JPS60192591A - 成人ｔ細胞白血病ウイルス抗原ポリペプチド - Google Patents
成人ｔ細胞白血病ウイルス抗原ポリペプチドInfo
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- JPS60192591A JPS60192591A JP59046687A JP4668784A JPS60192591A JP S60192591 A JPS60192591 A JP S60192591A JP 59046687 A JP59046687 A JP 59046687A JP 4668784 A JP4668784 A JP 4668784A JP S60192591 A JPS60192591 A JP S60192591A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ｅｎｖ遺伝子によりコードされる成人Ｔ細胞
白血病ウィルス抗原ポリペプチド、該ぺプチドをコード
するＤＮＡ断片を組み込んだ組換え体プラスミド、該プ
ラスミドを含む微生物および該微生物を用いるｅｎｖ遺
伝子によりコードされる成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原
ポリペプチドの製造法に関する。
白血病ウィルス抗原ポリペプチド、該ぺプチドをコード
するＤＮＡ断片を組み込んだ組換え体プラスミド、該プ
ラスミドを含む微生物および該微生物を用いるｅｎｖ遺
伝子によりコードされる成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原
ポリペプチドの製造法に関する。
成人Ｔ細胞白血病ウィルス［ａｄｕｌｔ Ｔ ｃｅｌｌ
ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ、以下ΔＴＬＶと略記す
る。ＡＴＬＶは、またヒトＴ細胞白血病ウィルス（ｌ（
ＴＬＶ）とも言うがここではＡＴＬＶを用いる。〕は、
成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕ
ｋｅｍｉａ 、以下ＡＴＬと略記する。）患者より分離
されたＣ型レトロウィルスである〔吉川ら、 Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ、以下ΔＴＬＶと略記す
る。ＡＴＬＶは、またヒトＴ細胞白血病ウィルス（ｌ（
ＴＬＶ）とも言うがここではＡＴＬＶを用いる。〕は、
成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕ
ｋｅｍｉａ 、以下ＡＴＬと略記する。）患者より分離
されたＣ型レトロウィルスである〔吉川ら、 Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、 ヱ９． ２０３１−２０３６ （
１９Ｂ２） ） 。 ＡＴＬ患者の予後は不良であり、
有効な治療法もなく、患者の半数は１０ケ月以内に死亡
するという報告が多い。
１９Ｂ２） ） 。 ＡＴＬ患者の予後は不良であり、
有効な治療法もなく、患者の半数は１０ケ月以内に死亡
するという報告が多い。
近年、ＡＴＬ患者血清中に、ＡＴＬ由来培養株であるＭ
Ｔ−１細胞と特異的に反応する抗体の存在が発見された
〔８沼ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、。
Ｔ−１細胞と特異的に反応する抗体の存在が発見された
〔８沼ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、。
ＵＳＡ、７８．６４７６−６４８０ （１９８１）］。
以後ＡＴＬ患者全例にこの抗体の存在が確認され、この
抗体に対する抗原はＡＴＬ−関連抗原（ＡＴＬ−ａｓｓ
ｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎ、以下ＡＴＬΔと略記す
る）とよばれている。このＡＴＬＡに対する抗体（以下
抗ＡＴＬＡ抗体と略記する）はＡＴＬ多発地帯の正常健
康人の２５％にも存在すること、さらに抗ＡＴＬＡ抗体
保持者の分布はＡＴＬ多発地域に一致することが判明し
ている。ＡＴＬＡの主体がこのレトロウィルス抗原であ
り、また患者末梢血リンパ球中には、ＡＴＬＶのゲノム
の存在が証明されるとともに、正常人で抗ＡＴＬＡ抗体
陽性者のリンパ球を培養してもＡＴＬＶが検出される。
抗体に対する抗原はＡＴＬ−関連抗原（ＡＴＬ−ａｓｓ
ｏｃｉａｔｅｄａｎｔｉｇｅｎ、以下ＡＴＬΔと略記す
る）とよばれている。このＡＴＬＡに対する抗体（以下
抗ＡＴＬＡ抗体と略記する）はＡＴＬ多発地帯の正常健
康人の２５％にも存在すること、さらに抗ＡＴＬＡ抗体
保持者の分布はＡＴＬ多発地域に一致することが判明し
ている。ＡＴＬＡの主体がこのレトロウィルス抗原であ
り、また患者末梢血リンパ球中には、ＡＴＬＶのゲノム
の存在が証明されるとともに、正常人で抗ＡＴＬＡ抗体
陽性者のリンパ球を培養してもＡＴＬＶが検出される。
ＡＴＬとＡＴＬＶは密接な関係があり、ＡＴＬＶはＡＴ
Ｌの原因ウィルスと考えられているが、いまだ感染経路
等は明確でない。輸血が感染経路の１つであることが示
されている。
Ｌの原因ウィルスと考えられているが、いまだ感染経路
等は明確でない。輸血が感染経路の１つであることが示
されている。
ＡＴＬの多発地域では健康人の２５％が抗ΔＴＬＡ抗体
陽性であり、これらの人々はＡＴＬＶのキャリヤである
可能性が極めて高いため、これらの人々からの輸血は避
けるべきである。
陽性であり、これらの人々はＡＴＬＶのキャリヤである
可能性が極めて高いため、これらの人々からの輸血は避
けるべきである。
抗ＡＴＬＡ抗体を検出できれば、そのような輸血を回避
でき、またＡＴＬの早期発見もできる。
でき、またＡＴＬの早期発見もできる。
現在、抗ΔＴＬＡ抗体の検出は、ＡＴＬ由来培養細胞株
のア士トン固定スライドを用いて行われている。しかし
、より簡便、迅速な抗ＡＴＬＡ抗体の検出およびＡＴＬ
の早期発見が望まれている。
のア士トン固定スライドを用いて行われている。しかし
、より簡便、迅速な抗ＡＴＬＡ抗体の検出およびＡＴＬ
の早期発見が望まれている。
本発明者らは、抗ＡＴＬＡ抗体の検出ならびにＡＴＬＶ
の感染予防に役立つＡＴＬＡを大量かつ安価に供給でき
る方法について研究を行った。その結果、ＡＴＬＶゲノ
ムの外被蛋白質抗原（表面抗原）ペプチド遺伝子（ｅｎ
ｖ遺伝子とよばれる）を組換えＤＮＡの手法を用いてベ
クターＤＮＡに組み込み、得られる組換え体ＤＮＡを含
む酵母を培養した結果、ｅｎｖ遺伝子によりコードされ
るＡ Ｔ Ｌ Ｖ抗原ポリペプチドが著量生成蓄積され
ることを見出し、本発明を完成した。
の感染予防に役立つＡＴＬＡを大量かつ安価に供給でき
る方法について研究を行った。その結果、ＡＴＬＶゲノ
ムの外被蛋白質抗原（表面抗原）ペプチド遺伝子（ｅｎ
ｖ遺伝子とよばれる）を組換えＤＮＡの手法を用いてベ
クターＤＮＡに組み込み、得られる組換え体ＤＮＡを含
む酵母を培養した結果、ｅｎｖ遺伝子によりコードされ
るＡ Ｔ Ｌ Ｖ抗原ポリペプチドが著量生成蓄積され
ることを見出し、本発明を完成した。
ｅｎｖ遺伝子産物の１つが分子量６，２万の糖蛋白質（
ｇｐ６２）であることについては既に報告［）１ａｔｔ
ｏｒｉら：Ｇａｎｎ、 ７４．７９０−７９３ （１９
８３））があり、またＡＴＬＶの全ＤＮＡ配列は本発明
者らが決定した〔特願昭５７−２１４２８７． Ｐｒｏ
ｃ。
ｇｐ６２）であることについては既に報告［）１ａｔｔ
ｏｒｉら：Ｇａｎｎ、 ７４．７９０−７９３ （１９
８３））があり、またＡＴＬＶの全ＤＮＡ配列は本発明
者らが決定した〔特願昭５７−２１４２８７． Ｐｒｏ
ｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ロＳＡ ８ρ、３６１８
−３６２２ （１９８３））が、微生物においてｅｎｖ
遺伝子によりコードされるＡＴＬＶ抗原ポリペプチドの
生産を行ったのは本発明がはじめてである。
−３６２２ （１９８３））が、微生物においてｅｎｖ
遺伝子によりコードされるＡＴＬＶ抗原ポリペプチドの
生産を行ったのは本発明がはじめてである。
本発明で生産されるＡＴＬＶ表面抗原蛋白質は、表面抗
原の蛋白質の全体を含むので、表面抗原上に複数存在す
る抗原決定基の全部を含み、診断用。
原の蛋白質の全体を含むので、表面抗原上に複数存在す
る抗原決定基の全部を含み、診断用。
ワクチン用の抗原として適していると考えられる。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明は、ＡＴＬＶのｅｎｖ遺伝子をコードするＤＮＡ
断片を組み込んだ組換え体プラスミド。
断片を組み込んだ組換え体プラスミド。
該プラスミドを含む微生物および該微生物を用いるＡＴ
ＬＶ抗原ペプチド（ｅｎｖ遺伝子産物）の製造法を提供
する。
ＬＶ抗原ペプチド（ｅｎｖ遺伝子産物）の製造法を提供
する。
本発明の組換え体プラスミドの造成は以下のとふり行う
。
。
ＡＴＬＶのｅｎｖ遺伝子をコードするＤＮＡを組換えＤ
ＮＡ技法によりベクターＤＮＡに組み込むことによって
組換え体プラスミドを造成することができる。
ＮＡ技法によりベクターＤＮＡに組み込むことによって
組換え体プラスミドを造成することができる。
ＡＴＬＶのｅｎｖ遺伝子をコードするＤＮＡとしては、
たとえば清水らによってクローン化されたｐＡＴＫ１０
Ｍ清木ら、 Ｐ清水ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
たとえば清水らによってクローン化されたｐＡＴＫ１０
Ｍ清木ら、 Ｐ清水ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、、 ＵＳＡ、８０．３６１３−３６２２ （１
９８３））を用いることができる。ＡＴＬＶのゲノムは
、両端のＬＴＲとｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｐＸの少な
くとも４つの遺伝子とからなる。このうちｅｎｖ遺伝子
にコードされる蛋白質は、ＡＴＬＶの感染により発現す
る外被蛋白質抗原（表面抗原）であることが知られてい
るのでＡＴＬＶ感染の診断、ＡＴＬＶ感染の阻止、ＡＴ
ＬＶにより生じた白血病の治療。
９８３））を用いることができる。ＡＴＬＶのゲノムは
、両端のＬＴＲとｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｐＸの少な
くとも４つの遺伝子とからなる。このうちｅｎｖ遺伝子
にコードされる蛋白質は、ＡＴＬＶの感染により発現す
る外被蛋白質抗原（表面抗原）であることが知られてい
るのでＡＴＬＶ感染の診断、ＡＴＬＶ感染の阻止、ＡＴ
ＬＶにより生じた白血病の治療。
さらには蛋白質自体のワクチンとしての使用などにも利
用することが期待される。
用することが期待される。
ｐＡＴＫｌｏｏは、ｅｎｖ遺伝子を全テ含ムクローンで
あり、ｅｎｖ遺伝子をコードするＤＮＡ断片の供給源と
して用いることができる。
あり、ｅｎｖ遺伝子をコードするＤＮＡ断片の供給源と
して用いることができる。
ベクターＤＮＡとしては、挿入した目的ＤＮＡが微生物
中で発現できるものなら、いかなるものも用いることが
できる。好ましくは、適当なプロモーター、たとえば酵
母の３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）系、ト
リプトファン（ＴＲＰｌ）系、アルコール脱水素酵母Ｉ
（ΔＤＨＩ）系。
中で発現できるものなら、いかなるものも用いることが
できる。好ましくは、適当なプロモーター、たとえば酵
母の３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）系、ト
リプトファン（ＴＲＰｌ）系、アルコール脱水素酵母Ｉ
（ΔＤＨＩ）系。
ガラクトース・キナーゼ（ＧΔＬｌ）系、グリセルアル
デヒドー３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）系、！−
６０などのプロモーターを持ち、その下流に目的ＤＮＡ
を挿入できるプラスミドを用いることができる。プラス
ミドとしてはｐＹｅＨＢｓ。
デヒドー３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）系、！−
６０などのプロモーターを持ち、その下流に目的ＤＮＡ
を挿入できるプラスミドを用いることができる。プラス
ミドとしてはｐＹｅＨＢｓ。
ｐＭＡ３６．ｐＭＡ５６．ｐＭＡ８２などを用いること
ができるが、具体的に好適なプラスミドとしては、ｐＡ
Ｍ８２をあげることができる。ｐΔＭ８２はＭｉｙａｎ
ｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ができるが、具体的に好適なプラスミドとしては、ｐＡ
Ｍ８２をあげることができる。ｐΔＭ８２はＭｉｙａｎ
ｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＩＪｓ八、８Ｑ、］−５（１９８３）に記載された方法
で製造される。ｐＡＭ８２はｐＢ’Ｒ３２２由来の複製
開始点、アンピシリン耐性（Ａｐ”）遺伝子および酵母
由来のａｒｓｌ遺伝子、１ｅｕ２遺伝子。
で製造される。ｐＡＭ８２はｐＢ’Ｒ３２２由来の複製
開始点、アンピシリン耐性（Ａｐ”）遺伝子および酵母
由来のａｒｓｌ遺伝子、１ｅｕ２遺伝子。
２μＤＮＡの複製開始点を有し、大腸菌および酵母菌内
での自己複製およびプラスミド保持菌の選択が可能なプ
ラスミドである。
での自己複製およびプラスミド保持菌の選択が可能なプ
ラスミドである。
さらにｐＡＭ８２は酵母菌の抑制型酵母ホスファターゼ
のポリペプチド（Ｐ−６０）遺伝子のプロモーター領域
を有しており、本プラスミドに唯一存在するＸｈｏＩ部
位に翻訳開始点を有する遺伝子を挿入することにより、
外来ＤＮＡを発現させることができる。
のポリペプチド（Ｐ−６０）遺伝子のプロモーター領域
を有しており、本プラスミドに唯一存在するＸｈｏＩ部
位に翻訳開始点を有する遺伝子を挿入することにより、
外来ＤＮＡを発現させることができる。
−ＡＴＬＶのｅ’ｎ ｖ遺伝子をコードするＤＮＡ。
たとえばｐΔＴＫ１００からのＤ ’Ｎ Ａと、ベクタ
ーＤＮＡたとえばｐＡＭ８２との組換えは、制限酵素を
用いて両ＤＮＡを消化後、Ｔ ４ ＤＮＡ リガーゼを
用いて結合する一般的組換えＤＮＡ技法を用いて行うこ
とができる。結合に際してはＤＮＡポリメラーゼ■・Ｋ
ｌｅｎｏｗ断片を用いる埋め込み反応（ｆｉｌｌ−ｉｎ
）や、ＤＮＡリンカ−を用いる方法によって行うこと
ができる。
ーＤＮＡたとえばｐＡＭ８２との組換えは、制限酵素を
用いて両ＤＮＡを消化後、Ｔ ４ ＤＮＡ リガーゼを
用いて結合する一般的組換えＤＮＡ技法を用いて行うこ
とができる。結合に際してはＤＮＡポリメラーゼ■・Ｋ
ｌｅｎｏｗ断片を用いる埋め込み反応（ｆｉｌｌ−ｉｎ
）や、ＤＮＡリンカ−を用いる方法によって行うこと
ができる。
具体例として示したｐΔＴＫ１００とｐＡＭ８２の場合
は、第１図に示したごとく、ｐＡＴＫｌｏｏのｅｎｖ遺
伝子を制限酵素Ｐｓｔｌで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで末端を平滑末端にし、さらにＨｉｎｄｌｌｒおよ
びＨａ ｅＩＩＩで次々に消化して得られる断片をｐＡ
Ｍ８２のＸｈｏＩ部位に挿入することによって組換え体
プラスミドｐＡＴＹＥ３０７を造成することができる。
は、第１図に示したごとく、ｐＡＴＫｌｏｏのｅｎｖ遺
伝子を制限酵素Ｐｓｔｌで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼで末端を平滑末端にし、さらにＨｉｎｄｌｌｒおよ
びＨａ ｅＩＩＩで次々に消化して得られる断片をｐＡ
Ｍ８２のＸｈｏＩ部位に挿入することによって組換え体
プラスミドｐＡＴＹＥ３０７を造成することができる。
上記組換えプラスミド作成に必要な反応の条件は次のと
おりである。
おりである。
ＤＮＡの制限酵素による消化は通常０．１〜１００μｇ
のＤＮＡを２〜２００ミリモル（好ましくは１０〜４０
ミリモル）のトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ６
，０〜９．５、好ましくはｐ Ｈ７，０−８，０）、］
〜１５０ミリモルのＮａＣｊ！、２〜２０ミリモル（好
ましくは５〜１０ミリモル）のＭ ｇ ＣＩｌＲ中で制
限酵素０．１〜３００単位（好ましくは１μｇのＤＮＡ
に対し１〜３単位の酵素）を用い、１８〜４２℃（好ま
しくは３２〜３８℃）において、１５０〜２４時間消化
反応を行う。反応の停止は通常５５〜７５℃（好ましく
は６３〜７０℃）で５〜３０分間加熱することによるが
、フェノールやジエチルピロカーボネートなどの試薬に
より制限酵素を失活させる方法も用いることができる。
のＤＮＡを２〜２００ミリモル（好ましくは１０〜４０
ミリモル）のトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ６
，０〜９．５、好ましくはｐ Ｈ７，０−８，０）、］
〜１５０ミリモルのＮａＣｊ！、２〜２０ミリモル（好
ましくは５〜１０ミリモル）のＭ ｇ ＣＩｌＲ中で制
限酵素０．１〜３００単位（好ましくは１μｇのＤＮＡ
に対し１〜３単位の酵素）を用い、１８〜４２℃（好ま
しくは３２〜３８℃）において、１５０〜２４時間消化
反応を行う。反応の停止は通常５５〜７５℃（好ましく
は６３〜７０℃）で５〜３０分間加熱することによるが
、フェノールやジエチルピロカーボネートなどの試薬に
より制限酵素を失活させる方法も用いることができる。
ＤＮＡ断片を結合させる場合は２〜２００ ミＩＪモル
（好ましくは１０〜７０ミリモル）のトリス塩酸（ｐＨ
６，０−９，５、ｐＨ７，０−８，０）、２〜２０ミリ
モル（好ましくは５〜１０ミリモル）のＭｇＣＣ１０，
１〜１０ミリモル（好ましくは０．５〜２ミリモル）の
ＡＴＰ、１〜５０ミリモル（好ましくは５〜１０ミリモ
ル）のジチオスレイトール中でＴ４ＤＮＡリガーゼ０．
１〜１０単位を用いて１〜３７℃（好ましくは３〜２０
℃）で１５分〜７２時間（好ましくは２〜２０’時間）
結合反応を行う。
（好ましくは１０〜７０ミリモル）のトリス塩酸（ｐＨ
６，０−９，５、ｐＨ７，０−８，０）、２〜２０ミリ
モル（好ましくは５〜１０ミリモル）のＭｇＣＣ１０，
１〜１０ミリモル（好ましくは０．５〜２ミリモル）の
ＡＴＰ、１〜５０ミリモル（好ましくは５〜１０ミリモ
ル）のジチオスレイトール中でＴ４ＤＮＡリガーゼ０．
１〜１０単位を用いて１〜３７℃（好ましくは３〜２０
℃）で１５分〜７２時間（好ましくは２〜２０’時間）
結合反応を行う。
ＤＮＡ断片、組換え体プラスミドなどの精製はアガロー
スゲル電気泳動法によって行う。
スゲル電気泳動法によって行う。
組換え体プラスミド、たとえばｐＡＴＹＥ３０７を微生
物に形質転換して入れ、得られる形質転換株を培養する
ことによってｅｎｖ遺伝子によりコードされるＡ ’Ｔ
Ｌ Ｖ抗原ポリペプチドを得ることができる。
物に形質転換して入れ、得られる形質転換株を培養する
ことによってｅｎｖ遺伝子によりコードされるＡ ’Ｔ
Ｌ Ｖ抗原ポリペプチドを得ることができる。
微生物としては、酵母が好ましく用いられ、具体的に好
適には、Ｓ’ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａ’ｅ Ａｔ１２２（ａ、 Ｉｅｕ２． ｈｉｓ４
． ｃａｎｌ、 ｃｉｒ” ） ［Ｉｔｏ、 Ｈ，ｅｔ
ａｌ、。
適には、Ｓ’ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉ
ｓｉａ’ｅ Ａｔ１２２（ａ、 Ｉｅｕ２． ｈｉｓ４
． ｃａｎｌ、 ｃｉｒ” ） ［Ｉｔｏ、 Ｈ，ｅｔ
ａｌ、。
Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 １５３．１６３−１６８
（１９８３） ］が用いられる。
（１９８３） ］が用いられる。
形質転換はＨ，Ｉｔｏらの方法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、 １５３゜１６３−１６８ （１９８３））に従っ
て行うことができる。形質転換株はｐＡＴＹＥ３０７の
場合、ロイシン非要求性株として得ることができる。
ｌ、 １５３゜１６３−１６８ （１９８３））に従っ
て行うことができる。形質転換株はｐＡＴＹＥ３０７の
場合、ロイシン非要求性株として得ることができる。
形質転換株によるΔＴＬＶ抗原ポリペプチドの発現はた
とえばこの菌株をプルクホールダーの最小培地またはそ
の改良培地にて培養後、菌体破砕してフェニルメチルス
ルフォニルフルオライドを含むリン酸緩衝液で抽出し、
得られる抽出液をＳＤＳ存在下のゲル電気泳動にかけ、
Ｔｏｗｂｉｎらの方法−［Ｔｏｗｂｉｎ Ｈ，ｅｔ ａ
ｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ。
とえばこの菌株をプルクホールダーの最小培地またはそ
の改良培地にて培養後、菌体破砕してフェニルメチルス
ルフォニルフルオライドを含むリン酸緩衝液で抽出し、
得られる抽出液をＳＤＳ存在下のゲル電気泳動にかけ、
Ｔｏｗｂｉｎらの方法−［Ｔｏｗｂｉｎ Ｈ，ｅｔ ａ
ｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ ７６、４３５０−４３５４ （１９７９）：］
により、酵母中に産生されたＡＴＬＶ外被蛋白質を検出
することにより確認する。ここで検出されたポリペプチ
ドは患者血清と特異的に免疫沈降することが確認でき、
Ａ Ｔ’ Ｌ Ｖ抗原ペプチドとしての性質を保有して
いることがわかる。
により、酵母中に産生されたＡＴＬＶ外被蛋白質を検出
することにより確認する。ここで検出されたポリペプチ
ドは患者血清と特異的に免疫沈降することが確認でき、
Ａ Ｔ’ Ｌ Ｖ抗原ペプチドとしての性質を保有して
いることがわかる。
酵母からのプラスミドの分離はに、 ５ｔｒｕ旧ら、Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ
７６１０３５ （１９７９）の方法によって行う。
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ
７６１０３５ （１９７９）の方法によって行う。
ｐＡＴＹＥ３０７の形質転換株は、米国アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションにＳａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｃ１１ｌ八ＴＣＣ２
０６９７としてそれぞれ国際寄託が行われている。
イプ・カルチャー・コレクションにＳａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｃ１１ｌ八ＴＣＣ２
０６９７としてそれぞれ国際寄託が行われている。
以下本発明の実施例を示す。
実施例１゜
プラスミドｐＡＴＫ １００ ［：５ｅｉｋｉ、 Ｍ、
ｅｔ ａｌ、。
ｅｔ ａｌ、。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、’Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ
８０ 、３６１８−３６２２ ］の２００μｇを、５０
ｍＭ ＮａＣｊ！、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩｌ （ｐ
Ｈ７，５）、７ｍＭ ＭｇＣｊＬおよび６ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノールからなる緩衝液１０００μｌに溶か
し、さらに制限酵素Ｐｓｔｌ（全酒造社製、以下特記し
ないかぎり制限酵素は同社製である）２００単位を加え
、３７℃で１時間反応させた。反応物を０．９％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、１μｇ ／ｍｌのエチジウム
・ブロマイドで染色してＤＮＡ断片を検出し、ｅｎｖ遺
伝子を含む２．４２５塩基対（ｂｐと略記する）のＩ）
ＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片４１μｇを３０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７，９）、６６ｍＭ酢酸カリウム
、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ ｍ Ｍジチオス
レイトール、０．１ｍＭｄＡＴＰ、０．１ｍＭ ｄＴＴ
Ｐ、０．１ｍＭ ｄＧＴＰおよび０．１ｍＭ ｄＣＴＰ
を含む液３００μＡに加え、さらにＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ（全酒造社製）４単位を加えて、３７℃で１０分間
反応した。
８０ 、３６１８−３６２２ ］の２００μｇを、５０
ｍＭ ＮａＣｊ！、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩｌ （ｐ
Ｈ７，５）、７ｍＭ ＭｇＣｊＬおよび６ｍＭ ２−メ
ルカプトエタノールからなる緩衝液１０００μｌに溶か
し、さらに制限酵素Ｐｓｔｌ（全酒造社製、以下特記し
ないかぎり制限酵素は同社製である）２００単位を加え
、３７℃で１時間反応させた。反応物を０．９％アガロ
ースゲル電気泳動にかけ、１μｇ ／ｍｌのエチジウム
・ブロマイドで染色してＤＮＡ断片を検出し、ｅｎｖ遺
伝子を含む２．４２５塩基対（ｂｐと略記する）のＩ）
ＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片４１μｇを３０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７，９）、６６ｍＭ酢酸カリウム
、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ ｍ Ｍジチオス
レイトール、０．１ｍＭｄＡＴＰ、０．１ｍＭ ｄＴＴ
Ｐ、０．１ｍＭ ｄＧＴＰおよび０．１ｍＭ ｄＣＴＰ
を含む液３００μＡに加え、さらにＴ４ＤＮＡポリメラ
ーゼ（全酒造社製）４単位を加えて、３７℃で１０分間
反応した。
この反応で、該ＤＮＡ断片のＰｓｔＩ切断による接着末
端（Ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）は修復されて、平滑末
端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）になった。
端（Ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）は修復されて、平滑末
端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）になった。
このＤＮＡ断片４０ｔ−ｔｇを、５０ｍＭ ＮａＣβ、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ（ｐＨ７，５）、７ｍＭ
Ｍ ｇ Ｃ，Ｉｌ ２および６ｍＭ ２−メルカプトエ
タノールからなる緩衝液２００μｌに溶かし、さらに制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ５０単位を加え、３７℃で１時間
反応させ、ｅｎｖ遺伝子を含む１，７４３ｂｐのＤＮＡ
断片を得た。この１．７４３ ｂ ｐのＤＮＡ断片２７
μｇを５０ｍＭ ＮａＣｊ！、１０ｍＭＴｒ ｉ ５−
ＨＣＩｌ（ｐＨ７，５）、７ｍＭ ’ＭｇＣｌ１２およ
び６ｍＭ ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液２
５０μｌに溶かし、さらに制限酵素Ｈａｅ１１１４２単
位を加え、３７℃で２５分間反応させた。反応物を１．
４％アガロースゲル電気泳動にかけ、１μｇ ／ｎ＋１
のエチジウム・ブロマイドで染色してＤＮ断片を検出し
、ｅｎｖ遺伝子を含む、１．５９０ｂｐのＤＮＡ断片を
得た。
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ（ｐＨ７，５）、７ｍＭ
Ｍ ｇ Ｃ，Ｉｌ ２および６ｍＭ ２−メルカプトエ
タノールからなる緩衝液２００μｌに溶かし、さらに制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ５０単位を加え、３７℃で１時間
反応させ、ｅｎｖ遺伝子を含む１，７４３ｂｐのＤＮＡ
断片を得た。この１．７４３ ｂ ｐのＤＮＡ断片２７
μｇを５０ｍＭ ＮａＣｊ！、１０ｍＭＴｒ ｉ ５−
ＨＣＩｌ（ｐＨ７，５）、７ｍＭ ’ＭｇＣｌ１２およ
び６ｍＭ ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液２
５０μｌに溶かし、さらに制限酵素Ｈａｅ１１１４２単
位を加え、３７℃で２５分間反応させた。反応物を１．
４％アガロースゲル電気泳動にかけ、１μｇ ／ｎ＋１
のエチジウム・ブロマイドで染色してＤＮ断片を検出し
、ｅｎｖ遺伝子を含む、１．５９０ｂｐのＤＮＡ断片を
得た。
一方、ベクタープラスミドｐΔＭ８２ （Ｍｉｙａｎｏ
ｈａｒａ。
ｈａｒａ。
八、 ｅｔ ａユ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、ＩＩＳ八、 ８０ ＋１−５．１９８３）の３
ｕｇを１００ｍＭ ＮａＣＡ、１０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５
−ＨＣＩｌ （ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｇＣｊ！２Ｊよ
び６ｍＭ ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液２
０μｌに溶かし、さらに制限酵素ＸｈｏＩ ８単位を加
え、３７℃で１時間反応させた。ＤＮＡ断片を含むこの
反応液を５０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩｌ （ｐＨ７
，８）、５ｍＭＭｇＣｊ！２．１０ｍＭ ２−メルカプ
トエタノール、５．！ｊｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛血清アル
ブミン）、０．１ｍＭ ｄＡＴＰ、０．１ｍＭ ｄＴＴ
Ｐ、０．１ｍＭ ｄＧＴＰおよび０．１ｍＭ ｄＣｊＰ
を含む液２５μｌに加え、さらにＤＮＡポリメラーゼＩ
（Ｋｌｅｎｏｗ断片）３単位を加えて、２２℃で３０分
間反応した。この反応で、該ＤＮＡ断片のＸｈ。
Ｓｃｉ、ＩＩＳ八、 ８０ ＋１−５．１９８３）の３
ｕｇを１００ｍＭ ＮａＣＡ、１０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５
−ＨＣＩｌ （ｐＨ７，５）、７ｍＭＭｇＣｊ！２Ｊよ
び６ｍＭ ２−メルカプトエタノールからなる緩衝液２
０μｌに溶かし、さらに制限酵素ＸｈｏＩ ８単位を加
え、３７℃で１時間反応させた。ＤＮＡ断片を含むこの
反応液を５０ｍＭ Ｔｒ ｉ ５−ＨＣＩｌ （ｐＨ７
，８）、５ｍＭＭｇＣｊ！２．１０ｍＭ ２−メルカプ
トエタノール、５．！ｊｇ／ｍｌ ＢＳＡ（牛血清アル
ブミン）、０．１ｍＭ ｄＡＴＰ、０．１ｍＭ ｄＴＴ
Ｐ、０．１ｍＭ ｄＧＴＰおよび０．１ｍＭ ｄＣｊＰ
を含む液２５μｌに加え、さらにＤＮＡポリメラーゼＩ
（Ｋｌｅｎｏｗ断片）３単位を加えて、２２℃で３０分
間反応した。この反応で、該ＤＮＡ断片のＸｈ。
■切断による接着末端が修復されて平滑末端になった約
１１，０００ ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
１１，０００ ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
ｐＡＴＫ１００由来のＤＮＡ断片（１゜５９０ ｂｐ）
０．２３μｇと、ｐＡＭ８２由来のＤＮＡ断片（約１１
．０００ｂｐ）０．８４μｇとを６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩｌ （’ｐＨ７，５）、６．６ｍＭ ＭｇＣＣ１
１０ｍＭジチオスレトールおよび０．５ｍＭＡＴＰから
なる液５０μｌに加え、さらにＴ ４ ＤＮＡ リガー
ゼ（全酒造社製）３単位を加えて、４℃で１日間結合反
応を行った。
０．２３μｇと、ｐＡＭ８２由来のＤＮＡ断片（約１１
．０００ｂｐ）０．８４μｇとを６６ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩｌ （’ｐＨ７，５）、６．６ｍＭ ＭｇＣＣ１
１０ｍＭジチオスレトールおよび０．５ｍＭＡＴＰから
なる液５０μｌに加え、さらにＴ ４ ＤＮＡ リガー
ゼ（全酒造社製）３単位を加えて、４℃で１日間結合反
応を行った。
反応液をフェノール抽出して除蛋白して得られる液を用
いて常法に従い大腸菌ＨＢＩＯＩ［’Ｂｏｌｉｖｅｒ
ら、Ｇｅ１ｅ ２７５ （１９７７））を形質転換した
。形質転換株は、Ｌ −Ｂｒｏｔｈ（！β中バクトドリ
プトン１０ｇ１酵母エキス５ｇ、ＮａＣｊ！５ｇを含む
培地）にアンピシリン２５μｇ ／ｍｌを含む培地上で
生育してくる菌株として選択した。形質転換株の１株か
らプラスミドをＨｌＣ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ７．１５１
３ （１９７９）に記載の方法に従い分離し、ｐＡＴＹ
Ｅ３０７と命名した。
いて常法に従い大腸菌ＨＢＩＯＩ［’Ｂｏｌｉｖｅｒ
ら、Ｇｅ１ｅ ２７５ （１９７７））を形質転換した
。形質転換株は、Ｌ −Ｂｒｏｔｈ（！β中バクトドリ
プトン１０ｇ１酵母エキス５ｇ、ＮａＣｊ！５ｇを含む
培地）にアンピシリン２５μｇ ／ｍｌを含む培地上で
生育してくる菌株として選択した。形質転換株の１株か
らプラスミドをＨｌＣ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ら、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ７．１５１
３ （１９７９）に記載の方法に従い分離し、ｐＡＴＹ
Ｅ３０７と命名した。
ｐＡＴＹＥ３０７はベクタープラスミドｐＡＭ８２のＰ
−６０プロモーターと同じ転写方向にｅｎｖ遺伝子が組
み込まれた組換え体であり、Ｐ−６０プロモーターの支
配下にＡＴＬＶのｅｎｖ遺伝子の発現が可能な構造（下
記構造参照）をしていることを、Ｍａｘａｍ−Ｇ ｉ
Ｉｂｅｒｔの方法［Ａ、 ＭｌＭａｘａｍら ： Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４’
、５６０（１９７７） ］によって確１忍した。
−６０プロモーターと同じ転写方向にｅｎｖ遺伝子が組
み込まれた組換え体であり、Ｐ−６０プロモーターの支
配下にＡＴＬＶのｅｎｖ遺伝子の発現が可能な構造（下
記構造参照）をしていることを、Ｍａｘａｍ−Ｇ ｉ
Ｉｂｅｒｔの方法［Ａ、 ＭｌＭａｘａｍら ： Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４’
、５６０（１９７７） ］によって確１忍した。
一−ＴＧＡＡＡＣＧＴＡＴＡＴＡＡＧ［ｌ：ＧＣＴＧＡ
ＴＧＴＴＴＴＧＣＴ八八ＧＴＣ’Ｇ八ＧＧＨｏｇへへ爾
３ ｏ へ ＴＴＡＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＣＡＴＧ八Ｇ
ＡＡＴ八八Ｇ八八［へへＣＣＣａｐｐｉｎｇへｂｏｘ ＴへへＣへへＣＧＣＣＧＡＴ（：ＣＣ八へへへ八へへへ
へへ八ＣＣ八Ｃ［へへ［八［Ｃ←４ このプラスミドｐＡＴＹＥ３０７を用いてしｉ＋法（Ｉ
ｔｏ、 Ｈ，、ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、 １５３．１６３−１６８、１９８３ ） に従い
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ＾
Ｈ２２（ａ、 ］ｅｕ２． ｈｉｓ４． ｃａｎｌ、
ｃｉｒ＋） （同上文献記載）を形質転換した。形質転
換株は、６．７ｇ／ｌのＹｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ
（Ｄｉｆｃｏ社製）、２０ｇ／βのグルコース、および
２０ｇｇ ／ｍｌのヒスチジンを含む培地上で生育して
くる菌株として選択した。
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ｔｏ、 Ｈ，、ｅｔ ａｌ、、 Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ、 １５３．１６３−１６８、１９８３ ） に従い
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ＾
Ｈ２２（ａ、 ］ｅｕ２． ｈｉｓ４． ｃａｎｌ、
ｃｉｒ＋） （同上文献記載）を形質転換した。形質転
換株は、６．７ｇ／ｌのＹｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ
ｂａｓｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ
（Ｄｉｆｃｏ社製）、２０ｇ／βのグルコース、および
２０ｇｇ ／ｍｌのヒスチジンを含む培地上で生育して
くる菌株として選択した。
ｐＡＴＹＥ３０７を含む形質転換株は米国アメリカ・タ
イプ・カルチャー・コレクションにＳａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＩ １１ Ａ Ｔ
ＣＣとして寄託されている。
イプ・カルチャー・コレクションにＳａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＩ １１ Ａ Ｔ
ＣＣとして寄託されている。
実施例２゜
実施例１で得られた形質転換株ＣＩＩＩおよびｐＡＭ８
２をＡ３２２株に導入したＬ−８２−１株を改良したブ
ルクホールグーの最小培地（ｐＨ５，０）［：、ＩＩｌ
中に次の成分を含む培地ニゲルコース２０ｇ、アスパラ
ギン２ｇ、ＫＨ２Ｐ０．１．５ｇ、ＣａＣＬ ・２Ｈ２
０，０，３３ｇ、Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈ２０’０．５ｇ、’
（ＮＨ，）２８０． ２ｇ。
２をＡ３２２株に導入したＬ−８２−１株を改良したブ
ルクホールグーの最小培地（ｐＨ５，０）［：、ＩＩｌ
中に次の成分を含む培地ニゲルコース２０ｇ、アスパラ
ギン２ｇ、ＫＨ２Ｐ０．１．５ｇ、ＣａＣＬ ・２Ｈ２
０，０，３３ｇ、Ｍｇ５Ｏ＜・７Ｈ２０’０．５ｇ、’
（ＮＨ，）２８０． ２ｇ。
ＫＩ Ｏ，１＋ｎｇ、８３ ＢＯ２６０１−ｔｇ、Ｍｎ
ＳＯ４３０μｇ、Ｚｎ５Ｏ＜ ・７Ｈ２０３０’（Ｊｕ
ｇ。
ＳＯ４３０μｇ、Ｚｎ５Ｏ＜ ・７Ｈ２０３０’（Ｊｕ
ｇ。
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２０４［１／Ｊｇ、ＦｅＣＡ３−６Ｈ
２０２５，０ｇｇ、Ｎａ２Ｍ００４ ・２８２０２５μ
ｇ、チアミン２００μｇ、ピリドキシン２００μｇ、ニ
コチン１１２２００ｇｇ、パントティン酸２００μｇ、
ビオチン２μｇ、イノシトール１０ｍｇ、ヒスチジン２
０ｍｇ：］に植菌し、３０℃で１晩振盪（２ＱＯｒｐｍ
）培養した。集菌し、菌体を滅菌水で洗浄後、生産培地
（改良したプルクホールグー最小培地のＫＨ２ＰＯ，８
度を３０ｍｇ／ｊｌ！に下げて、Ｌ ５ ｇ ／ （ｌ
のＫＣｌを添加した培地）にＯＤ、、、が０．０５とな
るように懸濁し、３０℃で２０〜２４時間振盪（２０Ｏ
ｒｐｍ）培養した。集菌し、菌体を滅菌水で洗浄後、１
ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオロライドを含
む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）０．５＋＋＋］
に懸濁し、ガラスピーズを用いて粉砕して抽出液を調製
した。抽出液を、０．１％ＳＤＳ存在下のポリアクリル
アミドゲル電気泳動にかけ、Ｔｏｗｂｉｎらの方法［Ｔ
ｏｗｂｉｎ、Ｈ，、ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ。
２０２５，０ｇｇ、Ｎａ２Ｍ００４ ・２８２０２５μ
ｇ、チアミン２００μｇ、ピリドキシン２００μｇ、ニ
コチン１１２２００ｇｇ、パントティン酸２００μｇ、
ビオチン２μｇ、イノシトール１０ｍｇ、ヒスチジン２
０ｍｇ：］に植菌し、３０℃で１晩振盪（２ＱＯｒｐｍ
）培養した。集菌し、菌体を滅菌水で洗浄後、生産培地
（改良したプルクホールグー最小培地のＫＨ２ＰＯ，８
度を３０ｍｇ／ｊｌ！に下げて、Ｌ ５ ｇ ／ （ｌ
のＫＣｌを添加した培地）にＯＤ、、、が０．０５とな
るように懸濁し、３０℃で２０〜２４時間振盪（２０Ｏ
ｒｐｍ）培養した。集菌し、菌体を滅菌水で洗浄後、１
ｍＭのフェニルメチルスルフォニルフルオロライドを含
む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）０．５＋＋＋］
に懸濁し、ガラスピーズを用いて粉砕して抽出液を調製
した。抽出液を、０．１％ＳＤＳ存在下のポリアクリル
アミドゲル電気泳動にかけ、Ｔｏｗｂｉｎらの方法［Ｔ
ｏｗｂｉｎ、Ｈ，、ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ＬＩＳＡ、四、４３５０−４３５４ （１９
７９） ］により”Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ
” （蛋白質ブＣ１７テイング）を行い、酵母中で産生
されたＡＴＬＶ外被蛋白質を検出した。上記方法での一
次抗体および二次抗体としては、ＡＴＬ患者血清および
（＋２Ｓｉ）標識抗ヒト免疫グロブリン（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ社製）を用いた。
７９） ］により”Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ
” （蛋白質ブＣ１７テイング）を行い、酵母中で産生
されたＡＴＬＶ外被蛋白質を検出した。上記方法での一
次抗体および二次抗体としては、ＡＴＬ患者血清および
（＋２Ｓｉ）標識抗ヒト免疫グロブリン（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ社製）を用いた。
この結果、分子量約４３．（）ＤＯの蛋白質が特異的バ
ンドとして検出された。正常人血清を一次抗体として用
いた場合にはこのバンドは検出されず、またベクターと
して用いたｐΔＭ８２により形質転換した酵母菌Ｌ−８
２−４中にもこのバンドが検出されないことから、この
蛋白質はＡＴＬＶ外被蛋白質遺伝子産物であることがわ
かる。
ンドとして検出された。正常人血清を一次抗体として用
いた場合にはこのバンドは検出されず、またベクターと
して用いたｐΔＭ８２により形質転換した酵母菌Ｌ−８
２−４中にもこのバンドが検出されないことから、この
蛋白質はＡＴＬＶ外被蛋白質遺伝子産物であることがわ
かる。
第１図はプラスミドｐＡＴＹＥ３０７の構成を示すフロ
ーシートである。図中ＨはＨａ ｅｍ部位を示す。 矢印→はＰ−６０による転写の方向性、−・※はｅｎｖ
遺伝子転写の方向性をそれぞれ表わしている。 第１図 手続補正書 昭和６０年３月２０日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第４６６８７号 ２、発明の名称 成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ポリペプチド３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １７０ 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容 （１）明細書箱３頁１２〜１３行目のｒＰｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ。 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｊを［プロシーディング・オブ
・ザ（２）明細書箱５頁１１行目の［ａｎｎ、 、Ｊを
「ガン（Ｇａｎｎ）、Ｊに訂正する。 （３）明細書第７頁７行目の「脱水素酵母■」を「脱水
素酵素Ｉ」に訂正する。 （４）明細書束７頁１３行目の［ｐＭＡ８２ Ｊをｒｐ
ＡＭ８２ Ｊに訂正する。 （５）明細書第７頁２４行目の「抑制型酵母」を「抑制
型酵素Ｊに訂正する。 （６）明細書第１０頁１３行目の「Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、 Ｊを［ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ
（Ｊ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） Ｊに訂正する。 （７）明細書束１１頁１４行目の「それぞれ」を削除す
る。 （８）明細書箱１４頁１２行目のｒＧｅｎｅコを「ジー
ン（Ｇｅｎｅ） Ｊに訂正する。 （９）明細書第１４頁１８行目のｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ Ｊを「ヌクレイツク・ア
シッヅ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ） Ｊに訂正する。 σ１ 明細書箱１６頁１行目の「とじて」の前にｒ ２
０６９７Ｊを加入する。
ーシートである。図中ＨはＨａ ｅｍ部位を示す。 矢印→はＰ−６０による転写の方向性、−・※はｅｎｖ
遺伝子転写の方向性をそれぞれ表わしている。 第１図 手続補正書 昭和６０年３月２０日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第４６６８７号 ２、発明の名称 成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ポリペプチド３、補正を
する者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １７０ 明細書の発明の詳細な説明の欄 ５、補正の内容 （１）明細書箱３頁１２〜１３行目のｒＰｒｏｃ、 Ｎ
ａｔｌ。 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｊを［プロシーディング・オブ
・ザ（２）明細書箱５頁１１行目の［ａｎｎ、 、Ｊを
「ガン（Ｇａｎｎ）、Ｊに訂正する。 （３）明細書第７頁７行目の「脱水素酵母■」を「脱水
素酵素Ｉ」に訂正する。 （４）明細書束７頁１３行目の［ｐＭＡ８２ Ｊをｒｐ
ＡＭ８２ Ｊに訂正する。 （５）明細書第７頁２４行目の「抑制型酵母」を「抑制
型酵素Ｊに訂正する。 （６）明細書第１０頁１３行目の「Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、 Ｊを［ジャーナル・オブ・バクテリオロジイ
（Ｊ。 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、） Ｊに訂正する。 （７）明細書束１１頁１４行目の「それぞれ」を削除す
る。 （８）明細書箱１４頁１２行目のｒＧｅｎｅコを「ジー
ン（Ｇｅｎｅ） Ｊに訂正する。 （９）明細書第１４頁１８行目のｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ Ｊを「ヌクレイツク・ア
シッヅ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ） Ｊに訂正する。 σ１ 明細書箱１６頁１行目の「とじて」の前にｒ ２
０６９７Ｊを加入する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）成人工細胞白血病つィルスｅｎｖ遺伝子によりコ
ードされる成人工細胞白血病ウィルス抗原ポリペプチド
。 （２）成人Ｔ細胞白血病ウィルスのｅｎｖ遺伝子をコー
ドするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラスミド。 （３）Ｐ−６０プロモーターを有することを特徴とする
特許請求の範囲第２項記載の組換え体プラスミド。 （４）ｐΔＴＹＥ３０７であることを特徴とする特許請
求の範囲第３項記載の組換え体プラスミド。 （５）成人Ｔ細胞白血病ウィルスのｅｎｖ遺伝子をコー
ドするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラスミドを
保有する微生物を培地に培養し、培養物中にｅｎｖ遺伝
子によりコードされる成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ポ
リペプチドを生成蓄積せしめ、該培養物から該ペプチド
を採取することを特徴とするｅｎｖ遺伝子によりコード
される成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗原ポリペプチドの製
造法。 （６）該組換え体プラスミドがＰ−６０プロモーターを
有する組換え体プラスミドであることを特徴とする特許
請求の範囲第５項記載の方法。 （７）該微生物がサツカロミセス属に属することを特徴
とする特許請求の範囲第５項記載の方法。 （８）該微生物がサツカロミセス・セレビシェに属する
ことを特徴とする特許請求の範囲第７項記載の方法。 （９）該組換え体プラスミドがｐＡＴＹＥ３０７である
ことを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の方法。 σＱ 成人工細胞白血病ウィルスのｅｎｖ遺伝子をコー
ドするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラスミドを
含む微生物。 （１１）該組換え体プラスミドがＰ−６０プロモーター
を有する組換え体プラスミドであることを特徴とする特
許請求の範囲第１０項記載の微生物。 （１２）該微生物がサツカロミセス・セレビシェに属す
ることを特徴とする特許請求の範囲第１１項記載の微生
物。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59046687A JPS60192591A (ja) | 1984-03-12 | 1984-03-12 | 成人ｔ細胞白血病ウイルス抗原ポリペプチド |
| EP85101063A EP0152030A3 (en) | 1984-02-03 | 1985-02-01 | Adult t cell leukemia virus antigen polypeptide |
| DE1985101063 DE152030T1 (de) | 1984-02-03 | 1985-02-01 | Adult-t-zell-leukemiavirus-antigenpolypeptid. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59046687A JPS60192591A (ja) | 1984-03-12 | 1984-03-12 | 成人ｔ細胞白血病ウイルス抗原ポリペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60192591A true JPS60192591A (ja) | 1985-10-01 |
Family
ID=12754286
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59046687A Pending JPS60192591A (ja) | 1984-02-03 | 1984-03-12 | 成人ｔ細胞白血病ウイルス抗原ポリペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60192591A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6363380A (ja) * | 1986-09-03 | 1988-03-19 | Univ Kyoto | 組換ワクシニアウイルスを用いた人白血病ウイルスワクチン |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58109427A (ja) * | 1981-08-31 | 1983-06-29 | ジエネンテツク・インコ−ポレ−テツド | 酵母菌中でのｂ型肝炎表面抗原の製造 |
-
1984
- 1984-03-12 JP JP59046687A patent/JPS60192591A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58109427A (ja) * | 1981-08-31 | 1983-06-29 | ジエネンテツク・インコ−ポレ−テツド | 酵母菌中でのｂ型肝炎表面抗原の製造 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6363380A (ja) * | 1986-09-03 | 1988-03-19 | Univ Kyoto | 組換ワクシニアウイルスを用いた人白血病ウイルスワクチン |
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