CN101048427B - 抗体或其片段的结晶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗体或抗体片段的结晶和/或浓缩方法。所述方法包括使抗体或抗体片段与包含二价阳离子盐的溶液接触。抗体或抗体片段的晶体和/或蛋白质凝胶可用于组合物和配制剂。

Description

抗体或其片段的结晶
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2004年7月23日提交的美国申请60/590,707的权益，在此将该申请收入本文作为参考。
发明背景
在包括但不限于癌症，呼吸系统疾病，炎性疾病和传染病的多种疾病和病症的治疗中，单克隆抗体日益成为强有力的治疗剂。一般而言，包含抗体的疗法需要每剂投递100mg到1g的抗体。为了进行这样的治疗，一种常用的手段是用约2到20mL的50mg/mL抗体溶液作静脉内输注。由于静脉内给药之外的导入方法是人们所希望的，诸如皮下注射，更浓的抗体溶液可能具有优势。但是，浓的抗体溶液可能导致一些问题，包括，但不限于：高粘度的溶液、蛋白质聚集、以及溶液的稳定性的问题。
抗体片段已经被结晶，例如用于X射线晶体学。先前报道的结晶单克隆抗体的方法一般使用蒸气扩散(vapor diffusion)技术。这种技术的缺陷包括生成晶体的量极小，和使用某些情况下不适用于人的试剂。还可以使用分批过程的方法来制备稍大一些的量的晶体。常用的分批过程方法通常使用有机或聚合沉淀剂。已经描述了使用有机沉淀剂来结晶抗体的方案。Yang et al，PNAS，vol.100，no.12，pp.6934-6939(2003)；Kuznetsov et al，J.Crystal Growth，vol.232，pp.30-39(2001)；Kuznetsov et al，J.StructuralBiology，vol.131，pp.108-115(2000)；Harris et al，Immunological Reviews，vol.163，pp.35-43(1998)；Harris et al，J.MoI.Biol.，vol.275，pp.861-872，(1998)；and Harris et al，Proteins，vol.23，pp.285-89(1995)。常用的有机或聚合沉淀剂的例子包括聚乙二醇(PEG)、异丙醇、(Huntsman PetrochemicalCorp.，Salt Lake City，UT)，以及(+/-)-2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)。
目前有许多抗体被大规模地加工以供施用于人，因此需要大规模形成晶体和/或浓缩的蛋白质凝胶的方法，特别是不包含有机或聚合沉淀剂的方法。晶体和/或凝胶对贮藏和治疗施用是有用的。
发明概述
本发明的一个方面提供了制备抗体或其片段的晶体的方法，其包括下列步骤：使抗体或其片段接触含有约1到500毫摩尔每升(mM)的二价阳离子盐和约1到100mM缓冲剂的溶液，并将所述抗体或其片段和所述溶液共同温育直到形成所述抗体或其片段的晶体。
在一些实施方案中，一种方法包括使抗体或其片段接触包含约1到120mM锌盐的溶液，并将所述抗体或其片段和所述溶液共同保温直到形成所述抗体或其片段的晶体和/或蛋白质凝胶。在一些实施方案中，温育在环境温度进行。在一些实施方案中，温度为约20到27℃。在其它实施方案中，温育在低于约20℃的温度，优选约0到20℃，更优选约0到10℃进行。
在一些实施方案中，一种方法包括使抗体或其片段接触基本上由锌盐和缓冲剂组成的溶液，并将所述抗体或其片段和所述溶液共同温育直到形成所述抗体或其片段的晶体和/或蛋白质凝胶。
制备抗体或其片段的晶体的方法包括：使抗体或其片段接触包含锌盐并缺少其它沉淀剂的溶液；并将所述抗体或其片段和所述溶液共同温育直到形成所述抗体或其片段的晶体。
在一些实施方案中，所述二价盐为约10到80mM，更优选25mM到60mM的氯化锌(ZnCl2)。在其它实施方案中，所述缓冲剂是约1到20mM的NaOAc，更优选约25到75mM的乙酸钠(NaOAc)。在一些实施方案中，所述溶液包含多于约10mM的ZnCl2和多于约5mM的NaOAc。例如，该溶液包含约100mM的ZnCl2和约10mM的NaOAc。在其它实施方案中，所述缓冲剂的pH为约4到约9，更优选约4.7到5.7。
本发明还提供了通过本文所述方法制备的抗体或其片段的晶体。所述抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、人源抗体或人源化抗体。
本发明还提供了组合物，其包含选自下组的抗体的晶体或蛋白质凝胶以及载体：抗VEGF抗体、抗CD20、抗CD11a、抗CD40、抗Apo-2、抗HER2、抗IgE、及其片段。优选地，所述抗体是全长的糖基化抗体。
本发明还提供一种配制剂，其包含选自下组的抗体的晶体或蛋白质凝胶以及至少一种成分：抗VEGF抗体、抗Apo-2、抗CD20、抗CD11a、抗CD40、抗HER2、抗Apo-2、抗IgE、及其片段。
本发明还提供了治疗哺乳动物中的病症的方法，其包括对所述哺乳动物施用有效量的上述组合物或配制剂之一。所述病症包括与VEGF、CD20、CD11a、CD40、Apo-2和HER2相关的那些病症。
本发明还提供了制品，其包含至少一种上述组合物或配制剂，以及容器。
本发明还提供了格外可用于浓缩、纯化、保存和送递抗体或其片段的方法、组合物和配制剂。
附图说明
图1是显示抗VEGF在不同浓度的ZnCl2和NaOAc，pH5.7，室温条件下的溶解度的图表。该图显示了可溶性抗VEGF浓度作为ZnCl2浓度和NaOAc浓度的函数的作图。不同的NaOAc浓度如下所示：x 10mM NaOAc；Δ25mM NaOAc(白线)；◆50mM NaOAc；■75mM NaOAc；*100mMNaOAc。
图2a是非双折射光下200倍放大的在5mM ZnCl2、100mM NaOAc，pH 5.7存在下形成的抗VEGF晶体的图像。
图2b是双折射光下200倍放大的在5mM ZnCl2、100mM NaOAc，pH5.7存在下形成的抗VEGF晶体的图像。
图2c是非双折射光下200倍放大的在25mM ZnCl2、10mM NaOAc，pH 5.7存在下形成的抗VEGF晶体的图像。
图2d是双折射光下200倍放大的在25mM ZnCl2、10mM NaOAc，pH5.7存在下形成的抗VEGF晶体的图像。
图2e是非双折射光下200倍放大的在10mM ZnCl2、100mM NaOAc，pH 5.7存在下形成的抗VEGF晶体的图像。
图2f是双折射光下200倍放大的在10mM ZnCl2、100mM NaOAc，pH5.7存在下形成的抗VEGF晶体的图像。
图3显示了通过以ZnCl2浓度对NaOAc浓度作图生成的静态条件的相图。下列符号代表：◇游离晶体；■相变；△凝胶晶体(白色三角形)。
图4显示了混合对静态条件的相图。下列符号代表：◇游离混合；◆凝胶混合；--◆--相变混合；--■--相变静态；□游离静态；和■凝胶静态。
图5显示了经过分离、洗涤和重溶的抗VEGF晶体的SDS-PAGE。泳道1是分子量标记。泳道2是5μg的抗VEGF；泳道3为空；泳道4是上清液；泳道5是洗涤1，母液；泳道6是洗涤2，母液；泳道7是洗涤3，母液；泳道8为空；泳道9是1ml晶体(溶于水)；泳道10是5ml晶体(溶于水)；泳道11是10ml晶体(溶于水)；泳道12是15ml晶体(溶于水)；泳道13是20ml晶体(溶于水)。
图6显示了向抗VEGF结晶条件10mM ZnCl2，10mM NaOAc，pH 5.7中加入沉淀剂。用可溶性抗VEGF对加入的沉淀剂的％作图。
图7显示了抗VEGF储液(D)、抗VEGF晶体溶液(A，C)和洗涤晶体的溶液(B)的质谱分析。抗VEGF的还原轻链的质量为约23,449D。
优选实施方案详述
详述
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换使用，且使用其最宽泛的意义，包括单克隆抗体(全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、具有多表位特异性的抗体组合物、亲和力成熟的抗体、人源化抗体、人源抗体、嵌合抗体、人源化多价抗体、和多特异性抗体(例如双特异性抗体，只要其表现所需的生物活性)以及抗原结合片段(例如，Fab、F(ab′)2、scFv和Fv)，只要它们表现所需的生物活性。
全长的抗体包含四条多肽链，即由二硫键相互连接的两条相同的重链(H)和两条相同的轻链(L)。每条重链包括一重链可变区结构域(VH)和一重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包括一轻链可变区结构域(VL)和一轻链恒定区结构域。轻链恒定区包括一个结构域，CL。VH和VL结构域可进一步分成互补决定区(CDR)或高变环(HVL)，其中散布着更加保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL通常包含3个CDR和4个FR，它们以下面的顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将抗体(免疫球蛋白)归入不同的类别。免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgA-1、IgA-2等。将与不同免疫球蛋白类别对应的重链恒定区分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，在例如Abbas等人，Cellular and Mol.Immunology，第4版(2000)中有一般性描述。抗体可以是更大的融合分子的一部分，该融合分子由抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价结合而构成。
根据其恒定区的氨基酸序列，可将来自任何脊椎动物物种的抗体的轻链归入两种截然不同的类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“全长抗体”指包括至少2条重链和2条轻链的以基本上完整的形式存在的抗体，不是下面所定义的抗体片段。该术语特别指具有含Fc区的重链的抗体。全长抗体可以是天然序列的抗体或重组抗体。全长抗体可以是人源的，人源化的和/或亲和力成熟的。
本文所用的术语“单克隆抗体”指由一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体本质上相同，除了生产抗体的过程中可能产生的变体外。
单克隆抗体在本文中特别包括“嵌合”抗体，在嵌合抗体中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源；还包括此类抗体的片段，只要它们显示出所需的生物学活性(美国专利4,816,567；Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
非人源(如鼠源)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人源免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人源免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR或高变环(HVL)残基用具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的CDR或HVL残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人源免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人源残基替换以改善抗原结合亲和力。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。可以进行这些修饰以改进抗体的亲和力或功能活性。通常，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、通常为两个如下所述的可变区，其中所有或基本上所有的高变区对应于非人源免疫球蛋白的高变区，且所有或基本上所有的FR是人源免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体还可制备为本文所述的抗原结合片段。任选的是，人源化抗体还将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是衍生自人源免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还参见本文所引用的下列综述和参考文献：Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle和Gross，Curr.Op.Biotech 5：428-433(1994)。
“人源抗体”具有这样的氨基酸序列，该序列对应于人类所产生的抗体的氨基酸序列，并且/或者是使用任何制造人类抗体的方法所制造的。具体地，人源抗体的定义不包括包含非人源抗原结合残基的人源化抗体。
“亲和力成熟”的抗体在一个或多个高变区中具有一个或多个改变，所述改变导致该抗体与不具有所述改变的亲本抗体相比，对抗原的亲和力得到改进。优选的亲和力成熟的抗体将对目标抗原具有纳摩尔乃至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体是用本领域已知的程序制造的。Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)描述了利用VH和VL结构域改组(shuffling)的亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机诱变由下列文献描述：Barbas等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Scier等人，Gene 169：147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；和Hawkins等人，J.MoI Biol.226：889-896(1992)。
“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，通常包含完整抗体的抗原结合位点并因此保留结合抗原的能力。本定义所涵盖的抗体片段的例子包括：(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1结构域，在重链和轻链之间具有一个二硫键；(ii)Fab’片段，其是在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1结构域；(iv)Fd’片段，其具有VH和CH1结构域，并在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有抗体的一条臂的VL和VH结构域；(vi)dAb片段，其由VH结构域组成；(vii)缺铰链抗体，其至少包含VL、VH、CL、CH1结构域且缺少铰链区；(viii)F(ab)2片段，其是包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab’片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)；(x)“双抗体”(diabodies)，其具有两个抗原结合位点，包括在同一多肽链中相互连接的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)；(xi)“线性抗体”，其包含一对串联的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，它与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。
本文中使用的“晶体”是指固态物质的一种形式，其中原子在三维上周期重复地排列，通常形成晶格。
本文中使用的“凝胶”是指抗体或抗体片段的浓缩形式，它是一种粘弹性溶液，比液体的胶体溶液更为坚固。任选地，凝胶可包括晶体。使用本发明的方法所形成的凝胶通常含有高浓度的抗体或其片段，并且可任选包含晶体。
本文中使用的“沉淀剂”是指导致化合物或分子变为不可溶的试剂。在某些情况下，所述化合物或分子形成晶体。可用来形成化合物或分子的晶体的沉淀剂通常为盐类、聚合物类或有机分子类。有机沉淀剂包括异丙醇、乙醇、己二醇和2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)。聚合沉淀剂包括聚乙二醇和聚胺例如所用的盐类包括硫酸铵、柠檬酸钠、乙酸钠、氯化铵、氯化钠和甲酸镁，浓度通常为0.2M或更高。
“紊乱”或“病症”是任何可从抗体治疗获益的状态。它包括慢性和急性紊乱或疾病，包括那些导致哺乳动物易于患上所讨论紊乱的病理状态。本文中要治疗的紊乱的非限制性例子包括恶性和良性肿瘤，非白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑以及其它腺、巨噬细胞、上皮细胞、基质和囊胚腔的紊乱；以及炎性、血管发生性和免疫紊乱。
本文中使用的“治疗”是指试图改变受治疗的个体或细胞的自然进程的临床干预。治疗的理想结果包括症状的减轻，疾病的任何直接或间接的病理后果的减小，防止转移，降低疾病进展的速率，疾病状态的改善或缓和，以及预后的减轻或改善。
用于实施本发明的方法
抗体和抗体片段已经有了很大的用处，尤其在治疗上。人们正在研究多种抗体的治疗用途。治疗用途通常需要大规模生产抗体或抗体片段。本发明的一个方面包括一种浓缩、纯化和储存抗体或其片段，尤其是大规模生产的抗体或其片段的方法。本发明的方法提供了晶体、凝胶和带晶体的凝胶。抗体或其片段的晶体和/或凝胶在例如通过x射线衍射表征抗体或其片段的三维结构，以及抗体或其片段的储存、浓缩、纯化和送递等方面有用处。
许多蛋白质由于其大小和三维构造可能难以结晶。典型地，必须对沉淀剂、缓冲剂和pH的数种组合进行筛选以确定可促成结晶的条件组合。抗体和抗体片段特别难于结晶，这是由于它们的大小，以及铰链区使得这些分子较多柔性和较少刚性的缘故。另外，根据抗体的来源，抗体或其片段可能发生糖基化。
在一些实施方案中，一种方法包括使抗体或其片段接触溶液，所述溶液包含二价阳离子盐，基本上由二价阳离子盐组成，或由二价阳离子盐组成。在一些实施方案中，二价阳离子盐以低浓度存在，例如约1到500mM。所述溶液还可以包含缓冲剂，基本上由缓冲剂组成，或由缓冲剂组成，所述缓冲剂例如乙酸钠。在一些实施方案中，缓冲剂具有低离子强度，如大约1到100mM。二价阳离子的例子包括但不限于锌、镁和钙。所述二价阳离子盐起沉淀剂的作用并促成蛋白质晶体的形成，但这不构成对本发明的任何限制。在某些情况下，所述溶液不包含其它的沉淀剂，例如有机或聚合沉淀剂。
在一些实施方案中，一种方法包括使抗体或其片段接触包含锌盐，基本上由锌盐组成，或由锌盐组成的溶液。在一些实施方案中，锌盐以低浓度存在，例如约1到120mM，优选10到80mM，更优选25到60mM。在一些实施方案中，所述锌盐是ZnCl2。所述溶液还可以包含缓冲剂，基本上由缓冲剂组成，或由缓冲剂组成，所述缓冲剂例如乙酸钠。在一些实施方案中，缓冲剂具有低离子强度，如大约1到100mM，优选1到20mM，更优选25mM到75mM。在一些实施方案中，所述溶液包含约100mM ZnCl2和约100mM NaOAc。在一些实施方案中，所述溶液不包含其它的沉淀剂，例如有机或聚合沉淀剂。所述方法提供了晶体和/或蛋白质凝胶的形成。可任选地，所述蛋白质凝胶可包含晶体。
在一些实施方案中，所述溶液包含多于约10mM的ZnCl2和多于约5mM的NaOAc。在其它实施方案中，所述溶液包含100mM的ZnCl2和10mM的NaOAc。
在一些实施方案中，一种方法包括使抗体或其片段接触包含镁盐，基本上由镁盐组成，或由镁盐组成的溶液。在一些实施方案中，使用低浓度的氯化镁(MgCl2)，例如，约1到500mM，更优选约200到500mM，最优选约1到100mM。溶液可以包含缓冲剂，基本上由缓冲剂组成，或由缓冲剂组成，所述缓冲剂例如乙酸钠或tris。在一些实施方案中，所述缓冲剂具有低离子强度，例如约1到100mM。在某些情况下，所述溶液不包含其它的沉淀剂，例如有机或聚合沉淀剂。在某些情况下，所述溶液具有高pH，例如约7.5到约9。这些方法提供了晶体和/或蛋白质凝胶的形成。可任选地，所述蛋白质凝胶可包含晶体。
在一些实施方案中，一种方法包括使抗体或其片段接触包含锌盐，基本上由锌盐组成，或由锌盐组成的溶液，以形成蛋白质凝胶。可任选地，所述蛋白质凝胶可包含晶体。在一些实施方案中，锌盐以低浓度存在，例如约1到120mM。所述溶液可以包含缓冲剂，基本上由缓冲剂组成，或由缓冲剂组成，所述缓冲剂例如乙酸钠。在一些实施方案中，缓冲剂具有低离子强度，如大约1到100mM。在某些情况下，所述溶液不包含其它的沉淀剂，例如有机或聚合沉淀剂。
本发明的方法提供了一种低成本的结晶、浓缩或纯化抗体或其片段的方法。在某些情况下，本发明的方法提供了不包括使用可能不希望存在于产品中的其它沉淀剂，例如有机或聚合沉淀剂的方法。为了储存和/或施用，抗体或抗体片段的晶体和/或蛋白质凝胶可以与载体或其它成分组合。
抗体或其片段
本发明的方法中使用了抗体或其片段。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、亲和力成熟的抗体、具有多表位特异性的抗体、人源化抗体、人源抗体、嵌合抗体、和多特异性抗体。
在某些情况下，抗体作为全长的抗体生产。全长的抗体典型地包含2条轻链和2条重链。主要有5类免疫球蛋白，包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中几类还可进一步划分为亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1、IgM2、IgA1或IgA2。本发明的方法中可利用这些类中的一类或多类抗体。在一些实施方案中，所述抗体是IgG抗体。
本发明的方法中还可以使用抗体片段。抗体片段包含抗原结合片段，并包括Fab、Fab′、Fab2、Fab′2、Fd、单链Fv、ScFv2、dAb、缺铰链(hingeless)抗体、双抗体和线性抗体。
根据抗体或其片段的来源，抗体可以是糖基化的。典型地，来源于或产生在哺乳动物或昆虫细胞中的重组抗体是糖基化的。来源于或产生在原核细胞中的抗体或其片段缺乏糖基化或者是无糖基化的(aglycosylated)。通过糖基化位点序列的突变，抗体的糖基化还可以被改变或去除。
抗体或抗体片段对抗原具有特异性。本发明的方法中有用的抗体包括以例如下面所述分子为抗原的抗体：肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子例如因子VIIIC，因子IX，组织因子(TP)，以及冯维勒布兰德因子(von Willebrands factor)；抗凝血因子例如蛋白C；心钠素；肺表面活性物质(lung surfactant)；纤溶酶原激活物，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子α和β；脑啡肽酶；RANTES(活化调节的，正常T细胞表达和分泌的)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-I-α)；血清白蛋白例如人血清白蛋白；穆勒氏抑制物质(Muellerian-inhibiting substance)；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质，例如β-内酰胺酶；DNA酶；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，例如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子例如骨衍生神经营养因子(BDNE)，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5或NT-6)，或神经生长因子例如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子例如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白例如CD3，CD4，CD8，CD19，CD20和CD40；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素例如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，例如，M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1到IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原例如AIDS被膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白例如CD11a、CD11b、CD11c、CD18，ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原例如HER2，HER3或HER4受体；以及任何上述多肽的片段。
本发明所涵盖的抗体的优选抗原包括CD蛋白例如CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD40，CD34和CD46；ErbB受体家族成员例如EGF受体，HER2，HER3或HER4受体；细胞黏着分子例如LFA-I，Mac1，p150.95，VLA-4，ICAM-1，VCAM，α4/β7整联蛋白，及αv/β7整联蛋白，包括其α或β亚基(例如抗CD11a，抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子例如VEGF；组织因子(TF)；TGFβ；α干扰素(α-IFN)；白介素，例如IL-8；血型抗原；Apo-2死亡受体；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C等。本文中最优选的目标是VEGF、TF、CD19、CD20、CD40、TGF-β、CD11a、CD18、Apo-2死亡受体和C24。
在某些实施方案中，所述抗体或其片段包括抗VEGF、抗Apo-2、抗IgE、抗HER2、抗CD11a或抗CD20。
抗体或抗体片段可以从天然来源获得，合成制备，或通过重组方法制备。制备抗体的方法是本领域技术人员已知的，包括利用噬菌体展示技术(phage display)生产抗体或抗体片段。大规模生产的方法是已知的，包括以10升或更大的量生产抗体或其片段。
抗体或抗体片段通过本领域技术人员已知的方法纯化。在某些情况下，纯化所生产的抗体或其片段以获得基本上同质的制品用于进一步的测定和使用。可以采用本领域已知的标准蛋白质纯化方法。下面的程序是合适的纯化程序的例子：在免疫亲和柱或离子交换柱上分级，乙醇沉淀，反相HPLC，在硅土或阳离子交换树脂例如DEAE上进行层析，层析聚焦，SDS-PAGE，硫酸铵沉淀，以及使用例如Sephadex-75进行凝胶过滤。例如，作为纯化的第一步，将衍生自细胞培养的抗体或其片段加到固定了蛋白A的固相上，使抗体与蛋白A特异性结合。然后洗涤固相以去除与固相非特异性结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收抗体。
在本发明的一些实施方案中，在本发明方法中所用的溶液中的抗体浓度至少为1g/L。溶液中抗体浓度的范围为约1到约100g/L。在本发明的另一些实施方案中，溶液中抗体浓度的范围为约20到约100g/L。在本发明的另一些实施方案中，溶液中抗体浓度的范围为约40到约90g/L。
方法
本发明的方法牵涉从溶液中结晶或浓缩抗体或抗体片段的方法。晶体或蛋白质凝胶对于例如表征抗体或其片段的结构，以及抗体的储存、浓缩、纯化和送递都是有用的。在一些实施方案中，被浓缩的抗体的浓度至少为1gm/L，更优选地，至少40到90gm/L。本发明的方法提供了生产抗体或其片段的晶体的低成本方法。在本发明的一个方面中，一种方法包括：使抗体或其片段接触包含二价阳离子盐，基本上由二价阳离子盐组成，或由二价阳离子盐组成的溶液，并将该抗体或其片段与该溶液一起温育直到形成该抗体或其片段的晶体。
在一些实施方案中，所述方法包括使抗体接触包含锌盐，基本上由锌盐组成，或由锌盐组成的溶液，其中锌盐的浓度为约1到约120mM，更优选约10到约80mM，最优选约25到60mM的锌盐。锌盐包括氯化锌、磷酸锌、柠檬酸锌、乙酸锌或硫酸锌。在一些实施方案中，所述溶液包含约1到约100mM的ZnCl2，基本上由约1到约100mM的ZnCl2组成，或由约1到约100mM的ZnCl2组成。在特定的实施方案中，所述溶液包含多于10mM的ZnCl2和多于5mM的NaOAc，优选约100mM的ZnCl2和约10mM的NaOAc。在一些实施方案中，所述方法提供了蛋白质凝胶，其可任选地包含晶体。
在一些实施方案中，所述方法包括使抗VEGF抗体或其片段接触包含镁盐，基本上由镁盐组成，或由镁盐组成的溶液，所述镁盐的浓度为约1到约500mM，更优选约200到500mM，最优选约10到100mM的镁盐。所述镁盐是在所述溶剂中可溶并可解离(disassociate)的镁盐。镁盐包括氯化镁、磷酸镁、柠檬酸镁、乙酸镁和硫酸镁。在一些实施方案中，所述溶液包含约1到约100mM的氯化镁，基本上由约1到约100mM的氯化镁组成，或由约1到约100mM的氯化镁组成。在一些实施方案中，所述溶液具有高pH，例如约7.5到约9的pH。
在一些实施方案中，所述方法包括使抗VEGF抗体或其片段接触包含钙盐，基本上由钙盐组成，或由钙盐组成的溶液，所述钙盐的浓度为约1到约500mM，更优选约1到200mM，最优选约10到100mM的钙盐。所述钙盐是在所述溶剂中可溶并可解离的钙盐。钙盐包括氯化钙、磷酸钙、柠檬酸钙、乙酸钙和硫酸钙。在一些实施方案中，所述溶液包含约1到约100mM的氯化钙，基本上由约1到约100mM的氯化钙组成，或由约1到约100mM的氯化钙组成。在一些实施方案中，所述溶液具有高pH，例如约7.5到约9的pH。
在一些实施方案中，所述方法包括使抗体或其片段接触包含锌盐，基本上由锌盐组成，或由锌盐组成，但缺少其它沉淀剂的溶液。在某些情况下，最大程度地减小其它沉淀剂的使用可能是理想的，这些其它沉淀剂例如有机分子，包括2-甲基-2，4-戊二醇，异丙醇或聚合化合物，包括聚乙二醇或聚胺。
这些实施方案可提供相对于现有技术的结晶方法的优点，因为它们不使用其它沉淀剂。不使用任何有机或聚合沉淀剂的一个可能的优点是经济上的，即在大规模操作中，例如，有机沉淀剂的花费可能是可观的，因此不使用有机沉淀剂的方法在经济上将会更划算。不使用有机沉淀剂的另一种可能的优点是在最终的晶体中不会存在有机沉淀剂的任何残余。这可能是有利的，因为人们想将结晶的抗体配制成供施用于哺乳动物的溶液。某些使用的有机沉淀剂可能不适用于对哺乳动物例如人类的施用。
本发明的方法还包括这样的溶液，其包含二价阳离子盐和缓冲剂，基本上由二价阳离子盐和缓冲剂组成，或由二价阳离子盐和缓冲剂组成。本发明中可以使用的缓冲剂包括本领域技术人员常用的任何缓冲剂。其例子包括但不限于乙酸、碳酸铵、磷酸铵、硼酸、柠檬酸、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷-磺酸)、N-二(羟乙基)甘氨酸(bicine)、MES、二甲胂酸钠、咪唑、氯化铵、甲酸镁、乳酸、磷酸、柠檬酸钾、偏磷酸钾、磷酸二氢钾、乙酸钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、和Tris(trisroxymethylamin-ethane)。在本发明的一些实施方案中，使用乙酸钠(NaOAc)作为缓冲剂。
在一些实施方案中，所述溶液中缓冲剂的浓度范围可为约1到约100mM。在本发明的另一实施方案中，所述溶液中缓冲剂的浓度范围可为约5到约100mM，更优选1到20mM，最优选25到75mM。
在一些实施方案中，所述缓冲剂与所述二价阳离子盐和所述抗体或其片段组合为固体。在本发明的另一实施方案中，所述缓冲剂与所述二价阳离子盐和所述抗体或其片段组合为溶液。在本发明的另一实施方案中，可将固体的缓冲剂和固体的二价阳离子盐加入溶液，然后与溶液中的或固体形式的抗体组合。
典型地，溶液的pH至少部分依赖于所用的特定缓冲剂。在一个实施方案中，溶液的所希望的pH至少部分依赖于所述二价阳离子盐和该盐在不同pH的溶解度。在一些实施方案中，缓冲剂的pH范围可为约4.5到约9。在所述二价阳离子是Zn的实施方案中，溶液的pH是约4到6。在本发明的另一实施方案中，所述二价阳离子是Zn，溶液中乙酸钠的浓度为约1到100mM，该溶液的pH是约4.7到5.7。在其它实施方案中，所述二价阳离子是Mg，缓冲剂是Tris，溶液的pH是约7.5到9。
在一个实施方案中，溶液的pH，所用的缓冲剂，以及所用的二价盐，可至少部分依赖于要结晶的抗体。在本发明的一些实施方案中，这些因素之间可能相互有影响，因为抗体可能在特定的pH范围内稳定，这可至少部分决定要使用的缓冲剂，而且类似地，可至少部分决定要使用的二价盐(例如由于溶解度的问题)。本领域技术人员可通过制作溶解度曲线并确定浓度范围或缓冲剂、二价盐和导致相变的pH来确定缓冲剂浓度和二价阳离子盐浓度。
在一些实施方案中，用至少25mM锌盐和至少50mM缓冲剂，例如乙酸钠，来沉淀抗体或其片段。在其它实施方案中，优选约10到80mM锌盐和25到75mM缓冲剂，例如乙酸钠的组合。
本发明的方法包括使溶液与抗体或其片段接触。在一些实施方案中，在蒸气扩散方法中使所述抗体或其片段接触所述溶液。在蒸气扩散中，小体积(即数个毫升)的抗体或其片段的溶液与所述溶液混合。该混合物悬浮在含有小体积的所述溶液的孔上方。在其它实施方案中，接触方法牵涉透析。透析牵涉半透性大小排阻膜，其保留抗体或其片段但容许小分子例如缓冲剂和沉淀剂扩散进出。沉淀剂缓慢地扩散通过膜并降低抗体或其片段的溶解度。另一实施方案是分批式的方法。在该分批方法中，将所述溶液加到抗体或其片段的溶液中。
本发明的方法包括将所述抗体或其片段和所述溶液一起温育直到形成晶体或蛋白质凝胶。在一些实施方案中，在温育过程中可以每天温和搅拌该溶液一次或两次。在其它实施方案中，可以连续地混合该溶液。如果想要大的晶体，应该最大程度地减少混合。
温育可以在约0℃到约27℃，更优选约2℃到25℃的范围进行。在一些实施方案中，温度保持在环境温度(例如约25℃)。在其它情况中，温育在约2到8℃进行。
将溶液和抗体或其片段一起温育直到形成晶体或蛋白质凝胶。典型地，温育时间为约1小时到30天，更优选1到5天。
晶体可以形成为游离的固体或形成在凝胶中。在本发明的一些实施方案中，抗体或其片段的晶体是凝胶的一部分。一般而言，本发明的方法中所形成的凝胶具有高浓度的抗体或其片段。在一个实施方案中，使用本发明的方法形成的凝胶具有约200到约250mg抗体/mL的浓度。
组合物或配制剂
本发明的方法涉及形成抗体或其片段的晶体或蛋白质凝胶。晶体具有规则的三维结构，通常称为晶格。这与无定形固体相反，无定形固体是没有规则的分子晶格，且具有不均一的分子结构或没有分子结构的非晶体固体。凝胶是浓缩的蛋白质溶液，其可以是软而粘的，或者是硬而脆的。
在本文描述的方法中形成的晶体可具有多种形状，包括针状、类锥形，球形和花朵状。晶体的尺寸可以在mm到μm级。在一些实施方案中，晶体的尺寸为至少10μm，以至于肉眼可见。就治疗性施用而言，晶体的尺寸可根据施用途径而变化，例如，供皮下施用的晶体尺寸可大于供静脉内施用的。
在某些情况中，可能需要验证晶体是否是抗体或其片段的晶体。可以通过显微镜在双折射光下分析抗体或其片段的晶体。晶体可容许双折射光通过，而非晶体物质则不可。在另一种方法中，可以分离晶体，洗涤，重溶，在SDS-PAGE凝胶上运行，并且，可选地，用抗Fc受体抗体染色。可选地，还可以用标准测定法来测试重溶的抗体或其片段与其特异抗原的结合。还可以通过质谱来分析重溶的抗体或其片段。
在某些情况中，可以将晶体相互交联。这样的交联可以提高晶体的稳定性。交联晶体的方法对本领域技术人员是已知的，在例如美国专利5,849,296中有描述。可以用双功能试剂例如戊二醛交联晶体。晶体一旦交联，即可冻干并储存备用，例如用于诊断或治疗用途。
在某些情况中，可能需要干燥所述晶体或蛋白质凝胶。可用N2和/或惰性气体、真空烘箱干燥、冻干、蒸发、盘式干燥、流化床干燥、喷雾干燥、真空干燥或滚筒干燥来干燥晶体或蛋白质凝胶。
可以将晶体保持在溶液中，或者可以将其洗涤并与其它载体和/或成分组合而形成该晶体的组合物和/或配制剂。所述组合物和配制剂可用于，例如治疗和诊断用途。
本发明的另一个方面涉及所述抗体或其片段晶体或蛋白质凝胶的组合物和/或配制剂。组合物包含抗体或其片段的晶体或蛋白质凝胶，以及载体。配制剂包含抗体或其片段的晶体或蛋白质凝胶，以及至少一种成分。在一些实施方案中，抗体选自抗VEGF、抗Apo-2、抗CD20、抗CD11a、抗HER2、抗IgE，及其片段。
制备抗体或抗原结合片段的晶体或蛋白质凝胶的配制剂或组合物，即将具有所需纯度的抗体与生理学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980)，以水溶液、冻干或其它干燥配制剂的形式贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，可将所述晶体或蛋白质凝胶与聚合载体组合，以提供稳定性和持续释放。这样的聚合物包括生物相容性的和生物可降解的聚合物。聚合载体可以是单一聚合物类型，或者可以由多种聚合物类型混合而成。聚合载体的非限制性例子包括例如聚(丙烯酸)，聚(氰基丙烯酸酯)，聚(氨基酸)，聚(酸酐)，聚(酯肽)(poly(depsipeptide))，聚(酯)例如聚(乳酸)或PLA，乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA，聚(β-羟基丁酸酯)，聚(己内酯)和聚(二噁烷酮(poly(dioxanone))；聚(乙二醇)；聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺)，聚[(有机)磷腈](poly[(organo)phosphazene])，聚(原酸酯)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，马来酸酐-烷基乙烯醚共聚物，pluronic多元醇，白蛋白，天然和合成多肽，藻酸盐，纤维素和纤维素衍生物，胶原，纤维蛋白，明胶，透明质酸，寡糖，糖胺聚糖，硫酸化多糖，改性淀粉例如直链淀粉，支链淀粉，羟乙基淀粉，甲基丙烯酸(酯/盐)淀粉，和其它淀粉，以及任何可包裹(encapsulate)蛋白质晶体的常规材料。
抗体或其片段的晶体的配制剂包括至少一种成分或赋形剂。成分或赋形剂是本领域技术人员已知的，包括酸化剂、气雾喷射剂、醇变性剂、碱化剂、消块剂、消泡剂、微生物防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、润滑剂、染料、干燥剂、乳化剂、助滤剂、香精和香料、润湿剂、软膏剂、增塑剂、溶剂(例如油或有机的)、吸附剂、二氧化碳吸附剂、硬化剂、栓剂基质(suppository bases)、悬浮或增粘剂、甜味剂、片剂粘合剂(tablet binders)、片剂或胶囊稀释剂、片剂崩解剂、片剂或胶囊润滑剂、张度剂(tonicityagent)、增香或增甜的赋形剂(vehicles)、油质赋形剂(oleaginous vehicles)、固体载体赋形剂(solid carrier vehicles)、防水剂、和润湿或增溶剂。
在一些实施方案中，所述成分提高储存稳定性。在其它的实施方案中，所述成分或赋形剂优选地选自白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇(latitol)、明胶和羟丙基-β-环糊精。
本文中描述的组合物和配制剂还包括有效量的结晶抗体或其片段。使用标准的方法可以容易地确定剂量。合适地，将抗体一次性地或经过多次治疗施用给患者。
根据疾病的种类和严重程度，用约1μg/kg到约50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)的抗体作为初始候选剂量，通过例如一次或多次分开的施用或通过连续输注施用给患者。根据条件不同，通常的每日或每周剂量范围可以为约1μg/kg到约20mg/kg或更多，重复该治疗直到疾病症状发生所希望的抑制。但是，也可以使用其它的剂量方案。
在某些情况中，组合物或配制剂包含重溶后浓度至少为约1g/L或更高的抗体或其片段。在其它实施方案中，重溶后的抗体浓度为至少约1g/L到约100g/L。
抗体或抗体片段的晶体和/或蛋白质凝胶，或者包含这样的晶体或蛋白质凝胶的配制剂或组合物，可以单独施用，作为药物制品、个人保健(personalcare)制品或兽医制品的一部分，或作为预防用制品的一部分施用，有或没有佐剂。可以通过胃肠外、口服或局部途径施用它们。例如，可以通过口服、肺、鼻、耳、肛门、皮肤、眼、静脉内、肌肉内、动脉内、腹膜内、粘膜、舌下、皮下、透皮、局部或颅内途径施用，或施用于口腔中。在药物、个人保健或兽医用途中，抗体或其片段的晶体，或其晶体配制剂或组合物，可局部施用于任何上皮表面。这样的上皮表面包括口腔、眼、耳、肛门和鼻的表面，这些表面可通过施用抗体或其片段的晶体或其晶体配制剂或组合物而得到治疗、保护、修复或解毒。
本发明的另一个方面包括制品。制品包含组合物或配制剂，所述组合物或配制剂包含抗体或其片段的晶体或蛋白质凝胶，以及容器。所述抗体或其片段优选为抗VEGF、抗CD20、抗Apo-2、抗CD11a、抗HER2、抗IgE或其片段。可选地，所述制品可包含关于对人施用以用于治疗的说明书。
制品还可以包含抗体或其片段的晶体或蛋白质凝胶的组合物或配制剂，以及多种用于检测所述抗体或其片段与其特异抗原结合的诊断试剂。检测抗体与其特异抗原结合的试剂包括针对所述抗体、用可检测试剂标记的抗体。所述可检测试剂可包括荧光部分、放射性部分和酶部分。在一些实施方案中，制品包含抗体或其片段的晶体或蛋白质凝胶的组合物或配制剂，以及容器。所述制品还可包含关于对人施用所述组合物或配制剂的说明书。在其它实施方案中，所述制品还包含检测所述抗体或其片段与其特异抗原结合的试剂。
组合物或配制剂的用途
包含抗体或其片段的晶体或蛋白质凝胶的本发明组合物或配制剂可用于常规抗体制剂的任何用途。例如，组合物或配制剂可用于例如纯化、浓缩、显像、诊断和/或治疗用途。在一些实施方案中，蛋白质凝胶或凝胶中存在的晶体可用于局部施用，用作进一步进行结晶或纯化的溶液，或作为储存晶体的溶液。
在一些实施方案中，所述组合物或配制剂包含抗VEGF抗体或其片段的晶体、结晶的抗VEGF抗体或其片段、或抗VEGF抗体或其片段的蛋白质凝胶。这些组合物或配制剂在VEGF相关紊乱或病症的诊断和治疗方法中有用处。VEGF相关紊乱或病症和诊断测定法在例如WO 98/45331中有描述。抗VEGF抗体可用于治疗多种瘤性(neoplastic)和非瘤性疾病和紊乱。适于治疗的瘤和相关病症包括乳癌，肺癌，胃癌、食道癌、结肠直肠癌、肝癌、卵巢癌、泡膜细胞瘤、男性细胞瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫内膜增生、子宫内膜异位症、纤维肉瘤、绒毛膜癌、头颈癌、鼻咽癌、喉癌、肝母细胞瘤、卡波西(Kaposi)肉瘤、黑色素瘤、皮肤癌、血管瘤、海绵状血管瘤、成血管细胞瘤、胰腺癌、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、许旺氏细胞瘤(Schwannoma)、少突神经胶质瘤、髓母细胞瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨源性肉瘤、平滑肌肉瘤、尿道癌、甲状腺癌、维尔姆斯(Wilms)瘤、肾细胞癌、前列腺癌、瘢痣病相关的异常血管增殖、水肿(如与脑肿瘤相关的)，以及梅格斯(Meigs)综合征。
适于治疗的非瘤性病症包括类风湿性关节炎、银屑病、动脉粥样硬化、糖尿病性或其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病、晶体后纤维增生症、新生血管性青光眼、与年龄相关的黄斑变性、甲状腺增生(包括格雷夫斯(Graves)病)、角膜和其它组织移植、慢性炎症、肺炎、肾炎综合征、先兆子痫、腹水、心包积液(例如与心包炎相关的)，和胸腔积液。
与年龄相关的黄斑变性(AMD)是在老年人群中造成严重视力丧失的主要原因。渗出形式的AMD的特征是脉络膜新生血管形成和视网膜色素上皮细胞脱离。由于脉络膜新生血管形成与急剧恶化的预后相关联，本发明的VEGF抗体可望在降低AMD的严重程度中尤其起作用。
在一些实施方案中，本发明的组合物或配制剂包含抗CD11a的晶体、结晶的抗CD11a、或抗CD11a的蛋白质凝胶。这些组合物或配制剂在CD11a相关紊乱或病症的诊断方法和治疗方法中有用处。CD11a相关紊乱或病症及诊断测定法在美国专利6,037,454中有描述，在此将其收入作为参考。
抗CD11a(LFA-1的α亚基)抗体可用来治疗多种LFA-1介导的紊乱。淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1；CD 11a/CD 18)涉及免疫应答和炎症的关键细胞相互作用中的白细胞黏附。术语“LFA-1介导的紊乱”指涉及淋巴细胞上LFA-1受体的细胞黏附相互作用导致的病理状态。这样的紊乱的例子包括T细胞炎性反应，例如炎性皮肤病，包括银屑病；炎性肠病相关反应(例如克罗恩(Crohn)病和溃疡性结肠炎)；成人呼吸窘迫综合征；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；变应性病症例如湿疹和哮喘；涉及T细胞浸润和慢性炎性反应的病症；皮肤超敏反应(包括野葛(poison ivy)和槲叶毒葛(poison oak)；动脉粥样硬化；白细胞黏附缺陷；自身免疫疾病例如类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮(SLE)，糖尿病，多发性硬化，雷诺(Reynaud)综合征，自身免疫性甲状腺炎；实验性自身免疫性脑脊髓炎，斯耶格伦(Sjogren)综合征，青少年型糖尿病，通常出现在结核病、结节病、多肌炎、肉芽肿病和血管炎中的与由细胞因子和T淋巴细胞介导的迟发的超敏反应相关的免疫反应；恶性贫血；慢性阻塞性肺病(COPD)；气管炎；胰岛炎(insulinitis)；鼻炎；荨麻疹；肾小球肾炎；涉及白细胞渗出的疾病；CNS炎性紊乱；败血症或外伤继发的多器官损伤综合征、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；肾病综合征、恶性肿瘤(例如B细胞恶性肿瘤，如慢性淋巴细胞性白血病或毛细胞白血病)；所有类型的移植，包括移植物抗宿主或宿主抗移植物病；HIV和鼻病毒感染；肺纤维化；肿瘤细胞侵入次级器官(secondary organ)等等。
在一些实施方案中，本发明的组合物或配制剂包含抗HER2的晶体、结晶的抗HER2、或抗HER2的蛋白质凝胶。这些组合物或配制剂可用于HER2相关紊乱或病症的诊断方法和治疗方法。HER2相关紊乱或病症和诊断测定法在美国专利6,387,371中有记载，在此将其收入作为参考。
对患者施用治疗有效量的抗HER2受体抗体，通过抑制HER2受体的功能而抑制肿瘤细胞生长。Trastuzumab(Genentech，Inc.)是针对HER2胞外域的重组人源化单克隆抗体，用于治疗HER2过表达/HER2基因扩增的癌症，特别是转移性乳癌(MBC)。HER2基因也可在唾液腺腺癌、肾腺癌、乳腺癌、和胃癌细胞系中扩增。该抗体还可以与其它治疗剂例如紫杉醇(paclitaxel)或组合施用给患者。
在一些实施方案中，本发明的组合物或配制剂包含抗CD20的晶体、结晶的抗CD20、或抗CD20的蛋白质凝胶。这些组合物或配制剂可用于CD20相关紊乱或病症的诊断方法和治疗方法。CD20相关紊乱或病症和诊断测定法在美国专利6,171,586和5,736,137中有记载，在此将其收入作为参考。CD20(又称Bp35)由于其表达水平很高而成为靶向B细胞瘤相关疾病的目标抗原。CD20是一种人类B细胞标志物，其在前B细胞发育早期表达并保持到浆细胞分化。CD20分子可调节活化过程中细胞周期启动和分化所需要的步骤。因此，可以将CD20表面抗原作为目标来治疗B细胞淋巴瘤。
C2B8是一种特异性免疫活性嵌合抗CD20抗体。利用C2B8进行的治疗性干预，清除或消减外周血和淋巴组织中的B细胞，作为去除B细胞淋巴瘤的手段，因为哺乳动物系统可容易且高效地恢复外周血B细胞。当免疫系统存在外周血B细胞缺乏时，无需采取“非常”预防措施(即患者隔离等)，因为灵长类的主要免疫反应是由T细胞介导的。C2B8也可以标记上放射性标记物，来摧毁目标肿瘤细胞。
在一些实施方案中，本发明的组合物或配制剂包含抗Apo-2抗体的晶体、结晶的抗Apo-2抗体、或抗Apo-2抗体的蛋白质凝胶。这些组合物或配制剂可用于治疗紊乱例如癌症。抗Apo-2抗体的治疗用途在美国专利6,252,050中有记载，在此将其收入作为参考。因此，本发明提供了使用抗体，例如交叉反应性Apo-2L受体抗体来治疗癌症的方法。例如，可以利用激动性(agonistic)Apo-2抗体在癌细胞中激活或刺激凋亡。当然，认为本发明的方法可以和其它的治疗技术例如手术组合使用。
在一些实施方案中，本发明的组合物或配制剂包含抗IgE抗体的晶体、结晶的抗IgE抗体、或抗IgE抗体的蛋白质凝胶。这些组合物和配制剂可用于治疗IgE介导的紊乱，例如变应性紊乱和炎症。抗IgE抗体的治疗用途在美国专利6,329,509和5,994,511中有描述，在此将它们收入作为参考。
在多种免疫成像和免疫测定程序中可以使用抗体和经过标记的抗体来检测患者中癌症的存在或监测已诊断有癌症的患者中该癌症的状态。当用于监测癌症状态时，必须使用定量的免疫测定程序。如果定期执行这样的监测性测定并比较结果，可以做出关于该患者的肿瘤负荷(tumor burden)是上升还是下降的判断。可以使用的常用测定技术包括直接和间接测定法。如果样品包含癌细胞，标记抗体将与这些细胞结合。洗涤组织或细胞以去除未结合的标记抗体后，检查该组织样品中带标记的免疫复合物的存在。在间接测定法中，将组织或细胞样品与未标记的单克隆抗体共同温育。然后用针对所述单克隆抗体的标记抗体(例如标记抗鼠抗体)处理该样品，洗涤，并检查三元复合物的存在。
尽管上文涉及了具体的实施方案，应当理解本发明不限于此。本领域普通技术人员将认识到，可以对公开的实施方案做出多种变化而不改变本发明的总体概念。本发明的范围意图包括所有这些变化。在此明确地将说明书中引用的所有参考文献收入作为参考。
实施例
实施例1：抗VEGF抗体在不同浓度的氯化锌和乙酸钠中的溶解度
全长和/或糖基化抗体的结晶可能是困难的。糖部分的大小、形状和存在都是难以获得抗体晶体的因素。可能需要考察有机和无机沉淀剂、缓冲剂和共溶质(cosolute)的许多不同组合来寻找适于抗体结晶的条件。考察了全长糖基化VEGF抗体在不同浓度ZnCl2和NaOAc的溶液中的溶解度，以确定在这些条件下是否可以形成抗体蛋白质晶体。
材料和方法
抗VEGF抗体的制备和纯化
一般地，抗VEGF抗体(bevacizumab)可以按WO 98/45331和Presta等人，Can.Res.，57：4593-4599所述制备，在此将其公开内容收入作为参考。下面对该过程作一般描述。
克隆并测序对VEGF特异的鼠源抗体，名为A4.6.1(Kunkel等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：488-492)。使用合成的人轻、重链可变区共有序列生成计算机图形模型，可使用InsightTM(Accelrys，Inc.San Diego CA)将鼠CDR输入该模型。还生成了鼠源抗体A.4.5.1的VH和VL区的计算机模型来确定CDR的构象。
从F(ab)-1的质粒模板构建了编码A4.6.1的所有F(ab)人源化变体的质粒。质粒pEMX1(Kunkel等人，1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：488-492)含有编码共有人VLP亚类I和VH亚类III的DNA片段。通过pEMX1(Kunkel等人，1985Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：488-492)的定点诱变构建人源化抗VEGF。编码抗VEGF抗体的核酸序列在WO 98/45331中提供。
本文中描述了产生抗VEGF的方法的一个例子。为了表达稳定的人源化IgG1变体(rhuMAb VEGF)，用为了共表达重链和轻链而设计的双顺反子载体转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Lucas等人，1996Nucleic Acids Res.，24：1774-1779)。用脂转染试剂(lipofectin)将质粒导入DP12细胞，并选择在不含甘氨酸/次黄嘌呤/胸苷(GHT)的培养基中的生长(Chisolm等人，1996，DNA Cloning 4.Mammalian systems，pp.1-41，Oxford：OxfordUniversity Press)，其中DP 12细胞是L.Chasin(Columbia University，NewYork，NY)开发的CHO-K1DUX B11细胞系的一种专有权所有的衍生物。
随机选择20个未扩增的克隆并重新接种到96孔板中。3天后用ELISA监测各个集落的相对单位生产率(relative specific productivity)以定量各孔中积累的全长人IgG。使用荧光染料Calcein AM作为每孔中活细胞数的替代标志(surrogate marker)。根据这些数据选择数个未扩增的克隆在存在递增浓度的氨甲蝶呤下进一步扩增。选择在存在10、50和100nM氨甲蝶呤下存活的个别克隆并转移到96孔板中进行生产率筛选。
将一个可重复地显示高单位生产率的克隆在T形瓶(T-flask)中扩增，并用其接种旋动培养物(spinner culture)。传代数次后，用适应了悬浮的(suspension-adapted)细胞接种添加了多种激素和蛋白质水解物的含GHT、无血清培养基中的生产培养物。收集含rhuMAb(重组人源化单克隆抗体)VEGF的细胞培养液并用蛋白A-CL-4B纯化。此步骤后的纯度为～99％。然后先后用Q和CM通过离子交换层析步骤进行后续纯化至均一。最终纯化的抗体的内毒素含量＜0.10eu/mg。通过超滤和渗滤对纯化的抗体进行浓缩和进一步纯化。纯化和/或浓缩的备选方法包括切向流过滤。
结晶条件
将如上述制备的抗VEGF在Milli-水中透析并浓缩到84.4g/L。用6N HCl将1M NaOAc储液的pH调节到5.7。用连续稀释法制备缓冲液并用1N NaOH将pH调节到pH 5.7。ZnCl2的浓度范围为5到100mM，NaOAc的浓度在10到100mM之间变化。
透析结晶法使用半透性大小排阻膜，其保留蛋白质但允许小分子(即缓冲剂和沉淀剂)自由地扩散通过该膜。透析法包括将一(1)毫升抗VEGF储液注射到Slide-a-透析盒(Pierce，Rockford，I1)中并在各储液中于5℃透析过夜。在三天时间内总共更换透析缓冲液3次。在各储液中连续混合所述透析装置，3天后回收所得物质。为了回收所述物质，小心切开透析盒的膜，用无菌刮勺将凝胶溶液转移到管中。测量从透析盒中回收的物质的蛋白质浓度以生成溶解度曲线。将蛋白质浓度对ZnCl2浓度作图。
结果
抗VEGF在ZnCl2和NaOAc，pH 5.7中的溶解度曲线如图1所示。
当ZnCl2浓度增加时，观察到抗VEGF的溶解度下降。当在含不同浓度ZnCl2的NaOAc缓冲液中透析抗VEGF时，发现透析盒中形成凝胶。凝胶开始时呈云雾状。在4℃和室温下透析25分钟内，在含低达2mM ZnCl2的缓冲液中形成了带有晶体的凝胶。用显微镜进一步分析这些凝胶，在凝胶中观察到了结晶物质。凝胶中的晶体非常小且均匀。显微镜观察时，凝胶中的晶体在正交偏光镜(cross polarizer)下显示双折射，说明其是结晶物质。
先前考察过多种条件的结晶全长糖基化抗体的能力，包括有机和无机沉淀剂连同多种缓冲剂和共溶质。考察的许多条件没有导致抗体晶体的形成(数据没有显示)。需要设计一种避免使用有机沉淀剂的结晶方法，对于要用于治疗的抗体尤其如此。
我们的研究显示，可以利用NaOAc缓冲液中二价阳离子例如以盐例如ZnCl2形式的组合，在没有任何有机沉淀剂的条件下形成全长抗体的晶体。根据抗VEGF抗体在含不同浓度ZnCl2的NaOAc缓冲液中的溶解度，可以确定抗VEGF变为不可溶而导致晶体产生时NaOAc中ZnCl2的浓度。在低浓度的ZnCl2下，观察到游离晶体。增加ZnCl2浓度则形成含晶体的凝胶。溶解度研究的结果决定了下一个实施例中用于分批结晶研究的浓度范围。
实施例2：用氯化锌和乙酸钠结晶抗VEGF
如实施例1中所述，用不同浓度ZnCl2和NaOAc的溶液透析抗VEGF溶液时，抗VEGF在特定的浓度变为不可溶，并导致晶体和/或凝胶的形成。在透析条件和分批条件下对用不含有机沉淀剂的ZnCl2和NaOAc溶液结晶抗VEGF进行了研究。对所得晶体作了进一步表征。在分批条件下结晶是想要的，因为这些条件可以放大为大规模生产。
材料和方法
结晶方法和分析
通过离心超滤将抗VEGF从36g/L浓缩到84.4g/L，并在Milli-水中透析，以制备抗VEGF。所得抗VEGF的浓度为84.4g/L，通过透析或以分批方式将其与不同浓度的ZnCl2和NaOAc一起温育。通过测量280nm的吸光度来测定抗VEGF的浓度。
如下制备4种ZnCl2和NaOAc的结晶储液：
1：10mM ZnCl2，100mMNaOAc，pH 5.7
2：50mM ZnCl2，100mM NaOAc，pH 5.7
3：50mM ZnCl2，10mM NaOAc，pH 5.7
4：50mM ZnCl2，用氢氧化钠将pH调节到5.7
ZnCl2和NaOAc浓度的组合如表1a所示。
为了进行透析法，将一(1)毫升抗VEGF储液置于Slide-a-透析装置(Pierce，Rockford，IL)中，并在各个储液中透析。在各个储液中连续混合透析装置，5天后将所得物质从装置中刮出并置于eppendorf管中。
还使用“分批”方法进行实验。分批法开始时，将0.75mL抗VEGF储液以1∶1的比例(即0.75mL)与各种结晶储液加入eppendorf管。将各管每天翻转2次以提供温和的混合。将管保持在环境温度并翻转两次达5天。
表1a
 条件#   ZnCl2(mM)   NaOAc pH5.7(mM)   方法   抗VEGF(g/L)   规模(mL)
 1   10   100   透析   84.4   1
 2   50   100   透析   84.4   1
 3   50   10   透析   84.4   1
 4   50   0   透析   84.4   1
 5   5   50   分批   42.2   1.5
 6   25   50   分批   42.2   1.5
 7   25   5   分批   42.2   1.5
 8   25   0   分批   42.2   1.5
晶体的显微镜分析
回收所述物质后，用显微镜分析晶体在存在和不存在双折射光时的形态。使用双折射光来区别结晶的固体和固态沉淀物。使光通过两个偏振片之间来进行分析。一个滤光片置于样品下方，另一个滤光片置于样品上方。如果样品不是结晶的，两个偏振片会阻挡光线到达观察者。如果样品是结晶的，它将会使光线偏折，允许其穿过第二个滤光片而进入观察者的眼睛。为了用显微镜分析晶体，将样品置于载玻片上并以不同放大倍数观察晶体。
使用了其它方法来测试该固体物质，包括用Izit染料染色以及压扁/破碎测试(crush/crack test)。压扁/破碎测试不是决定性的，因为大多数结晶物质太小而无法测定压扁/破碎比。Izit染料结果也不可靠，因为观察到很多假阴性和假阳性。
结果
结果在表1b和1c中显示
表1b显示在表1a给出的不同条件下，样品于第1、2和5天的目测观察结果。
表1b
 条件#   第1天   第2天   第5天
 1   蛋白石状(opalescent)   蛋白石状   大块固体
 2   液态白色   液态白色   大块/凝胶固体
 3   液态白色   液态白色   凝胶
 4   蛋白石状，白色固体   蛋白石状，白色固体   蛋白石状，白色固体
 5   若干白色固体   透明(clear)   透明
 6   完全为白色固体   底部为凝胶   凝胶
 7   透明固体   透明   透明
 8   白色固体   底部为凝胶   底部为凝胶
表1c显示表1a给出的不同条件下对从样品回收的物质进行的分析测量结果。在正交偏光镜下观察时，形成的固体显示双折射，但大多数情形中这些固体太小从而无法辨认出规则的形状或形态。
表1c
 条件#   双折射   晶体形态
 1   是   无
 2   是   无
 3   是   无
 4   否   无
 5   是   零星的锥体
 6   是   花朵
 7   是   大量锥体
 8   否   无
这些结果显示，使用ZnCl2和NaOAc的组合在透析和分批方法中都使得抗VEGF结晶。研究的每种条件都使抗VEGF在接触沉淀剂溶液后立即发生相变。在每种含ZnCl2和NaOAc的条件下都观察到了显示双折射的固体，表明在每种这些条件下都形成了晶体。在某些情况中，观察到的晶体位于抗VEGF的凝胶状相中。在某些情况中，不能从凝胶分离晶体，因此不能确定无疑的证明它们是抗VEGF晶体。这些晶体形成锥体样或花朵型的结构。该实施例显示，通过使用ZnCl2和NaOAc的透析或分批方法，不使用有机沉淀剂，可以产生抗VEGF晶体。
图2a-2f显示了双折射和非双折射光下的代表性图像。图2a是存在5mM ZnCl2和100mM NaOAc，pH 5.7时形成的抗VEGF晶体在非双折射光下200倍放大倍数的图像。图2b是存在5mM ZnCl2和100mM NaOAc，pH5.7时形成的抗VEGF晶体在双折射光下200倍放大倍数的图像。图2c是存在25mM ZnCl2和10mM NaOAc，pH 5.7时形成的抗VEGF晶体在非双折射光下200倍放大倍数的图像。图2d是存在25mM ZnCl2和10mMNaOAc，pH 5.7时形成的抗VEGF晶体在双折射光下200倍放大倍数的图像。图2e是存在10mM ZnCl2和100mMNaOAc，pH 5.7时形成的抗VEGF晶体在非双折射光下200倍放大倍数的图像。图2f是存在10mM ZnCl2和100mM NaOAc，pH 5.7时形成的抗VEGF晶体在双折射光下200倍放大倍数的图像。
实施例3：不同的结晶条件
如前所述的，在不同的ZnCl2和NaOAc浓度下结晶了抗VEGF抗体。其它结晶条件可能影响结晶抗VEGF的能力或抗VEGF晶体的产率。检查了pH、温度和二价阳离子种类的改变对结晶抗VEGF的影响。
材料和方法
通过10kD再生纤维素膜上的超滤和渗滤制备溶于Milli-水的87g/L抗VEGF储液。每个样品包含1∶1比例的蛋白质溶液和缓冲剂溶液，从而抗VEGF的终浓度为43.5g/L。通过将合适量的固体溶于Milli-Q水并用无菌级滤器过滤溶液来制备1M ZnCl2、氯化钙(CaCl2)和MgCl2的储液。通过添加合适量的三水合乙酸钠和冰乙酸到Milli-水中并通过无菌级滤器过滤来制备1M的NaOAc，pH4.7和NaOAc，pH5.7的储液。
通过加入合适量的水、二价离子储液、缓冲剂储液和蛋白质储液来准备溶液条件。蛋白质储液总是在最后加入。
在两个不同的pH和温度考察ZnCl2、MgCl2、CaCl2和NaOAc的浓度的组合。ZnCl2的浓度范围为5到100mM，NaOAc的范围为10到100mM。在10mM的NaOAc中MgCl2的浓度范围为5到100mM。在10mM的NaOAc中CaCl2的浓度范围为5到100mM。
使用分批方法的结晶按照实施例2所描述的进行，但各批的样品体积为1ml。
结果
结果如表2所示。ZnCl2和NaOAc的组合可有效地形成全长抗VEGF抗体的晶体和/或带有晶体的凝胶。通过双折射光的折射确定了所述固体物质对结晶物质为阳性。通过测量280nm的吸光度测定上清液中的抗VEGF浓度。
表2
  ZnCl2(mM)   NaOAc(mM)   pH   温度(℃)   观察结果   抗VEGF浓度(g/L)   双折射晶体
  5   10   4.7   4   薄膜(film)   43   是
  10   10   4.7   4   薄膜   44   是
  100   10   4.7   4   20％凝胶   16   是
  5   10   4.7   室温   薄膜+固体   44   是
  10   10   4.7   室温   大量固体   43   是
  100   10   4.7   室温   17％凝胶   18   是
5 10 5.7 4 薄膜+固体 44   是
10 10 5.7 4 薄膜+固体 42   是
  100   10   5.7   4   20％凝胶   4.3   是
  5   10   5.7   室温   薄膜   43   是
  10   10   5.7   室温   薄膜，云雾状   47   是
  100   10   5.7   室温   17％凝胶   3.8   是
所有所述ZnCl2/NaOAc组合都产生了凝胶中的或游离于溶液中的抗VEGF晶体。在这些条件下，氯化镁和乙酸钠溶液对抗VEGF没有显示任何效果(数据未显示)。氯化钙和乙酸钠溶液，在100mM CaCl2，10mM NaOAc，pH 4.7，4℃温育的条件下产生了抗VEGF的晶体(数据未显示)。
将100mM ZnCl2，10mM NaOAc，pH 5.7，室温温育形成的结晶物质从溶液中分离。用20mM NaOAc，20mM ZnCl2，pH5.7洗涤晶体3次，并将晶体溶于水。在SDS PAGE上运行不同量的重溶于水的晶体，并与结晶前的抗VEGF比较。也检测了晶体的洗涤液中抗VEGF的存在。结果如图5所示。该结果显示所述洗涤液对任何抗VEGF为阴性，而重溶的晶体确实具有抗VEGF。晶体的量增加导致检测到的抗VEGF增加。
还通过质谱来分析重溶的抗VEGF并与对照抗VEGF比较。完整抗体的MALDI-TOF质谱通常在150kDa处显示宽的峰，且不易将一种抗体与其它抗体区别开来。但是，还原的抗体的质谱对轻链显示高灵敏度。由于每种抗体产物的轻链的质量是独特的，用TCEP还原样品，并在线性正模式(linear positive mode)下分析。为了说明浓度的差异，用芥子酸基质溶液将最先的两个样品稀释50倍，接下来的两个样品稀释10倍，并在室温用TCEP还原(2小时)。将样品点在板上，风干，用冷的0.1％TFA洗涤，并获取质谱。
抗VEGF轻链的分子质量是23433Da，MALDI-TOF质谱在这个质量范围通常显示+/-0.05％的质量准确度。储液和上清液的谱图显示类似的图形，即来自单质子化和双质子化轻链的强峰和来自带两个电荷的重链的弱峰(图7D，A和C)。洗涤溶液(在分析的条件下)没有显示轻链的存在(图7B)，而晶体溶液确实显示了轻链的峰。
通过MALDI-TOFMS分析来自所述晶体的天然Lys-C消化物显示了许多抗VEGF相关峰(以及Lys-C自消化产物)。但是，来自第一次洗涤溶液的消化物也显示了一些所述的抗VEGF相关峰(数据未显示)。一般而言，MALDI-TOFMS对于消化物较之完整的蛋白质显示更高的灵敏度。
总而言之，在晶体中清楚地看到抗VEGF，但第一次洗涤液也可能含有少量抗VEGF。该结果显示，来自晶体的重溶抗VEGF与对照抗VEGF具有相同的质谱图谱。
实施例4：抗VEGF溶液的凝胶-液相的考察
在含有抗VEGF晶体的溶液中已经确认了两个相。它们包括游离在溶液中的晶体和可含有晶体的凝胶。抗VEGF上清浓度直接与存在的晶体相相关。当存在凝胶时，可溶性抗VEGF的浓度通常少于约10g/L。但不存在凝胶时，可溶性抗VEGF的浓度通常上升到40g/L以上。
通过改变pH 5.7时的NaOAc浓度和ZnCl2浓度研究了结晶条件的抗VEGF的相空间(phase space)。通过考察相空间，有可能确定溶液是在哪里从凝胶转变为液相的。这可能有助于寻找最优的结晶条件以改善晶体产率。
材料和方法
使用Milli-水中的84.4g/L抗VEGF储液和ZnCl2和NaOAc pH 5.7的1M储液作为这些1mL分批实验的成分。建立了二十二(22)个批次，每批的抗VEGF浓度为42.2g/L，ZnCl2和NaOAc浓度的范围分别为5到100mM和10到100mM(见表3)。
在保存于环境温度条件的聚丙烯管中制备所述溶液。22批有不同的两组进行，一组不混合，一组每天翻转两次以提供温和的混合。观察这些管3周的时间。在这3周的起点和终点目测确定不混合组中所形成凝胶的百分率。21天后将这些管离心，并通过A280分析上清液中的抗VEGF浓度。
结果
表3显示了不混合组，或称静态组的22个样品的结果。
表3
  ZnCl2浓度(mM)   NaOAc，pH 5.7浓度(mM)   ％凝胶起点   ％凝胶终点   上清液中的抗VEGF浓度(g/L)
  5   10   0   0   43
  5   100   20   0   43
  10   10   0   0   47
  10   50   0   0   48
  10   75   0   0   47
  10   100   25   0   44
  25   10   0   0   42
  25   25   15   0   43
  25   50   45   0   44
  25   75   25   20   7.1
  25   100   25   20   4.3
  40   10   0   0   49
  40   25   0   15   47
  40   50   20   40   6.0
  40   75   20   20   2.5
  60   10   15   20   18
  60   25   30   40   6.8
  60   50   35   40   2.9
  60   75   40   20   1.3
  80   10   40   40   9.4
  80   25   45   40   3.0
  100   10   65   20   3.8
  100   100   35   20   0.7
在混合组的管中，无法对％凝胶定量，因为凝胶相沿着管壁铺散开来。但是，在21天的起点和终点，测定了溶液的状态、透明、凝胶、游离固体、或凝胶+游离固体的直观指示。21天后，将管离心，并通过A280分析上清液中的抗VEGF浓度。表4显示了每天翻转(混合)2次组的22个样品的结果。
表4
  ZnCl2浓度   NaOAc，pH 5.7   起点   终点   上清液中的抗
  (mM)   浓度(mM)   观察结果   观察结果   VEGF浓度(g/L)
  10   50   透明   游离固体   49
  10   75   透明   游离固体   48
  10   100   游离固体   游离固体   47
  15   50   透明   游离固体   45
  20   50   透明   游离固体   47
  25   25   透明   游离固体   45
  25   50   透明   游离固体   42
  25   75   凝胶   凝胶+固体   8.1
  40   10   透明   游离固体   44
  40   25   凝胶   凝胶   20
  40   50   凝胶   凝胶   6.5
  40   75   凝胶   凝胶   3.2
  50   10   透明   透明   43
  50   25   凝胶   凝胶   11
  60   5   透明   凝胶   27
  60   10   凝胶   凝胶+固体   22
  60   25   凝胶   凝胶   8.2
  60   50   凝胶   凝胶   2.2
  60   75   凝胶   凝胶   1.4
  80   10   凝胶   凝胶   8.8
  80   25   凝胶   凝胶   3.8
  100   1   凝胶+固体   凝胶+固体   10
  100   5   凝胶+固体   凝胶+固体   9.2
  100   10   凝胶   凝胶   4.8
在所有管中均有晶体形成。一些晶体游离于溶液中，一些在凝胶中。
用ZnCl2浓度对NaOAc浓度作图来生成不混合样品的相图。该图可见于图3。图4比较了混合和非混合实验的相图。
总的来看，图1(来自实施例1)、3和4显示，当系统向相变点接近时，如果ZnCl2在40mM以上并混合管，则可溶性抗VEGF降低到约10-22g/L。当管静止且ZnCl2浓度为40mM或更少时，可溶性抗VEGF浓度少许减少乃至不减少。这可能让人相信ZnCl2是可溶性抗VEGF减少的主导因素。当ZnCl2浓度少于10mM或大于80mM时，NaOAc的影响减少。当ZnCl2浓度靠近转变点(25-60mM)时，NaOAc浓度对可溶性抗VEGF浓度的影响似乎增大。
实施例5：其它抗体的结晶
现有技术中全长抗体的结晶条件通常利用有机沉淀剂如PEG、MPD或丙醇。我们已经发现(见前面的实施例)，全长抗体例如抗VEGF可以在没有这些有机沉淀剂时的结晶。我们考察了其它全长抗体是否能在存在NaOAc(pH4.7；pH5.7)、HEPES(pH 7.5)或Tris(pH 9.0)时用二价阳离子结晶。
材料和方法
考察的单克隆抗体为：抗HER2、抗CD11a、抗CD20(C2B8)和抗VEGF(Genentech，South San Francisco，CA)。美国专利5,736,137、6,387,371和6,037,454，及WO 98/45331描述了具有这些特异性的抗体的制备和表征。使用三类层析，然后进行超滤和渗滤来纯化抗体，类似于实施例1中描述的纯化步骤。
在Milli-水中透析所述单克隆抗体以产生大约80-100mg/mL的所得浓度。通过将1份抗体溶液与1份每种合适溶液合并以分批模式进行实验。最终的样品体积为1到2mL。将样品储存在6mL聚丙烯管中。
所用的二价盐是ZnCl2、CaCl2和MgCl2。所用缓冲液的最终浓度和pH分别为：10mM NaOAc，pH 4.7；10mM NaOAc，pH 5.7；10mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷-磺酸)，pH 7.5，和10mM Tris(trishydroxymethylamino-ethane)，pH 9.0。含有Tris缓冲溶液的样品在环境温度保存，含有其它缓冲液的样品在2-8℃的温度保存。
每天目视检查这些样品。如果储存3天后没有观察到固体物质则将温度完全调换：根据样品原来的储存条件，将样品转到2-8℃或室温。如果再过3天仍没有观察到固体物质，则将样品保存在2-8℃并每周监测一次。对有固体物质的样品，在正交偏光镜下观察以确定双折射。
结果
在测试的条件下，对于抗CD40分子没有观察到晶体(数据未显示)。
ZnCl2与抗CD20(C2B8)分子的结果如表5所示。根据双折射，观察到的所有固体都不是结晶的。但是在某些情形中形成了蛋白质凝胶。CaCl2和MgCl2与抗CD20(C2B8)分子在测试的条件下没有观察到晶体(数据未显示)。表中的N/a表示上清液的280nm吸光度没有测定。
表5
  ZnCl2(mM)   NaOAc(mM)   pH   温度(℃)   观察结果   通过A280测定的上清液中的抗CD20(C2D8)(g/L)
  5   10   4.7   2-8   透明   42
  10   10   4.7   2-8   透明   42
  100   10   4.7   2-8   25％凝胶   13
  5   10   4.7   室温   透明   N/a
  10   10   4.7   室温   透明   N/a
  100   10   4.7   室温   蛋白石状+20％凝胶   N/a
  5   10   5.7   2-8   透明   42
  10   10   5.7   2-8   透明   43
  100   10   5.7   2-8   75％白色固体   2.1
  5   10   5.7   室温   透明   N/a
  10   10   5.7   室温   透明   N/a
  100   10   5.7   室温   33％固体   N/a
ZnCl2与抗HER2分子的结果如下面表6所示。根据双折射确定，在下述的条件下形成的所有固体都不是结晶的。CaCl2和MgCl2与抗HER2分子在测试条件下没有观察到晶体(数据未显示)。
表6
  ZnCl2(mM)   NaOAc(mM)   pH   温度(℃)   观察结果   通过A280测定的上清液中的抗HER2(g/L)
  5   10   4.7   2-8   透明   51
  10   10   4.7   2-8   透明   46
  100   10   4.7   2-8   25％凝胶   18
  5   10   4.7   室温   透明   N/a
  10   10   4.7   室温   透明   N/a
  100   10   4.7   室温   蛋白石状   N/a
  5   10   5.7   2-8   透明   46
  10   10   5.7   2-8   透明   47
  100   10   5.7   2-8   60％固体   41
  5   10   5.7   室温   透明   N/a
  10   10   5.7   室温   透明   N/a
  100   10   5.7   室温   凝胶+固体   N/a
抗CD11a分子和ZnCl2的结果如下面表7所示。根据双折射确定，在这些条件下形成的所有固体对晶体形成都为阴性。CaCl2或MgCl2与抗CD11a在测试条件下没有观察到晶体(数据未显示)。
表7
  ZnCl2(mM)   NaOAc(mM)   pH   温度(℃)   观察结果  通过A280测定的上清液中的抗CD11a(g/L)
  5   10   4.7   2-8   透明  59
  10   10   4.7   2-8   透明  N/a
  100   10   4.7   2-8   40％凝胶  13
  5   10   4.7   室温   透明  N/a
  10   10   4.7   室温   透明  N/a
  100   10   4.7   室温   25％凝胶  N/a
  5   10   5.7   2-8   透明  47
  10   10   5.7   2-8   透明  56
  100   10   5.7   2-8   75％白色固体  2.3
  5   10   5.7   室温   透明  N/a
  10   10   5.7   室温   透明  N/a
  100   10   5.7   室温   25％凝胶+固体  N/a
抗VEGF分子与ZnCl2的结果如表8所示，抗VEGF与MgCl2的结果如表9所示。在这些条件下形成了晶体和凝胶。根据双折射光，并非所有的沉淀物都是对结晶物质为阳性的。CaCl2和抗VEGF分子在测试条件下没有观察到晶体(数据未显示)。
表8
  ZnCl2(mM)   NaOAc(mM)   pH   温度(℃)   观察结果   通过A280测定的上清液中的抗VEGF(g/L)   双折射晶体
  5   10   4.7   2-8   薄膜   42.8   是
  10   10   4.7   2-8   薄膜   43.5   是
  100   10   4.7   2-8   20％凝胶   16.0   是
  5   10   4.7   室温   薄膜+固体   44.2   是
  10   10   4.7   室温   大量固体   42.6   是
  100   10   4.7   室温   17％凝胶   18.4   是
  5   10   5.7   2-8   薄膜+固体   43.9   是
  10   10   5.7   2-8   薄膜+固体   41.8   是
  100   10   5.7   2-8   20％凝胶   4.3   是
  5   10   5.7   室温   薄膜   43.1   是
  10   10   5.7   室温   薄膜+云雾状   46.6   是
  100   10   5.7   室温   17％凝胶   3.3   是
表9
  MgCl2(mM)   10mM缓冲剂   pH   温度(℃)   观察结果   通过A280测定的上清液中的抗VEGF(g/L)
  5   NaOAc   4.7   2-8   透明   51
  10   NaOAc   4.7   2-8   透明   N/a
  100   NaOAc   4.7   2-8   透明   52
  5   NaOAc   4.7   室温   透明   N/a
  10   NaOAc   4.7   室温   透明   N/a
  100   NaOAc   4.7   室温   透明   N/a
  5   NaOAc   5.7   2-8   透明   51
  10   NaOAc   5.7   2-8   透明   N/a
  100   NaOAc   5.7   2-8   透明   50
  5   NaOAc   5.7   室温   透明   N/a
  10   NaOAc   5.7   室温   透明   N/a
  100   NaOAc   5.7   室温   透明   N/a
  5   HEPES   7.5   2-8   微细颗粒   44
  50   HEPES   7.5   2-8   少数白色沉淀(wht ppt)   42
  100   HEPES   7.5   2-8   白色颗粒   42
  5   HEPES   7.5   环境温度   微细颗粒   44
  50   HEPES   7.5   环境温度   微细颗粒   43
  100   HEPES   7.5   环境温度   微细颗粒   43
  5   Tris   9.0   2-8   微细颗粒   44
  50   Tris   9.0   2-8   微细颗粒   44
  100   Tris   9.0   2-8   微细颗粒/双折射-小型海胆状晶体   51
  5   Tris   9.0   环境温度   微细颗粒   41
  50   Tris   9.0   环境温度   微细颗粒/双折射-小型海胆状晶体   44
  100   Tris   9.0   环境温度   微细颗粒/双折射   42
  -小型海胆状晶体
从上面的结果可见，似乎较高ZnCl2和NaOAc浓度的组合，以及pH 4.7和5.7诱导抗HER2、抗CD20(C2B8)和抗CD11a的相从可溶性抗体到抗体凝胶的转变。所有ZnCl2/NaOAc组合当施加于抗VEGF时都产生了晶体。
在pH7.5和pH9.0只考察了MgCl2和CaCl2(CaCl2的数据未显示)。基于上面的结果，在室温、10mM Tris，50mM MgCl2，pH 9.0，以及室温和2-8℃、10mM Tris，10mM MgCl2，pH 9.0的条件下，观察到了抗VEGF的结晶。
实施例6：沉淀剂在结晶条件中的使用
我们对抗VEGF沉淀条件中是否可掺入添加剂进行了考察。使用的结晶条件是10mM ZnCl2和10mM NaOAc，pH 5.7。
已经证明用10mM ZnCl2和10mM NaOAc，pH 5.7进行结晶产生了抗VEGF晶体。为了尝试提高产率，将三种最有效的有机沉淀剂(通过筛选确定的)加入结晶缓冲液中。测试的沉淀剂是购自Hampton Research的(+/-)-2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)，购自Hampton Research的聚乙二醇(PEG)3350，和购自Hampton Research的丙醇。
将每种沉淀剂加到装有抗VEGF(Genentech，South San Francisco，CA)的Milli-水溶液的聚丙烯管中，得到的终浓度为42.4g/L抗VEGF，10mMZnCl2，10mM NaOAc，pH5.7；沉淀剂的百分率如下面的表10所示。
将聚丙烯管置于环境温度并每天翻转以提供温和的混合。2周后，收集上清液样品并通过A280分析抗VEGF浓度。
结果
结果如表10所示。
表10
  沉淀剂   ％   晶体   上清液中的抗VEGF浓度(g/L)
  PEG 3350   0.5   是   52
PEG 3350 1   是   48
PEG 3350 5   是   49
  丙醇   0.5   是   41
  丙醇   1   是   47
  丙醇   5   是   46
  MPD   0.5   是   53
  MPD   1   是   48
  MPD   5   是   45
在所有批次的管中都目测观察到了晶体。所有聚丙烯管中测得的上清液浓度为41到53g/L。发生了结晶，但结晶似乎不因添加这些沉淀剂而增加。图6显示对于三种不同沉淀剂，上清液浓度与沉淀剂浓度的函数关系。可以确定，相对于使用10mM ZnCl2，10mM NaOAc，pH 5.7时的产率，添加MPD、PEG3350或丙醇似乎并不显著提高产率。
实施例7：其它单克隆抗体的结晶
我们考察了ZnCl2和NaOAc混合物是否可用作单克隆抗体的通用结晶条件。
本文已确定的抗VEGF结晶条件中不包含聚乙二醇。文献报道过的所有其它条件在其结晶过程中都用到了聚乙二醇。在过去的实验中，其它抗体在这些条件影响下从溶液中形成凝胶(gelling)或沉淀出来。在此实验中，为了研究抗体的相空间并确定结晶条件，对更高的ZnCl2浓度进行了研究。
材料和方法
比较的抗体为抗HER2、抗CD11a、抗2C4、抗CD20(2H7)、抗CD20(C2B8)和抗VEGF。将所有这些抗体在Milli-水中透析并浓缩到～100mg/mL。以分批模式进行实验，将1份抗体溶液与1份溶液合并。最终的样品体积为约3-5mL，且样品储存在6mL的聚丙烯管中，没有任何蛋白质对照。在环境温度和约2-8℃储存样品。每天检查一次样品。如果储存3天后没有观察到晶体或沉淀，则将温度完全调换：根据样品原来的储存条件，将样品转到2-8℃或室温。如果再过3天仍没有观察到任何东西，则将样品保存在2-8℃并每周监测一次。
各溶液具有不同的ZnCl2、CaCl2和MaCl2浓度，所有溶液都有0.01MNaOAc，pH为4.7或5.7。
结果
ZnCl2中抗VEGF分子的结果如表11所示。在这些条件下使用MaCl2或CaCl2没有观察到晶体(数据未显示)
表11
  ZnCl2(mM)   NaOAc(mM)   pH   温度(℃)   观察结果   双折射晶体
  75   10   4.7   环境温度   凝胶   否
  90   10   4.7   环境温度   凝胶   1或2个可能的晶体
  120   10   4.7   环境温度   厚凝胶   凝胶
  75   10   4.7   2-8   固体凝胶   小晶体
  90   10   4.7   2-8   固体凝胶   小晶体
  120   10   4.7   2-8   厚凝胶   晶体
  25   10   5.7   环境温度   厚凝胶   否
  50   10   5.7   环境温度   厚凝胶   凝胶小滴
  75   10   5.7   环境温度   松散凝胶   凝胶
  25   10   5.7   2-8   固体凝胶   晶体
  50   10   5.7   2-8   固体凝胶   许多小晶体
  75   10   5.7   2-8   1/2凝胶   许多小晶体
在任何测试的条件下，抗CD20(C2B8)和抗2C4分子的结果没有显示晶体或凝胶的形成(数据未显示)。
抗CD20(2H7)分子的结果在下面的表12(ZnCl2)、表13(CaCl2)和表14(MgCl2)中显示。在许多情况中形成了蛋白质凝胶。根据双折射的确定，沉淀的物质不是结晶的。
表12
  ZnCl2(mM)   NaOAc(mM)   pH   温度(℃)   观察结果   双折射晶体
  75   10   4.7   环境温度   透明   否
  90   10   4.7   环境温度   薄凝胶   否
  120   10   4.7   环境温度   凝胶   否
  75   10   4.7   2-8   沉淀   否
  90   10   4.7   2-8   沉淀   否
  120   10   4.7   2-8   沉淀   否
  25   10   5.7   环境温度   粒状沉淀   否
  50   10   5.7   环境温度   沉淀   否
  75   10   5.7   环境温度   沉淀   否
  25   10   5.7   2-8   凝胶   否
  50   10   5.7   2-8   厚凝胶   否
  75   10   5.7   2-8   厚凝胶   否
表13
  CaCl2   NaOAc   pH   温度   观察结果   双折射晶体
  (mM)   (mM)   (℃)
  200   10   4.7   环境温度   蛋白石状，白色固体   否
  500   10   4.7   环境温度   凝胶   否
  200   10   4.7   2-8   蛋白石状厚凝胶   否
  500   10   4.7   2-8   蛋白石状厚凝胶   否
  200   10   5.7   环境温度   厚凝胶   否
  500   10   5.7   环境温度   蛋白石状厚凝胶   否
  200   10   5.7   2-8   厚凝胶   否
  500   10   5.7   2-8   厚凝胶   否
表14
  MgCl2(mM)   NaOAc(mM)   pH   温度(℃)   观察结果   双折射晶体
  200   10   4.7   环境温度   短暂的凝胶   否
  500   10   4.7   环境温度   厚凝胶   否
  200   10   4.7   2-8   厚凝胶   否
  500   10   4.7   2-8   厚凝胶   否
  200   10   4.7   环境温度   短暂的凝胶   否
  500   10   4.7   环境温度   厚凝胶   否
  200   10   5.7   2-8   厚凝胶   否
  500   10   5.7   2-8   厚凝胶   否
抗HER2分子的结果如下表15(ZnCl2)所示。在这些条件下使用MgCl2或CaCl2没有观察到晶体(数据未显示)。
表15
  ZnCl2(mM)   NaOAc(mM)   pH   温度(℃)   观察结果   双折射晶体
  75   10   4.7   环境温度   浅乳白色   否
  90   10   4.7   环境温度   浅乳白色   否
  120   10   4.7   环境温度   蛋白石状   否
  75   10   4.7   2-8   透明   否
  90   10   4.7   2-8   蛋白石状   否
  120   10   4.7   2-8   小固体颗粒   弱的双折射
  25   10   5.7   环境温度   浅乳白色   否
  50   10   5.7   环境温度   浅乳白色   否
  75   10   5.7   环境温度   凝胶   否
  25   10   5.7   2-8   透明   否
  50   10   5.7   2-8   凝胶   否
  75   10   5.7   2-8   软凝胶   否
抗CD11a分子的结果如下表16(ZnCl2)所示。在这些条件下使用MgCl2或CaCl2没有观察到晶体(数据未显示)。
表16
  ZnCl2(mM)   NaOAc(mM)   pH   温度(℃)   观察结果   双折射晶体
  75   10   4.7   环境温度   透明   否
  90   10   4.7   环境温度   透明   否
  120   10   4.7   环境温度   蛋白石状   否
  75   10   4.7   2-8   透明   否
  90   10   4.7   2-8   透明   否
  120   10   4.7   2-8   沉淀   否
  25   10   5.7   环境温度   透明   否
  50   10   5.7   环境温度   透明   否
  75   10   5.7   环境温度   凝胶/固体   否
  25   10   5.7   2-8   透明   否
  50   10   5.7   2-8   蛋白石状   否
  75   10   5.7   2-8   沉淀   否
这些结果表明，不同抗体当接触ZnCl2和NaOAc时，可形成晶体或凝胶。

Claims (8)

1.制备抗VEGF抗体的晶体的方法，包括：
a)使抗VEGF抗体接触i)pH为约4.7到5.7的包含约5mM到120mM的ZnCl2和约1mM到100mM的NaOAc缓冲剂的溶液，所述接触在2-8℃进行；或ii)pH为约4.7的包含约5mM到60mM的ZnCl2和约1mM到100mM的NaOAc缓冲剂的溶液，所述接触在环境温度进行；或iii)pH为约5.7的包含约40mM到100mM的ZnCl2和约1mM到100mM的NaOAc缓冲剂的溶液，所述接触在环境温度进行；并
b)将所述抗VEGF抗体和所述溶液共同温育直到形成所述抗VEGF抗体的晶体。
2.权利要求1的方法，其中所述NaOAc缓冲剂包括约1mM到20mMNaOAc。
3.权利要求1的方法，其中所述NaOAc缓冲剂包括约25mM到75mMNaOAc。
4.权利要求1的方法，其中所述溶液包含多于约10mM的ZnCl2和多于约5mM的NaOAc。
5.权利要求4的方法，其中所述溶液包含约100mM的ZnCl2和约10mM的NaOAc。
6.制备抗VEGF抗体的晶体的方法，包括：
a)使抗VEGF抗体接触i)pH为约9.0的包含约50mM到100mM的MgCl2和10mM的Tris缓冲剂的溶液，所述接触在环境温度进行；或ii)pH为约9.0的包含约100mM的MgCl2和10mM的Tris缓冲剂的溶液，所述接触在2-8℃进行；并
b)将所述抗VEGF抗体和所述溶液共同温育直到形成所述抗VEGF抗体的晶体。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、亲和力成熟的抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人源抗体或人源化抗体。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述抗体是全长抗VEGF抗体。
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