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述HCP源自哺乳动物细胞。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述HCP是磷脂酶B-样2蛋白。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述洗涤缓冲液的pH在pH 7至pH 9之间。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述洗涤缓冲液的pH在pH 7.5至pH8.5之间。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述抗ICOS抗体是单克隆抗体(mAb)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述抗ICOS抗体是IgG1或IgG4。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述抗ICOS抗体是IgG4。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述超抗原选自蛋白A、蛋白G和蛋白L。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中在步骤(c)之后，HCP的量小于约200ng HCP/mg产物。
18.纯化抗ICOS抗体或其抗原结合片段并分离掉磷脂酶B-样2蛋白的方法，所述方法包括：(a)将包含所述抗ICOS抗体或其抗原结合片段和磷脂酶B-样2蛋白的溶液施加至超抗原色谱固体支持物，(b)用包含约100 mM辛酸盐和约1.1 M精氨酸的洗涤缓冲液洗涤所述超抗原色谱固体支持物；和(c)从所述超抗原色谱固体支持物洗脱所述抗ICOS抗体或其抗原结合片段。
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