CN103533929A - 用于流行性感冒的治疗和诊断的组合物和方法 - Google Patents

用于流行性感冒的治疗和诊断的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了新型人抗-流行性感冒抗体以及相关的组合物和方法。这些抗体可以用于流行性感冒感染的诊断和治疗中。

Description

用于流行性感冒的治疗和诊断的组合物和方法
相关申请
本申请要求2011年3月15日提交的临时申请USSN61／453,101的优先权，将其内容按引用全部并入本文中作为参考。
按引用并入
在2012年3月1日建立的并且大小为138KB的名称为“37418517001WOST25.txt”的文本文件的内容，按引用全部并入本文中。
发明领域
本发明总地涉及对流行性感冒感染的治疗、诊断以及监控。本发明更具体地涉及鉴定流行性感冒基质2蛋白-特异性抗体的方法及其制造和使用。这样的抗体可以用于药物组合物中，用于流行性感冒的预防和治疗，并且用于流行性感冒感染的诊断和监控。
发明背景
在美国，流行性感冒病毒每年感染5-20％的人群并且导致30000-50000人死亡。尽管流行性感冒疫苗是预防感染的首要方法，在美国也可以利用四种抗病毒药物：金刚烷胺(amantadine)、金刚乙胺(rimantadine)、奥司他韦(oseltamivir)和扎那米韦(zanamivir)。到2005年12月为止，仅仅奥司他韦(TAMIFLUTM)已被推荐用于A型流行性感冒的治疗，这是因为所述病毒的M2蛋白中的氨基酸取代导致该病毒对金刚烷胺和金刚乙胺的抗药性增强。
由A型流行性感冒的病毒感染而引发的疾病的特征在于其周期性的性质。抗原的漂变以及漂移使得每年有不同的A型菌株出现。不仅如此，高度致病性的菌株侵入普遍人群中的威胁加强了对于流行性感冒感染的新治疗方法的需求。中和抗体的主要片段针对红血球凝集素以及神经氨糖酸苷酶蛋白的多态性区域。因此，这样的中和MAb大概仅仅能够命中一个或者几个菌株。近来的焦点专注于相对不变的基质2(M2)蛋白。一种作用于基质2蛋白(M2)的中和MAb可能适合于对所有的A型流行性感冒菌株进行治疗。
在一种形成离子通道的同型四聚体中发现了M2蛋白，并且认为其能够帮助病毒在进入细胞中时脱除外壳。感染后，可以在细胞表面上找到大量的M2蛋白。随后其被导入到病毒粒子外壳中，在病毒粒子外壳中仅仅包括全部外壳蛋白的大约2％。M2细胞外结构域(M2e)是短的，氨基末端上的2-24个氨基酸陈列在细胞之外。抗M2MAb迄今为止已经作用于该线性序列。因此，它们对于细胞表达的M2不会表现出期望的结合性质，包括在天然M2上的构象抗原决定簇上的结合。
因此，长久以来本领域对可结合细胞表达的M2和天然M2上的构象决定簇的新抗体存在着需求。
发明概述
本发明提供了特异性对抗M2e的全人单克隆抗体。本发明的全人单克隆抗M2e抗体是用于预防和治疗流行性感冒的有效且广泛保护性的抗体。替换地，或另外地，这些抗体也是中和的。例如，这些抗体可以保护对抗最高毒性的H1N1毒株。这些抗体的作用机制例如是使用纳米摩尔或微摩尔效能的抗体介导的感染细胞的杀灭。此外，本发明的全人单克隆抗-M2e抗体，单独使用，或结合抗病毒药物使用，预防、抑制、降低或减少流行性病毒扩散至感染的个人、患者或病人气道之外。给药抗M2e抗体单一疗法或包括抗M2e抗体和抗病毒药物的联合疗法，可以在暴露于流行性感冒病毒之前或之后的任何时间进行。用于给药抗M2e抗体单一疗法或包括抗M2e抗体和抗病毒药物的联合疗法的示例性治疗窗口为感染后1天至感染后30天之间。本文中所述的联合疗法意思是包括其中将抗M2e抗体和抗病毒药物提供给同一个体用于流行性感冒感染的治疗或预防的治疗方案，然而，抗体和抗病毒药物不需要在同一混合物、组合物或药物制剂中给药，抗体和抗病毒药物不需要同时给药，抗体和抗病毒药物不需要通过相同途径给药，以及抗体和抗病毒药物不需要以相同剂量给药。
任选，抗体分离自人捐赠者的B细胞。示例性单克隆抗体包括本文中所述的8i10(也称为TCN-032)、21B15、23K12(也称为TCN-031)、3241_G23、3244_I10、3243_J07、3259_J21、3245_O19、3244_H04、3136_G05、3252_C13、255_J06、3420_I23、3139_P23、3248_P18、3253_P10、3260_D19、3362_B11和3242_P05。抗体在本文中分别被称为huM2e抗体。该huM2e抗体具有以下的一个或多个特征：a)结合流行性病毒的基质2胞外域(M2e)多肽的胞外结构域中的表位；b)结合A型流行性感冒感染的细胞；或c)结合A型流行性感冒病毒。
huM2e抗体结合的表位是M2多肽的非线性表位。优选的，表位包括M2e多肽的氨基端区域。更优选的，表位全部或部分包括氨基酸序列SLLTEV(SEQ ID NO：42)。更优选的，根据SEQID NO：1编号时，表位包括M2e多肽的位置2、5和6的氨基酸。位置2的氨基酸是丝氨酸；位置5的是苏氨酸；以及位置6的是谷氨酸。
huM2e抗体含有具有SEQ ID NO：44或50的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：46或52的氨基酸序列的轻链可变区。优选，三个重链CDR包括与NYYWS(SEQ ID NO：72)、FIYYGGNTKYNPSLKS(SEQ ID NO：74)、ASCSGGYCILD(SEQ ID NO：76)、SNYMS(SEQ ID NO：103)、VIYSGGSTYYADSVK(SEQ ID NO：105)、CLSRMRGYGLDV(SEQ ID NO：107)(如通过Kabat方法测定)或ASCSGGYCILD(SEQ ID NO：76)、CLSRMRGYGLDV(SEQ ID NO：107)、GSSISN(SEQ ID NO：109)、FIYYGGNTK(SEQ ID NO：110)、GFTVSSN(SEQ ID NO：112)、VIYSGGSTY(SEQ ID NO：113)(如通过Chothia方法测定)的氨基酸序列至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列，和轻链的三个CDR包括与RASQNIYKYLN(SEQ ID NO：59)、AASGLQS(SEQ ID NO：61)、QQSYSPPLT(SEQ ID NO：63)、RTSQSISSYLN(SEQ ID NO：92)、AASSLQSGVPSRF(SEQ ID NO：94)、QQSYSMPA(SEQ IDNO：96)(如通过Kabat方法测定)或RASQNIYKYLN(SEQ IDNO：59)、AASGLQS(SEQ ID NO：61)、QQSYSPPLT(SEQ ID NO：63)、RTSQSISSYLN(SEQ ID NO：92)、AASSLQSGVPSRF(SEQID NO：94)、QQSYSMPA(SEQ ID NO：96)(如通过Chothia方法测定)的氨基酸序列至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。该抗体结合M2e。
分离的抗-基质2胞外结构域(M2e)抗体，或其抗原结合片段，包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，其中VH结构域和VL结构域各自包含三个互补决定区1至3(CDR1-3)，并且其中每个CDR包括以下的氨基酸序列：VHCDR1：SEQ ID NOs：179，187，196，204，212，224，230，235，242，248或254；VH CDR2：SEQ ID NOs：180，188，195，197，205，213，218，225，231，236，243，249，246或256；VH CDR3SEQ ID NOs：181，189，198，206，214，219，226，232，237，244或250；VLCDR1：SEQ ID NOs：184，192，199，215，220，233或238；VLCDR2：SEQ ID NOs：61，185，193，200，207，211，216，227，239或241；和VL CDR3：SEQ ID NOs：63，186，194，201，208，221，228，234，240，245或251。
替换地，或另外地，分离的抗基质2胞外结构域(M2e)抗体，或其抗原结合片段，包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域，其中VH结构域和VL结构域各自包含三个互补决定区1至3(CDR1-3)，并且其中每个CDR包括以下的氨基酸序列：VH CDR1：SEQ ID NOs：182，190，202，209，222，229，247，252，257，258或260；VH CDR2：SEQ ID NOs：183，191，203，210，217，223，230，246，253，259或261；VH CDR3SEQ ID NOs：181，189，195，198，206，214，219，226，232，237，244或250；VL CDR1：SEQ ID NOs：184，192，199，215，220，233或238；VL CDR2：SEQID NOs：61，185，193，200，207，211，216，227，239或241；和VLCDR3：SEQ ID NOs：63，186，194，201，208，221，228，234，240，245或251。
本发明提供了分离的全人单克隆抗基质2胞外结构域(M2e)抗体，其包括：a)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的重链序列和包含氨基酸序列SEQ ID NO：46的轻链序列；b)包含SEQ IDNO：263的氨基酸序列的重链序列和包含氨基酸序列SEQ IDNO：46的轻链序列；c)包含SEQ ID NO：265的氨基酸序列的重链序列和包含氨基酸序列SEQ ID NO：46的轻链序列；d)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的重链序列和包含氨基酸序列SEQID NO：52的轻链序列；e)包含SEQ ID NO：267的氨基酸序列的重链序列和包含氨基酸序列SEQ ID NO：52的轻链序列；或f)包含SEQ ID NO：269的氨基酸序列的重链序列和包含氨基酸序列SEQ IDNO：52的轻链序列。
M2e抗体的重链源自种系V(可变)基因，如，例如，IgHV4或IgHV3种系基因。
本发明的M2e抗体包括由人IgHV4或IgHV3种系基因序列编码的可变重链(VH)区。IgHV4种系基因序列显示于例如登录号L10088、M29812、M95114、X56360和M95117中。IgHV3种系基因序列显示于例如登录号X92218、X70208、Z27504、M99679和AB019437中。本发明的M2e抗体包括由与IgHV4或IgHV3种系基因序列至少80％同源的核酸序列编码的VH区。优选，核酸序列与IgHV4或IgHV3种系基因序列至少90％、95％、96％、97％同源，并且更优选，与IgHV4或IgHV3种系基因序列至少98％、99％同源。M2e抗体的VH区与由IgHV4或IgHV3种系基因序列编码的VH区的氨基酸序列至少80％同源。优选，M2e抗体的VH区的氨基酸序列与由IgHV4或IgHV3种系基因序列编码的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％同源，并且更优选，与由IgHV4或IgHV3种系基因序列编码的序列至少98％、99％同源。
本发明的M2e抗体还包括由人IgKV1种系基因序列编码的可变轻链(VL)区。人IgKV1VL种系基因序列显示于例如登录号X59315、X59312、X59318、J00248和Y14865中。或者，M2e抗体包括由与IgKV1种系基因序列至少80％同源的核酸序列编码的VL区。优选，核酸序列与IgKV1种系基因序列至少90％、95％、96％、97％同源，并且更优选，与IgKV1种系基因序列至少98％、99％同源。M2e抗体的VL区与由IgKV1种系基因序列编码的VL区的氨基酸序列至少80％同源。优选，M2e抗体的VL区的氨基酸序列与由IgKV1种系基因序列编码的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％同源，并且更优选，与由IgKV1种系基因序列编码的序列至少98％、99％同源。
在另一个方面中，本发明提供了包括根据本发明的huM2e抗体的组合物。组合物任选是包括本文中所述的任一种M2e抗体和药物载体的药物组合物。在不同的方面中，组合物进一步包括抗病毒药物、病毒进入抑制剂或病毒附着抑制剂。抗病毒药物例如是神经氨酸酶抑制剂、HA抑制剂、唾液酸抑制剂或M2离子通道抑制剂。M2离子通道抑制剂例如是金刚烷胺或金刚乙胺。神经氨酸酶抑制剂例如为扎那米韦或磷酸奥司他韦。在进一步的方面中，组合物进一步包括第二种抗A型流行性感冒抗体。
在进一步的方面中，根据本发明的huM2e抗体可操作地连接治疗剂或可检测标记。
另外，本发明提供了通过将huM2e抗体给药患者来刺激免疫应答，治疗、预防或减轻流行性感冒病毒感染症状的方法。
任选，患者进一步给药第二种药剂，如，但不限于，流行性感冒病毒抗体、抗病毒药物，如神经氨酸酶抑制剂、HA抑制剂、唾液酸抑制剂或M2离子通道抑制剂、病毒进入抑制剂或病毒附着抑制剂。M2离子通道抑制剂例如为金刚烷胺或金刚乙胺。神经氨酸酶抑制剂例如为扎那米韦或磷酸奥司他韦。患者遭受流行性感冒病毒感染或倾向于产生流行性感冒病毒感染，如，例如，自体免疫疾病或炎性失调。
在另一个方面中，本发明提供了在暴露于流行性感冒病毒之前和／或之后，将本发明的huM2e抗体给药于患者的方法。例如，本发明的huM2e抗体用于治疗或预防流行性感冒感染。以足以促进病毒清除或消除A型流行性感冒感染的细胞的剂量来给药huM2e抗体。
本发明还包括用于确定病人体内存在流行性感冒病毒感染的方法，通过将获自病人的生物样品接触humM2e抗体；检测结合生物样品的抗体的含量；以及将结合生物样品的抗体的含量与对照值相比较。
本发明进一步提供了包含huM2e抗体的试剂盒或诊断试剂盒。
本发明提供了一种优选的组合物，其包含：(a)分离的全人单克隆抗-M2e抗体组合物，其中抗体包含以下区域：包含NYYWS(SEQ ID NO：72)的氨基酸序列的VH CDR1区；包含FIYYGGNTKYNPSLKS(SEQ ID NO：74)的氨基酸序列的VHCDR2区；包含ASCSGGYCILD(SEQ ID NO：76)的氨基酸序列的VH CDR3区；包含RASQNIYKYLN(SEQ ID NO：59)的氨基酸序列的VL CDR1区；包含AASGLQS(SEQ ID NO：61)的氨基酸序列的VL CDR2区；包含QQSYSPPLT(SEQ ID NO：63)的氨基酸序列的VL CDR3区；和(b)奥司他韦组合物。
本发明还提供了一种优选的组合物，其包含：(a)分离的全人单克隆抗-M2e抗体组合物，其中抗体包含以下区域：包含SNYMS(SEQ ID NO：103)的氨基酸序列的VH CDR1区；包含VIYSGGSTYYADSVK(SEQ ID NO：105)的氨基酸序列的VHCDR2区；包含CLSRMRGYGLDV(SEQ ID NO：107)的氨基酸序列的VH CDR3区；包含RTSQSISSYLN(SEQ ID NO：92)的氨基酸序列的VL CDR1区；包含AASSLQSGVPSRF(SEQ ID NO：94)的氨基酸序列的VL CDR2区；包含QQSYSMPA(SEQ ID NO：96)的氨基酸序列的VL CDR3区；和(b)奥司他韦组合物。
药物组合物可以包含本文中所述的优选组合物和药物载体，所述的优选组合物包括分离的全人单克隆抗-M2e抗体组合物和奥司他韦组合物的组合。
在特定的实施方案中，奥司他韦组合物是磷酸奥司他韦。或者，奥司他韦组合物也可以包括任何其前药、盐、类似物或衍生物。奥司他韦组合物任选包括药物载体。
本文中所述的包括分离的全人单克隆抗-M2e抗体组合物和奥司他韦组合物的组合的优选组合物进一步包括第二种抗A型流行性感冒抗体。第二种抗A型流行性感冒抗体是抗-M2e抗体或抗-HA抗体。例如，抗-HA抗体可以是国际申请No.WO2008／028946中公开的任何抗体，在此按引用将其内容全部并入本文中作为参考。
本发明还提供了用于治疗或预防患者流行性感冒病毒感染的优选方法，其包括将本文中所述的优选组合物中的一种或多种给药于患者，所述优选组合物包括分离的全人单克隆抗-M2e抗体组合物和奥司他韦组合物的组合，并且其任选包括药物载体。
在这个优选方法的特定实施方案中，以10至40mg／kg／天的剂量给药抗-M2e抗体。此外，抗-M2e抗体可以每天给药一次或两次(各自为q.d.或bid)、每周一次或两次，或每月一次或两次。尽管可以通过例如任何非肠道途径来全身给药抗-M2e抗体，优选静脉内注射或灌输来给药抗-M2e抗体。示例性给药方案包括一周静脉内注射或灌输抗-M2e抗体一次，持续三周。
替换地，或除了这些实施方案以外，以0.1-100mg/kg的剂量给药奥司他韦组合物。给药方案通常为每天两次口服所提供的75mg胶囊，然而，这些方法包括每天给药5-100mg的奥司他韦。还可以每天给药一次或两次(各自为q.d.或bid)。奥司他韦组合物
可以在流行性感冒感染之前给药抗-M2e抗体或奥司他韦组合物。或者，可以在流行性感冒感染后给药抗-M2e抗体或奥司他韦组合物。在这一方法的特定方面中，在优选的治疗窗口内给药抗-M2e抗体。例如，治疗窗口可以从感染时延伸至流行性感冒感染后的4天或96小时。
同时或按序给药抗-M2e抗体和奥司他韦组合物。按序给药抗-M2e抗体和奥司他韦组合物时，可以在奥司他韦组合物之前或之后给药抗-M2e抗体。
本发明进一步包括优选的试剂盒或诊断试剂盒，其包含分离的全人单克隆抗-M2e抗体组合物和奥司他韦组合物的组合。在试剂盒的特定方面中，分开提供和／或分开给药抗-M2e抗体组合物和奥司他韦组合物。此外，在试剂盒的其他方面中，以液体制剂提供了抗-M2e抗体组合物，以液体或固体制剂提供了奥司他韦组合物。可以静脉内给药抗-M2e抗体组合物。可以口服给药奥司他韦组合物。任选，试剂盒的组合物进一步包括药物载体。
抗-M2e抗体和奥司他韦组合物协同作用来治疗或预防流行性感冒或流行性感冒介导的死亡。本发明的M2e抗体是保护性对抗感染的，并且此外最小化病毒传播至主要直接接触流行性感冒病毒的组织之外，所述组织例如为病人的气道，其包括但不限于，肺气道、呼吸系统、呼吸道、鼻、嘴和肺泡。具体地，因为空气从鼻或嘴通过咽喉进入气管中，其气管分支成左右主支气管，流行性感冒因此病毒可以接触这些组织或结构中的每一个。此外，主支气管随后分支成大的细支气管，每个肺叶有一支大的细支气管。在肺叶内，该细支气管进一步细分并终止于肺泡群。尽管流行性感冒病毒最初接触或感染这些组织或结构中任一个内的细胞，但使用本发明抗-M2e抗体(单独或结合奥司他韦组合物)的治疗，如果预防性给药将预防感染，或另外地，治疗感染和防止病毒扩散至非呼吸道组织。
本发明的抗-M2e抗体是预防性的或中和性的。在任一种情况中，本发明的抗-M2e抗体选择性地或特异性地诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。ADCC破坏感染的细胞，由此治疗感染和防止病毒扩散。
奥司他韦是一种抗病毒药物，并且具体地，是一种神经氨酸酶抑制剂，其通过干扰神经氨酸分裂来自宿主细胞上的糖蛋白的唾液酸基团的能力也抑制流行性感冒病毒在细胞之间的扩散。这种分裂事件是病毒复制以及病毒从其宿主细胞释放所需的。
因此，本发明的抗-M2e抗体和奥司他韦组合物通过不同的细胞机制来起作用，这些细胞机制在本文中所述的优选组合物和方法中一起被激活。将抗-M2e抗体和奥司他韦组合物的组合给药于患者时，例如，在致命感染攻击中观察到的益处证明了协同效应。这种联合疗法可以延缓、抑制或预防个体产生奥司他韦的抗药性。这种联合疗法的主要益处是抑制或防止产生流行性感冒病毒的逃逸突变形式。抗-M2e抗体和奥司他韦组合物的结合提供了优于任一种疗法单独可以产生的保护作用。重要地，联合给药抗-M2e抗体和奥司他韦组合物的治疗益处优于单独施用时的附加治疗益处，特别是用高风险流行性感冒毒株或致命剂量攻击时。
本发明的其他特征和优点将通过以下的详细描述和权利要求所保护的内容而变得显而易见，并且其已被涵盖在下述的详细描述以及权利要求之内。
附图简述
图1显示了在存在或不存在游离的M2肽的情况下，本发明中的三种抗体和对照的hu14C2抗体与用M2表达构建体或对照载体转染的293-HEK细胞的结合。
图2A和B显示了与A型流行性感冒／Puerto Rico／8／32结合的人单克隆抗体的图。
图3A显示了M2变体的胞外结构域的氨基酸序列的图表(恭敬地，SEQ ID NO1-3、272和5-40)。
图3B和C显示了人单克隆抗流行性感冒抗体结合图3A中所示的M2变体的柱状图。
图4A和B显示了人单克隆抗流行性感冒抗体结合接受了丙氨酸扫描诱变的M2肽的柱状图。
图5是一系列柱状表，显示了MAb8i10和23K12与表示在CHO细胞系DG44中稳定表达的流行性感冒毒株A／HK／483／1997序列的M2蛋白的结合。
图6A显示了抗M2抗体与变体M2肽(恭敬地，SEQ ID NO273-297)没有交叉反应或结合的图，因为它们不包括三维的、非线性的或构象表位。
图6B显示了抗M2抗体与截短的M2肽(各自为，SEQ ID NO273、298-316、271和1)没有交叉反应或结合的图，因为它们不包括三维的、非线性的或构象表位。
图7显示了用人抗流行性感冒单克隆抗体治疗流行性感冒感染小鼠的存活的图。
图8显示了抗M2抗体结合M2e(SEQ ID NO：1)的N-端中的高度保守区域的图解。
图9显示了在ELISA中来自结合流行性感冒的粗上清液中的抗M2rHMAb的图，而对照抗M2emAb14C2并不能容易地结合病毒。
图10是一系列的照片，显示了结合流行性感冒感染细胞的抗M2rHMAb。MDCK细胞感染或未感染A型流行性感冒／PR／8／32并且在24小时后测试来自粗上清液中的Ab结合。从FMAT平板扫描仪收集数据。
图11显示了来自结合用流行性感冒亚型H1N1M2蛋白转染的细胞的粗上清液的抗-M2rHMAb克隆的图。将编码对应于流行性感冒毒株H1N1的全长M2cDNA的质粒，以及模拟质粒对照，瞬时转染至293细胞中。测试14C2、8i10、23K12和21B15mAB与转染子的结合，并且用AF647-偶联的抗人IgG二抗检测。显示了FACS分析后结合的特异性mAB的平均荧光强度。
图12A-B是抗-M2e mAb的可变区的氨基酸序列。显示了VH和Vk的框架区1-4(FR1-4)和互补决定区1-3(CDR1-3)。使用IMGT数据库(
Figure BDA0000413462010000131
the International ImMunoGeneTicsInformation
Figure BDA0000413462010000132
http：／／www.imgt.org)中的命名法来限定FR、CDR和基因名称。灰色框表示与淡蓝色框中所示的种系序列的同一性，连字符表示缝隙，而白色框是来自种系的氨基酸置换突变。
图13描绘了一组抗-M2e mAb与TCN-032Fab的竞争结合分析结果的图。将所示的抗-M2e mAb用于结合之前已经用或未用10μg／mL TCN-032Fab片段处理的表达A／HongKong／483／97的M2的稳定CHO转染子。用山羊抗-huIgG FcAlexafluor488FACS检测结合细胞表面的抗-M2e mAb，并通过流式细胞术进行分析。结果源自一个实验。
图14A描绘了抗-M2e mAb TCN-032和TCN-031结合病毒粒子和病毒感染细胞但不是M2e-衍生的合成肽的能力的图。将纯化的流行性感冒病毒(A／Puerto Rico／8／34)以10μg／ml涂布于ELISA孔上，并且使用HRP-标记的山羊抗-人Fc评价抗-M2emAb TCN-031、TCN-032、ch14C2和HCMVmAb2N9的结合。所示的结果是3个实验的表示。
图14B描绘了抗-M2e mAb TCN-032和TCN-031结合病毒粒子和病毒感染细胞但不是M2e-衍生的合成肽的能力的图。将源自A／Fort Worth／1／50的M2的23mer合成肽以1μg／ml涂布于ELISA孔上，并且如图a中那样评价mAb TCN-031、TCN-032、ch14C2和2N9的结合。所示的结果是3个实验的表示。
图14C描绘了抗-M2e mAb TCN-032和TCN-031结合病毒粒子和病毒感染细胞但不是M2e-衍生的合成肽的能力的图。用A／Puerto Rico／8／34(PR8)感染MDCK细胞，并且随后用mAbTCN-031、TCN-032、ch14C2和HCMV mAb5J12染色。使用Alexaflour647-偶联的山羊抗人IgG H&L抗体检测抗体的结合并且通过流式细胞术来定量。所示的结果是3个实验的表示。
图14D是一系列照片，描绘了在5μg／ml M2e肽存在或不存在的情况下，用含有mAb TCN-031、TCN-032或对照ch14C2的瞬时转染上清液将用A／Fort Worth／1／50(D20)的M2胞外域稳定转染的H293细胞染色，并且通过FMAT分析M2的结合。模拟转染的细胞是用单独的载体稳定转染的293细胞。所示的结果是3个实验的表示。
图15A-D描绘了小鼠中抗-M2mAb TCN-031和TCN-032的治疗功效的图。通过鼻内接种5×LD50A／Vietnam／1203／04(H5N1)(图A-B)感染小鼠(n＝10)或接种5×LD50A／Puerto Rico8／34(H1N1)(图C-D)感染小鼠(n＝5)，接着在感染后24、72和120小时时3次腹膜内(ip)注射mAb(每只小鼠总共3次mAb注射)，并且每日称重，持续14天。在a和c中显示了百分比存活，而小鼠的百分比体重变化显示于B和D中。对于感染A／Vietnam／1203／04(H5N1)的小鼠的治疗研究所示的结果是2次实验的表示。
图16是一系列图，描绘了用H5N1A/Vietnam／1203／04激发后用抗-M2e mAbTCN-031和TCN-032治疗的小鼠的肺、肝和脑中的病毒滴定度。BALB／C小鼠(n＝19)通过i.p.注射400μg／200μL剂量的TCN-031、TCN-032、对照人mAb2N9、对照嵌合mAbch14C2、PBS来治疗，或未治疗。在感染后3和6天时，从每组3只小鼠的肺(作为局部复制的指示)以及肝和脑(作为全身扩散的指示，这是H5N1感染的特征)中测定组织病毒滴定度。
图17描绘了TCN-031和TCN-032加强NK细胞的细胞溶解能力的图。用A／Solomon Island／3／2006(H1N1)感染MDCK细胞，并用mAb TCN-031、TCN-032或亚类相配负对照mAb2N9处理。然后用纯化的人NK细胞激发细胞，并且通过吸光值测量作为细胞溶解结果释放的乳酸脱氢酶。结果是使用两名不同的正常人捐献者的两个分开实验的表示。
图18描绘了结合抗-M2mAb的M2-表达细胞的补体依赖性细胞溶解(CDC)的图。用所示的mAb处理表达A／HongKong／483／97的M2的稳定转染子和模拟对照，并且随后用人补体激发。通过碘化丙啶染色接着FACS分析来观察溶解的细胞。数据是两个实验的表示。
图19A-C描绘了抗-M2e mAb TCN-031和TCN-032与M2突变体的结合的图，表明表位位于M2e的高度保守的N-端中。将在A／Fort Worth／1／50／(D20)的M2胞外域的每个位置具有取代的丙氨酸的突变体(A)或包括A／Vietnam／1203／04(VN)和A／HongKong／483／97(HK)的四十个野生型M2突变体(B)瞬时转染至293细胞中。每种野生型M2突变体的同一性列于表6中。在转染后24小时时，用mAb TCN-031、TCN-032或对照ch14C2将转染的细胞染色，并且通过FACS分析与M2的结合。mAb TCN-031和TCN-032没有结合在M2e的位置1、4或5具有氨基酸置换的变体。(C)TCN-031和TCN-032的推定表位发生在M2e的高保守区域中，并且与ch14C2发现的不同。对于(A)和(B)所示的结果是3个实验的表示。
图20描绘了mAb TCN-031和TCN-032识别M2e上的相同区域的图。用10μg／mLTCN-031、TCN-032或2N9染色，接着用Alexafluor647-标记的TCN-031(TCN-031AF647)或TCN-032(TCN-032AF647)检测，并通过流式细胞术分析，对于A／HongKong／483／97，CHO转染子稳定表达M2。结果是3个实验的表示。
图21描绘了抗-M2e mAb TCN-031和TCN-032结合已经用H1N1A／California／4／09感染的细胞的图。用A型流行性感冒毒株H1N1A／Memphis／14／96、H1N1A／California／4／09感染MDCK细胞，或模拟感染。感染后二十四小时，用mAb TCN-031、TCN-032或对照ch14C2将细胞染色，并通过FACS分析与M2的结合。所示的结果是一个实验的结果。
图22描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(A／VN／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后用PBS(给药对照)、抗体同种型对照、同种型对照／奥司他韦、奥司他韦、TCN-032抗体或TCN-032／奥司他韦联合治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-032vs.同种型对照(p＜0.027)、TCN-032／奥司他韦vs.同种型对照／奥司他韦(p＜0.012)、TCN-032vs.未处理(p＜0.031)、TCN-032／奥司他韦vs.未处理(p＞0.0001)和奥司他韦vs.未处理(p＜0.0001)。
图23描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(A／VN／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后用PBS(给药对照)、抗体同种型对照、同种型对照／奥司他韦、奥司他韦、TCN-032抗体或TCN-032／奥司他韦联合治疗的小鼠群的百分比(％)体重变化vs.感染后天数的图。此外，未激发和未治疗的小鼠群用作正对照。TCN-032／奥司他韦联合提供了与未激发和未治疗的正对照相当的治疗益处。
图24描绘了用10倍LD50(10D50)剂量的H5N1(A／VN／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后用PBS(给药对照)、抗体同种型对照、同种型对照／奥司他韦、奥司他韦、TCN-032抗体或TCN-032／奥司他韦联合治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-032vs.同种型对照(p＜0.001)、TCN-032／奥司他韦vs.奥司他韦(p＜0.029)、TCN-032vs.未处理(p＜0.037)和TCN-032／奥司他韦vs.未处理(p＜0.0003)。联合治疗与单独的TCN-032或单独的奥司他韦治疗是可区别的，因为提供了潜在的协同作用。
图25描绘了用10倍LD50(10LD50)剂量的H5N1(A／VN／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后用PBS(给药对照)、抗体同种型对照、同种型对照／奥司他韦、奥司他韦、TCN-032抗体或TCN-032／奥司他韦联合治疗的小鼠群的百分比(％)体重变化vs.感染后天数的图。此外，未激发和未治疗的小鼠群用作正对照。不仅TCN-032／奥司他韦联合提供了与未激发和未治疗对照相当的治疗益处，而且联合治疗与单独的TCN-032或单独的奥司他韦治疗是可区别的，因为提供了潜在的协同作用。
图26描绘了用20倍LD50(20D50)剂量的H5N1(A／VN／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后用PBS(给药对照)、抗体同种型对照、同种型对照／奥司他韦、奥司他韦、TCN-032抗体或TCN-032／奥司他韦联合治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-032vs.同种型对照(p＜0.0002)、TCN-032／奥司他韦vs.同种型对照／奥司他韦(p＜0.012)和TCN-032／奥司他韦vs.奥司他韦(p＜0.029)。联合治疗与单独的TCN-032或单独的奥司他韦治疗是可区别的，因为提供了潜在的协同作用。
图27描绘了用20倍LD50(20LD50)剂量的H5N1(A／VN／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后用PBS(给药对照)、抗体同种型对照、同种型对照／奥司他韦、奥司他韦、TCN-032抗体或TCN-032／奥司他韦联合治疗的小鼠群的百分比(％)体重变化vs.感染后天数的图。此外，未激发和未治疗的小鼠群用作正对照。TCN-032／奥司他韦联合提供了与未激发和未治疗对照相当的治疗益处。
图28是实施例14、15、18和19中进行的实验的示意图。
图29描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(VN1203)A型流行性感冒病毒激发并随后用抗体同种型对照(2N9)、正对照抗体(14C2)、抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)或抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。还将激发了但未治疗的小鼠群用作另一个对照(UT／C)组。
图30描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(VN1203)A型流行性感冒病毒激发并随后用抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)或抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)，或奥司他韦治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图，所述奥司他韦治疗在感染后四小时开始，并且持续五天，或在感染后1天开始奥司他韦治疗，并持续五天。结果显示了单独的奥司他韦治疗不能保护VN1203致命激发模型中的小鼠。
图31描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(VN1203)A型流行性感冒病毒激发并随后用抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、奥司他韦(a／k／aTamifluTM)治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图，所述奥司他韦的治疗在感染后四小时开始，并且持续五天，或在感染后1天开始奥司他韦治疗，并持续五天。还将激发了但未治疗的小鼠群用作另一个对照(UT／C)组。第二个对照小鼠群是既未激发也未治疗(未治疗／未激发)，并且因此代表健康小鼠。结果显示了用抗-M2e抗体(包括TCN-031和TCN-032)治疗后，保护小鼠免受致命的禽H5N1流感感染(5M LD50VN1203／04)。
图32描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(VN1203)A型流行性感冒病毒激发并随后用抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、奥司他韦(a／k／aTamifluTM)治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图，所述奥司他韦治疗在感染后四小时开始，并且持续五天，或在感染后1天开始奥司他韦治疗，并持续五天。结果显示了奥司他韦没有保护小鼠对抗VN1203／04，即使在感染四小时内给药时。
图33是实施例16所进行的实验的示意图。
图34描绘了用10倍LD50(10LD50)剂量的H1N1(A／SolomonIslands／06)A型流行性感冒病毒激发并随后在感染后1天和3天时用抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、奥司他韦(a／k／aTamifluTM)治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：奥司他韦vs.PBS(p＜0.0001)。
图35描绘了用10倍LD50(10LD50)剂量的H1N1(A／SolomonIslands／06)A型流行性感冒病毒激发并随后在感染后3天和5天时用抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、奥司他韦(a／k／aTamifluTM)治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：奥司他韦vs.PBS(p＜0.034)。
图36是实施例17中进行的实验的示意图。
图37描绘了用4倍LD50(4LD50)剂量的H1N1(A／NMS／33)A型流行性感冒病毒激发并随后用抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、奥司他韦(a／k／a TamifluTM)治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-032vs.同种型负对照(p<0.021)、TCN-040vs.同种型负对照(p<0.002)、奥司他韦vs.PBS(p<0.0004)。
图38描绘了用2倍LD50(2LD50)剂量的H1N1(A／NMS／33)A型流行性感冒病毒激发并随后用抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、奥司他韦(a／k／a TamifluTM)治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-040vs.同种型负对照(p<0.002)、奥司他韦vs.PBS(p<0.0005)。
图39描绘了用5倍LD50(2LD50)剂量的H1N1(A／PR／8／34)A型流行性感冒病毒激发并随后用抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、感染后4小时开始的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-031vs.同种型负对照(p<0.049)、TCN-032vs.同种型负对照(p<0.019)、奥司他韦+4hr vs.PBS(p<0.002)。
图40描绘了用2.5倍LD50(2.5LD50)剂量的H1N1(WSLH34939)A型流行性感冒病毒激发并随后用抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)或PBS安慰剂(给药对照)治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。
图41是实施例20中进行的实验的示意图。
图42描绘了用5倍LD50(2LD50)剂量的H5N1(VN1203)A型流行性感冒病毒激发并随后用20mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、20mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供一次(qd)的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)或每天提供两次(bid)的奥司他韦治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-032vs.同种型负对照(p<0.012)、奥司他韦qd vs.PBS(p<0.006)和奥司他韦bidvs.PBS(p<0.0001)。
图43描绘了用5倍LD50(2LD50)剂量的H5N1(VN1203)A型流行性感冒病毒激发并随后用40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供一次(qd)的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)或每天提供两次(bid)的奥司他韦治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-032vs.同种型负对照(p<0.004)、奥司他韦qd vs.PBS(p<0.006)和奥司他韦bidvs.PBS(p<0.0001)。
图44A-F是一系列代表性的照片，描绘了从实施例20中进行的实验中包括的小鼠收集的组织的免疫组织学染色。图A-C显示了用TCN-031治疗的病毒激发小鼠的肺(A)、肝(B)和脑(C)。图D-F显示了来自对照组(即，接受了PBS安慰剂的那些)的病毒激发小鼠的肺(D)、肝(E)和脑(F)。
图45是一系列图，描绘了作为给药实施例20中所述的每个小鼠群的治疗类型或对照的函数，每克组织的病毒的斑形成单位(p.f.u.)(pfu／g)的对数。结果显示了用抗-M2e抗体疗法(TCN-031或TCN-032)的治疗限制了病毒从气道的扩散，如通过与肺相比肝和脑中降低的病毒滴定度所证实的。
图46是实施例21中进行的实验的示意图。
图47描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(VN1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第1、3和5天用40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供一次(qd)的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)或每天提供两次(bid)的奥司他韦治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。将激发且未治疗的小鼠群作为负对照群。相反，将另一个未激发且未治疗的小鼠群作为对照群，并且因此，这些小鼠代表健康的个体。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-031vs.同种型负对照(p<0.0008)、TCN-032vs.同种型负对照(p<0.004)、TCN-031vs.未治疗／激发(p<0.0007)和TCN-032vs.未治疗／激发(p<0.003)。结果表明在第1、3和5天用800μg(40mg／kg)抗-M2e单克隆抗体(包括TCN-031和TCN-032)治疗后，保护小鼠免受了致命禽H5N1流感感染(5MLD50VN1203／04)。
图48描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(VN1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第2、4和6天用40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供一次(qd)的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)或每天提供两次(bid)的奥司他韦治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。将激发且未治疗的小鼠群作为负对照群。相反，将另一个未激发且未治疗的小鼠群作为对照群，并且因此，这些小鼠代表健康的个体。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-031vs.同种型负对照(p<0.001)、TCN-032vs.同种型负对照(p<0.009)、TCN-031vs.未治疗／激发(p<0.0005)和TCN-032vs.未治疗／激发(p<0.003)。结果表明在第2、4和6天用800μg(40mg／kg)抗-M2e单克隆抗体(包括TCN-031和TCN-032)治疗后，保护小鼠免受了致命禽H5N1流感感染(5MLD50VN1203／04)。
图49描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(VN1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第3、5和7天用40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供一次(qd)的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)或每天提供两次(bid)的奥司他韦治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。将激发且未治疗的小鼠群作为负对照群。相反，将另一个未激发且未治疗的小鼠群作为对照群，并且因此，这些小鼠代表健康的个体。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-031vs.同种型负对照(p<0.0039)、TCN-031vs.未治疗／激发(p<0.0002)、TCN-032vs.未治疗／激发(p<0.023)和TCN-040vs.未治疗／激发(p<0.010)。结果表明在第3、5和7天用800μg(40mg／kg)抗-M2e单克隆抗体(包括TCN-031和TCN-032)治疗后，保护小鼠免受了致命禽H5N1流感感染(5MLD50VN1203／04)。
图50描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(VN1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第4、6和8天用40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供一次(qd)的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)或每天提供两次(bid)的奥司他韦治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。将激发且未治疗的小鼠群作为负对照群。相反，将另一个未激发且未治疗的小鼠群作为对照群，并且因此，这些小鼠代表健康的个体。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-031vs.同种型负对照(p<0.046)、TCN-031vs.未治疗／激发(p<0.0009)、TC N-032vs.同种型负对照(p<0.002)和TCN-040vs.未治疗／激发(p<0.003)。结果表明在第4、6和8天用800μg(40mg／kg)抗-M2e单克隆抗体(包括TCN-031和TCN-032)治疗后，保护小鼠免受了致命禽H5N1流感感染(5MLD50VN1203／04)。
图51描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(VN1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第1、3和5天用40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供一次(qd)的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)或每天提供两次(bid)的奥司他韦治疗的小鼠群的剩余百分比重量vs.感染后天数的图。将激发且未治疗的小鼠群作为负对照群。相反，将另一个未激发且未治疗的小鼠群作为对照群，并且因此，这些小鼠代表健康的个体。结果是基于与体重减轻无关的死亡。
图52描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(VN1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第2、4和6天用40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供一次(qd)的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)或每天提供两次(bid)的奥司他韦治疗的小鼠群的剩余百分比重量vs.感染后天数的图。将激发且未治疗的小鼠群作为负对照群。相反，将另一个未激发且未治疗的小鼠群作为对照群，并且因此，这些小鼠代表健康的个体。结果是基于与体重减轻无关的死亡。
图53描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(VN1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第3、5和7天用40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供一次(qd)的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)或每天提供两次(bid)的奥司他韦治疗的小鼠群的剩余百分比重量vs.感染后天数的图。将激发且未治疗的小鼠群作为负对照群。相反，将另一个未激发且未治疗的小鼠群作为对照群，并且因此，这些小鼠代表健康的个体。结果是基于与体重减轻无关的死亡。
图54描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(VN1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第4、6和8天用40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)、40mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-031，a／k／a23k12)、正对照抗体(TCN-040，a／k／a14C2)、同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供一次(qd)的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)或每天提供两次(bid)的奥司他韦治疗的小鼠群的剩余百分比重量vs.感染后天数的图。将激发且未治疗的小鼠群作为负对照群。相反，将另一个未激发且未治疗的小鼠群作为对照群，并且因此，这些小鼠代表健康的个体。结果是基于与体重减轻无关的死亡。
图55是实施例22中进行的实验的示意图。
图56描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(A／VN／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第1、3和5天用20mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)或同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供两次(bid)的10mg／kg的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)、TCN-032／奥司他韦联合或同种型对照／奥司他韦联合治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。激发且未治疗的小鼠群作为另一个负对照组(PBS给药对照)。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-032vs.同种型负对照(p<0.027)、TCN-032／奥司他韦vs.同种型对照／奥司他韦(p<0.012)、TCN-032vs.未治疗／激发(p<0.031)、TCN-032／奥司他韦vs.未治疗／激发(p<0.0001)和奥司他韦vs.未治疗／激发(p<0.0001)。
图57描绘了用5倍LD50(5LD50)剂量的H5N1(A／VN／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第1、3和5天用20mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)或同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供两次(bid)的10mg／kg的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)、TCN-032／奥司他韦联合或同种型对照／奥司他韦联合治疗的小鼠群的百分比重量变化vs.感染后天数的图。将激发且未治疗的小鼠群作为另一个负对照组(PBS给药对照)。另外，未激发且未治疗的小鼠群作为对照组。
图58描绘了用10倍LD50(10LD50)剂量的H5N1(A／VN／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第1、3和5天用20mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)或同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供两次(bid)的10mg／kg的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)、TCN-032／奥司他韦联合或同种型对照／奥司他韦联合治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。激发且未治疗的小鼠群作为另一个负对照组(PBS给药对照)。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-032vs.同种型负对照(p<0.001)、TCN-032／奥司他韦vs.奥司他韦(p<0.029)、TCN-032vs.未治疗／激发(p<0.037)和TCN-032／奥司他韦vs.未治疗／激发(p<0.0003)。
图59描绘了用10倍LD50(10LD50)剂量的H5N1(A／VN／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第1、3和5天用20mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)或同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供两次(bid)的10mg／kg的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)、TCN-032／奥司他韦联合或同种型对照／奥司他韦联合治疗的小鼠群的百分比体重变化vs.感染后天数的图。激发且未治疗的小鼠群作为另一个负对照组(PBS给药对照)。
图60描绘了用20倍LD50(20LD50)剂量的H5N1(A／VN／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第1、3和5天用20mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)或同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供两次(bid)的10mg／kg的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)、TCN-032／奥司他韦联合或同种型对照／奥司他韦联合治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。激发且未治疗的小鼠群作为另一个负对照组(PBS给药对照)。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-032vs.同种型负对照(p<0.0002)、TCN-032／奥司他韦vs.同种型对照／奥司他韦(p<0.012)和TCN-032／奥司他韦vs.奥司他韦(p<0.029)。
图61描绘了用20倍LD50(20LD50)剂量的H5N1(A／VN／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第1、3和5天用20mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)或同种型负对照抗体(2N9)、PBS安慰剂(给药对照)、每天提供两次(bid)的10mg／kg的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)、TCN-032／奥司他韦联合或同种型对照／奥司他韦联合治疗的小鼠群的百分比重量变化vs.感染后天数的图。激发且未治疗的小鼠群作为另一个负对照组(PBS给药对照)。另外，未激发且未治疗的小鼠群作为对照组。
图62是实施例23中进行的实验的示意图。
图63是一对图，其描绘了第一个和第二个研究中的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数，所述小鼠群用20倍LD50(20LD50)剂量的H5N1(A／VN／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第1、3和5天用20mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)或同种型负对照抗体(2N9)、每天提供两次(bid)的10mg／kg的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)、TCN-032／奥司他韦联合或同种型对照／奥司他韦联合治疗。激发且未治疗的小鼠群作为另一个负对照组(PBS给药对照)。再一个未激发且未治疗的小鼠群作为对照。
图64是一系列图，其描绘了用20倍LD50(20LD50)剂量的H5N1(A／VN／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第1、3和5天(左上)、第3、5和7天(右上)、第4、6和8天(左下)、第5、7和9天(右下)用20mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)或同种型负对照抗体(2N9)、每天提供两次(bid)的10mg／kg的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)、TCN-032／奥司他韦联合或同种型对照／奥司他韦联合治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数。激发且未治疗的小鼠群作为另一个负对照组(PBS给药对照)。再一个未激发且未治疗的小鼠群作为对照。包括抗-M2e抗体TCN-032和奥司他韦的联合疗法证明了优良的特性，并且具体地，相对于单独的TCN-032或单独的奥司他韦治疗结果的协同关系。联合疗法导致90％的存活率，而TCN-032单独疗法导致10％的存活率，而奥司他韦疗法在治疗结束前导致群消失(右上图)。因此，联合疗法提供了高于任一种单独提供的单一疗法的叠加效果的效果。
图65是一系列图，其描绘了用20倍LD50(20LD50)剂量的H5N1(A／VN／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并随后在第1、3和5天(左上)、第3、5和7天(右上)、第4、6和8天(左下)、第5、7和9天(右下)用20mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10)或同种型负对照抗体(2N9)、每天提供两次(bid)的10mg／kg的奥司他韦(a／k／a TamifluTM)、TCN-032／奥司他韦联合或同种型对照／奥司他韦联合治疗的小鼠群的百分比重量变化vs.感染后天数。激发且未治疗的小鼠群作为另一个负对照组(PBS给药对照)。再一个未激发且未治疗的小鼠群作为对照。
图66是实施例24中进行的实验的示意图。
图67描绘了用1倍LD50(1×LD50)剂量的H5N1(A／Vietnam／1203／04)A型流行性感冒病毒激发并在第-1天和2天，治疗后用20mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，a／k／a8I10或TCN-01，a／k／a23K12)、正对照抗体(14C2)，或同种型负对照抗体(2N9)治疗的小鼠群的百分比存活vs.感染后天数的图。在以下组之间证明了百分比存活的统计学显著差异：TCN-031(23K12)vs.同种型负对照(2N9)(p<0.004)、TCN-032(8I10)vs.同种型负对照(2N9)(p<0.029)和正对照抗体(14C2)vs.同种型负对照(2N9)(p<0.0035)。
图68是一系列描绘了抗-M2e介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的图。然后将用A型流行性感冒病毒(A／Soloman Islands／3／2006)感染并用抗-M2e单克隆抗体(例如，TCN-031或TCN-032)或同种型相配负对照(抗-CMV抗体)预先孵育的MDCK细胞接触分离自单个人捐献者的人自然杀伤(NK)细胞。通过测量释放的乳酸脱氢酶(LDH)来定量细胞溶解(左图)。通过右图中提供的效应物与目标物的比例来测定ADCC介导的溶解的功效(上图中是特异性溶解百分比的原始数据，下图中显示了校正的特异性溶解百分比)。
图69是一系列图，描绘了从实施例26中所述的两次实验和图68描述收集的数据。
图70是一系列照片，描绘了抗-M2e抗体免疫组织化学特征。单独检查了冷冻肺组织的三个完整切片的染色，以及使用1.25μg／ml浓度的抗体TCN-031-FITC和TCN-032-FITC的组织微矩阵(TMA)载玻片(Biochain-FDA Standard Frozen Tissue Array，cat#T6234701，lot#B203071)。使用这些条件，正对照细胞系内的细胞子集是非常阳性的。
图71是一系列照片，描绘了抗-M2e抗体免疫组织化学特征。单独检查了冷冻肺组织的三个完整切片的染色，以及使用1.25μg／ml浓度的抗体TCN-031-FITC和TCN-032-FITC的组织微矩阵(TMA)载玻片(Biochain-FDA Standard Frozen Tissue Array，cat#T6234701，lot#B203071)。使用这些条件，正对照细胞系内的细胞子集是非常阳性的。
图72是实施例29中所用的96-孔CDC试验方案的示意图。
图73是一系列图，描绘了对于抗-M2e抗体TCN-032和负对照抗-CMV抗体(TCN-202)，相对光单位(RLU)／人补体百分比(％)的CDC试验读出(其实验方案描绘于图72中)。将目标细胞滴定的标准曲线(中间所示)用于测定TCN-032的特异性目标细胞杀灭功效，如特异性溶解百分比(％)／人补体百分比(％)所示。该实验的结果证明了用5-10％补体(体积比体积，v／v)获得了最大目标溶解。
图74是实施例29中所用的96-孔同源性CDC试验方案的示意图。
图75是一系列图，描绘了对于抗-M2e抗体TCN-032和负对照抗-CMV抗体(TCN-202)，相对光单位(RLU)／人补体百分比(％)的CDC试验读出(其实验方案描绘于图74中)。将目标细胞滴定的标准曲线(中间所示)用于测定TCN-032的特异性目标细胞杀灭功效，如特异性溶解百分比(％)／人补体百分比(％)所示。该实验的结果证明了用大约6.25％补体(v／v)获得了具有最小的可忽略的背景溶解的最大目标溶解。
图76是一系列图，描绘了在同源性CDC试验(其实验方案描绘于图74中)中温度胁迫的TCN-032的分析。作为分别胁迫至50℃、60℃和70℃的抗-M2e抗体TCN-032以及负对照抗-CMV抗体(TCN-202)的单克隆抗体浓度的函数，以细胞／孔来提供该试验读出。将目标细胞滴定的标准曲线(中间所示)用于测定TCN-032的特异性目标细胞杀灭功效，描绘为特异性溶解百分比(％)／人补体百分比(％)。该实验的结果证明了在高于60℃(>60℃)下胁迫的TCN-032显示出降低的CDC活性。然而，抗-Me2抗体TCN-032证明了即使胁迫至50℃时仍然优越的稳定性。
具体实施方式
本发明提供了对抗基质2(M2)多肽的胞外结构域的特异性全人单克隆抗体。抗体在本文中分别称为huM2e抗体。
M2是96个氨基酸的跨膜蛋白，其作为同型四聚体存在于流行性感冒病毒和病毒感染细胞的表面上。M2含有在A型流行性感冒毒株中高度保守的23个氨基酸的胞外域(M2e)。从1918年大流行毒株开始，仅有几个氨基酸发生了改变，因此M2e胞外域对于流行性感冒的治疗而言是一个有吸引力的目标。在之前的研究中，M2胞外域(M2e)特异性的单克隆抗体是通过对应于M2e线性序列的肽的免疫作用而得到的。相反，本发明提供了一种新型方法，其中在细胞系中表达全长M2，这使得可以鉴定结合这种细胞表达的M2e的人抗体。已经表明huM2e抗体结合M2-转染细胞上的构象决定簇以及流行性感冒感染细胞或病毒自身上的天然M2。huM2e抗体不结合线性M2e肽，但它们结合几种天然M2变体，也在转染至细胞系的cDNA上表达。因此，本发明可以鉴定和产生对非常宽范围的A型流行性感冒毒株呈现出新特异性的人单克隆抗体。这些抗体可以在诊断上用于鉴定A型流行性感冒感染，以及在治疗上用于治疗A型流行性感冒感染。
本发明的huM2e抗体具有一个或多个以下的特征：huM2e抗体结合a)流行性病毒的基质2(M2)多肽的胞外结构域中的表位；b)结合A型流行性感冒感染的细胞；和／或c)结合A型流行性感冒病毒(即，病毒粒子)。。本发明的huM2e抗体通过免疫效应物机制，如ADCC，消除流行性感冒感染的细胞，并且通过结合流行性感冒病毒粒子促进直接的病毒清除。本发明的huM2e抗体结合Me2多肽的氨基端区域。优选，本发明的huM2e抗体结合M2e多肽的氨基端区域，其中N-端甲硫氨酸残基不存在。示例性M2e序列包括以下表1中所列的那些序列。
表1
Figure BDA0000413462010000341
Figure BDA0000413462010000351
Figure BDA0000413462010000361
Figure BDA0000413462010000371
在一个实施方案中，本发明的huM2e抗体结合全部或部分包括根据SEQ ID NO：1编号时M2e的位置2至位置7的氨基酸残基的M2e。例如，本发明的huM2e抗体全部或部分结合氨基酸序列SLLTEVET(SEQ ID NO：41)。最优选，本发明的huM2e抗体全部或部分结合氨基酸序列SLLTEV(SEQ ID NO：42)。优选，本发明的huM2e抗体结合M2e蛋白的非线性表位。例如，huM2e抗体结合包含根据SEQ ID NO：1编号时M2e多肽的位置2、5和6的表位，其中氨基酸在a)位置2是丝氨酸；b)位置5是苏氨酸；和c)位置6是谷氨酸。结合该表位的示例性huM2e单克隆抗体是本文中所述的8I10、21B15或23K12抗体。
8I10抗体包括由以下SEQ ID NO：43中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：44)和由SEQ ID NO：45中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：46)。
在以下序列中，包括由Chothia，C等(1989，Nature，342：877-883)定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由KabatE.A.等(1991，Sequences of Protein of Immunological Interest，第5版　，NIH Publication no.91-3242U.S.Department of Health andHuman Services.)定义的那些是粗体突出的。
8I10抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：NYYWS(SEQ ID NO：72)、FIYYGGNTKYNPSLKS(SEQ ID NO：74)和ASCSGGYCILD(SEQ ID NO：76)。8I10抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQNIYKYLN(SEQ ID NO：59)、AASGLQS(SEQ ID NO：61)和QQSYSPPLT(SEQ ID NO：63)。
8I10抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GSSISN(SEQ ID NO：109)、FIYYGGNTK(SEQ ID NO：110)和ASCSGGYCILD(SEQ ID NO：76)。8I10抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQNIYKYLN(SEQ ID NO：59)、AASGLQS(SEQ ID NO：61)和QQＳYＳPPLT(ＳEQ ID NＯ：63)。
>8I10VH核苷酸序列：(SEQ ID NO：43)
CAGGTGGAATTGCAGGAGICGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCTGCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTTCGTCCATCAGTAATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGTCCCCAGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTTTATCTATTACGGTGGAAACACCAAGTACAATCCCTCCCTCAAGAGCCGCGTCACCATATCACAAGACACTTCCAAGAGTCAGGTCTCCCTGACGATGACCTCTGTGACCGCTGCGGAATCGGCCGTCTATTTCTGTTCGAGAGCGCGCCCTGTAGTGGTGGTACTGTATCCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCG
>8I10VH氨基酸序列：(SEQ ID NO：44)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQLQESGPGLVKPSFTLSLTCTVSGSSTS
Figure BDA0000413462010000391
WIRQSPGKGLEWIG
Figure BDA0000413462010000392
Figure BDA0000413462010000393
RVTISQDTSKSQVSLTMSSVTAAESAVYFCAR
Figure BDA0000413462010000394
Figure BDA0000413462010000395
YWGQGTLVTVS
>8I10VH短核苷酸序列：(SEQ ID NO：262)
CASGTGCAATTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTTCGTCCATCAGTAATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGTCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTTTATCTATTACGGTGGAAACACCAAGTACAATCCCTCCCTCAAGAGCCGCGTCACCATATCACAAGACACTTCCAAGAGTCAGGTCTCCCTGACGATGAGCTCTGTGACCGCTGCGGAATCGGCCGTCTATTTCTGTGCGAGAGCGTCTTGTAGTGGTGGTTACTGTATCCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGT
>8I10VH短氨基酸序列：(SEQ ID NO：263)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGSSIS
Figure BDA0000413462010000396
WIRQSPGKGLEWIG
Figure BDA0000413462010000397
Figure BDA0000413462010000398
RVTISQDTSKSQVSLTMSSVTAAESAVYFCAR
Figure BDA00004134620100003910
YWGQGTLVT
>8I10VH长核苷酸序列：(SEQ ID NO：264)
CAGGTGCAATTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTTCGTCCATCAGTAATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGTCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTTTATCTATTACGGTGGAAACACCAAGTACAATCCCTCCCTCAAGAGCCGCGTCACCATATCACAAGACACTTCCAAGAGTCAGGTCTCCCTCACGATGAGCTCTGTGACCGCTGCGGAATCGGCCGTCTATTTCTGTGCGAGAGCGTCTTGTAGTGGTGGTTACTGTATCCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>8I10VH长氨基酸序列：(SEQ ID NO：265)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGSSIS
Figure BDA0000413462010000401
WIRQSPGKGLEWIG
Figure BDA0000413462010000402
RVTISQDTSKSQVSLTMSSVTAAESAVYFCAR
Figure BDA0000413462010000404
Figure BDA0000413462010000405
YWGQGTLVTVSS
>8I10VL核苷酸序列：(SEQ ID NO：45)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCGAGTCAGAACATTTACAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAGACCAGGGAAAGCCCCTAAGGGCCTGATCTCTGCTGCATCCGGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCACCACTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGTCTTACAGTCCCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAGGGTGGAGATCAAAC
>8I10VL氨基酸序列：(SEQ ID NO：46)
Kabat粗体，Chothia下划线
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
Figure BDA0000413462010000406
WYQQRPGKAPKGLIS
Figure BDA0000413462010000407
GVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPEDFATYYC
Figure BDA0000413462010000408
EGGGTRVEIK
21B15抗体包括由以下SEQ ID NO：47中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：44)和由SEQ ID NO：48中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：46)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
21B15抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：NYYWS(SEQ ID NO：72)、FIYYGGNTKYNPSLKS(SEQ ID NO：74)和ASCSGGYCILD(SEQ ID NO：76)。21815抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQNIYKYLN(SEQ ID NO：59)、AASGLQS(SEQ ID NO：61)和QQSYSPPLT(SEQ ID NO：63)。
21B15抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GSSISN(SEQ ID NO：109)、FIYYGGNTK(SEQ ID NO：110)和ASCSGGYCILD(SEQ ID NO：76)。21815抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQNIYKYLN(SEQ ID NO：59)、AASGLQS(SEQ ID NO：61)和QQSYSPPLT(SEQ ID NO：63)。
>21B15VH核苷酸序列：(SEQ ID NO：47)
CAGGTGCAATTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTTCGTCCATCAGTAATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCACTCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTTTATCTATTACGGTGGAAACACCAAGTACAATCCCTCCCTCAAGAGCCGCGTCACCATATCACAAGACACTTCCAAGAGTCAGGTCTCCCTGACGATGAGCTCTGTGACCGCTGCGGAATCGGCCGTCTATTTCTGTGCGAGAGGGTCTTGTAGTGGTGGTTACTGTATCCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCG
>21B15VH氨基酸序列：(SEQ ID NO：44)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQTQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGSSIS
Figure BDA0000413462010000411
WIRQSPCKGLEWIG
Figure BDA0000413462010000412
Figure BDA0000413462010000413
RVTISQDTSKSQVSLTMSSVTAAESAVYFCAR
Figure BDA0000413462010000414
Figure BDA0000413462010000415
YWGQGTLVTVS
>21B15VL核苷酸序列：(SEQ ID NO：48)
GACATCCAGGTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGCGCGAGTCAGAACATTTACAAGTATTTAAATTGGTATCACCAGAGACCAGGGAAAGCCCCTAAGGGCCTGATCTCTGCTGCATCCGGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCACCAGTCTGCAAGCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTCCCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAGGGTGGATATCAAAC
>21B15VL氨基酸序列：(SEQ ID NO：317)
Kabat粗体，Chothia下划线
DIQVTQSPSSLSASVGDRVTITC
Figure BDA0000413462010000421
WYQQRPGKAPKGLIS
Figure BDA0000413462010000422
GVPSRFSGSGSGTDFTLTITSLQPEDFATYYC
Figure BDA0000413462010000423
FGGGTRVDIK
23K12抗体包括以下抗体，所述抗体包括由以下SEQ IDNO：49中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：50)和由SEQ ID NO：51中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ IDNO：52)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
23K12抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：SNYMS(SEQ ID NO：103)、VIYSGGSTYYADSVK(SEQ ID NO：105)和CLSRMRGYGLDV(SEQ ID NO：107)。23K12抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RTSQSISSYLN(SEQ IDNO：92)、ASSLQSGVPSRF(SEQ ID NO：94)和QQSYSMPA(SEQID NO：96)。
23K12抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GFTVSSN(SEQ ID NO：112)、VIYSGGSTY(SEQ ID NO：113)和CLSRMRGYGLDV(SEQ ID NO：107)。23K12抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RTSQSISSYLN(SEQ ID NO：92)、AASSLQSGVPSRF(SEQ ID NO：94)和QQSYSMPA(SEQ IDNO：96)。
>23K12VH核苷酸序列：(SEQ ID NO：49)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCGTGGGGGGTCCCTGAGAATCTCCTGTGCAGGGTCTGGATTCACCGTCAGTAGCAACTACATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCAGATTCTCCTTCTCCAGAGACAACTCCAAGAACACAGTGTTTCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGATGTCTGAGCAGGATGCGGGGTTACGGTTTAGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCG
>23K12VH氨基酸序列：(SEQ ID NO：50)
Kabat粗体，Chothia下划线
EVQLVESGGGLVQPGGSLRISCAASGFTVS
Figure BDA0000413462010000431
WVRQAPGKGLEWVS
Figure BDA0000413462010000432
GRFSFSRDNSKNTVFLQMNSLRAEDTAVYYCAR
Figure BDA0000413462010000434
Figure BDA0000413462010000435
WGQGTTVTVS
>23K12VH短核苷酸序列：(SEQ ID NO：266)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCGTGAGAATCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAGCAACTACATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTCCCTCTCAGTTATTTATAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCAGATTCTCCTTCTCCAGAGACAACTCCAAGAACACAGTGTTTCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGATGTCTGAGCAGGATGCGGGGTTACGGTTTAGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGT
>23K12VH短氨基酸序列：(SEQ ID NO：267)
Kabat粗体，Chothia下划线
EVQLVESGGGLVQPGGSLRISCAASGFTVS
Figure BDA0000413462010000441
WVRQAPGKGLEWVS
Figure BDA0000413462010000442
Figure BDA0000413462010000443
GRFSFSRDNSKNTVFLQMNSLRAEDTAVYYCAR
Figure BDA0000413462010000444
Figure BDA0000413462010000445
WGQGTTVTVS
>23K12VH长核苷酸序列：(SEQ ID NO：268)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGAATCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAGCAACTACATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCAGATTCTCCTTCTCCAGAGACAACTCCAAGAACACAGTGTTTCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGATGTCTGAGCAGGATGCGGGGTTACGGTTTAGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGC
>23K12VH长氨基酸序列：(SEQ ID NO：269)
Kabat粗体，Chothia下划线
EVQLVESGGGLVQPGGSLRISCAASGFTVS
Figure BDA0000413462010000446
WVRQAPGKGLEWVS
Figure BDA0000413462010000447
Figure BDA0000413462010000448
GRFSFSRDNSKNTVFLQMNSLRAEDTAVYYCAR
Figure BDA00004134620100004410
WGQGTTVTVSS
>23K12VL核苷酸序列：(SEQ ID NO：51)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGACAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACCTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTATGCCTGCCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
>23K12VL氨基酸序列：(SEQ ID NO：52)
Kabat粗体，Chothia下划线
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
Figure BDA0000413462010000451
WYQQKPGKAPKLLIY
Figure BDA0000413462010000452
SGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYC
Figure BDA0000413462010000453
FGQGTKLEIK
3241_G23抗体(本文中也称为G23)包括如下抗体，所述抗体包括由以下的SEQ ID NO：115中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：116)和由SEQ ID NO：117中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：118)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
G23抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：GGGYSWN(SEQ ID NO：179)、FMFHSGSPRYNPTLKS(SEQ IDNO：180)和VGQMDKYYAMDV(SEQ ID NO：181)。G23抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQSIGAYVN(SEQ ID NO：184)、GASNLQS(SEQ ID NO：185)和QQTYSTPIT(SEQ ID NO：186)。
G23抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GGPVSGGG(SEQ ID NO：182)、FMFHSGSPR(SEQ ID NO：183)和VGQMDKYYAMDV(SEQ ID NO：181)。G23抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQSIGAYVN(SEQ ID NO：184)、GASNLQS(SEQ ID NO：185)和QQTYSTPIT(SEQ ID NO：186)。
>3241_G23VH核苷酸序列(SEQ ID NO：115)
CAGGTGCAGCTGCAGCAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACTTGCACTGTCTCTGGTGGCCCCGTCAGCGGTGGTGGTTACTCCTGGAACTGGATCCGCCAACGCCCAGGACAGGGCCTGGAGTGGGTTGGGTTCATGTTTCACAGTGGGAGTCCCCGCTACAATCCGACCCTCAAGAGTCGAATTACCATCTCAGTCGACACGTCTAAGAACCTGGTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACGGCCGCGGACACGGCCGTGTATTTTTGTGCGCGAGTGGGGCAGATGGACAAGTACTATGCCATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGC
>3241_G23VH氨基酸序列(SEQ ID NO：116)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGPVS
Figure BDA0000413462010000461
WLRQRPGQGLEWVG
Figure BDA0000413462010000463
RITISVDTSKNLVSLKLSSVTAADTAVYFCARWGQGTTVTVSS
>3241_G23VL核苷酸序列(SEQ ID NO：117)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTTCCTCTGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTGGCGCCTATGTAAATTGGTATCAACAGAAAGCAGGGAAAGCCCCCCAGGTCCTGATCTTTGGTGCTTCCAATTTACAAAGCGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGACTTTGCAACTTACTTCTGTCAACAGACTTACAGTACCCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACG
>3241_G23VL氨基酸序列(SEQ ID NO：118)
DIQMTQSPSSLSSSVGDRVTITC
Figure BDA0000413462010000465
WYQQKAGKAPQVLIF
Figure BDA0000413462010000466
GVPSRFSGSGSGTDFTLTTSSLQPEDFATYFC
Figure BDA0000413462010000467
PGQGTRLEIK
3244_I10抗体(本文中也称为I10)包括如下抗体，所述抗体包括由以下的SEQ ID NO：119中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：120)和由SEQ ID NO：121中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：122)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
I10抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：SDYWS(SEQ ID NO：187)、FFYNGGSTKYNPSLKS(SEQ ID NO：188)和HDAKFSGSYYVAS(SEQ ID NO：189)。I10抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQSISTYLN(SEQ IDNO：192)、GATNLQS(SEQ ID NO：193)和QQSYNTPLI(SEQ IDNO：194)。
I10抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GGSITS(SEQ ID NO：190)、FFYNGGSTK(SEQ ID NO：191)和HDAKFSGSYYVAS(SEQ ID NO：189)。I10抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQSISTYLN(SEQ ID NO：192)、GATNLQS(SEQ ID NO：193)和QQSYNTPLI(SEQ ID NO：194)。
>3244_I10VH核苷酸序列(SEQ ID NO：119)
CAGGTCCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGCTGAAGCCTTCGGACACCCTGGCCCTCACTTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCACCAGTGACTACTGGAGCTGGATCCGGCAACCCCCAGGGAGGGGACTGGACTGGATCGGATTCTTCTATAACGGCGGAAGCACCAAGTACAATCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATTTCAGCGGACACGTCCAAGAACCAGTTGTCCCTGAAATTGACCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGGCGTGTATTATTGTGCGAGACATGATGCCAAATTTAGTGGGAGCTACTACGTTGCCTCCTGGGGCCAGGGAACCCGAGTCACCGTCTCGAGC
>3244_I10VH氨基酸序列(SEQ ID NO：120)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQLQESGPGLLKPSDTLALTCTVSGGSIT WIRQPPGRGLDWIG
Figure BDA0000413462010000472
Figure BDA0000413462010000473
RVTISADTSKNQLSLKLTSVTAADTGVYYCAR
Figure BDA0000413462010000474
WGQGTRVTVSS
>3244_I10VL核苷酸序列(SEQ ID NO：121)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCTCTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCACCTATTTAAATTGGTATCAGCAGCAACCTGGGAAAGCCCCTAAGGTCCTCATTTTTGGTGCAACCAACTTGCAAAGTGGGGTCCCATCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAATACCCCCCTCATTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACG
>3244_I10VL氨基酸序列(SEQ ID NO：122)
Kabat粗体，Chothia下划线
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISC
Figure BDA0000413462010000481
WYQQQPGKAPKVLIF
Figure BDA0000413462010000482
GVPSRFSGSGSGYDFTLTISSLQPEDFATYYC
Figure BDA0000413462010000483
FGQGTKLEIK
3243_J07抗体(本文中也称为J07)包括如下抗体，所述抗体包括由以下的SEQ ID NO：123所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：124)和由SEQ ID NO：125所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：126)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
J07抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：SDYWS(SEQ ID NO：187)、FYNGGSTKYNPSLKS(SEQ ID NO：188)和HDVKFSGSYYVAS(SEQ ID NO：195)。J07抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQSISTYLN(SEQ IDNO：192)、GATNLQS(SEQ ID NO：193)和QQSYNTPLI(SEQ IDNO：194)。
J07抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GGSITS(SEQ ID NO：190)、FFYNGGSTK(SEQ ID NO：191)和HDVKFSGSYYVAS(SEQ ID NO：195)。J07抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQSISTYLN(SEQ ID NO：192)、GATNLQS(SEQ ID NO：193)和QQSYNTPLI(SEQ ID NO：194)。
>3243_J07VH核苷酸序列(SEQ ID NO：123)
CAGGTCCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGCTGAAGCCTTCGGACACCCTGGCCCTCACTTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCACCAGTGACTACTGGAGCTGGATCCGGCAACCCCCAGGGAGGGGACTGGACTGGATCGGATTCTTCTATAACGGCGGGAGCACCAAGTACAATCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGCGGACACGTCCAAGAACCAGTTGTCCCTGAAATTGACCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGGCGTGTATTATTGTGCGAGACATGATGTCAAATTTAGTGGGAGCTACTACGTTGCCTCCTGGGGCCAGGGAACCCGAGTCACCGTCTCGAGC
>3243_J07VH氨基酸序列(SEQ ID NO：124)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQLQESGPGLLKPSDTLALTCTVSGGSIT
Figure BDA0000413462010000491
WIRQPPGRGLDWIG
Figure BDA0000413462010000492
Figure BDA0000413462010000493
RVTISADTSKNQLSLKLTSVTAADTGVYYCARWGQGTRVTVSS
>3243_J07VL核苷酸序列(SEQ ID NO：125)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCTCTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCACCTATTTAAATTGGTATCAGCAGCAACCTGGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTCTGGTGCAACCAACTTGCAAAGTGGGGTCCCATCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAATACCCCCCTCATTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACG
>3243_J07VL氨基酸序列(SEQ ID NO：126)
Kabat粗体，Chothia下划线d
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISC
Figure BDA0000413462010000495
WYQQQPGKAPKVLISGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
Figure BDA0000413462010000497
FGQGTKLEIK
3259_J21抗体(本文中也称为J21)包括如下抗体，所述抗体包括由以下的SEQ ID NO：127中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：128)和由SEQ ID NO：129中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：130)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat E.A.等1991定义的那些是粗体突出的。
J21抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：SYNWI(SEQ ID NO：196)、HIYDYGRTFYNSSLQS(SEQ ID NO：197)和PLGILHYYAMDL(SEQ ID NO：198)。J21抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQSIDKFLN(SEQ ID NO：199)、GASNLHS(SEQ ID NO：200)和QQSFSVPA(SEQ ID NO：201)。
J21抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GGSISS(SEQ ID NO：202)、HIYDYGRTF(SEQ ID NO：203)和PLGILHYYAMDL(SEQ ID NO：198)。J21抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQSIDKFLN(SEQ ID NO：199)、GASNLHS(SEQ ID NO：200)和QQSFSVPA(SEQ ID NO：201)。
>3259_J21VH核苷酸序列(SEQ ID NO：127)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCACGAGTGGTGAGGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCGGGGGGCTCCATCAGTTCTTACAACTGGATTTGGATCCGGCAGCCCCCTGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGCACATATATGACTATGGGAGGACCTTCTACAACTCCTCCCTCCAGAGTCGACCTACCATATCTGTAGACGCGTCCAAGAATCAGCTCTCCCTGCGATTGACCTCTGTGACCGCCTCAGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGACCTCTCGGTATACTCCACTACTACGCGATGGACCTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGC
>3259_J21VH氨基酸序列(SEQ ID NO：128)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQLQESGPRVVRPSETLSLTCTVSGGSIS
Figure BDA0000413462010000501
WTRQPPGKGLEWIG
Figure BDA0000413462010000502
Figure BDA0000413462010000503
RPTISVDASKNQLSLRLTSVTASDTAVYYCAR
Figure BDA0000413462010000504
WGQGTTVTVSS
>3259_J21VL核苷酸序列(SEQ ID NO：129)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATTATCCGTGTCTGTATCTGTCGGGGACAGGGTCACCATCGCTTGCCGGGCAAGTCAGAGTATTGACAAGTTTTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATGGTGCCTCCAATTTGCACAGTGGGGCCCCATCAAGGTTCAGTGCCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTAACAATCACCAATATACAGACTGAAGATTTCGCAACTTACCTCTGTCAACAGAGTTTCAGTGTCCCCGCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAACG
>3259_J21VL氨基酸序列(SEQ ID NO：130)
Kabat粗体，Chothia下划线
DLQMTQSPLSVSVSVGDRVTIAC
Figure BDA0000413462010000511
WYQQKPGKAPKLLIY
Figure BDA0000413462010000512
GAPSRFSASGSGTDFTLTITNIQTEEFATYLC
Figure BDA0000413462010000513
FGGGTKVEIK
3245_O19抗体(本文中也称为O19)包括由以下的SEQ IDNO：131中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：132)和由SEQ ID NO：133中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQID NO：134)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
O19抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：STYMN(SEQ ID NO：204)、VFYSETRTYYADSVKG(SEQ ID NO：205)和VQRLSYGMDV(SEQ ID NO：206)。O19抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQSISTYLN(SEQ ID NO：192)、GASTLQS(SEQ ID NO：207)和QQTYSIPL(SEQ ID NO：208)。
O19抗体的重链CDR具有以下按照ChOthia定义的序列：GLSVSS(SEQ ID NO：209)、FYSETRTY(SEQ ID NO：210)和VQRLSYGMDV(SEQ ID NO：206)。O19抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQSISTYLN(SEQ ID NO：192)、GASTLQS(SEQ ID NO：207)和QQTYSIPL(SEQ ID NO：208)。
>3245_O19VH核苷酸序列(SEQ ID NO：131)
GAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGAGGGGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACGGCCTCTGGGTTAAGTGTCAGTTCCACCTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGGTCTCAGTTTTTTATAGTGAGACCAGGACGTACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGACACAATTCCAACAACACGCTCTATCTTCAGATGAACAGCCTGAGAGTTGAAGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAGTCCAGAGATTGTCGTACGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGC
>3245_O19VH氨基酸序列(SEQ ID NO：132)
Kabat粗体，Chothia下划线
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGLSVS
Figure BDA0000413462010000521
WVRQAPGKGLEWVS
Figure BDA0000413462010000523
RFTVSRHNSNNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCAR
Figure BDA0000413462010000524
WGQGTTVTVSS
>3245_O19VL核苷酸序列(SEQ ID NO：133)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTTGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCACCTATTTAAATT GGTATCAGAAGAGACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGGTCTATGGTGCATCCACTTTGCAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCGCCAGTCTGCAACCTGAAGATTCTGCAACTTAGTACTGTCAACAGACTTACTGTATCCCCCTCTTCGGCCAGGGGACACGGCTGGAGATTAAACG
>3245_O19VL氨基酸序列(SEQ ID NO：134)
Kabat粗体，Chothia下划线
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
Figure BDA0000413462010000525
WYQKRPGKAPKLLVY
Figure BDA0000413462010000526
GVPSRFSGSGSGTDFTLTIASLQPEDSATYYC
Figure BDA0000413462010000527
FGQGTRLEIK
3244_H04抗体(本文中也称为H04)包括如下抗体，所述抗体包括由以下的SEQ ID NO：135中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：136)和由SEQ ID NO：137中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：138)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
H04抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：STYMN(SEQ ID NO：204)、VFYSETRTYYADSVKG(SEQ ID NO：205)和VQRLSYGMDV(SEQ ID NO：206)。H04抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQSISTYLN(SEQ ID NO：192)、GASSLQS(SEQ ID NO：211)和QQTYSIPL(SEQ ID NO：208)。
H04抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GLSVSS(SEQ ID NO：209)、VFYSETRTY(SEQ ID NO：210)和VQRLSYGMDV(SEQ ID NO：206)。H04抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQSISTYLN(SEQ ID NO：192)、GASSLQS(SEQ ID NO：211)和QQTYSIPL(SEQ ID NO：208)。
>3244_H04VH核苷酸序列(SEQ ID NO：135)
GAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGAGGGGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTACAGCCTCTGGGTTAAGCGTCAGTTCCACCTACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGGTCTCAGTTTTTTATAGTGAAACCAGGACGTATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGACACAATTCCAACAACACGCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAAGACACGGCCGTGTATTATTGTGCGAGAGTCCAGAGACTGTCATACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGC
>3244_H04VH氨基酸序列(SEQ ID NO：136)
Kabat粗体，Chothia下划线
EVQLVESGCGLVQPGGSLRLSCTASGLSVS
Figure BDA0000413462010000541
WVRQAPGKGLEWVS RFTVSRHNSNNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
Figure BDA0000413462010000544
WGQGTTVTVSS
>3244_H04VL核苷酸序列(SEQ ID NO：137)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCGTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCACCTATTTAAATTGGTATCAGAAGAGACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGGTCTATGGTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCGCCAGTCTGCAACCTGAAGATTCTGCAGTTTATTACTGTCAACAGACTTACAGTATCCCCCTCTTCGGCCAGGGGACACGACTGGAGATTAAACG
>3244_H04VL氨基酸序列(SEQ ID NO：138)
Kabat粗体，Chothia下划线
DIQMTQS PSSLSASVGDRVTTTC
Figure BDA0000413462010000545
WYQKRPGKAPKLLVY
Figure BDA0000413462010000546
GVPSRFSGSGSGTDFTLTIASLQPEDSAVYYC
Figure BDA0000413462010000547
FGQGTRLEIK
3136_G05抗体(本文中也称为G05)包括如下抗体，所述抗体包括由以下的SEQ ID NO：139中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：140)和由SEQ ID NO：141中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：142)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
G05抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：SDFWS(SEQ ID No：212)、YVYNRGSTKYSPSLKS(SEQ ID NO：213)和NGRSSTSWGIDV(SEQ ID NO：214)。G05抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQSISTYLH(SEQ IDNO：215)、AASSLQS(SEQ ID NO：216)和QQSYSPPLT(SEQ IDNO：63)。
G05抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GGSISS(SEQ ID NO：202)、YVYNRGSTK(SEQ ID NO：217)和NGRSSTSWGIDV(SEQ ID NO：214)。G05抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQSISTYLH(SEQ ID NO：215)、AASSLQS(SEQ ID NO：216)和QQSYSPPLT(SEQ ID NO：63)。
>3136_G05VH核苷酸序列(SEQ ID NO：139)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCAGTGTCTCTGGTGGCTCCATTAGTAGTGATTTCTGGAGTTGGATCCGACAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATGTCTATAACAGAGGGAGCACTAAGTACAGTCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGCAGACATGTCCAACAACCACTTTTCCCTGAATATGAGTTCTGTGACCCCTGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAAATGGTCGAAGTAGCACCAGTTGGGGCATCGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGC
>3136_G05VH氨基酸序列(SEQ ID NO：140)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGGSIS
Figure BDA0000413462010000551
WIRQPPGKGLEWIG
Figure BDA0000413462010000553
RVTTSADMSKNQFSLNMSSVTAADTAVYYCAKWGKGTTVTVSS
>3136_G05VL核苷酸序列(SEQ ID NO：141)
CACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGACTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCACCTATTTACATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTAGATCAGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGATGACTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTCCCCCCCTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATGAAACG
>3136_G05VL氨基酸序列(SEQ ID NO：142)
Kabat粗体，Chothia下划线
DIQMTQSPSSLSASVGDRLTLTC
Figure BDA0000413462010000561
WYQQKPGKAPKLLIY
Figure BDA0000413462010000562
GVPSRFSGSRSGTDFTLTLSSLQPDDFATYYCFGPGTKVDMK
3252_C13抗体(本文中也称为C13)包括如下抗体，所述抗体包括由以下的SEQ ID NO：143中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：144)和由SEQ ID NO：145中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：146)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
C13抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：SDYWS(SEQ ID NO：187)、YIYNRGSTKYTPSLKS(SEQ ID NO：218)和HVGGHTYGIDY(SEQ ID NO：219)。C13抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQSISNYLN(SEQ ID NO：220)、AASSLQS(SEQ ID NO：216)和QQSYNTPIT(SEQ ID NO：221)。
C13抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GASISS(SEQ ID NO：222)、YIYNRGSTK(SEQ ID NO：223)和HVGGHTYGIDY(SEQ ID NO：219)。C13抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQSISNYLN(SEQ ID NO：220)、AASSLQS(SEQ ID NO：216)和QQSYNTPIT(SEQ ID NO：221)。
>3252_C13VH核苷酸序列(SEQ ID NO：143)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGCCTCCATCAGTAGTGACTACTGGAGCTGGATCCGGCTGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATAATAGAGGGAGTACCAAGTACACCCCCTCCCTGAAGAGTCGAGTCACCATATCACTAGACACGGCCGAGAACCAGTTCTCCCTGAGGCTGAGGTCGGTGACCGCCGCAGACACGGCCATCTATTACTGTGCGAGACATGTAGGTGGCCACACCTATGGAATTGATTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>3252_C13VH氨基酸序列(SEQ ID NO：144)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASLS
Figure BDA0000413462010000571
WIRLPPGKGLEWIG
Figure BDA0000413462010000572
Figure BDA0000413462010000573
RVTISLDTAENQFSLRLRSVTAADTATYYCAR
Figure BDA0000413462010000574
WGQGTLVTVSS
>3252_C13VL核苷酸序列(SEQ ID NO：145)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCGTCCCTGTCTGCCTCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAACACAAACCTGGGGAAGCCCCCAAGCTCCTGAACTATGCTGCGTCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAACCTTCAGTGCCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTTCAACCTGAAGATTTTGCCACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAATACTCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAAATTAAACG
>3252_C13VL氨基酸序列(SEQ ID NO：146)
Kabat粗体，Chothia下划线
DTQMTQSPSSLSASVGDRVTLTCWYQHKPGEAPKLLNY
Figure BDA0000413462010000576
GVPSRFSASGSGTDFTLTISSLQFEDFATYYC
Figure BDA0000413462010000577
FGQGTRLEIK
3259_J06抗体(本文中也称为J06)包括如下抗体，所述抗体包括由以下的SEQ ID NO：147中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：148)和由SEQ ID NO：149中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：150)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
J06抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：SDYWS(SEQ ID NO：187)、YIYNRGSTKYTPSLKS(SEQ ID NO：218)和HVGGHTYGIDY(SEQ ID NO：219)。J06抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQSISNYLN(SEQ ID NO：220)、AASSLQS(SEQ ID NO：216)和QQSYNTPIT(SEQ ID NO：221)。
J06抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GASISS(SEQ ID NO：222)、YIYNRGSTK(SEQ ID NO：223)和HVGGHTYGIDY(SEQ ID NO：219)。J06抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQSISNYLN(SEQ ID NO：220)、AASSLQS(SEQ ID NO：216)和QQSYNTPIT(SEQ ID NO：221)。
>3255_J06VH核苷酸序列(SEQ ID NO：147)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGCCTCCATCAGTAGTGACTACTGGAGCTGGATCCGGCTGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTATATCTATAATAGAGGGAGTACCAAGTACACCCCCTCCCTGAAGAGTCGAGTCACCATATCACTAGACACGGCCGAGAACCAGTTCTCCCTGAGGCTGAGGTCGGTGACCGCCGCAGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGACATGTGGGTGGCCACACCTATGGAATTGATTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGC
>3255_J06VH氨基酸序列(SEQ ID NO：148)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGASIS WIRLPPGKGLEWIG
Figure BDA0000413462010000583
RVTISLDTAENQFSLRLRSVTAADTAVYYCAR
Figure BDA0000413462010000584
WGQGTLVTVSS
>3255_J06VL核苷酸序列(SEQ ID NO：149)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCGTCCCTGTCTGCCTCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAACACAAACCTGGGGAAGCCCCCAAGCTCCTGAACTATGCTGCGTCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGCCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCAGCATCAGCGGTCT TCAACCTGAAGATTTTGCCACTTACTACTGTCAACAGAGCTACAATACTCCGATCACCTTCGGCCCAGGGACACGACTGGAAATTAAACG
>3255_J06VL氨基酸序列(SEQ ID NO：150)
Kabat粗体，Chothia下划线
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
Figure BDA0000413462010000591
WYQRKPGEAPKLLNY
Figure BDA0000413462010000592
GVPSRFSASGSGTDFTLSISGLQPEDFATYYC
Figure BDA0000413462010000593
FGPGTRLEIK
3410_I23抗体(本文中也称为I23)包括如下抗体，所述抗体包括由以下的SEQ ID NO：151中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：152)和由SEQ ID NO：153中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：154)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
I23抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：SYSWS(SEQ ID NO：224)、YLYYSGSTKYNPSLKS(SEQ ID NO：225)和TGSESTTGYGMDV(SEQ ID NO：226)。I23抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQSISTYLN(SEQ IDNO：192)、AASSLHS(SEQ ID NO：227)和QQSYSPPIT(SEQ IDNO：228)。
I23抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GDSISS(SEQ ID NO：229)、YLYYSGSTK(SEQ ID NO：230)和TGSESTTGYGMDV(SEQ ID NO：226)。I23抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQSISTYLN(SEQ ID NO：192)、AASSLHS(SEQ ID NO：227)和QQSYSPPIT(SEQ ID NO：228)。
>3420_I23VH核苷酸序列(SEQ ID NO：151)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCGTCACCTGCAAAGTCTCTGGTGACTCCATCAGTAGTTATTCCTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTTGGCTATTTGTATTATAGTGGGAGCACCAAGTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAACCACCATATCAGTAGACACGTCCACGAACCAGTTGTCCCTGAAGTTGAGTTTTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTTCTGTGCGAGAACCGGCTCGGAATCTACTACCGGCTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGC
>3420_I23VH氨基酸序列(SEQ ID NO：152)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCKVSGDSTS
Figure BDA0000413462010000601
WIRQPPGKGLEWVG RTTTSVDTSTNQLSLKLSFVTAADTAVYFCARWGQGTTVTVSS
>3420_I23VL核苷酸序列(SEQ ID NO：153)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCACCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCACAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCGCTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTCCCCCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACG
>3420_I23VL氨基酸序列(SEQ ID NO：154)
Kabat粗体，Chothia下划线
DTQMTQSPSSLSASVGDRVTTTC
Figure BDA0000413462010000605
WYQQKPGKAPKLLTYGVPSRFSGSGSGTDFALTISSLQPEDFATYYC
Figure BDA0000413462010000607
FGQGTRLEIK
3139_P23抗体(本文中也称为P23)包括如下抗体，所述抗体包括由以下的SEQ ID NO：155中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：156)和由SEQ ID NO：157中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：158)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
P23抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：NSFWG(SEQ ID NO：318)、YVYNSGNTKYNPSLKS(SEQ IDNO：231)和HDDASHGYSIS(SEQ ID NO：232)。P23抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQTISTYLN(SEQ IDNO：233)、AASGLQS(SEQ ID NO：61)和QQSYNTPLT(SEQ IDNO：234)。
P23抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GGSISN(SEQ ID NO：258)、YVYNSGNTK(SEQ ID NO：259)和HDDASHGYSIS(SEQ ID NO：232)。P23抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQTISTYLN(SEQ ID NO：233)、AASGLQS(SEQ ID NO：61)和QQSYNTPLT(SEQ ID NO：234)。
＞3139_P23VH核苷酸序列(SEQ ID NO：155)
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAAGACTGGTGAAGCCTTCGGAGAGCCTGTCCCTCACCTGCACTCTCTCTGGTGGCTCCATTAGTAATTCCTTCTGGGGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGGAGGGACTGGAGTGGATTGGTTATGTCTATAACAGTGGCAACACCAAGTACAATCCCTCCCTCAAGACTCGAGTCACCATTTCGCGCGACACGTCCAAGAGTCAACTCTACATGAAGCTGAGGTCTGTGACCGCCGCTGACACGGCCGTGTACTACTGTGCGAGGCATGACGACGCAAGTCATGGCTACAGCATCTCCTGGGGCACGGAACCCTGGTCACCGTCTCTCGAGC
＞3139_P23VH氨基酸序列(SEQ ID NO：156)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQLQESGPRLVKPSESLSLTCTVSGGSIS
Figure BDA0000413462010000611
WIRQPPGEGLEWIG
Figure BDA0000413462010000612
Figure BDA0000413462010000613
RVTISRDTSKSQLYMKLRSVTAADTAVYYCAR
Figure BDA0000413462010000614
WGHGTLVTVSS
＞3139_P23VL核苷酸序列(SEQ ID NO：157)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGACCATTAGTACTTATTTAAATTGGTATCAACAGAAATCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCGGTTTGCAAAGTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTTCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTTCTGTCAACAGAGTTACAATACTCCCCTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
＞3139_P23VL氨基酸序列(SEQ ID NO：158)
Kabat粗体，Chothia下划线
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
Figure BDA0000413462010000621
WYQQKSGKAPKLLIY
Figure BDA0000413462010000622
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFC
Figure BDA0000413462010000623
FGQGTKVEIK
3248_P18抗体(本文中也称为P18)包括如下抗体，所述抗体包括由以下的SEQ ID NO：159中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：160)和由SEQ ID NO：161中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：162)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
P18抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：AYHWs(SEQ ID NO：235)、HIFDSGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO：236)和PLGSRYYYGMDV(SEQ ID NO：237)。P18抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQSISRYLN(SEQ IDNO：238)、GASTLQN(SEQ ID NO：239)和QQSYSVPA(SEQ IDNO：240)。
P18抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GGSISA(SEQ ID NO：260)、HIFDSGSTY(SEQ ID NO：261)和PLGSRYYYGMDV(SEQ ID NO：237)。P18抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQSISRYLN(SEQ ID NO：238)、GASTLQN(SEQ ID NO：239)和QQSYSVPA(SEQ ID NO：240)。
＞3248_P18VH核苷酸序列(SEQ ID NO：159)
CAGGTGCAACTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCGGGTGGCTCCATCAGTGCTTACCACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGCAcATCTTTGACAGTGGGAGCACTTACTACAACCCCTCCCTTAAGAGTCGAGTCACCATATCACTAGACGCGTCCAAGAACCAGCTCTCCCTGAGATTGACCTCTGTGACCGCCTCAGACACGGCCATATATTACTGTGCGAGACCTCTCGGGAGTCGGTACTATTACGGAATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGC
＞3248_P18VH氨基酸序列(SEQ ID NO：160)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIS
Figure BDA0000413462010000632
WIRQPPGKGLEWIG
Figure BDA0000413462010000631
Figure BDA0000413462010000637
RVTISLDASKNQLSLRLTSVTASDTAIYYCAR
Figure BDA0000413462010000633
WGQGTTVTVSS
＞3248_P18VL核苷酸序列(SEQ ID NO：161)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCCTCCTCCCTGTCTGCATCTGTCGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGTATTAGCAGGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCCTCCACTTTGCAAAATGGGGCCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTACAACCTGAAGATTCCGCAACTTACCTCTGTCAACAGAGTTACAGTGTCCCTGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAGGTCAAA
＞3248_P18vL氨基酸序列(SEQ ID NO：162)
Kabat粗体，chothia下划线
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
Figure BDA0000413462010000635
WYQQKPGKAPKLLIY
Figure BDA0000413462010000634
GAPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYLC
Figure BDA0000413462010000636
FGGGTKVEVK
3253_P10抗体(本文中也称为P10)包括如下抗体，所述抗体包括由以下的SEQ ID NO：163中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：164)和由SEQ ID NO：165中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：166)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
P10抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：SDYWS(SEQ ID NO：187)、FFYNGGSTKYNPSLKS(SEQ ID NO：188)和HDAKFSGSYYVAS(SEQ ID NO：189)。P10抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQSISTYLN(SEQ IDNO：192)、GATDLQS(SEQ ID NO：241)和QQSYNTPLI(SEQ IDNO：194)。
P10抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GGSITS(SEQ ID NO：190)、FFYNGGSTK(SEQ ID NO：191)和HDAKFSGSYYVAS(SEQ ID NO：189)。P10抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQSISTYLN(SEQ ID NO：192)、GATDLQS(SEQ ID NO：241)和QQSYNTPLI(SEQ ID NO：194)。
＞3253_P10VH核苷酸序列(SEQ ID NO：163)
CAGGTCCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGCTGAAGCCTTCGGACACCCTGGCCCTCACTTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCACCAGTGACTACTGGAGCTGGATCCGGCAACCCCCAGGGAGGGGACTGGACTGGATCGGATTCTTCTATAACGGCGGGAGCACCAAGTACAATCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGCGGACACGTCCAAGAACCAGTTGTCCCTGAAATTGACCTCTGTGACCGCCGCAGACACGGGCGTGTATTATTGTGCGAGACATGATGCCAAATTTAGTGGGAGCTACTACGTTGCCTCCTGGGGCCAGGGAACCCGAGTCACCGTCTCGAGC
＞3253_P10VH氨基酸序列(SEQ ID NO：164)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQLQESGPGLLKPSDTLALTCTVSGGSIT
Figure BDA0000413462010000659
WIRQPPGRGLDWIG
Figure BDA00004134620100006510
Figure BDA00004134620100006511
RVTISADTSKNQLSLKLTSVTAADTGVYYCAR
Figure BDA0000413462010000658
WGQGTRVTVSS
＞3253_P10VL核苷酸序列(SEQ ID NO：165)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCCTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCTCTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCACCTATTTAAATTGGTATCACCAGCAACCTGGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTCTGGTGCAACCGACTTGCAAAGTGGGGTCCCATCTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAATACCCCCCTCATTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
＞3253_P10VL氨基酸序列(SEQ ID NO：166)
Kabat粗体，Chothia下划线
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISC
Figure BDA0000413462010000655
WYQQQPGKAPKVLIS
Figure BDA0000413462010000656
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
Figure BDA0000413462010000657
FGQGTKLEIK
3260_D19抗体(本文中也称为D19)包括如下抗体，所述抗体包括由以下的SEQ ID NO：167中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：168)和由SEQ ID NO：169中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：170)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
D19抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：DNYIN(SEQ ID NO：242)、VFYSADRTSYADSVKG(SEQ ID NO：243)和VQKSYYGMDV(SEQ ID NO：244)。D19抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQSISRYLN(SEQ ID NO：238)、GASSLQS(SEQ ID NO：211)和QQTFSIPL(SEQ ID NO：245)。
D19抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GFSVSD(SEQ ID NO：247)、VFYSADRTS(SEQ ID NO：246)和VQKSYYGMDV(SEQ ID NO：244)。D19抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQSISRYLN(SEQ ID NO：238)、GASSLQS(SEQ ID NO：211)和QQTFSIPL(SEQ ID NO：245)。
＞3260_D19VH核苷酸序列(SEQ ID NO：167)
GACATGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCCCGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGGTTTTCCGTCAGTGACAACTACATAAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGACTGGGTCTCAGTCTTTTATAGTGCTGATAGAACATCCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGCCACGATTCCAAGAACACAGTGTACCTTCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAGTTCAGAAGTCCTATTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGC
＞3260_D19VH氨基酸序列(SEQ ID NO：168)
Kabat粗体，Chothia下划线
DMQLVESGGGLVPPGGSLRLSCAASGFSVS
Figure BDA0000413462010000664
WVRQAPGKGLDWVS
Figure BDA0000413462010000661
Figure BDA0000413462010000662
RFTVSSHDSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
Figure BDA0000413462010000663
WGQGTTVTVSS
＞3260_D19VL核苷酸序列(SEQ ID NO：169)
GGCATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGATATTTAAATTGGTATCTGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTCTGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCACTGGGTCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGTTTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACTTTCAGTATCCCTCTTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
＞3260_D19VL氨基酸序列(SEQ ID NO：170)
Kabat粗体，Chothia下划线
GIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
Figure BDA0000413462010000671
WYLQKPGKAPKLLIS
Figure BDA0000413462010000672
GVPSRFSGTGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC
Figure BDA0000413462010000673
FGQGTKVEIK
3362_B11抗体(本文中也称为B11)包括如下抗体，所述抗体包括由以下的SEQ ID NO：171中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：172)和由SEQ ID NO：173中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：174)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
B11抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：SGAYYWT(SEQ ID NO：248)YIYYSGNTYYNPSLKS(SEQ IDNO：249)和AASTSVLGYGMDV(SEQ ID NO：250)。B11抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQSISRYLN(SEQID NO：238)AASSLQS(SEQ ID NO：216)和QQSYSTPLT(SEQID NO：251)。
B11抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：GDSITSGA(SEQ ID NO：252)YIYYSGNTY(SEQ ID NO：253)和AASTSVLGYGMDV(SEQ ID NO：250)。B11抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQSISRYLN(SEQ ID NO：238)、AASSLQS(SEQ ID NO：216)和QQSYSTPLT(SEQ ID NO：251)。
＞3362_B11VH核苷酸序列(SEQ ID NO：171)
CAGGTGCAGCTGCAGGCGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCAGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGACTCCATCACCAGTGGTGCTTACTACTGGACCTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAACACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCACTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGGTGAACTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGCGAGCTGCTTCGACTTCAGTGCTAGGATACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGC
＞3362_B11VH氨基酸序列(SEQ ID NO：172)
Kabat粗体，Chothia下划线
QVQLQASGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSIT
Figure BDA0000413462010000688
WIRQHPGKGLEWIG
Figure BDA0000413462010000689
Figure BDA0000413462010000683
RVTISLDTSKNQFSLKVNSVTAADTAVYYCAR
Figure BDA0000413462010000684
WGQGTTVTVSS
＞3362_B11VL核苷酸序列(SEQ ID NO：173)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGATATTTAAATTGGTATCAGCAGGAACCAGGGAAGGCCCCTAAGCTCCTGGTCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATAAGCAGTCTTCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTATAGTACCCCCCTCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA
＞3362_B11VH氨基酸序列(SEQ ID NO：174)
Kabat粗体，Chothia下划线
DIQMTQSPSSLSASGDRVTITC
Figure BDA0000413462010000685
WYQQEPGKAPKLLVY
Figure BDA0000413462010000686
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
Figure BDA0000413462010000687
FGQGTRLEIK
3242_P05抗体(本文中也称为P05)包括如下抗体，所述抗体包括由以下的SEQ ID NO：175中所示的核酸序列编码的重链可变区(SEQ ID NO：176)和由SEQ ID NO：177中所示的核酸序列编码的轻链可变区(SEQ ID NO：178)。
在以下序列中，包括由Chothia等1989定义的CDR的氨基酸是下划线的，而由Kabat等1991定义的那些是粗体突出的。
P05抗体的重链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：VSDNYIN(SEQ ID NO：254)、VFYSADRTSYAD(SEQ ID NO：256)和VQKSYYGMDV(SEQ ID NO：244)。P05抗体的轻链CDR具有以下按照Kabat定义的序列：RASQSISRYLN(SEQ ID NO：238)、GASSLQS(SEQ ID NO：211)和QQTFSIPL(SEQ ID NO：245)。
P05抗体的重链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：SGFSV(SEQ ID NO：257)、VFYSADRTS(SEQ ID NO：246)和VQKSYYGMDV(SEQ ID NO：244)。B11抗体的轻链CDR具有以下按照Chothia定义的序列：RASQSISRYLN(SEQ ID NO：238)、GASSLQS(SEQ ID NO：211)和QQTFSIPL(SEQ ID NO：245)。
＞3242_P05VH核苷酸序列(SEQ ID NO：175)
CACTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCCCGCCGGGGGGGTCCCTCAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGGTTTTCCGTCAGTGACAACTACATAAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGACTGGGTCTCAGTCTTTTATAGTGCTGATAGAACATCCTACGCAFACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGCCACGATTCCAAGAACACAGTGTACCTTCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGAGAGTTCAGAAGTCCTATTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAGC
＞3242_P05VH氨基酸序列(SEQ ID NO：176)
Kabat粗体，Chothia下划线
DMQLVESGGGLVPPGGSLRLSCAASGFS
Figure BDA0000413462010000694
WVRQAPGKGLDWVS
Figure BDA0000413462010000691
RFTVSSHDSKKTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
Figure BDA0000413462010000693
WGQGTTVTVSS
＞3242_P05VL核苷酸序列(SEQ ID NO：177)
GGCATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGATATTTAAATTGGTATCTGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTCTGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCACTGGGTCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGTTTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGACTTTCAGTATCCCTCTTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
＞3242_P05VL氨基酸序列(SEQ ID NO：178)
Kabat粗体，Chothia下划线
GIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
Figure BDA0000413462010000701
WYLQKPGKAPKLLIS
Figure BDA0000413462010000702
GVPSRFSGTGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC
Figure BDA0000413462010000703
FGQGTKVEIK
本发明的huM2e抗体还包括如下抗体，所述抗体包括与SEQID NO：44或49的氨基酸序列至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更多相同的重链可变氨基酸序列和/或与SEQ ID NO：46或52的氨基酸序列至少90％、92％、95％、97％、98％、99％或更多相同的轻链可变氨基酸。
或者，单克隆抗体是与8I10，21815，23K12，3241_G23，3244_110，3243_J07，3259_J21，3245_O19，3244_H04，3136_G05，3252_C13，3255_J06，3420_I23，3139_P23，3248_P18，3253_P10，3260_D19、3362_B11或3242_P05结合相同表位的抗体。
M2e抗体的重链源自种系V(可变)基因，如，例如，IgHV4或IgHV3种系基因。
本发明的M2e抗体包括由人IgHV4或IgHV3种系基因序列编码的可变重链(VH)区。IgHV4种系基因序列显示于，例如，登录号L10088M29812M95114X56360和M95117。IgHV3种系基因序列显示于，例如，登录号X92218X70208Z27504、M99679和AB019437。本发明的M2e抗体包括由与IgHV4或IgHV3种系基因序列至少80％同源的核酸序列编码的VH区。优选，核酸序列与IgHV4或IgHV3种系基因序列至少90％、95％、96％、97％同源，并且更优选，与IgHV4或IgHV3种系基因序列至少98％，99％同源。M2e抗体的VH区域与由IgHV4或IgHV3VH种系基因序列编码的VH区的氨基酸序列至少80％同源。优选，M2e抗体的VH区的氨基酸序列与由IgHV4或IgHV3种系基因序列编码的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％同源，并且更优选，与由IgHV4或IgHV3种系基因序列编码的序列至少98％、99％同源。
本发明的M2e抗体还包括由人IgKV1种系基因序列编码的可变轻链(VL)区。人IgKV1VL种系基因序列显示于，例如，登录号X59315、X59318、J00248和Y14865。或者，M2e抗体包括由与IgKV1种系基因序列至少80％同源的核酸序列编码的VL区。优选，核酸序列与IgKV1种系基因序列至少90％、95％、96％、97％同源，并且更优选，与IgKV1种系基因序列至少98％、99％同源。M2e抗体的VL区与由IgKV1种系基因序列编码的VL区的氨基酸序列至少80％同源。优选，M2e抗体的VL区的氨基酸序列与由IgKV1种系基因序列编码的VL区的氨基酸序列至少90％、95％、96％、97％同源，并且更优选，与由IgKV1种系基因序列编码的序列至少98％、99％同源。
除非另外限定，结合本发明使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的意思。此外，除非内容另外需要，单数术语应当包括复数，而复数术语应当包括单数。通常，结合本文中所述的细胞和组织培养、分子生物学以及蛋白质和寡-或多核苷酸化学和杂交技术所用的命名是本领域公知的且常用的那些。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。根据制造商的说明或按照本领域通常完成的或按照本文中所述的，来进行酶反应和纯化技术。除非特意表明相反，本发明的实施将使用本领域技术内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，为了说明的目的，以下将描述其中的许多内容。在文献中有这些技术的全面解释。参见，例如，Sambrook等，MolecularCloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(第2版，1989)；Maniatis等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)(1982)；DNA Cloning：A Practical Approach(DNA克隆：实践方法)，vol.I&II(D.Glover编辑)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(N.Gait编辑，1984)；Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)(B.Hames&S.Higgins编辑，1985)；Transcription and Translation(转录和翻译)(B.Hames&Higgins编辑，1984)；Animal Cell Culture(动物细胞培养)(R.Freshney编辑，1986)；Perbal，A Practical Guide toMolecular Cloning(分子克隆的实践指导)(1984)。
结合本文中所述的分析化学、合成有机化学以及机械和药物化学的实验室程序和技术使用的命名是本领域公知且常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和传送，以及病人的治疗。
以下定义用于理解本发明：
本文中所用的术语“抗体”(Ab)包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们呈现所需的生物活性。术语“免疫球蛋白”(Ig)与“抗体”在本文中可以互换使用。
“分离的抗体”是已经从其天然环境的成分分离和/或收集的抗体。其天然环境的杂质成分是干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至：(1)如通过Lowry方法测定的，高于95％重量的抗体，并且最优选高于99％重量；(2)通过使用旋杯式序列分析仪足以获得至少15个残基的N-端或内部氨基酸序列的程度；或(3)在还原或非还原条件下，使用考马斯蓝或优选银染，通过SDS-PAGE测定的同源性。由于抗体天然环境的至少一种成分不存在，分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体。然而，通常，将通过至少一个纯化步骤来制备分离的抗体。
基本的四-链抗体单位是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的杂四聚糖蛋白。IgM抗体由五个基本的杂四聚体单位与另外的称为J链的多肽组成，并且因此，含有十个抗原结合位点，同时分泌的IgA抗体可以聚合形成包含2-5个基本的4-链单位连同J链的多价聚集体。在IgG的情况中，4-链单位通常为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键连接H链，而两个H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键彼此连接。每个H和L链通常还具有隔开的链内二硫桥。对于α和γ链的每一种，每个H链在N-端具有可变结构域(VH)，接着是三个恒定结构域(CH)，对于u和ε同种型，是四个CH结构域。每个L链在N-端具有可变结构域(VL)，接着在其另一端是恒定结构域(CL)。VL与VH结合，而CL与重链的第一个恒定结构域结合(CH1)。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL一起配对形成单个抗原结合位点。对于不同类别的抗体的结构和特性，参见，例如，Basic and ClinicalImmunology，第8版，Daniel P.Stites，Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(编辑)，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.1994，第71页，和第6章。
来自任何脊椎动物物种的L链可以分配给两种明显不同类型中的一种，基于它们恒定结构域(CL)的氨基酸序列，称为kappa(κ)和lambda(λ)。根据其重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分配给不同的类别或同种型。存在五个类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，各自具有称为alpha(α)、delta(σ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)的重链。基于CH序列和功能中相对次要的差异，将γ和α类别进一步分成亚类，例如，人表达一些亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变的”指的是V结构域的特定区段的序列在抗体之间有很大程度上的不同。V结构域介导抗原结合并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变结构域的110个氨基酸跨度中不是均匀分布的。替代地，V区由相对不变的由较短的非常可变的各自9-12个氨基酸长的称为“超变区”的区域隔开的15-30个氨基酸的称为框架区(FR)的链组成。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，大部分采用了β-层构象，通过三个超变区连接，所述超变区形成环连接，并且在一些情况中，形成β-层的一部分。每个链中的超变区通过FR非常紧密地结合在一起，并且与来自其他链的超变区结合在一起，引起抗体的抗原结合位点的形成(参见，Kabat等，Sequence of Proteins ofImmunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。恒定结构域没有直接涉及抗体与抗原的结合，但呈现出各种效应物功能，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中的抗体参与。
在本文中使用时，术语“超变区”指的是抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。超变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，根据Kabat编号系统编号时，VL中大约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)周围，以及VH中大约残基31-35(Hi)、50-65(H2)和95-102(H3)周围；Kabat等，Sequence of Proteins of Immunological Interest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，第5版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))；和/或来自“超变环”的那些残基(例如，根据Chothia编号系统编号时，VL中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及VH中的26-32(H1)、52-56(H2)和951-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mo1.Bio1.196：901-917(1987))；和/或来自“超变环”/CDR的那些残基(例如，根据IMGT编号系统编号时，VL中的残基27-38(L1)、56-65(L2)和105-120(L3)，以及VH中的27-38(H1)、56-65(H2)和105-120(H3)；Lefranc，M.P.等，Nucl.Acids Res.27：209-212(1999)，Ruiz，M.等，Nucl.Acids Res.28：219-221(2000))。任选，根据AHo编号时，抗体在以下的一个或多个点具有对称插入：VL中的28、36(L1)、63、74-75(L2)和123(L3)，以及VH中的28、36(H1)、63、74-75(H2)和123(H3)；Honneger，A.和Plunkthun，A.J.Mo1.Bio1.309：657-670(2001))。
“种系核酸残基”意思是在编码恒定或可变区的种系基因中天然产生的核酸残基。“种系基因”是在生殖细胞(即，注定变成卵子或精子中的细胞)中发现的DNA。“种系突变”指的是在单细胞阶段的种系细胞或受精卵中产生的特定DNA中的可遗传变化，以及传递给后代时，将这样的突变引入身体的每个细胞中。种系突变与体细胞突变相对，体细胞突变是在单个体细胞中获得的突变。在一些情况中，用不同的核苷酸突变(即，体细胞突变)和替代编码可变区的种系DNA序列中的核苷酸。
本文中使用的术语“单克隆抗体”指的是获自基本上同源的抗体群的抗体，即，包含单个抗体的群相同，除了可能少量存在的天然产生的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相对，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性，单克隆抗体是有利的，因为它们可以不受其他抗体污染而合成。修饰词“单克隆”不是解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，本发明中有用的单克隆抗体可以通过Kohler等第一个描述的杂交瘤方法来制备，Nature，256：495(1975)，或可以使用细菌、真核动物或植物细胞中的重组DNA方法(参见，例如，U.S.专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可以从噬菌体抗体文库分离，例如，使用Clackson等，Nature，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Bio1.，222：581-597(1991)中所述的技术。
本文中的单克隆看题包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与源自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要它们呈现出所需的生物活性(参见，U.S.专利No.4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984))。本发明提供了源自人抗体的可变结构域抗原结合序列。因此，本文中主要的感兴趣的嵌合抗体包括具有一个或多个人抗原结合序列(例如，CDR)的抗体和含有一个或多个源自非人抗体的序列(例如，FR或C区序列)的抗体。此外，本文中主要的感兴趣的嵌合抗体包括具有一个抗体类别或亚类的人可变结构域抗原结合序列和源自另一个抗体类别或亚类的另一个序列(例如，FR或C区序列)的那些。本文中感兴趣的嵌合抗体还包括含有涉及本文中所述那些的或源自不同物种(如，非人灵长类(例如，Old World Monkey、猿等))的可变结构域抗原结合序列的那些。嵌合抗体还包括灵长类化和人源化抗体。
此外，嵌合抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰来进一步改善抗体性能。对于更多的详细内容，参见Jones等，Nature321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
“人源化抗体”通常认为是具有一个或多个引入其中的来自非人来源的残基的人抗体。这些非人氨基酸残基常常被称为“输入”残基，其通常获自“输出”可变结构域。传统上按照Winter和同事的方法进行人源化(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))，通过将输入的超变区取代相应的人抗体序列。因此，这样的“人源化”抗体是嵌合抗体(U.S.专利No.4,816,567)，其中基本上小于完整人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列取代。
“人抗体”是只含有存在于人天然产生的抗体中的序列的抗体。然而，如本文中所用的，人抗体可以包含在天然产生的人抗体中未发现的残基或修饰，包括本文中所述的那些修饰和变体序列。通常进行这些来进一步改善或增强抗体性能。
“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选，完整抗体具有一个或多个效应物功能。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；二抗；直链抗体(参见，U.S.专利No.5,641，870；Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
短语抗体的“功能性片段或类似物”是具有与全长抗体一样的定性生物活性的化合物。例如，抗-IgE抗体的功能性片段或类似物可以是结合IgE免疫球蛋白的片段或类似物，以这种方式使得防止或实质性地降低这些分子结合高亲和性受体FcεRI的能力。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，以及残余的“Fc”片段，这是容易反映出结晶能力的名称。Fab片段由完整的L链连同H链的可变区结构域(VH)和一个重链的第一个恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段相对于抗原结合是单价的，即，其具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大的F(ab’)2片段，其大致对应于两个二硫化物连接的具有二价抗原结合活性的Fab片段，并且其仍然能够与抗原交联。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基端具有另外几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab’-SH是在此对其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab’的名称。F(ab’)2抗体片段最初是作为在其间具有交联半胱氨酸的Fab’段对。抗体片段的其他化学耦合也是已知的。
“Fc”片段包含通过二硫化物结合在一起的两条H链的羧基端部分。通过Fc区域中的序列测定抗体的效应物功能，该区域也是通过特定类型细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠发散出六个超变环(各自从H和L链发散出三个环)，其贡献用于抗原结合的氨基酸残基并且给药对抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或只包含三个抗原特异性CDR的Fv的一半)具有识别并结合抗原的能力，尽管亲和性低于完整的结合位点。
“单链Fv”也是“sFv”或“scFv”的缩写，是包含连接成单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选，sFv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含多肽连接物，这能够使得sFv形成用于抗原结合的所需结构。对于sFv的综述，参见Pluckthun的The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学)，vol.113，Rosenburg and Moore编辑，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994)；Borrebaeck1995，下文。
术语“二抗”指的是通过构建在VH和VL结构域之间具有较短连接物(约5-10个残基)的sFv片段制得的小抗体片段，使得获得链间但不是链内的V结构域配对，形成二价片段，即，具有两个抗原结合位点的片段。双特异性抗体是两个“杂交”sFv片段的杂二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。二抗更全面地描述于例如EP404,097；WO93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)中。
如本文中所用的，“内在化的”抗体是结合哺乳动物细胞上的抗原(例如，细胞表面多肽或受体)时被细胞吸收(即，进入)的抗体。内在化抗体当然将包括抗体片段、人或嵌合抗体和抗体偶联物。对于特定的治疗应用，考虑体内内在化。内在化的抗体分子的数量将是充分的或适当的，以杀灭细胞或抑制其生长，尤其是感染的细胞。根据抗体或抗体偶联物的功效，在一些情况中，单个抗体分子吸收至细胞中足以杀灭抗体结合的目标细胞。例如，特定的毒素在杀灭中是高效的，使得偶联至抗体的毒素的一个分子的内在化足以杀灭感染的细胞。
如本文中所用的，如果以可检测的水平与抗原反应，优选具有高于或等于约104M-1的亲和性常数Ka，或高于或等于约105M-1，高于或等于约106M-1，高于或等于约107M-1，或高于或等于108M-1，那么将抗原称为“免疫特异性的”、“对抗原特异性的”或“特异性结合抗原”。抗体对其同族抗原的亲和性通常也表示为解离常数KD，并且在特定的实施方案中，如果HuM2e抗体以低于或等于10-4M，低于或等于约10-5M，低于或等于约10-6M，低于或等于约10-7M，或低于或等于10-8M的KD结合，则HuM2e抗体特异性地结合M2e。可以使用常规技术，例如，Scarchard等所述的那些(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA51：660(1949))，容易地测定抗体的亲和性。
通常可以使用免疫检测方法，包括，例如，基于免疫荧光的试验，如免疫-组织化学(IHC)和/或荧光激活细胞分选(FACS)，来测定和评价抗体对抗原、细胞或其组织的结合特性。
具有所设计抗体的“生物特征”的抗体是具有一个或多个将其与其他抗体区分开来的抗体生物特征的抗体。例如，在特定的实施方案中，具有所设计抗体的生物特征的抗体将结合所设计抗体结合的相同表位和/或具有与所涉及抗体共同的效应物功能。
术语“拮抗剂”抗体以最宽泛的意思来使用，并且包括部分或全部阻断、抑制或中和与其特异性结合的表位、多肽或细胞的生物活性的抗体。用于鉴定拮抗剂抗体的方法可以包括将候选拮抗剂抗体特异性结合的多肽或细胞与候选拮抗剂抗体接触并测量通常与多肽或细胞相关的一个或多个生物活性的可检测变化。
“抑制感染细胞生长的抗体”或“生长抑制抗体”是结合表达或能够表达M2e表位的感染细胞并且通过抗体结合导致所述细胞可测量的生长抑制的抗体。与合适的对照相比，优选的生长抑制抗体抑制感染细胞的生长高于20％，优选约20％至约50％。乃至更优选，高于50％(例如，约50％至约100％)，对照通常是未用待测试抗体处理的感染细胞。可以在细胞培养物中的约0.1至30μg/ml或约0.5nM至200nM抗体浓度下测量生长抑制，其中在感染细胞暴露于抗体后1-10天测定生长抑制。可以以本领域抑制的各种方式来测定体内感染细胞的生长抑制。如果以约1ug/kg至约100mg/kg体重给药抗体导致在第一次给药抗体的约5天至3个月内(优选约5至30天内)感染细胞的百分比或感染细胞的总数降低，则该抗体是体内生长抑制的。
“诱导凋亡”的抗体是诱导程序性细胞死亡的抗体，如通过模联蛋白V的结合、DNA的片段化、细胞收缩、内质网的扩张、细胞片段化和/或膜囊(称为凋亡体)的形成来测定。优选，细胞是感染细胞。各种方法可用于评价与凋亡相关的细胞事件。例如，可以通过模联蛋白结合来测量磷脂酰丝氨酸(PS)迁移；可以通过DNA阶梯评价DNA片段化；和可以通过二倍体细胞的任何增加来评价核/染色质缩合连同DNA片段化。优选，诱导凋亡的抗体是模联蛋白结合试验中，相对于未处理细胞，导致约2至50倍，优选约5至50倍，并且最优选约10至50倍的模联蛋白结合诱导。
抗体“效应物功能”指的是可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性，并且随着抗体同种型而改变。抗体效应物功能的实例包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞激活。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指的是其中特定细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的结合Fc受体(FcR)的分泌Ig能够使这些细胞毒性效应物细胞特异性地结合带有抗原的目标细胞并且随后用细胞毒素杀灭目标细胞的细胞毒性形式。抗体“装备(arm)”细胞毒性细胞，并且是这样的杀灭需要的。用于介导ADCC的初级细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概括于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9：457-92(1991)的第464页的表3中。为了测定目标分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC试验，如U.S.专利No.5,500,362或U.S.专利No.5,821,337中所述的。用于这些试验的有用效应物细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替换地，或另外地，目标分子的ADCC活性可以在体内测定，例如，在动物模型中，如Clynes等，PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的。
“Fc受体”或“FcR”描述了结合抗体的Fc区的受体。在特定的实施方案中，FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)的FcR，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体，并且可替换地，这些受体的剪接形式。FCγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有相似的氨基酸序列，主要在其胞质结构域中不同。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见，综述M.的Daeron，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR综述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9：457-92(1991)；Capel等，Immunomethods4：25-34(1994)；和de Hass等，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。其他FcR，包括将来鉴定的那些，包括在本文中的术语“FcR”中。术语该包括新生儿受体，FcRn，其负责母体IgG转移至胎儿中(Guyer等，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等，J.Immunol.24：249(1994))。
“人效应物细胞”是表达一种或多种FcR的白细胞，并且进行效应物功能。优选，细胞至少表达FcγRIII并且进行ADCC效应物功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括PBMC、NK细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；PBMC和NK细胞是优选的。效应物细胞可以从天然来源分离，例如，从血液分离。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指的是在补体存在下目标细胞的溶解。传统补体途径的激活通过补体系统的第一种成分(Clq)与(合适亚类的)抗体的结合来启动，所述抗体结合其同族抗原。为了评价补体激活，可以进行CDC实验，例如，如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202：163(1996)中所述的。
术语“A型流行性感冒”和“A型流行性感冒病毒”指的是病毒的正粘病毒科的属。A型流行性感冒只包括一个种：A型流行性感冒病毒，其引起乌类、人、猪和马的流行性感冒。A型流行性感冒病毒的所有亚型的菌株已经从野生乌类分离出来，尽管疾病是不共有的。A型流行性感冒病毒的一些分离物在家禽和罕见地在人体中都引起严重的疾病。
对于治疗感染的目的，“哺乳动物”指的是任何哺乳动物，包括人、家养和农场动物，已经动物园、运动或宠物动物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔子等。优选，哺乳动物是人。
“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“缓解”指的是治疗性处理和预防性或防范性措施；其中目的是防止或减缓(减少)针对的病理状况或失调。需要治疗的那些包括已经患有疾病的那些，以及易于患有疾病的那些或疾病待防止的那些。如果在接受治疗量的根据本发明方法的抗体后，病人显示出以下的一种或多种状况的可观察和/或可测量的减轻或不存在，则患者或哺乳动物得到成功“治疗”：感染细胞数量的减少或感染细胞不存在；感染的总细胞的百分比降低；和/或一种或多种与特定感染相关症状减轻至一定程度；降低的发病率和死亡率，以及生活质量的改善。通过医师熟知的常规程序可以容易地测量以上用于评价疾病的成功治疗和改善的参数。
术语“治疗有效量”指的是有效“治疗”患者或哺乳动物疾病或失调的抗体或药物的含量。参见之前的“治疗”定义。
“慢性”给药指的是与急性方式相对的，以连续方式给药药剂，使得将最初的治疗效果(活性)维持延长的时间段。“间歇性”给药是没有间断地不连续进行的治疗，而本质上是周期性的。
“结合”一种或多种其他治疗剂的给药包括同时(伴随)和以任何顺序的连续给药。
本文中所用的“载体”包括在所用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒的药物学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。通常，生理学上可接受的载体是含水pH缓冲液。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(低于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
本文中所用的术语“细胞毒性剂”指的是抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。术语用来包括放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂(例如，氨甲喋呤、阿霉素、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、亚德里亚霉素、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)、酶及其片段(如，核水解酶)、抗生素和毒素(如，细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体)，以及以下公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。以下描述了其他细胞毒性剂。
用于本文中时，“生长抑制剂”指的是在体外或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期进展的制剂，如诱导G1停止和M-期停止的制剂。经典的M-期阻断剂包括长春花生物碱(长春新碱、长春瑞滨和长春花碱)、紫杉烷和拓扑异构酶II抑制剂，如亚德里亚霉素、表柔比星、柔红霉素、依托泊苷和博来霉素。停止G1的那些制剂还延伸至S-期停止，例如，DNA烷化剂，如他莫昔芬、泼尼松、氮烯唑胺、氮芥、顺铂、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。更多的信息可以在The Molecular Basis of Cancer(癌症的分子基础)，Mendelsohn和Israel编辑，第1章，标题“Cell cycle regulation，oncogenes，andantineoplastic drugs(细胞周期调控、致癌基因和抗肿瘤药物)”，Murakami等(W B Saunders：Philadelphia，1995)，尤其是p.13中找到。紫杉烷(paciltaxel和多西他奇(docetaxel))都是产自紫杉树的抗癌药。多西他奇(TAXOTERETM，Rhone-Poulene Rorer)，源自欧洲紫杉，是paclitaxel(
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Bristo1-Myers Squibb)的半合成类似物。Paclitaxel和多西他奇促进微管从微管蛋白二聚体的装配并且通过防止解聚作用稳定微管蛋白，解聚作用导致细胞中有丝分裂的抑制。
本文中所用的“标记”指的是直接或间接偶联抗体的可检测化合物或组合物，使得产生“标记的”抗体。标记可以自身是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶标记的情况中，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
本文中所用的术语“标记的表位”指的是包含融合至“标记多肽”的多肽的嵌合多肽。标记多肽具有足够的残基来提供相对其可以制得抗体的表位，但也足够短，使得没有干扰与其融合的多肽的活性。标记多肽还优选相当独特，使得抗体基本上没有与其他表位交叉反应。合适的标记多肽通常具有至少六个氨基酸残基，并且通常为约8至50个氨基酸残基(优选，约10至20个氨基酸残基)。
“小分子”在本文中限定为具有低于约500道尔顿的分子量。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用，表示单-或双-链RNA、DNA或混合聚合物。多核苷酸可以包括基因组序列、基因组外和质粒序列，以及表达或可以适应于表达多肽的较小工程化基因区段。
“分离的核酸”是基本上与其他基因组DNA序列以及天然伴随天然序列的蛋白或复合物(如，核糖体和聚合酶)分离的核酸。术语包括已经从其天然产生环境中取出的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA分离物以及化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。基本上纯的核酸包括核酸的分离形式。当然，这指的是最初分离的核酸并且没有排除之后通过人工加入分离的核酸中的基因或序列。
术语“多肽”以其常规意思来使用，即，作为氨基酸的序列。多肽不限于产物的特定长度。肽、寡肽和蛋白包括在多肽的定义内，并且这些术语在本文中可以互换使用，除非另外具体表示。该术语没有表示或排除了多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的其他修饰，天然产生的和非天然产生的。多肽可以是完整的蛋白，或其子序列。本发明内容中特定的目标多肽是包含CDR并且能够结合抗原或A型流行性感冒感染细胞的氨基酸子序列。
“分离的多肽”是已经从其天然环境的成分中鉴定和分离和/或收集的多肽。在优选的实施方案中，分离的多肽将纯化至(1)如通过Lowry方法测定的，高于95％重量的多肽，并且最优选高于99％重量，(2)通过使用旋杯式序列分析仪足以获得至少15个残基的N-端或内部氨基酸序列的程度，或(3)在还原或非还原条件下，使用考马斯蓝或优选银染，通过SDS-PAGE测定的同源性。由于多肽天然环境的至少一种成分将不存在，分离的多肽包括在重组细胞内的原位多肽。然而，通常，将通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。
“天然序列”多核苷酸是与源自自然界的多核苷酸具有相同核苷酸序列的多核苷酸。“天然序列”多肽是具有与源自自然界(例如，来自任何物种)的多肽(例如，抗体)具有相同氨基酸序列的多肽。这样的天然序列多核苷酸和多肽可以分离自自然界或可以通过重组或合成方式产生。
如本文中所用的术语多核苷酸“变体”是通常与本文中具体公开的多核苷酸有一个或多个取代、删除、添加和/或插入不同的多核苷酸。这样的变体可以是天然产生的或可以合成产生，例如，通过修饰一个或多个本发明的多核苷酸序列并且评价本文中所述的编码多肽的一个或多个生物活性和/或使用本领域公知的多种技术中的任一种。
如本文中所用的术语多肽“变体”是通常与本文中具体公开的多肽有一个或多个取代、删除、添加和/或插入不同的多肽。这样的变体可以是天然产生的或可以是合成产生的，例如，通过修饰一个或多个以上的本发明多肽序列并且评价本文中所述的多肽的一个或多个生物活性和/或使用本领域公知的多种技术中的任一种。
可以在本发明的多核苷酸和多肽的结构中形成修饰并且仍然获得编码具有所需特征的变体或衍生多肽的功能性分子。希望改变多肽的氨基酸序列来形成等价物，乃至本发明多肽的提高的变体或一部分时，本领域技术人员通常将改变编码DNA序列的一个或多个密码子。
例如，可以在蛋白结构中将特定的氨基酸替代其他氨基酸，而没有可察觉的结合其他多肽(例如，抗原)或细胞的能力的丢失。由于限定蛋白生物功能活性的蛋白的结合能力和性质，可以在蛋白序列中形成特定的氨基酸序列取代，并且当然，其基础的DNA编码序列，并且无论如何获得了具有类似特性的蛋白。因此考虑了在所公开组成的肽序列或编码所述肽的相应DNA序列中可以形成各种改变，而没有可察觉的生物实用性或活性的丢失。
在许多情况中，多肽变体将含有一个或多个保守取代。“保守取代”是其中氨基酸取代另一个具有相似特性的氨基酸的取代，使得肽化学领域的技术人员将预期多肽的二级结构和亲水性质基本上未改变。
在形成这样的改变中，考虑了氨基酸的亲水指数。本领域中通常理解亲水性氨基酸指数在给药蛋白交互式生物功能中的重要性(Kyte和Doolittle，1982)。公认氨基酸的相关亲水性特征有助于所得到蛋白的二级结构，其随后限定了蛋白与其他分子的相互作用，所述其他分子如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等。基于其疏水性和电荷特征，每个氨基酸已经分配了亲水指数(Kyte和Doolittle，1982)。这些值是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸盐(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸盐(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域已知特定的氨基酸可以被具有相似的亲水指数或评分的其他氨基酸取代，并且仍然获得具有相似生物活性的蛋白，即，仍然获得生物功能上相等的蛋白。在形成这样的变化中，亲水指数在±2以内的氨基酸的取代是优选的，在±1以内的特别优选，而在±0.5以内的那些更是特别优选。本领域还理解基于亲水性可以有效地进行类似氨基酸的取代。U.S.专利4,554,101描述了蛋白的最大局部平均亲水性，如通过其邻近氨基酸的亲水性控制的，与蛋白的生物特性相关。
如U.S.专利4,554,101中详细记载的，将以下的亲水性值分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸盐(+3.0±1)；谷氨酸盐(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。理解氨基酸可以取代具有相似亲水性值的其他氨基酸，并且仍然获得生物等价体，并且特别地，免疫等价蛋白。在这样的变化中，亲水性值在±2以内的氨基酸的取代是优选的，在±1以内的那些特别优选，而在±0.5以内的那些更是特别优选。
如以上所列出的，因此氨基酸取代通常具有氨基酸侧链取代基的相关相似性，例如，疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑之前各种特征的示例性取代是本领域技术人员公知的，并且包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性来进一步地进行氨基酸取代。例如，负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的带有不带电极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；谷氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以表示保守性改变的氨基酸的其他基团包括：(1)ala、pro、gly、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。变体还可以或替换地含有非保守性改变。在优选的实施方案中，变体多肽与天然序列有五个氨基酸或更少氨基酸的取代、删除或添加的不同。还可以(或替换地)通过例如删除或添加对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性具有最小影响的氨基酸来改变变体。
多肽可以在蛋白的N-端包含信号(或前导)系列，其与翻译一起或在翻译后指导蛋白的转移。多肽还可以与连接物或其他序列偶联，使多肽易于合成、纯化或鉴定(例如，poly-His)或增强多肽与固体支持物的结合。例如，多肽可以与免疫球蛋白Fc区偶联。
比较多核苷酸和多肽序列时，如以下所述的，为最大一致性比对时，如果两个序列中的核苷酸或氨基酸的序列相同，则称两个序列是“相同的”。两个序列之间的比较通常通过在比较窗口比较序列来进行，以鉴定和比较局部区域的序列相似性。如本文中所用的“比较窗口”指的是至少约20个连续位置的区段，通常30至约75个，40至约50个，其中在两个序列最佳比对后可以将序列与相同数量的连续位置的参考序列相比较。
可以使用生物信息学软件的Lasergene套(DNASTAR，Inc.，Madlson，WI)中的Megalign程序，使用缺省参数，来进行用于比较的序列的最佳比对。该程序收录了以下参考文献中描述的几个比对方案：Dayhoff，M.O.(1978)A model of evolutionary changein proteins-Matrices for detecting distant relationships(蛋白中的进化改变的模型).In Dayhoff，M.O.(编辑)Atlas of ProteinSequence and Structure(蛋白序列和结构图册)，NationalBiomedical Research Foundation(国家生物药学研究基础)，Washington DC Vol.5，Suppl.3，PP.345-358；Hein J.(1990)Unified Approach to Alignment and Phylogenes(比对和系统发育的统一方法)，pp.626-645Methods in Enzymology vol.183，Academic Press，Inc.，San Diego，CA；Higgins，D.G.and Sharp，P.M.(1989)CABIOS5：151-153；Myers，E.W.and Muller W.(1988)CABIOS4：11-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor11：105；Santou，N.Nes，M.(1987)Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath，P.H.A.and Sokal，R.R.(1973)Numerical Taxonomy-the Principlesand Practice of Numerical Taxonomy(数值分类学-数值分类学原理和实践)，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.andLipman，D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.，Sci.USA80：726-730。
或者，可以通过Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math2：482的局部同一性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同一性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444的搜寻相似性方法，通过这些算法的计算化执行(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575Science Dr.，Madison，WI)或通过观察，来进行用于比较的序列的最佳比对。
适用于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个优选实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等(1977)Nucl.Acids Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。例如，可以使用本文中所述的参数，将BLAST和BLAST2.0用于测定本发明的多核苷酸和多肽的百分比序列同一性。用于进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)是公众可获得的。
在一个说明性的实例中，对于核苷酸序列，可以使用参数M(对于一对相配残基的奖励得分；通常＞0)和N(对于错配残基的惩罚得分；通常＜0)来计算累积的得分。当：累积比对得分从其最大的获得值下跌X量；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分为零或更低；或达到任一个序列末端时；停止每个方向的字目标(word hit)的延伸。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。按照缺省的11字长(W)和10的预期(E)，来使用BLASTN程序(用于核苷酸序列)，以及BLOSUM62评分矩阵(参见，Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)比对，50的(B)，10的预期(E)，M＝5，N＝-4和两条链的比较。
对于氨基酸序列，评分矩阵可以用于计算累积得分。当：累积比对得分从其最大的获得值下跌X量；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分为零或更低；或达到任一个序列末端时；停止每个方向的字目标(word hit)的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。
在一个方法中，通过在至少20个位置的比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性的百分比”，其中为了两个序列的最佳比对，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分与参考序列(其不含添加或删除)相比，可以包含20％或更低的添加或删除(即，缺口)，通常5至15％，或10至12％。通过以下方法来计算百分比：确定两个序列中产生的核酸碱基或氨基酸残基相同的位置数，以产生相配位置数，将相配位置数除以参考序列中的总位置数(即，窗口大小)，再将结果乘以100，以产生序列同一性百分比。
“同源性”指的是比对序列和引入缺口(如果需要)来获得最大百分比同源性后多核苷酸或多肽序列变体中与非变体序列相同的残基的百分比。在特定的实施方案中，多核苷酸和多肽变体与本文中所述的多核苷酸或多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％多核苷酸或多肽同源性。
“载体”包括穿梭和表达载体。通常，质粒构建体还将包括复制起点(例如，ColE1复制起点)和选择标记(例如，氨苄青霉素或四环素抗性)，分别用于细菌中的质粒复制和选择。“表达载体”指的是含有必需控制序列或调控元件的载体，用于在细菌或真核细胞中表达包括本发明抗体片段的抗体。以下将公开合适的载体。
如本说明书和所附权利要求中所用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指代物，除非文中另外清楚指出。
本发明包括含有本发明多肽的HuM2e抗体，所述多肽包括由实施例1中所列的多核苷酸序列编码的那些片段以及实施例1和2中所示的氨基酸序列，及其片段和变体。在一个实施方案中，抗体是本文中命名为8i10，21B15，23K12，3241_G23，3244_I10，3243_J07，3259_J21，3245_O19，3244_H04，3136_G05，3252_C13，3255_J06，3420_I23，3139_P23，3248_P18，3253_P10，3260_D19，3362_B11或3242_P05的抗体。与相同细胞类型的未感染的对照细胞相比，这些抗体择优结合或特异性地结合A型流行性感冒感染的细胞。
在特定的实施方案中，本发明的抗体结合M2蛋白。在特定的实施方案中，本发明提供了结合只存在于天然构象中(即，在细胞中表达的)的M2e内的表位的HuM2e抗体。在特定的实施方案中，这些抗体不能特异性地结合分离的M2e多肽，例如，23个氨基酸残基的M2e片段。理解这些抗体识别M2肽的非线性(即，构象)表位。
M2蛋白内的(特别是M2e内的)这些特定构象表位，可以用作疫苗，来防止患者体内产生流行性感冒感染。
本领域技术人员将理解，本文中的抗体及其制备和使用方法的概述也适用于单独的抗体多肽成分和抗体片段。
本发明的抗体可以是多克隆或单克隆抗体。然而，在优选的实施方案中，它们是单克隆的。在特定的实施方案中，本发明的抗体是全人抗体。生产多克隆和单克隆抗体的方法是本领域已知的，并且通常描述于，例如，U.S.专利No.6,824,780中。通常，如以下进一步描述的，使用本领域可获得的载体和方法，重组产生本发明的抗体。也可以通过体外激活的B细胞来产生人抗体(参见，U.S.专利No.5,567,610和5,229,275)。
还在能够在内源性免疫球蛋白产生不存在下产生全套(repertoire)人抗体的转基因动物(例如，小鼠)中生产人抗体。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源性抗体产生的完全抑制。人种系免疫球蛋白基因矩阵转移至这样的种系突变小鼠中导致抗原激发时产生人抗体。参见，例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.，7：33(1993)；U.S.专利No.5,545，806，5,569,825，5,591，669(全部都是GenPharm)；U.S.Pat.No.5,545,807和WO97/17852。这样的动物可以遗传工程化来产生包含本发明多肽的人抗体。
在特定的实施方案中，本发明的抗体是包含源自人和非人两个来源的序列的嵌合抗体。在特定的实施方案中，将这些抗体人源化或灵长类化TM。实际上，人源化抗体通常是其中一些超变区残基以及可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代的人抗体。
在本发明的内容中，嵌合抗体还包括全人抗体，其中保留了人超变区或一个或多个CDR，但一个或多个其他序列区已经被来自非人动物的相应序列取代。
打算将抗体用于人治疗用途时，用于制备嵌合抗体中的轻链和重链的非人序列的选择对于降低抗原性和人抗非人抗体应答是重要的。更重要的是嵌合抗体保持对抗原的高结合亲和性和其他有利生物特性。为了实现这一目标，根据优选的方法，使用亲本人和非人序列的三维模型，通过亲本序列和各种概念嵌合产物的分析方法，来制备嵌合抗体。三维免疫球蛋白模型是常用的，并且是本领域技术人员熟悉的。可以使用计算机程序，其说明和展示了选定的候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构。这些展示的观察可以分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体和输出序列选择FR残基并结合，使得获得所需的抗体特征，如提高的对目标抗原的亲和性。通常，超变区残基直接并且最显著地涉及影响抗原结合。
如上所述，抗体(或免疫球蛋白)可以根据重链恒定区中的氨基酸序列的差异分成五个不同的类别。给定类别中的所有免疫球蛋白具有非常相似的重链恒定区。可以通过序列研究或更常见地通过血清学方法(例如，通过使用针对这些差异的抗体)来检测这些差异。本发明的抗体或其片段可以是任何类别的，并且因此可以具有γ、μ、α、σ或ε重链。γ链可以是γ1、γ1、γ3或γ4；而α链可以是α1或α2。
在优选的实施方案中，本发明的抗体或其片段是IgG。认为IgG是最多用途的免疫球蛋白，因为它能够进行免疫球蛋白分子的所有功能。IgG是血清中的主要Ig，并且是穿过胎盘的唯一Ig类别。IgG还固定补体，尽管IgG4亚类没有。巨噬细胞、单核细胞、PMN和一些淋巴细胞具有用于IgG Fc区的Fc受体。不是所有的亚类能结合地同样好：IgG2和IgG4不结合Fc受体。结合PMN、单核细胞和巨噬细胞上的Fc受体的结果是细胞现在可以更好地内在化抗原。IgG是增强吞噬作用的调理素。IgG与其他细胞类型上的Fc受体的结合导致其他功能的激活。本发明的抗体可以是任何IgG亚类。
在另一个优选的实施方案中，本发明的抗体及其片段是IgE。IgE是最少见的血清Ig，因为其非常紧密地结合嗜碱细胞和肥大细胞上的Fc受体，即使在与抗原相互作用之前。作为结合嗜碱细胞和肥大细胞的结果，IgE涉及过敏反应。过敏原与细胞上的IgE的结合导致各种药理学介质的释放，这导致过敏症状。IgE还在寄生的蠕虫疾病中起作用。嗜酸性粒细胞具有用于IgE的Fc受体，并且嗜酸性粒细胞与IgE覆盖的蠕虫的结合导致寄生虫的杀灭。IgE不固定补体。
在各种实施方案中，本发明的抗体及其片段包含是κ或λ的可变轻链。λ链可以是任何亚型，包括，例如λ1、λ2、λ3和λ4。
如上所述，本发明进一步提供了包含本发明多肽的抗体片段。在特定的情况中，存在使用抗体片段而不是整个抗体的优势。例如，片段较小的尺寸允许快速清除，并且可以导致提高的进入特定的组织中，如实体肿瘤。抗体片段的实例包括：Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；二抗；线性抗体；单链抗体；和从抗体片段形成的多特异性抗体。
已经研发了各种技术来生产抗体片段。传统上，通过完整抗体的蛋白水解消化来产生这些片段(参见，例如，Morimoto等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods24：107-117(1992)；和Brennan等，Science，229：81(1985))。然而，现在可以通过重组宿主细胞直接产生这些片段。Fab、Fv和ScFv抗体片段全部可以在大肠杆菌中表达并分泌出来，因此使得可以容易地大量生产这些片段。可以从大肠杆菌直接收集Fab’-SH片段，并且化学偶联，以形成F(ab’)2片段(Carter等，Bio/Technology10：163-167(1992))。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab’)2片段。U.S.专利No.5,869,046中描述了包含补救受体结合表位残基的具有提高的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段。用于生产抗体片段的其他技术是本领域技术人员清楚的。
在其他实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；U.S.专利No.5,571,894和5,587,458。Fv和sFv是唯一没有恒定区的具有完整结合位点的类型。因此，它们适于在体内使用过程中降低的非特异性结合。可以构建sFv融合蛋白，以在sFv的氨基或羧基端产生效应物蛋白的融合体。参见，Antibody Engineering(抗体工程化)，编辑Borrebaeck，上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，U.S.专利No.5,641,870中所述的。这样的线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。
在特定的实施方案中，本发明的抗体是双特异性的或多特异性的。双特异性抗体是对于至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可以结合单个抗原的两个不同表位。其他这样的抗体可以结合第一个抗原结合位点和用于第二个抗原的结合位点。或者，抗-M2e臂可以与结合白细胞上的触发分子的臂结合，所述触发分子如T-细胞受体分子(例如，CD3)或用于IgG的Fc受体(FcγR)，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，以将ibao防御机制聚焦和定位于感染的细胞。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位于感染的细胞。这些抗体具有M2e-结合臂和结合细胞毒性剂(例如，皂素、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒素A链、氨甲喋呤或放射性同位素半抗原)的臂。可以按照全长抗体或抗体片段来制备双特异性抗体(例如，F(ab’)2双特异性抗体)。WO96/16673描述了双特异性抗-ErbB2/抗-FcγRIII抗体和U.S.专利No.5,837,234公开了双特异性抗-ErbB2/抗-FcγRI抗体。双特异性抗-ErbB2/Fcα抗体显示于WO98/02463中。U.S.专利No.5,821,337教导了一种双特异性抗-ErbB2/抗-CD3抗体。
用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共同表达，其中两个链具有不同的特异性(Millstein等，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机搭配，这些杂交瘤(quadromas)产生潜在的十个不同抗体分子的混合物，其中只有一个具有正确的双特异性结构。正确分子的纯化，通常通过亲和性色谱步骤来进行，是相当麻烦的，并且产物产量低。相似的程序公开于WO93/08829和Traunecker等，EMBO J.，10：3655-3659(1991)中。
根据不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选，融合体具有Ig重链恒定结构域，包含铰链CH2和CH3区的至少一部分。优选具有第一个重链恒定区(CH1)，其含有轻链键合需要的位点，存在于至少一个融合体中。将编码免疫球蛋白重链融合体和如果需要免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体中，并且共同转染至合适的宿主细胞中。当构建中所用的不等比例的三个多肽链提供所需双特异性抗体的最佳产量时，这给调节实施方案中三个多肽片段的相互比例提供了更大的灵活性。然而，当相等比例的至少两个多肽链的表达导致高产量时或比例对所需链组合的产量不具有明显影响时，可以将两个或全部三个多肽链的编码序列插入单个表达载体中。
在这种方法的优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂中具有第一种结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和另一个臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)组成。发现了这种不对称结构有助于从不需要的免疫球蛋白链组合中分离出所需的双特异性化合物，因为只在一半双特异性分子中存在免疫球蛋白轻链提供了容易的分离方式。这种方法公开于WO94/04690中。对于产生双特异性抗体的更多详细内容，参见，例如，Suresh等，Methods in Enzymology(酶学方法)，121：210(1986)。
根据U.S.专利No.5,731,168中描述的另一种方法，可以将抗体分子对之间的接触面工程化，以最大化从重组细胞培养物收集的杂二聚体的百分比。优选的接触面包含至少一部分的CH3结构域。在这种方法中，用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替代第一个抗体分子接触面的一个或多个小氨基酸侧链。通过用较小的侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替代大的氨基酸侧链在第二个抗体分子的接触面上形成了与大侧链相同或相似大小的补偿“空腔”。这提供了优于其他不需要的终产物(如，同型二聚体)来提高杂二聚体产量的机制。
双特异性抗体包括交联的或“杂偶联物”抗体。例如，杂偶联物中的抗体之一可以与抗生物素蛋白偶联，另一个与生物素偶联。这样的抗体，例如已经提出将免疫系统细胞不需要的细胞(U.S.专利No.4,676,980)，并且用于HIV感染的治疗(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。可以使用任何常规交联方法来制得杂偶联物抗体。合适的交联剂是本领域公知的，并且公开于U.S.专利No.4,676,980，还公开了各种交联技术。
文献中也已经描述了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可以使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，Science，229：81(1985)描述了其中通过蛋白水解将完整抗体分裂产生F(ab’)2片段的程序。在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下，这些片段被还原，以稳定邻近的二硫醇并且防止分子间形成二硫化物。所产生的Fab’片段随后转化成硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将Fab’-TNB衍生物之一转化成Fab’-硫醇，并与等摩尔量的其他Fab’-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可以用作用于酶选择性固定的试剂。
最近的进展促进了从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段，其可以化学偶联，以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.，175：217-225(1992)描述了生产全人源化双特异性抗体F(ab’)2分子。每个Fab’片段分开从大肠杆菌分泌出来，并且接受直接的体外化学偶联，以形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够结合超表达ErbB2受体的细胞和正常的人T细胞，并引发相对人乳房肿瘤目标物的人细胞毒性淋巴细胞的溶解活性。
从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的各种技术也已经得到了描述。例如，使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。Kostelny等，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接两个不同抗体的Fab’部分。在铰链区将抗体同型二聚体还原，以形成单体，然后重新氧化形成抗体杂二聚体。该方法还用于生产抗体同型二聚体。Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)描述的“二抗”技术已经提供了用于制备双特异性抗体片段的可替换机制。片段包含通过连接物连接VL的VH，所述连接物太短，以致不能使相同链上的两个结构域之间配对。因此，迫使一个片段的VH和VL结构域与另一个片段的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了另一个通过使用单链Fv(scFv)二聚体制备双特异性抗体片段的策略。参见Cruber等，J.Immunol.，152：5368(1994)。
考虑了具有超过两价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体。Tutt等，J.Immunol.147：60(1991)。通过细胞表达抗体与其结合的抗原，多价抗体可以比二价抗体更快速地内在化(和／或分解代谢)。本发明的抗体可以是具有三个或多个抗原结合位点的多价抗体(例如，四价抗体)，其可以通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达来容易地产生。多价抗体可以包含二聚结构域和三个或多个抗原结合位点。优选的二聚结构域包含Fc区或铰链区(或由Fc区或铰链区组成)。在这种情况下，抗体将包含Fc区和Fc区氨基端的三个或多个抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含三个至约八个抗原结合位点(或由三个至约八个抗原结合位点组成)，但优选四个。多价抗体包含至少一个多肽链(和优选两个多肽链)，其中多肽链包含两个或多个可变结构域。例如，多肽链可以包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一个可变结构域，VD2是第二个可变结构域，Fc是Fc区的多肽链，X1和X2表示氨基酸或多肽，n为0或1。例如，多肽链可以包含：VH-CH1-弹性连接物-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两个(和优选四个)轻链可变结构域多肽。本文中的多价抗体可以例如包含约两个至约八个轻链可变结构域多肽。本文中考虑的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，并且任选进一步包含CL结构域。
本发明的抗体进一步包括单链抗体。
在特定的实施方案中，本发明的抗体是内在化抗体。
考虑了本文中所述的抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能需要提高抗体的结合亲和性和／或其他生物特性。可以通过将合适的核苷酸变化引入编码抗体或其链的多核苷酸中，或通过肽合成，来制备抗体的氨基酸序列变体。这样的修饰包括，例如，从抗体的氨基酸序列内删除残基，和／或将残基插入抗体的氨基酸序列内和／或取代抗体的氨基酸序列内的残基。可以进行删除、插入和取代的任何组合，以获得最终抗体，只要最终的构建体具有所需的特征。氨基酸变化还可以改变抗体的翻译后过程，如改变糖基化位点的数量或位置。上述用于本发明多肽的任一个变化和修饰可以包括在本发明的抗体中。
用于鉴定是用于诱变的优选位置的抗体的特定残基或区域的有用方法是“丙氨酸扫描诱变”，由Cuningham和Wells在Science，244：1081-1085(1989)中所述。在此，鉴定出一个残基或一组目标残基(例如，带电的残基，如arg、asp、his、lys和glu)并由中性或负电荷氨基酸替代(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)，以影响氨基酸与PSCA抗原的相互作用。然后通过在取代的位点或用于取代的位点引入更多或其他变体来提炼证明了对取代功能灵敏度的那些氨基酸位置。因此，尽管预先确定了用于引入氨基酸序列变化的位点，但不需要预先预定突变本身的性质。例如，为了分析给定位点的突变的性能，在目标密码子或区域进行ala扫描或随机诱变，并且筛选表达的抗-抗体变体的所需活性。
氨基酸序列插入包括氨基-和／或羧基-端融合体，长度范围从一个残基至含有上百或更多个氨基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N-端甲硫氨酰基残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体的其他插入变体包括抗体的N-或C-端与酶(例如，ADEPT)的融合体或提高抗体血清半衰期的多肽。
另一种类型的变体是氨基酸取代变体。这些变体在抗体分子中具有至少一个被不同残基取代的氨基酸残基。对于取代诱变最感兴趣的位点包括超变区，但也考虑FR改变。考虑保守和非保守取代。
通过选择在其对维持以下作用中显著不同的取代来完成抗体的生物特性中的实质性修饰，所述作用为(a)取代区域中的多肽主链的结构，例如，作为层或螺旋构象，(b)目标位点的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小。
还可以取代未涉及维持抗体正确构象的任何半胱氨酸残基，通常用丝氨酸取代，以提高分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反地，可以将半胱氨酸键添加至抗体，以提高其稳定性(特别在抗体是抗体片段(如，Fv片段)的情况中)。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体的一个或多个超变区。通常，为进一步发展选择得到的变体相对于产生其的亲本抗体具有提高的生物特性。用于产生这样的取代变体的便利方法涉及使用噬菌体展示的亲和性突变。简而言之，突变几个超变区位点(例如，6-7个位点)，以在每个位点产生所有可能的氨基酸取代。作为与每个颗粒内包装的M13的基因III产物的融合体，以单价方式从丝状噬菌体颗粒展示由此产生的抗体变体。然后按照本文中公开的筛选噬菌体展示变体的生物活性(例如，结合亲和性)。为了鉴定用于修饰的候选超变区位点，可以进行丙氨酸扫描诱变，以鉴定显著影响抗原结合的超变区残基。替换地，或另外地，分析抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原或感染细胞之间的接触点是有益的。根据本文中详细阐述的技术，这样的接触残基和邻近残基是用于取代的候选物。一旦产生了这样的变体，按照本文中所述的，将变体组接受筛选，并且可以在一个或多个相关试验中筛选具有优等特性的抗体，用于进一步发展。
另一种类型的抗体的氨基酸变体改变了抗体的原始糖基化模式。改变意思是删除一个或多个抗体中发现的碳水化合物部分和／或添加一个或多个抗体中不存在的糖基化位点。
抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的指的是碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是用于将碳水化合物部分酶连接天冬酰胺侧链的识别序列，其中X是任何氨基酸，除了脯氨酸。因此，多肽中这些三肽序列中的任一个的存在形成了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指的是糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列来方便地完成将糖基化位点添加至抗体，使其含有一个或多个上述三肽序列(用于N-连接的糖基化位点)。还可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加至原始抗体的序列或通过一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代原始抗体的序列来形成改变(用于O-连接的糖基化位点)。
对于效应物功能来修饰本发明的抗体，例如，以增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和／或补体依赖性细胞毒性(CDC)。可以通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现这。可替换地或另外地，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，由此在该区域中形成链间二硫键。因此产生的同型二聚抗体具有提高的内在化能力和／或提高的补体介导的细胞杀灭和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见，Caron等，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.J.Immunol.148：2918-2922(1992)。按照Wolff等，Cancer Research53：2560-2565(1993)等所述的，使用杂双功能交联剂，也可以制备具有增强抗感染活性的同型二聚抗体。或者，可以将抗体工程化，其具有双重Fc区，并且由此具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见，Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design3：219-230(1989)。
为了提高抗体的血清半衰期，可以将救助受体结合表位结合至抗体中(尤其是抗体片段)，例如，按照U.S.专利No.5,739,277中所述的。如本文中所用的，术语“救助受体结合表位”指的是负责提高IgG分子的体内血清半衰期的IgG分子(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc区的表位。
本发明的抗体也可以进行修饰，以包括表位标记物或标记，例如，用于纯化或诊断引用。本发明还涉及用免疫偶联物的治疗，所述免疫偶联物包含与抗癌剂(如，细胞毒性剂)或生长抑制剂偶联的抗体。以上还描述了用于产生这样的免疫偶联物中的化疗剂。
本文中还考虑了抗体和一种或多种小分子毒素的偶联物，所述毒素如卡奇霉素(calicheamicin)、美登木素(maytansinoid)、新月霉素(trichothene)和CC1065，以及这些毒素具有毒素活性的衍生物。
在一个优选的实施方案中，将本发明的抗体(全长或片段)与一个或多个美登木素分子偶联。美登木素是通过抑制微管蛋白聚合起作用的有丝分裂抑制剂。美登素(maytansine)首先从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)中分离出来(U.S.专利No.3,896,111)。随后，发现了特定的微生物也产生美登木素，如美登醇(maytansinol)和C-3美登醇酯(U.S.专利No.4,151,042)。例如，在中公开了合成的美登醇及其衍生物和类似物。
在提高治疗指数的尝试中，将美登素和美登木素与特异性结合肿瘤细胞抗原的抗体偶联。例如，在U.S.专利No.5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0425235B1中公开了含有maytansinoid的免疫偶联物及其治疗用途。Liu等，Proc.Natl.Acid.Sci.USA93：8618-8623(1996)描述了包含连接针对人直肠癌的单克隆抗体C242的命名为DM1的美登木素。发现偶联物针对培养的结肠癌细胞是高度细胞毒性的，并且在体内肿瘤生长试验中显示出抗肿瘤活性。
通过将抗体与美登木素分子化学连接来制备抗体-美登木素偶联物，而没有显著消除抗体或美登木素分子的生物活性。每个抗体分子偶联的平均3-4个美登木素分子已经在增强目标细胞的细胞毒性中显示出功效，而没有不利地影响抗体的功能和溶解性，尽管预期即使一个分子的毒素／抗体也将增强细胞毒性，优于使用裸露的抗体。美登木素是本领域公知的，并且可以通过已知技术来合成，或从天然来源分离。例如，在U.S.专利No.5,208,020以及以上提及的其他专利和非专利出版物中，公开了合适的美登木素。优选的美登木素是美登醇以及在美登醇分子的芳环或其他位置中修饰的美登醇类似物，如各种美登醇酯。
存在许多本领域已知的用于制备抗体偶联物的连接基团，包括，例如，U.S.专利No.5,208,020或EP专利0425235B1以及Chari等，Cancer Research52：127-131(1992)中公开的那些。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸易分解性基团、光易分解性基团、肽酶易分解性基团或酯酶易分解性基团，如以上所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。
可以使用各种双功能蛋白偶联剂来制备免疫偶联物，所述偶联剂如N-琥珀酰-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰-4-(N-马来酰亚胺)环己烷-1-羧酸酯、亚胺基硫代坊(TT)、酰亚胺酯的双功能衍生物(如，二甲基己二亚酰胺HCl)、活性酯(如，二琥珀酰辛二酸酯)、醛(如，戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(p-叠氮苯甲酰)己二胺)、双-重氮衍生物(如，双-(p-重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(如，甲苯2,6-二异氰酸盐)和双-活性氟化合物(如，1，5-二氟-2,4-二硝基苯)。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，Biochem.J.173：723-737[1978])和N-琥珀酰-4-(2-吡啶基硫)戊酸酯(SPP)，以提供二硫化物连接。例如，可以按照Vitetta等，Science238：1098(1987)中所述的来制备蓖麻免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸基-3-甲基二乙烯三胺戊醋酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的示例性螯合剂。参见WO94／11026。连接物可以是“可分裂的连接物”，有助于细胞中的细胞毒性药物的释放。例如，可以使用酸易分解的连接物，Cancer Research52：127-131(1992)；U.S.专利No.5,208,020。
另一种令人感兴趣的免疫偶联物包含与一个或多个卡奇霉素分子偶联的抗体。抗体的卡奇霉素家族能够在次-皮摩尔浓度下产生双链DNA破裂。对于卡奇霉素家族的偶联物的制备，参见U.S.专利No.5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296(全鄙是American Cyanamid Company)。抗体可以偶联的另一种药物是QFA，其是抗叶酸物。卡奇霉素和QFA具有胞内作用位点，并且不容易穿过质膜。因此，这些药剂通过抗体介导的内在化的细胞吸收通常增强了它们的细胞毒性作用。
可以与本发明的抗体偶联的其他药剂的实例包括BCNU、链脲霉素、长春新碱和5-氟尿嘧啶，描述于U.S.专利No.5,053,394、5,770,710中的总称为LL-E33288复合物的药剂家族以及埃斯佩拉霉素(esperamicin)(U.S.专利No.5,877,296)。
可以使用的酶活性毒素及其片段包括，例如，白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-sarcin、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒素、肥皂草(sapaonariaofficialis)抑制剂、多花白树毒蛋白(gelonin)、mitogellin、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素、单端胞霉烯(tricothecene)。参见，例如，WO93／21232。
本发明进一步包括在抗体和具有核酸分解活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，如脱氧核糖核酸酶；DNase)之间形成的免疫偶联物。
为了选择性地破坏感染的细胞，抗体包括高放射性的原子。各种放射性同位素可用于生产放射性偶联的抗-PSCA抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Rc188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。将偶联物用于诊断时，可以包含用于闪烁扫描研究的放射性原子，例如tc99m或I123，或能够与核磁共振成像的自旋标记物(NMR)(也称为磁共振成像，MRI)，如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
将无线电-或其他标记以已知的方式结合至偶联物中。例如，肽可以生物合成，或可以使用合适的氨基酸前体(例如，涉及氟-19替代氢)，通过化学氨基酸合成来合成。可以通过肽中的半胱氨酸残基连接标记物，如tc99m或I123、Re186、Re188和In111。钇-90可以通过赖氨酸残基连接。IODOGEN方法(Fraker等(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57)可以用于结合碘-123。“Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy(免疫闪烁法中的抗体)”(Chatal，CRC Press1989)详细描述了其他方法。
或者，例如，通过重组技术或肽合成，来制备包含抗体和细胞毒性剂的融合体。DNA的长度可以包含各自编码偶联物的两个部分的区域，这两个部分可以互相邻接或通过编码连接物肽的区域隔开，所述连接物肽没有破坏所需的偶联物特性。
通过将抗体与前药激活酶偶联，还可以将本发明的抗体用于抗体依赖性酶介导的前药疗法(ADET)中，所述前药激活酶将前药(例如，肽酰化疗剂，参见WO8I／01145)转化成活性抗癌药(参见，例如，WO88／07378和U.S.专利No.4,975,278)。
用于ADEPT的免疫偶联物的酶成分包括能够作用于前药的任何酶，以这样的方式将前药转化成其更有活性的、细胞毒性的形式。本发明方法中有用的酶包括，但不限于，用于将含磷酸盐的前药转化成游离药物的碱性磷酸酶；用于将含有硫酸盐的前药转化成游离药物的芳基硫酸酯酶；用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化成抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨基酶；蛋白酶，如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧基肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)，用于将含肽的前药转化成游离药物；D-丙氨酰羧基肽酶，用于转化含有D-氨基酸取代基的前药；碳水化合物分裂酶，如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，用于将糖基化的前药转化成游离药；β-内酰胺酶，用于将β-内酰胺衍生的药物转化成游离药；和青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，用于将在其胺氮分别用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基基团衍生的药物转化成游离药。或者，具有酶活性的抗体，本领域中也称为“抗体酶”，可以用于将本发明的前药转化成游离的活性药(参见，例如，Massey，Nature328：457-458(1987))。可以按照本文中所述的制备抗体-酶偶联物，用于将抗体酶传送至感染的细胞群。
可以通过本领域公知的技术，如使用以上讨论的杂双功能交联试剂，将本发明的酶共价结合抗体。或者，可以使用本领域公知的重组DNA技术(参见，例如，Neuberger等，Nature，312：604-608)，来构建包含连接本发明的酶的至少功能活性部分的本发明的抗体的至少抗原结合区的融合蛋白。
本文中考虑了抗体的其他修饰。例如，抗体可以连接多种非蛋白聚合物中的一种，例如，聚乙二醇、据丙二醇、聚氧化烯，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。抗体还可以包裹在胶状药物传送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗滴乳液中的微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合(例如，分别地，羟乙基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)制得。这样的技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，第16版，Oslo，A.，编辑(1980)。
本文中公开的抗体还配制为免疫脂质体。“脂质体”是由各种类型的用于将药物传送给哺乳动物的脂质、磷脂和／或表面活性组成的小泡囊。脂质体的成分通常以双层形成排列，与生物膜的脂质排列相似。通过本领域已知的方法制备含有抗体的脂质体，如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；U.S.专利No.4,485,045和4,544,545；和1997年10月23日公开的W097／38731中所述的方法。具有增强的循环时间的脂质体公开于U.S.专利No.5,013,556中。
可以通过反相蒸发方法来产生特别有用的脂质体，使用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物。通过限定孔大小的滤器挤出脂质体，以产生具有所需直径的脂质体。如Martin等，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述的，通过二硫化物互换反应，可以将本发明的抗体的Fab’片段与脂质体偶联。
本发明的抗体，或其片段，可以具有多种生物或功能特征中的任一种。在特定的实施方案中，这些抗体是A型流行性感冒特异性的或M2蛋白特异性的抗体，表明与正常的对照细胞相比，它们分别特异性地结合或择优地结合A型流行性感冒或其M2蛋白。在特定的实施方案中，抗体是HuM2e抗体，表明与正常的对照细胞相比，它们特异性地结合M2e蛋白，优选结合只在细胞中表达M2蛋白时存在的或存在于病毒上的M2e结构域的表位。
在特定的实施方案中，本发明的抗体是拮抗抗体，其部分地或全部地阻断或抑制其特异性或择优结合的多肽或细胞的生物活性。在其他实施方案中，本发明的抗体是生长抑制抗体，其部分地或全部地阻断或抑制与其结合的感染细胞的生长。在另一个实施方案中，本发明的抗体诱导凋亡。在再另一个实施方案中，本发明的抗体诱导或促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性。
鉴定和生产流行性感冒病毒特异性抗体的方法
本发明提供了用于鉴定HuM2e抗体的新方法，如实施例4中举例说明的。这些方法可以容易地适用于通过感染剂鉴定细胞表面上表达的其他多肽特异性的抗体，或甚至感染剂自身表面上表达的多肽。
通常，该方法包括从已经感染了感染剂或相对感染剂接种的病人获得血清样品。然后筛选这些血清样品，以鉴定含有与感染剂相关的特定多肽特异性的抗体的那些，所述多肽如，例如，感染了感染剂的细胞的表面上特异性表达的多肽，而不是在未感染细胞上表达的。在特定的实施方案中，通过将样品接触已经用表达载体转染的细胞来筛选血清样品，所述表达载体在感染细胞的表面上表达多肽。
一旦病人鉴定为具有含有鉴定的目标感染剂多肽特异性抗体的血清，使用本文中所述的或本领域中可用的任一种方法，将获自相同病人的单核细胞和／或B细胞用于鉴定产生抗体的细胞或其克隆。一旦鉴定出产生抗体的B细胞，可以使用标准RT-PCR载体和保守抗体序列特异性的引物，来克隆编码抗体的可变区或其片段的cDNA，并且亚克隆至表达载体中，所述表达载体用于重组产生目标感染剂多肽特异性的单克隆抗体。
在一个实施方案中，本发明提供了鉴定特异性结合A型流行性感冒感染细胞的抗体的方法，其包括：将A型流行性感冒病毒或表达M2蛋白的细胞接触获自已经被A型流行性感冒感染的病人的生物样品；测定生物样品中结合细胞的抗体的含量；将测定的含量与对照值相比较，其中如果测定的值比对照值高出至少两倍，则表明是特异性结合A型流行性感冒感染细胞的抗体。在不同的实施方案中，表达M2蛋白的细胞是感染了A型流行性感冒病毒的细胞或用表达M2蛋白的多核苷酸转染的细胞。或者，细胞表达M2蛋白的一部分，所述M2蛋白包括M2e结构域和足够的其他M2序列，使得蛋白保持与细胞相连并且M2e结构域以存在于全长M2蛋白内时的相同方式存在于细胞表面上。由于M2序列是公众可获得的，可以容易地完成制备M2表达载体和转染合适的细胞(包括本文中所述的那些)的方法。参见，例如，Influenza Sequence Database(ISD)(互联网上的flu.lanl.gov.，描述于Macken等，2001，″The value of a database in surveillanceand vaccine selection″，见Options for the Control of Influenza IV.A.D.M.E.，Osterhaus&Hampson(编辑)，Elsevier Science，Amsterdam，pp.103-106)和The Institute for Genomic Research(TIGR)的Microbial Sequencing Center(MSC)(互联网上的tigr.org／msc／infl_a_virus.shtml)。
使用标准生物技术，将以上所述的M2e-表达细胞或病毒用于筛选获自感染了A型流行性感冒的病人的生物样品中择优结合表达M2多肽的细胞的抗体的存在。例如，在特定的实施方案中，可以将抗体进行标记，并且检测与细胞相关的标记的存在，例如，使用FMAT或FAC分析。在特定的实施方案中，生物样品是血液、血清、血浆、支气管灌洗液或唾液。可以使用高通量技术来实施本发明的方法。
然后可以进一步表征鉴定的人抗体。例如，使用表达的M2e多肽的定点诱变，例如可以确定抗体结合需要的或足以使抗体结合的M2e蛋白内的特定构象表位。这些方法可以容易地适用于鉴定结合细胞表面上表达的任何蛋白的人抗体。此外，这些方法可以适用于确定抗体与病毒自身的结合，与表达重组M2e或感染病毒的细胞相对。
可以将编码抗体或其可变区或其抗原结合片段的多核苷酸序列亚克隆至用于HuM2e抗体重组生产的表达载体中。在一个实施方案中，通过以下方法来实现这：从病人获得单核细胞，所述病人是从其获得含有鉴定的HuM2e抗体的血清的病人；从单核细胞产生B细胞克隆；诱导B细胞变成产抗体的浆细胞；和筛选浆细胞产生的上清液，以确定其是否含有HuM2e抗体。一旦鉴定出产生HuM2e抗体的B细胞克隆，进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，以克隆编码HuM2e抗体的可变区或其部分的DNA。然后将这些序列亚克隆至适用于重组生产人HuM2e抗体的表达载体中。可以通过测定重组抗体结合表达M2e多肽的细胞的能力来证实结合特异性。
在本文中所述方法的特定实施方案中，例如，基于CD19阳性，将从外周血或淋巴结分离的B细胞进行分选，并且涂布于例如96、384或1536孔构造中，例如，尽可能低的每孔单个细胞特异性。诱导细胞分化成产抗体细胞，例如，浆细胞，并且收集培养物上清液，并为了结合在其表面上表达感染剂多肽的细胞进行测试，例如使用FMAT或FACS分析来进行测试。然后将阳性细胞接受全孔RT-PCR，以扩增通过克隆的子细胞表达的IgG分子的重链和轻链可变区。将所得到的编码重链和轻链可变区或其部分的PCR产物亚克隆至用于重组表达的人抗体表达载体中。然后测试所得到的重组抗体来证实它们初始的结合特异性并且可以进一步测试各种感染剂分离物毒株的pan specificity。
因此，在一个实施方案中，按照以下的来实施鉴定HuM2e抗体的方法。首先，将全长或接近全长的M2cDNA转染至用于M2蛋白表达的细胞系中。其次，测试单独的人血浆或血清样品中结合表达M2的细胞的抗体。最后，对于结合表达M2的相同细胞，来表征源自血浆-或血清-阳性个体的MAb。可以在这点进行MAb的精细特异性的进一步限定。
可以实施这些方法来鉴定各种不同的HuM2e抗体，包括对以下物质特异性的抗体：(a)线性M2e肽中的表位，(b)多种M2e变体中的共有表位，(c)M2同型四聚体的构象决定簇，和(d)多种M2同型四聚体变体的共有构象决定簇。最后一类是特别理想的，因为这种特异性可能是对所有A型流行性感冒毒株特异性的。
可以根据本领域中可用的和本文中所述的方法，包括使用人抗体多肽的保守区特异性的引物，通过聚合酶链式反应扩增，从表达HuM2e抗体的细胞分离编码本发明的HuM2e抗体或其部分的多核苷酸。例如，可以根据WO92／02551；U.S.专利No.5,627,052；或Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：7843-48(1996)中所述的分子生物技术，从B细胞克隆轻链和重链可变区。在特定的实施方案中，可以将编码由表达HuM2e抗体的克隆子浆细胞表达的IgG分子的重链和轻链可变区的全部或一部分的多核苷酸亚克隆并测序。可以从多核苷酸序列容易地编码的多肽序列。可以使用本领域已知的和本文中所述的程序，将编码本发明多肽的分离多核苷酸亚克隆至表达载体中，以重组产生本发明的抗体和多肽。
通常可以使用免疫检测方法，包括例如基于免疫荧光的试验，如免疫组织化学(IHC)和／或荧光激活细胞分选(FACS)，来测定和评价抗体(或其片段)与M2e或感染细胞或组织的结合特性。免疫试验方法可以包括对照和程序来测定抗体是否特异性地结合来自一个或多个特定A型流行性感冒毒株的M2e，并且没有识别或与正常对照细胞交叉反应。
预先筛选血清来鉴定产生对感染剂或其多肽(例如，M2)的抗体的病人后，本发明的方法通常包括从之前获自病人或患者的生物样品中分离或纯化B细胞。病人或患者可以是当前或之前诊断为或怀疑或具有特定疾病或感染，或可以认为病人或患者无或特定疾病或感染。通常，病人或患者是哺乳动物，并且在特定的实施方案中，是人。生物样品可以是含有B细胞的任何样品，包括但不限于，淋巴结或淋巴结组织、胸膜积液、外周血、腹水、肿瘤组织或脑脊髓液(CSF)。在各种实施方案中，B细胞分离自不同类型的生物样品，如受到特定疾病或感染影响的生物样品。然而，理解包含B细胞的任何生物样品可以用于本发明的任一个实施方案中。
一旦分离，诱导B细胞产生抗体，例如，通过在支持B细胞增殖或发育成浆细胞(plasmacyte)、浆母细胞或浆细胞(plasmacell)的条件下培养B细胞。然后筛选抗体，通常使用高通量技术，以鉴定特异性结合目标抗原的抗体，所述目标抗原例如为特定的组织、细胞、感染剂或多肽。在特定的实施方案中，特异性的抗原，例如，抗体结合的细胞表面多肽是未知的，而在其他实施方案中，抗体特异性结合的抗原是已知的。
根据本发明，通过本领域已知的和可用的任何方法，B细胞可以分离自生物样品，例如，肿瘤、组织、外周血或淋巴结样品。通常基于其表面上B细胞特异性的标记物的存在，通过FACS来分选B细胞，所述标记物例如为CD19、CD138和／或表面IgG。然而，可以使用本领域已知的其他方法，如，例如，使用CD19磁珠或IgG-特异性磁珠的柱纯化，接着从柱洗脱。然而，利用任何标记物的B细胞的磁分离可能导致特定B细胞的丢失。因此，在特定的实施方案中，分离的细胞没有分选，但替代地，将从肿瘤分离的phicol-纯化的单核细胞直接涂布成每孔合适的或所需的特异性数量。
为了鉴定产生感染剂特异性抗体的B细胞，通常以低密度(例如，每孔单个细胞特异性，每孔1-10个细胞，每孔10-100个细胞，每孔1-100个细胞，每孔低于10个细胞，或每孔低于100个细胞)将B细胞涂布于多孔或微量滴定平板中，例如，在96、384或1536孔构造中。最初以高于每孔一个细胞的密度涂布B细胞时，那么本发明的方法可以包括随后在孔中稀释鉴定为产生抗原特异性抗体的步骤，直至获得每孔单个细胞特异性，由此促进产生抗原特异性抗体的B细胞的鉴定。
在特定的实施方案中，在有利于B细胞产生抗体的条件下培养B细胞。例如，可以在利于B细胞增殖和分化产生产抗体浆细胞(plasmablast)、浆母细胞或浆细胞(plasma cell)的条件下培养B细胞。在特定的实施方案中，在B细胞有丝分裂原的存在下培养B细胞，所述有丝分裂原如脂多糖(LPS)或CD40配体。
可以使用本领域可用的常规方法，包括本文中所述的那些，测试细胞培养物上清液或从其获得的抗体结合目标抗原的能力。在特定的实施方案中，使用高通量方法测试培养物上清液中结合目标抗原的抗体的存在。例如，可以在多孔微量滴定盘中培养B细胞，使得机器人平板处理机可以用于同时取样多孔上清液并且测试结合目标抗原的存在。在特定的实施方案中，抗原结合珠子(例如，顺磁或乳胶珠子)，以促进抗体／抗原复合物的捕获。在其他实施方案中，将抗体进行荧光标记(用不同的标记物)，并且进行FACS分析来鉴定结合目标抗原的抗体的存在。在一个实施方案中，使用FMATTM分析和仪表(Applied Biosystems，FosterCity，CA)测定了抗体结合。FMATTM是用于高通量筛选的荧光大-共焦平台，其是使用活细胞或珠子的混合和阅读(mix-and-read)的非放射性试验。
在将抗体与特定目标抗原(例如，生物样品，如感染的组织或细胞，或感染剂)的结合与对照样品(例如，生物样品，如未受感染的细胞，或不同的感染剂)相比较的内容中，在不同的实施方案中，如果与结合对照样品的量相比，抗体结合特定目标抗原高至少两倍、至少三倍、至少五倍或至少十倍，则认为抗体择优地结合特定的目标抗原。
可以利用本领域可用的任何方法，从细胞分离编码抗体链、其可变区或其片段的多核苷酸。在一个实施方案中，使用聚合酶链式反应(PCR)，例如，反转录-PCR(RT-PCR)，使用特异性结合编码多核苷酸序列或其补体的重链或轻链的寡核苷酸引物，使用本领域可用的常规程序，来分离多核苷酸。在一个实施方案中，将阳性细胞接受全孔RT-PCR，以扩增由克隆子浆细胞表达的IgG分子的重链和轻链可变区。可以将这些PCR产物进行测序。
然后根据本领域中的常规程序(参见，例如，US专利No.7,112,439)，将所得到的编码重链和轻链可变区或其一部分的PCR产物亚克隆至人抗体表达载体中，并且重组表达。如本文中所述的，可以根据多种公知程序中的任何一种，将编码肿瘤特异性抗体或其片段的核酸分子进行繁殖和表达，用于核酸切除、连接、转化和转染。因此，在特定的实施方案中，抗体片段的表达可以优选在原核宿主细胞中，如大肠杆菌(参见，例如，Pluckthun等Methods Enzymol.178：497-515(1989))。在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合片段的表达优选在真核宿主细胞中，包括酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和毕赤酵母(Pichia pastoris))；动物细胞(包括哺乳动物细胞)；或植物细胞。合适的动物细胞的实例包括，但不限于，骨髓瘤、COS、CHO或杂交瘤细胞。植物细胞的实例包括烟草、玉米、大豆和水稻细胞。通过本领域普通技术已知的方法并且基于本发明的公开内容，可以设计核酸载体，用于在特定的宿主系统中表达外源序列，然后可以插入编码肿瘤特异性抗体(或其片段)的多核苷酸序列。调控元件将根据特定的宿主而改变。
可以制备含有编码可变区和／或恒定区的多核苷酸的一个或多个可复制表达载体，并且用于转化合适的细胞系，例如，非产生骨髓瘤的细胞系，如小鼠NSO系或细菌，如大肠杆菌，其中将发生抗体的产生。为了获得有效的转录和翻译，每个载体中的多核苷酸序列应当包括适当的调控序列，特别是可操作连接可变结构域序列的启动子和前导序列。以这种方式生产抗体的特定方法通常是公知的并且是常用的。例如，Sambrook等(MolecularCloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory，New York，1989；还参见Sambrook等，第3版，ColdSpring Harbor Laboratory，New York，(2001))描述了分子生物学程序。尽管不需要，在特定的实施方案中，可以将编码重组抗体的多核苷酸的区域进行测序。可以按照Sanger等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA74：5463(1977))和Amersham International plc测序手册以及包括其改进中所述的进行DNA测序。
在特定的实施方案中，然后测试所得到的重组抗体或其片段，以证实其原始特异性并且可以进一步测试pan-specificity，例如，使用相关感染剂来测试。在特定的实施方案中，通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或凋亡，测试根据本文中所述的方法鉴定或产生的抗体的细胞杀灭，和／或及其内在化的能力。
多核苷酸
在其他的方面中，本发明提供了多核苷酸组合物。在优选的实施方案中，这些多核苷酸编码本发明的多肽，例如，结合A型流行性感冒、M2或M2e的抗体的可变链的区域。本发明的多核苷酸是单链(编码或反义)或双链DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括，但不限于，HnRNA分子(其含有内含子并且以一对一的方式对应于DNA分子)和mRNA分子(其不含内含子)。可替换地，或另外地，多核苷酸连接本发明的其他分子和／或支持材料。本发明的多核苷酸例如用于杂交试验中，以检测生物样品中的A型流行性感冒抗体的存在，以及用于本发明多肽的重组产生。
因此，根据本发明的另一个方面中，提供了多核苷酸组合物，其包括实施例1中所列的一些或全部多核苷酸序列、实施例1中所列的多核苷酸序列的补体和实施例1中所列的多核苷酸序列的简并变体。在特定的优选实施方案中，本文中所列的多核苷酸序列编码与正常的对照未感染细胞相比能够择优结合A型流行性病毒感染细胞的多肽，包括具有实施例1或2中所列序列的多肽。此外，本发明包括编码本发明任何多肽的所有多核苷酸。
在其他相关的实施方案中，本发明提供了与图1中所列序列具有实质性同一性的多核苷酸变体，例如，与本发明的多核苷酸序列相比，包含至少70％序列同一性，优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的那些，序列同一性如使用本文中所述的方法测定的(例如，使用标准参数的BLAST分析)。本领域技术人员将认识到通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，这些值可以适当调整以确定两个核苷酸序列编码的蛋白的相应同一性
通常，多核苷酸变体含有一个或多个取代、添加、删除和／或插入，优选使得由变体多核苷酸编码的多肽的免疫结合特性相对于由本文中具体所示多核苷酸序列编码的多肽基本上没有降低。在其他实施方案中，本发明提供了包含与本文中公开的一个或多个序列相同或互补的各种长度的连续序列链的多核苷酸片段。例如，本发明提供了包含本文中公开的一个或多个序列的至少约10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多个连续核苷酸以及之间的所有中间长度的多核苷酸。如本文中所用的，术语“中间长度”用来描述所述值之间的任何长度，如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500；500-1000等的所有整数。
在本发明的另一个实施方案中，提供了能够在中等至高严谨条件下与本文中提供的多核苷酸序列或其片段或其互补序列杂交的多核苷酸组合物。杂交技术是分子生物学领域公知的。为了说明的目的，用于测试本发明的多核苷酸与其他多核苷酸杂交的合适中等严谨条件包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-60℃，5×SSC下杂交过夜；接着在65℃下洗涤20分钟，两次，每次使用含有0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC。本领域技术人员将理解杂交的严谨性可以容易地操作，如通过改变杂交溶液的盐含量和／或进行杂交的温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高严谨杂交条件包括上述的那些，除了杂交的温度提高，例如，提高至60-65℃或65-70℃。
在优选的实施方案中，多核苷酸变体或片段编码的多肽具有与天然多核苷酸编码的多肽相同的结合特异性(即，特异性地或择优地结合相同的表位或A型流行性感冒毒株。)在特定的优选实施方案中，以上所述的多核苷酸，例如，多核苷酸变体、片段和杂交序列，编码具有本文中具体所列多肽序列的至少约50％，优选至少约70％，和更优选至少约90％结合活性水平的多肽。
本发明的多核苷酸，或其片段，与编码序列自身的长度无关，可以结合其他DNA序列，如启动子、多腺苷酸化信号、其他限制酶位点、多克隆位点、其他编码区段等，使得它们的整体长度可以有相当大的变化。使用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选受到易于制备的限制并且用于计划的重组DNA实验方案中。例如，在本发明的许多实施中包括具有约10,000、约5000、约3000、约2,000、约1,000、约500、约200、约100、约50个碱基对总长的说明性多核苷酸区段。
本领域普通技术人员将认识到，作为遗传密码简并性的结果，存在多个编码本文中所述多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。虽然如此，本发明特意考虑了编码本发明多肽的但可能由于密码子使用的差异而有所不同的多核苷酸。此外，包括基因的等位基因的本文中提供的多核苷酸序列在本发明的范围之内。等位基因是作为一个或多个突变结果而改变的内源性基因，所述突变如核苷酸的删除、添加和／或取代。所得到的mRNA和打败可以但不必需具有改变的结构或功能。可以使用标准技术(如杂交、扩增和／或数据库序列比较)来鉴定等位基因。
在本发明的特定实施方案中，为了改变所编码多肽的一个或多个特性，如结合特异性或结合强度，进行了所公开的多核苷酸序列的诱变。用于诱变的技术是本领域公知的，并且广泛用于形成多肽和多核苷酸的变体。使用诱变方法，如位点特异性诱变，用于制备本文中所述多肽的变体和／或衍生物。通过这种方法，经由编码多肽的基础多核苷酸的诱变，在多肽序列中形成特定的改变。这些技术提供了一种直截了当的方法，例如，通过将一个或多个核苷酸序列变化引入多核苷酸中，结合一个或多个之前的考虑，来制备和测试序列变体。
位点特异性诱变可以通过使用特异性寡核苷酸序列来生产突变体，所述寡核苷酸序列包括所需突变的核苷酸序列以及足够数量的邻近核苷酸，以提供足够大小的引物序列和序列复杂性，以在穿过的删除连接点两侧形成稳定的双链体。在选定的多核苷酸序列中使用突变，以提高、改变、降低、修饰或另外变换多核苷酸自身的特性和／或改变所编码多肽的特性、活性、组成、稳定性和一级序列。
在本发明的其他实施方案中，将本文中提供的多核苷酸序列用作用于核酸杂交的探针或引物，例如，作为PCR引物。这样的核酸探针与目标序列特异性杂交的能力能使其检测给定样品中互补序列的存在。然而，本发明还包括其他用途，如序列信息用于制备突变物质引物或用于制备其他遗传构造的引物的用途。因此，包括与本文中公开的15个核苷酸长的连续序列具有相同序列或与其互补的至少约15个核苷酸长的连续序列的序列区的本发明的核酸区段特别有用。较长的连续的相同或互补序列，例如，约20、30、40、50、100、200、500、1000的那些(包括所有中间长度)，包括全长序列，和其中的所有长度，也用于特定的实施方案中。
具有与本文中公开的多核苷酸序列相同或互补的10-14、15-20、30、50，乃至100-200个左右核苷酸(也包括中间长度)组成的序列区的多核苷酸分子特别考虑作为杂交探针，用于例如Southern和Northern印迹中，和／或作为引物，用于例如聚合酶链式反应(PCR)中。总的片段大小，以及互补链的大小，最终取决于所打算的特定核酸区段的用途或应用。较小的片段通常用于杂交实施方案中，其中连续互补区的长度可以改变，如约15至约100个核苷酸，但根据希望检测的互补序列的长度，可以使用较长的连续互补链。
约15-25个核苷酸长的杂交探针的使用使得可以形成稳定且选择性的双链分子。但是，为了提高杂交体的稳定性和选择性，并且由此提高所获得的特定杂交分子的质量和程度，在超过12个碱基的链中具有连续互补序列的分子通常是优选的。具有15至25个连续核苷酸的基因互补链的核酸分子，或在希望更长的情况中，通常是优选的。
从本文中公开的任一个序列的任何部分选择杂交探针。所需的一切就是回顾希望用作探针或引物的本文中所列的序列，或序列的任何连续部分，从约15-25个核苷酸长直至和包括全长序列。通过各种因素来控制探针和引物序列的选择。例如，希望使用来自朝向总序列末端的引物。
例如，通过化学方法直接合成片段，如通常使用自动化寡核苷酸合成仪实践的，来容易地制备本发明的多核苷酸，或其片段或变体。此外，可以通过应用核酸复制技术，如U.S.专利4,683,202的PCRTM技术，通过将选定序列引入用于重组生产的重组载体中，以及通过分子生物学领域的技术人员通常已知的其他重组DNA技术，来获得片段。
载体、宿主细胞和重组方法
本发明提供了包含本发明核酸的载体和宿主细胞，以及用于生产本发明多肽的重组技术。本发明的载体包括能够在任何类型的细胞或生物体(例如，质粒、噬菌体、粘粒和迷你染色体)中复制的那些。在各种实施方案中，包含本发明多核苷酸的载体是适用于多核苷酸增殖或复制的载体，或适用于表达本发明多肽的载体。这样的载体是本领域已知的并且是可购得的。
使用常规分子和细胞生物学技术，包括，例如，使用合适的限制位点和限制酶，将多核苷酸亚克隆至线性化的载体中，来合成本发明的多核苷酸，然后完整地或部分地组合，并插入载体中。使用与多核苷酸的每个链互补的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应来扩增本发明的多核苷酸。这些引物也包括限制酶分裂位点，以促进亚克隆至载体中。可复制的载体成分通常包括，但不限于，以下的一个或多个：信号序列、复制起点和一个或多个标记物或选择基因。
为了表达本发明的多肽，将编码多肽或功能等价物的核苷酸序列插入合适的表达载体中，即，含有插入的编码序列的转录和翻译所需的元件。将本领域技术人员公知的方法用于构建表达载体，所述表达载体含有编码目标多肽的序列以及合适的转录和翻译控制元件。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内基因组重组。这样的技术描述于例如Sambrook，J.等(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆，实验室手册)，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.和Ausubel，F.M.等(1989)Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学通用实验方案)，John Wiley&Sons，NewYork.N.Y.。
将各种表达载体／宿主系统用于包含和表达多核苷酸序列。这些包括，但不限于，微生物，如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。在一个实施方案内，使用核苷酸引物，从杂交瘤细胞扩增表达目标单克隆抗体的基因的可变区。通过本领域普通技术人员合成这些引物，或可以购自市售来源(参见，例如，Stratagene(La Jolla，California))，其销售用于扩增小鼠和人可变区的引物。将引物用于扩增重链或轻链可变区，然后将其插入载体中，分别如ImmunoZAPTM H或ImmunoZAPTM L(Stratagene)。然后将这些载体引入用于表达的基于大肠杆菌、酵母或哺乳动物的系统中。使用这些方法产生了大量含有VH和VL结构域融合体的单链蛋白(参见，Bird等，Science242：423-426(1988))。
表达载体中存在的“控制元件”或“调控序列”是与宿主细胞蛋白相互作用的载体的那些非翻译区，例如，增强子、启动子、5’和3’未翻译区，以进行转录和翻译。这些元件的强度和特异性可以不同。根据所用的载体系统和宿主，使用多种合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。
适用于原核宿主的启动子实例包括phoa启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子，如tac启动子。然而，其他已知的细菌启动子是合适的。用于细菌系统中的启动子也常常含有可操作连接编码多肽的DNA的Shine-Dalgarno序列。使用诱导型启动子，如PBLUESCRIPT嗜菌粒(Stratagene，La Jolla，Calif.)或PSPORT1质粒(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)等的杂合lacZ启动子。
各种用于真核生物的启动子序列是已知的，并且根据本发明使用任何一种。实际上，所有真核基因具有富AT区，其位于从启动转录位点上游的大约25至30个碱基。从许多基因的转录起始上游的70至80个碱基发现的另一个序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。大部分真核基因的3’端是AATAAA序列，其可以是将多A尾添加至编码序列3’端的信号。将所有这些序列合适地插入真核表达载体中。
在哺乳动物细胞系统中，通常优选来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。控制从哺乳动物宿主细胞中的载体的多肽表达，例如，通过获自病毒(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如，腺病毒2)、牛乳头状瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、逆转录病毒、乙肝病毒，并且最优选猿猴病毒40(SV40))基因组的启动子、异源哺乳动物启动子(例如，激动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)和热休克启动子来控制，只要这些启动子与宿主细胞系统相适。如果需要产生含有多肽编码序列的多个拷贝的细胞系，可以将基于SV40或EBV的载体有利地与合适的选择标记一起使用。合适的表达载体的一个实例是pcDNA-3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其包括CMV启动子。
各种基于病毒的表达系统可用于多肽的哺乳动物表达。例如，在其中将腺病毒用作表达载体的情况中，可以将编码目标多肽的序列连接至腺病毒转录／翻译复合物中，所述复合物由晚期启动子和三重前导序列组成。病毒基因组的非必需E1或E3中的插入可以用于获得能够在感染的宿主细胞中表达多肽的活病毒(Logan，J.和Shenk，T.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81：3655-3659)。此外，转录增强子，如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子，可以用于提高哺乳动物宿主细胞中的表达。
在细菌系统中，根据打算为表达的多肽的使用，选择多种表达载体中的任何一种。例如，需要大的含量时，使用针对容易纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。这样的载体包括，但不限于，多功能大肠杆菌克隆和表达载体，如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中可以将编码目标多肽的序列连接至载体中，在框内连接用于氨基端Met的序列和随后的β-半乳糖苷酶的7个残基，使得产生杂合蛋白；pIN载体(Van Heeke，G.和S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.264：5503-5509)；等。pGEX载体(Promega，Madison，WI)也可以用于表达外源多肽，作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白来表达。通常，这样的融合蛋白是可溶的，并且通过吸附至谷胱甘肽-琼脂糖珠子，接着在游离谷胱甘肽的存在下洗脱，将其容易从溶解的细胞中纯化出来。将在这些系统中制得的蛋白设计成包括肝素、凝血酶或因子XA蛋白酶分裂位点，使得编码的目标多肽可以从GST部分随意地释放出来。
在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，使用含有组成型或诱导型启动子的各种载体，如α因子、醇氧化酶和PGH。其他合适的与酵母宿主一起使用的启动子序列的实例包括用于3-磷酸甘油酯激酶或其他糖分解酶(如，烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸酯变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶)的启动子。对于综述，参见Ausubel等(上文)和Grant等(1987)Methods Enzymol.153：516-544。具有通过生长条件控制转录的其他优势的是诱导型启动子的其他酵母启动子包括用于醇脱氢酶-2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。用于酵母表达中的合适载体和启动子进一步描述于EP73,657中。酵母增强子也有利地与酵母启动子一起使用。
在其中使用植物表达载体的情况中，通过多种启动子中的任何一种来驱动编码多肽的序列的表达。例如，病毒启动子，如CaMV的35S和19S启动子，单独使用或结合来自TMV的ω前导序列一起使用(Takamatsu，N.(1987)EMBO J.6：307-311)。或者，使用植物启动子，如RUBISCO的小亚基或热休克启动子(Coruzzi，G.等(1984)EMBO J.3：1671-1680；Broglie，R.等(1984)Science224：838-843；和Winter，J.等(1991)Results Probl.CellDiffer.17：85-105)。可以通过直接DNA转化或病原体介导的转染，将这些构建体引入植物细胞中。这样的技术描述于多个通常可获得的综述中(参见，例如，Hobbs，S.或Murry，L.E.见McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)McGrawHill，New York，N.Y.；pp.191-196)。
昆虫系统也用于表达目标多肽。例如，在一个这样的系统中，将苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病病毒(AcNPV)用作载体，以在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因。将编码多肽的序列克隆至病毒的非必需区域中，如多角体蛋白基因，并且置于多角体蛋白启动子的控制下。多肽编码序列的成功插入使得多角体蛋白失活并且产生缺乏外壳蛋白的重组病毒。然后将重组病毒用于感染，例如，草地贪夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫，在其中表达目标多肽(Engelhard，E.K.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：3224-3227)。
特异性的起始信号也用于获得更有效的编码目标多肽的序列的翻译。这样的信号包括ATG起始密码子和邻近的序列。在其中将编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列插入合适的表达载体中的情况中，不需要另外的转录或翻译控制序列。然而，在其中只插入了编码序列或其部分的情况中，提供外源性翻译控制信号，包括ATG起始密码子。此外，起始密码子在正确的阅读框中，以确保插入的多核苷酸的正确翻译。外源性翻译元件和起始密码子是各种来源的，天然的和合成的。
常常通过将增强子序列插入载体中来提高编码本发明多肽的DNA的转录。许多增强子序列是已知的，包括，例如，在编码球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰岛素的基因中鉴定的那些。然而，通常，使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点后侧上的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧上的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。关于用于真核启动子激活的增强元件，还可以参见，Yaniv，Nature297：17-18(1982)。将增强子在多肽编码序列的5’或3’位置剪接至载体中，但优选位于启动子的5’位点。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物体的有核细胞)中的表达载体通常还含有终止转录和稳定mRNA所需的序列。这样的序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’和偶然3’未翻译区获得。这些区域含有作为编码抗-PSCA抗体的mRNA的未翻译部分中的多腺苷酸化片段转录的核苷酸区段。一个有用的转录终止成分是牛生长激素多腺苷酸化区。参见WO94／11026和其中公开的表达载体。
用于在本文中的载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞是以上所述的原核生物、酵母、植物或高等真核生物细胞。用于该目的的合适的原核生物的实例包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如，大肠埃希氏菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)，例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，1989年4月12日公开的DD266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠埃希氏菌克隆宿主是大肠埃希氏菌294(ATCC31,446)，尽管其他菌株，如大肠埃希氏菌B、大肠埃希氏菌X1776(ATCC31,537)和大肠埃希氏菌W3110(ATCC27,325)是合适的。这些实例是说明性的，而不是限制。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或普通烘焙酵母，是最常用的低等真核宿主微生物。然而，各种其他属、种和株通常是可获得的并用于本文中，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；耶罗维亚酵母(yarrowia)(EP402，226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP183,070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP244,234)；粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)；许旺酵母(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，如，例如，链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和米曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
在特定的实施方案中，为了调节插入序列的表达或以所需方式加工表达蛋白的能力来选择宿主细胞株。这样的多肽的修饰包括，但不限于，乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。分裂“prepro”形式的蛋白的翻译后加工也用来促进正确的插入、折叠和／或功能。选择不同的宿主细胞，如CHO、COS、HeLa、MDCK、HEK293和WI38，其具有特定的细胞机制和特征性的用于这样的翻译后活性的机制，以确保正确的修饰和外源蛋白的加工。
特别适用于抗体或其片段表达的方法和试剂也是本领域已知和可获得，包括例如U.S.专利No.4816567和6331415中所述的那些。在各种实施方案中，从相同或分开的表达载体表达抗体重链和轻链，或其片段。在一个实施方案中，在相同的细胞中表达两条链，由此促进功能性抗体或其片段的形成。
在细菌中生产全长抗体、抗体片段和抗体融合蛋白，特别是不需要糖基化和Fc效应物功能时，如将治疗抗体与细胞毒性剂(例如，毒素)偶联且免疫偶联物自身显示出在感染细胞破坏中的有效性时。对于在细菌中的抗体片段和多肽的表达，参见，例如，U.S.专利No.5,648,237、5,789,199和5,840,523，其描述了翻译起始区(TIR)以及用于优化表达和分泌的信号序列。表达后，从可溶部分中的大肠杆菌细胞糊状物中分离出抗体，并且可以纯化，例如，根据同种型，通过蛋白A或G柱来纯化。使用与用于纯化例如在CHO细胞中加工的抗体的相似方法来进行最终的纯化。
用于糖基化多肽和抗体表达的合适宿主细胞源自多细胞生物体。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了各种杆状病毒株和变体以及相应的来自如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、Aedes aegypti(蚊子)、Aedes albopicius(蚊子)、Drosophila melanogaster(果蝇)和蚕(Bombyx mori)这些宿主的容许的昆虫宿主细胞。各种用于转染的病毒株是公众可获得的，例如，Autographa californica NPV的L-1变体和蚕(Bombyxmori)NPV的Bm-5株，并且将这样的病毒用作根据本发明的本文中的病毒，特别是用于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、西红柿和烟草的植物细胞培养物可以用作宿主。
本发明包括在培养物中的脊椎动物细胞(组织培养物)中增殖抗体多肽及其片段的方法。用于本发明的方法中的哺乳动物宿主细胞的实例是SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾系(为在悬浮液培养物中生长而亚克隆的293或293细胞，Graham等，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞／-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216(1980))；小鼠足细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(HepG2，HB8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TR1细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤系(Hep G2)。
用上述的表达或克隆载体转化宿主细胞，用于多肽生产，并且在按照需要改良的常规营养培养基中培养，用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
对于长期的、高产量的重组蛋白生产，稳定的表达通常是优选的。例如，使用在相同或分开载体上含有病毒复制起点和／或内源性表达元件和选择标记基因的表达载体转化稳定表达目标多核苷酸的细胞系。引入载体后，使细胞在富集培养基中生长1-2天，然后将其转移至选择培养基。选择标记的目的是给药选择的抗性，并且它的存在使得成功表达引入序列的细胞可以生长和回收。使用适于所述细胞类型的组织培养技术，使稳定转化的细胞的抗性克隆增殖。
将多种选择系统用于回收转化的细胞系。这些包括，但不限于，分别用于tk-或aprt-细胞中的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler，M.等(1977)Cell11：223-32)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy，I.等(1990)Cell22：817-23)基因。此外，将抗代谢物、抗生素或除草剂抗性用作选择的基础；例如，dhfr，其给药氨甲喋呤抗性(Wigler，M.等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77：3567-70)；npt，其给药氨基糖苷、新霉素和G-418抗性(Colbere-Garapin，F.等(1981)J.Mol.Biol.150：1-14)；以及als或pat，其分别给药氯磺隆和草胺膦乙酰转移酶抗性(Murry，上文)。其他选择基因也已经得到了描述。例如，trpB允许细胞利用吲哚，替代色氨酸，而hisD允许细胞利用组胺醇，替代组氨酸(Hartman，S.C.和R.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：8047-51)。使用可见标记已经变得流行，这样的标记，如花青素、β-葡糖苷酸酶及其底物GUS以及荧光素酶及其底物荧光素，已经被广泛使用，不仅用于鉴定转化体，而且也用于定量归因于特异性载体系统的瞬时或稳定蛋白表达的含量(Rhodes，C.A.等(1995)Methods Mol.Biol.55：121-131).
尽管标记基因表达的存在／不存在表明目标基因也存在，证实了其存在和表达。例如，如果将编码多肽的序列插入标记基因序列内，通过标记基因功能的不存在来鉴定含有所述序列的重组细胞。或者，将标记基因与多肽编码序列串联置于单个启动子的控制下。应答诱导或选择的标记基因的表达通常也表明串联基因的表达。
或者，通过本领域技术人员已知的各种程序来鉴定含有和表达所需多核苷酸序列的宿主细胞。这些程序包括，但不限于，DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白生物试验或免疫试验技术，其包括，例如，基于膜、溶液或芯片的技术，用于检测和／或定量核酸或蛋白。
各种使用产物特异性的多克隆或单克隆抗体来检测和测量多核苷酸编码产物的表达的实验方案是本领域已知的。非限制性实例包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射性免疫试验(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。对于一些应用，优选利用与给定多肽上的两个非干扰表位反应的单克隆抗体的基于单克隆的免疫试验，但也可以使用竞争结合试验。在其他地方，这些和其他试验描述于Hampton，R.等(1990；Serological Methods，aLaboratory Manual，APS Press，St Paul.Minn.)和Maddox，D.E.等(1983；J.Exp.Med.158：1211-1216)。
各种标记物和偶联技术是本领域技术人员已知的，并且用于各种核酸和氨基酸试验中。用于生产涉及多核苷酸的标记的杂交或PCR探针的方法包括寡标记、切口平移、末端标记或使用标记核苷酸的PCR扩增。或者，将序列或其任何部分克隆至用于生产mRNA探针的载体中。这样的载体是本领域已知的，是可购得的，并且用于在体外合成RNA探针，通过合适的RNA聚合酶(如，T7、T3或SP6)和标记的核苷酸的添加。使用各种可购得的试剂盒来进行这些程序。所用的合适的报告分子或标记包括，但不限于，放射性核素、酶、荧光、化学发光或显色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁颗粒等。
根据所用的序列和／或载体，由重组细胞产生的多肽被分泌或包含在细胞内。将含有本发明多核苷酸的表达载体设计来含有信号序列，其指导编码的多肽通过原核或真核细胞膜分泌。
在特定的实施方案中，作为融合多肽来产生本发明的多肽，其进一步包括促进可溶性蛋白纯化的多肽结构域。这样的促进纯化的结构域包括，但不限于，金属螯合肽，如允许在固定的金属上纯化的组氨酸-色氨酸模块，允许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白A结构域和用于FLAGS延伸／亲和性纯化系统中的结构域(Amgen，Seattle，WA)。在纯化结构域和编码的多肽之间包含可分裂的连接物，如因子XA或肠激酶特异性的那些(Invitrogen，San Diego，CA)，用来促进纯化。示例性的表达载体提供融合蛋白的表达，所述融合蛋白含有目标多肽和编码6组氨酸残基的核酸(SEQ ID NO：319)，之后是硫氧还蛋白或肠激酶分裂位点。该组氨酸残基促进IMIAC(固定化的金属离子亲和性色谱)上的纯化，如Porath，J.等(1992，Prot.Exp.Purif.3：263-281)中所述的，同时肠激酶分裂位点提供了用于从融合蛋白纯化所需多肽的方法。Kroll，D.J.等(1993；DNA Cell Biol.12：441-453)中提供了用于生产融合蛋白的载体的讨论。
在特定的实施方案中，本发明的多肽与异源多肽融合，所述异源多肽可以是信号序列或在成熟蛋白或多肽的N-端具有特异性分裂位点的其他多肽。优选选择的异源信号序列是被宿主细胞识别并加工的序列(即，通过信号肽酶分裂)。对于原核宿主细胞，信号序列选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、1pp或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母分泌，信号序列选自例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母和克鲁维酵母α因子前导序列)或酸性磷酸酶前导序列、C.albicans葡糖淀粉酶或WO90／13646中描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如，单纯疱疹gD信号。
使用重组技术时，多肽或抗体在胞质间隙中在细胞内产生，或直接分泌至培养基中。如果多肽或抗体在胞内产生，作为第一个步骤，除去颗粒碎片，宿主细胞或溶解片段，例如，通过离心或超滤来去除。Carter等，Bio／Technology10：163-167(1992)描述了用于分离分泌至大肠杆菌的胞质间隙的抗体的程序。简而言之，在醋酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氯(PMSF)的存在下，将细胞糊状物融化约30min。通过离心除去细胞碎片。当多肽或抗体分泌至培养基中时，通常首先使用可购得的蛋白浓缩滤器，例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤装置，将来自表达系统的上清液浓缩。任选，在之前的任一个步骤中包括蛋白酶抑制剂，如PMSF，以抑制蛋白分解，并且包括抗生素来防止外来污染物的生长。
使用，例如，羟磷灰石色谱、凝胶电泳、渗析和亲和性色谱，来纯化从细胞制得的多肽或抗体组合物，亲和性色谱是优选的纯化技术。蛋白A作用亲和性配体的适合性取决于多肽或抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构的物种和同种型。将蛋白A用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体或其片段(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。推荐蛋白G用于所有小鼠同种型和用于人γ3(Guss等，EMBO J.5：15671575(1986))。亲和性配体连接的基质最常见的是琼脂糖，但其他基质也是可用的。机械上稳定的基质，如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯，与琼脂糖相比，允许较快的流速和较短的加工时间。在多肽或抗体包含CH3结构域的情况中，将Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，N.J.)用于纯化。根据待回收的多肽或抗体，也可以使用用于蛋白纯化的其他技术，如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的色谱、阴离子或阳离子交换树脂上的肝素SEPHAROSETM色谱(如，聚天冬氨酸柱)、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
任何初步纯化步骤后，将含有目标多肽或抗体和污染物的混合物接受低pH疏水性相互作用色谱，使用约2.5-4.5pH的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如，约0-0.25M盐)下进行。
药物组合物
本发明进一步包括药物制剂，其包括本发明的所需纯度的多肽、抗体或调节剂和药物学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remingion′s Pharmaceutical Sciences16th edition，Osol，A.编辑，(1980))。在特定的实施方案中，制备药物制剂来增强多肽或抗体在存储过程中的稳定性，例如，以冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括，例如，缓冲剂，如醋酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如，十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双胺；苯扎氯铵、苯索氯胺；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和m-甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白，或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；张力调节剂(tonicifier)，如海藻糖和氯化钠；糖类，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；表面活性剂，如聚山梨酸酯；成盐反离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和／或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。在特定的实施方案中，治疗制剂优选含有浓度为5-200mg／ml的多肽或抗体，优选10-100mg／ml。
本文中的制剂还含有一种或多种适用于治疗特定适应症(例如，待治疗的感染)或用于预防不希望的副作用的其他治疗剂。优选，其他治疗剂具有与本发明的多肽或抗体互补的活性，并且两者没有不利地彼此影响。例如，除了本发明的多肽或抗体，将其他的或第二种抗体、抗病毒剂、抗感染剂和／或保心药加入制剂中。这样的分子以对于打算的目的有效的含量合适地存在于药物制剂中。
活性成分，例如，本发明的多肽和抗体和其他治疗剂，还可以包裹在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备，例如，羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚甲基丙烯酸酯微胶囊，分别在胶状药物传送系统中(例如，脂质体、白蛋白微胶囊、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗滴乳液中。这样的技术公开于Remingion′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，第16版，Osol，A.编辑(1980)。
制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括，但不限于，含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，该基质是成型颗粒的形式，例如，薄膜或微胶囊。持续释放基质的非限制性实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-丙烯酸甲酯)，或聚(乙烯醇)、聚交酯(U.S.专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和亮氨酸脯氨酸醋酸酯组成的可注射微球体)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内给药的制剂优选是无菌的。通过无菌过滤膜的过滤可以容易地实现这。
诊断用途
本发明的抗体及其片段和治疗组合物，与正常对照细胞和组织相比，特异性地结合或择优地结合感染的细胞或组织。因此，将这些A型流行性感冒抗体用于检测病人、生物样品或细胞群中的感染细胞或组织，使用各种诊断和预后方法中的任何一种，包括本文中所述的那些。抗-M2e特异性抗体检测感染细胞的能力取决于其结合特异性，这可以通过测试其结合获自不同病人和／或感染不同A型流行性感冒毒株病人的感染细胞或组织的能力来容易地测定。诊断方法通常涉及将获自病人的生物样品(如，例如，血液、血清、唾液、尿液、痰液、细胞拭子样品或组织活检样品)接触A型流行性感冒，例如，HuM2e抗体，并且测定与对照样品或预定截留值相比，抗体是否择优地结合样品，由此表明感染细胞的存在。在特定的实施方案中，与合适的对照正常细胞或组织样品相比，HuM2e抗体结合感染细胞高至少两倍、三倍或五倍。例如，通过在用于进行待测试生物样品的诊断试验的相同条件下结合几种不同的合适对照样品的HuM2e抗体的含量进行平均，来确定截留值。
使用本文中所述的和本领域已知的程序来检测结合的抗体。在特定的实施方案中，使用与可检测标记偶联的HuM2来实施本发明的诊断方法，所述可检测标记为荧光团，以促进结合的抗体的检测。然而，还使用第二种检测HuM2e抗体的方法来实施它们。这些包括，例如，RIA、ELISA、沉淀、凝集、补体固定和免疫荧光。
在特定的程序中，将HuM2e抗体进行标记。直接检测该标记。直接检测的示例性标记包括，但不限于，放射性标记和荧光染料。替换地，或另外地，标记是必须反应或衍化才能被检测到的部分，如酶。同位素标记的非限制性实例是99Tc、14C、131I、125I、3H、32P和35S。所用的荧光材料包括，但不限于，例如，荧光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、金胺、丹酰、伞形酮、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、溶菌酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
通过目前所用的比色、分光、荧光分光-光度或气体定量技术中的任何一种来检测酶标记。用于这些程序中的许多酶是已知的并且用于本发明的方法中。非限制性实例是过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加过氧化物酶、半乳糖氧化酶加过氧化物酶和酸性磷酸酶。
通过已知的方法用这样的标记来标记抗体。例如，使用偶联剂，如醛类、碳二亚胺、二马来酰亚胺、亚氨酯、琥珀酰亚胺、bid-重氮化联苯胺等，用上述荧光剂、化学发光和酶标记来标记抗体。通常使用桥接分子，如碳二亚胺、高碘酸酯、二异氰酸酯、戊二醛等，将酶结合抗体。各种标记技术描述于Morrison，Methods in Enzymology(酶学方法)32b，103(1974)，Syvanen等，J.Biol.Chem.284，3762(1973)以及Bolton和Hunter，BiochemJ.133，529(1973)。
使用本文中提供的代表性试验，本发明的HuM2e抗体能够区分患有A型流行性感冒感染的病人和未患有A型流行性感冒感染的病人，并且确定病人是否具有感染。根据一种方法，从怀疑患有或已知患有A型流行性感染的病人获得生物样品。在优选的实施方案中，生物样品包括来自病人的细胞。将样品接触HuM2e抗体，例如，持续一定的时间并且在足以使HuM2e抗体结合样品中存在的感染细胞的条件下。例如，将样品接触HuM2e抗体10秒钟，30秒钟，1分钟，5分钟，10分钟，30分钟，1小时，6小时，12小时，24小时，3天或之间的任何点。测定结合的HuM2e抗体的含量，并且与对照值相比，所述对照值可以是例如预定值或从正常组织样品测定的值。与对照相比，提高的结合病人样品的抗体的含量表示病人样品中存在感染的细胞。
在相关的方法中，将获自病人的生物样品接触HuM2e抗体，持续一定的时间并且在足以使抗体结合样品中存在的感染细胞的条件下。然后检测结合的抗体，并且结合的抗体的存在表示样品中含有感染的细胞。HuM2e抗体没有以可检测水平结合正常细胞时，该实施方案特别有用。
不同的HuM2e抗体具有不同的结合和特异性特征。根据这些特征，将特定的HuM2e抗体用于检测一种或多种A型流行性感冒毒株的存在。例如，特定的抗体仅特异性地结合一种或几种流行性感冒病毒的毒株，而其他结合全部或大部分不同的流行性感冒病毒的毒株。将只对一种A型流行性感冒毒株特异性的抗体用于鉴定感染毒株。
在特定的实施方案中，结合感染细胞的抗体优选产生表示至少约20％的病人中存在感染的信号，患有待检测的感染，更优选至少约30％的病人。替换地，或另外地，抗体产生表示至少约90％个体中不存在感染的信号，没有待检测的感染。每个抗体满足以上的标准；然而，本发明的抗体结合使用来提高灵敏度。
本发明还包括用于进行诊断和预后试验的试剂盒，使用本发明的抗体。本发明的试剂盒包括合适的容器，其包含标记或未标记形式的本发明的HuM2e抗体。此外，以适用于间接结合试验的标记形式提供抗体时，试剂盒进一步包括用于进行合适的间接试验的试剂。例如，试剂盒包括一个或多个合适的容器，根据标记的性质，其包括酶底物或衍化剂。还包括对照样品和／或说明书。
治疗／预防用途
已经证明了被动免疫是用于预防和治疗病毒疾病的有效且安全的策略。(参见，Keller等，Clin.Microbiol.Rev.13：602-14(2000)；Casadevall，Nat.Biotechnol.20：114(2002)；Shibata等，Nat.Med.5：204-10(1999)和Igarashi等，Nat.Med.5：211-16(1999)，将每篇按引用并入本文中作为参考)。使用人单克隆抗体的被动免疫提供了用于紧急情况的流行性感冒的预防和治疗的即时治疗策略。
本发明的HuM2e抗体及其片段和治疗组合物，与正常的对照的未感染细胞和组织相比，特异性地结合或择优地结合感染的细胞。因此，将这些HuM2e抗体选择性地靶向病人、生物样品或细胞群中的感染细胞或组织。根据这些抗体的感染特异性结合特性，本发明提供了调节(例如，抑制)感染细胞生长的方法、杀灭感染细胞的方法和诱导感染细胞凋亡的方法。这些方法包括将感染的细胞接触本发明的HuM2e抗体。这些方法在体外、exvivo和体内实施。
在各种实施方案中，本发明的抗体本身在治疗上是有活性的。替换地，或另外地，本发明的抗体与细胞毒性剂或生长抑制剂偶联，例如，放射性同位素或毒素，其用于治疗被抗体结合或接触的感染细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防病人感染的方法，包括给诊断为患有A型流行性感冒感染、处于产生A型流行性感冒感染风险中或怀疑患有A型流行性感冒感染的病人提供本发明的HuM2e抗体。本发明的方法用于感染的第一线治疗、继续治疗或复发或难治疗感染的治疗中。用本发明的抗体的治疗是独立的治疗。或者，使用本发明的抗体的治疗是联合治疗方案的一个部分或一个阶段，其中一种或多种其他治疗剂也用于治疗病人。
处于流行性感冒病毒相关疾病或失调风险中的患者包括已经接触感染人员或已经以一些其他方式暴露于流行性感冒病毒的病人。在呈现流行性感冒病毒相关疾病或失调特征性症状之前，可以进行预防剂的给药，使得在其进展中预防或替换地延迟疾病或失调。
在不同的方面中，与患者感染基本上同时地给药huM2e或在患者感染后给药huM2e，即治疗性治疗。在另一个方面中，抗体提供治疗益处。在不同的方面中，治疗益处包括减轻或降低流行性感冒感染的一个或多个症状或并发症的进展、严重程度、频率、持续时间或可能性、病毒滴定度、病毒复制或一种或多种流行性感冒毒株的病毒蛋白的含量。在另一个方面中，治疗益处包括加速或促进患者从流行性感冒感染中恢复过来。
进一步提供了用于预防患者体内的流行性感冒病毒滴定度、病毒复制、病毒增殖或流行性感冒病毒蛋白的含量的增加的方法。在一个实施方案中，该方法包括将含量能有效预防患者体内流行性感冒病毒滴定度、病毒复制或一种或多种流行性感冒毒株或分离物的流行性感冒病毒蛋白含量增加的huM2e给药于患者。
另外提供了用于保护患者免受一种或多种流行性感冒毒株／分离物或亚型的感染或降低患者对感染一种或多种流行性感冒毒株／分离物或亚型的易感性的方法。在一个实施方案中，该方法包括将含量能有效保护患者免受一种或多种流行性感冒毒株／分离物或亚型的感染或能有效降低患者对感染一种或多种流行性感冒毒株／分离物或亚型的易感性的特异性结合流行性感冒M2的huM2e抗体给药于患者。
任选，给患者进一步给药第二种药剂，如但不限于，流行性感冒病毒抗体、抗病毒药物，如神经氨酸酶抑制剂、HA抑制剂、唾液酸抑制剂或M2离子通道抑制剂、病毒进入抑制剂或病毒粘附抑制剂。M2离子通道抑制剂例如是金刚胺或金刚烷乙胺。神经氨酸酶抑制剂例如是扎那米韦，或磷酸奥赛米韦。
可以减轻或降低的流行性感冒感染的症状或并发症包括，例如，发冷、发烧、咳嗽、喉咙疼痛、鼻塞、鼻窦塞、鼻感染、鼻窦感染、体痛、头痛、疲劳、肺炎、支气管炎、耳感染、耳痛或死亡。
对于人和非人病人的体内治疗，通常给病人给药或提供包括本发明的HuM2e抗体的药物制剂。用于体内治疗时，将本发明的抗体以治疗有效量(即，消除或降低病人病毒负荷的含量)给药于病人。根据已知的方法，如静脉内给药，例如，作为大丸药或通过在一定时间段内的连续灌输，通过肌内、腹膜内、脑脊液内、皮下、关节内、滑液内、鞘内、口服、局部或吸入途径，将抗体给药于人病人。抗体可以非肠道地给药，可能时，在目标细胞位点给药，或静脉内给药。在特定的实施方案中，优选抗体的静脉内或皮下给药。将本发明的治疗组合物全身地、非肠道地或局部地给药于病人或患者。
对于非肠道给药，以单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)来配制抗体，结合药物学上可接受的、非肠道载体。这样的载体的实例是水、盐水、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用非水载体，如固定油和乙酸乙酯。将脂质体用作载体。载体含有少量添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质，例如，缓冲剂和防腐剂。抗体通常以约1mg／ml至10mg／ml的浓度配制于这些载体中。
剂量和给药方案取决于医生容易确定的各种因素，如感染的性质和与抗体偶联的特定细胞毒性剂或生长抑制剂(使用时)的特征，例如，治疗指数、病人和病人的病史。通常，将治疗有效量的抗体给药于病人。在特定的实施方案中，给药的抗体含量在约0.01mg／kg至约100mg／kg病人体重的范围中，或更优选，在约0.1mg／kg至约40mg／kg病人体重的范围中。根据感染的类型和严重程度，约0.1mg抗体／kg体重至约40mg抗体／kg体重(例如，约0.1-40mg／kg／剂)是用于给药于病人的最初候选剂量，然而，无论如何，通过一次或多次分开的给药，或通过连续灌输。在可替换的实施方案中，给药的抗体含量在0.01mg／kg至0.1mg／kg、0.1mg／kg至0.10mg／kg、0.10mg／kg至1mg／kg、1mg／kg至10mg／kg、10mg／kg至20mg／kg、20mg／kg至30mg／kg、30mg／kg至40mg／kg、40mg／kg至50mg／kg、50mg／kg至60mg／kg、60mg／kg至70mg／kg、70mg／kg至80mg／kg、80mg／kg至90mg／kg或90mg／kg至100mg／kg病人体重的范围中。在其他方面中，给药的抗体含量在0.01mg／kg至100mg／kg、0.1mg／kg至60mg／kg、10mg／kg至40mg／kg、20mg／kg至30mg／kg病人体重的范围中，或其中的任何范围。可以通过常规的方法和试验并基于医生或本领域其他技术人员已知的标准来容易地监控这种治疗的进展。
在一个特定的实施方案中，将包括与细胞毒性剂偶联的抗体的免疫偶联物给药于病人。优选，免疫偶联物被细胞内在化，导致免疫偶联物在杀灭与其结合的细胞中提高的治疗功效。在一个实施方案中，细胞毒性剂靶向或干扰感染细胞中的核酸。以上描述了这样的细胞毒性剂的实例，包括并不限于，maytandinoid、calicheamicin、核酸核糖酶和DNA核酸内切酶。
将其他治疗方案结合本发明的HuM2e抗体的给药。联合给药包括共同给药，使用分开的制剂或单个药物制剂，以及以任一种顺序的连续给药，其中优选，存在一个时间段，同时两种(或全部)活性剂同时发挥出它们的生物活性。优选，这样的联合治疗导致协同治疗效果。
在特定的实施方案中，希望将本发明抗体的给药结合针对与感染剂相关的另一种抗原的另一种抗体。
除了将抗体蛋白给药于病人，本发明提供了通过基因治疗给药抗体的方法。通过表述“给药治疗有效量的抗体”来包括这种编码抗体的核酸的给药。参见，例如，PCT专利申请公开WO96／07321，其涉及使用基因治疗来产生胞内抗体。
在另一个实施方案中，将本发明的抗-M2e抗体用于确定结合的抗原的结构，例如，构象表位，然后将该结构用于研发具有或模拟这种结构的疫苗，例如，通过化学建模和SAR方法。然后将这样的疫苗用于预防A型流行性感冒的感染。
本说明书中涉及的和／或申请数据单中所列的以上U.S.专利、U.S.专利申请公开、U.S.专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物的全部以其整体按引用并入本文中作为参考。
实施例
实施例1：使用表达重组M2e蛋白的细胞筛选和表征人血浆 中存在的M2e-特异性抗体
按照以下所述的，在病人血清中鉴定M2特异性的并能够结合A型流行性感冒感染细胞和流行性感冒病毒自身的完全人单克隆抗体。
细胞系中的M2表达
将含有M2全长cDNA的表达构建体转染至293细胞中，M2全长cDNA对应于流行性感冒亚型HIN1A／Fort Worth／1／50中发现的衍生M2序列。
通过以下多核苷酸序列和SEQ ID NO：53编码的M2cDNA：
ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACGCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAACGATTCAAGTGATCCTCTTGTTGTTGCCGCAAGTATCATTGGGATCCTGCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTATCGTCTCTTTAAACACGGTCTGAAAAGAGGGCCTTCTACGGAAGGAGTACCAGAGTCTATGAGGGAAGAATATCGAAAGGAACAGCAGAGTGCTGTGGATGCTGACGATAGTCATTTTGTCAACATAGAGCTGGAG
通过以下多核苷酸序列(对应于Genbank登录NoX08091）编码的M2cDNA：
Figure BDA0000413462010001481
通过以下多肽序列(对应于Genbank登录No.X080901)编码的蛋白：
MSLLTEVETYVLSIVPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEALMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDRAVKLYRKLKREITFHGAKEIALSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQMVTTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMEVASQARQMVQAMRAIGTHPRSSAGLKDDLLENLQAYQKRMGVQMQRFK
使用抗-M2e肽特异性的MAb14C2证实了M2的细胞表面表达。两个其他的M2变体，来自A／Hong Kong／483／1997(HK483)和A／Vietnam／1203／2004(VN1203)，用于随后的分析，由于可以通过M2e中的各种氨基酸取代来停止14C12结合，使用本发明的M2-特异性单克隆抗体测定它们的表达。
外周血中的抗体的筛选
测试超过120个单独血浆样品的结合M2的抗体。没有一个呈现出与M2e肽的特异性结合。然而，10％的血浆样品含有特异性结合293-M2H1N1细胞系的抗体。这表明可以将抗体归类为结合M2同型四聚体的构象决定簇和结合多种M2同型四聚体变体的构象决定簇；它们对于线性M2e肽不是特异性的。
抗-M2MAb的表征
通过这种方法鉴定的人MAb证明了结合M2同型四聚体上的构象表位。它们结合初始293-M2转染体，以及结合两个其他细胞表达的M2变体。14C2MAb，除了结合M2e肽，证明了对M2变体序列更敏感。此外，14C2没有容易地结合流行性感冒病毒离子，而构象特异性抗-M2MAb可以。
这些结果证明本发明的方法提供了从对流行性感冒的正常人免疫应答中鉴定M2MAb，而不需要M2的特异性免疫。如果用于免疫治疗，这些完全人MAb具有病人更耐受人源化小鼠抗体的潜能。另外，并且与14C2和Gemini Biosciences MAb(其结合线性M2e肽)相反，本发明的MAb结合M2的构象表位，并且不仅对A型流行性感冒毒株感染的细胞是特异性的，而且对病毒自身也是特异性的。本发明的MAb的另一个优势在它们各自结合全部测试的M2变体，表明它们不限于特定的线性氨基酸序列。
实施例2：M2-特异性抗体的鉴定
将表达按照实施例1中所述的在人血清中鉴定的三种MAb的单核或B细胞稀释至克隆群中，并且诱导来产生抗体。为了结合用全长M2E蛋白稳定转染的293FT细胞，筛选含有抗体的上清液，所述全长M2E蛋白来自流行性感冒毒株流行性感冒亚型H1N1。将显示出阳性染色／结合的上清液在用全长M2E蛋白稳定转染的293FT细胞上和作为对照的载体单独转染的细胞上再次重新筛选，所述全长M2E蛋白来自流行性感冒毒株流行性感冒亚型H1N1。
然后从上清液显示出阳性结合的B细胞孔救助克隆将抗体的可变区。在293FT细胞中进行瞬时转染，以重建和产生这些抗体。为了结合用以上详述的全长M2E蛋白稳定转染的293FT细胞，筛选重建的抗体上清液，以鉴定救助的抗-M2E抗体。鉴定了三种不同的抗体：8i10、21B15和23K12。通过救助筛选分离出第四种另外的抗体克隆，4C2。然而，其不是独特的，并且具有与克隆8i10确实相同的序列，尽管其来自不同于克隆8i10的供体。
以下提供了这些抗体的κ和γ可变区的序列。
克隆8i10：
将抗M2克隆8i10的κLC可变区克隆为Hind III至BsiW1片段(参见下文)，并且通过以下多核苷酸序列以及SEQ ID NO：54(上)和SEQ ID NO：55(下)来编码：
AAGCTTCCACCATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGTTCGAAGGTGGTACCTGTACTCCCAGGAGCGAGTCGAGGACCCCGAGGACGATGAGACCGAGGCTCCACCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGTATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAGGTCTACACTGTAGGTCTACTGGGTCAGAGGTAGGAGGGACAGACGTAGACATCCTCTGTCTCAGTGGTTCACTTGCCGGGCGAGTCAGAACATTTACAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAGACCAGGGAAAGCCCAGTGAACGGCCCGCTCAGTCTTGTAAATGTTCATAAATTTAACCATAGTCGTCTCTGGTCCCTTTCGGGCTAAGGGCCTGATCTCTGCTGCATCCGGGTTGCTAAAGTGGGGTCGCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATGATTCCCGGACTAGAGACGACGTAGGCCCAACGTTTCACCCCAGGGTAGTTCCAAGTCACCGTCACCTACTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACGACCCTGTCTAAAGTGAGAGTGTAGTGGTCAGACGTTGGACTTCTAAAACGTTGAATGATGACAGTTG
AGAGTTACAGTCCCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGCACCAGGGTGGAGATCAAACGTACGTCTCAATGTCAGGGGGAGAGTGAAAGCCGCCTCCCTGGTCCCACCTCTAGTTTGCATGC
8i10κLC可变区的翻译如下，多核苷酸序列(上文，SEQ IDNO：54，上)和氨基酸序列(下文，对应于SEQ ID NO：56的残基1-131)。
Figure BDA0000413462010001521
8i10κLC可变区的的氨基酸序列如下，具有以下鉴定的特异性结构域(根据Kabat方法限定的CDR序列)：
Figure BDA0000413462010001522
以下是克隆至表达载体pcDNA3.1中的8i10的κLC可变区的实例，所述载体已经含有κLC恒定区(上多核苷酸序列对应于SEQ ID NO：65，下多核苷酸序列对应于SEQ ID NO：66，氨基酸序列对应于以上所述的SEQ ID NO：56)。非下划线的碱基表示pcDNA3.1载体序列；下划线的碱基表示克隆的抗体序列。还将本文中所述的抗体克隆至表达载体pCEP4中。
以下是克隆至表达载体pcDNA3.1中的8i10的γHC可变区的实例，所述载体已经含有γHC恒定区(上多核苷酸序列对应于SEQ ID NO：78，下多核苷酸序列对应于SEQ ID NO：79，氨基酸序列对应于以上所示的SEQ ID NO：69)。未下划线的碱基表示pcDNA3.1载体序列；下划线的碱基表示克隆的抗体序列。
Figure BDA0000413462010001531
Figure BDA0000413462010001541
将8i10γHC可变区克隆为Hind III至Xho1片段，并且由以下多核苷酸序列以及SEQ ID NO：67(上)和SEQ ID NO68(下)编码。
HindIII
AAGCTTCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGCTGGGTTTCGAAGGTGGTACTTTGTGGACACCAAGAAGGAAGAGGACCACCGTCGAGGGTCGACCCACCTGTCCCAGGTGCAATTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTCAAGCCTTCGGAGACCCTGGGACAGGGTCCACGTTAACGTCCTCAGCCCGGGTCCTTGACCACTTCGGAAGCCTCTGGGACTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTTCGTCCATCAGTAATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGGGAGTGGACGTGACAGAGACCAAGCAGGTAGTCATTAATGATGACCTCGACCTAGGCCGAGTCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTTTATCTATTACGGTGGAAACACCAAGTATCTGGGGTCCCTTCCCTGACCTCACCTAACCCAAATAGATAATGCCACCTTTGTGGTTCATCAATCCCTGGGTCAAGAGCCGCGTCACCATATCACAAGACACTTCCAAGAGTCAGGTCTCCGTTAGGGAGGGAGTTCTCGGCGCAGTGGTATAGTGTTCTGTGAAGGTTCTCAGTCCAGAGGCTGACGATGAGCTCTGTGACCGCTGCGCAATCGGCCGTCTATTTCTGTGCGAGAGCGTCTTGACTGCTACTCGAGACACTGGCGACGCCTTAGCCGGCAGATAAAGACACGCTCTCGCAGAA
Xho1
GTAGTGGTGGTTACTGTATCCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGCATCACCACCAATGACATAGGAACTGATGACCCCGGTCCCTTGGGACCAGTGGCAGAGCTC
8i10γHC的翻译如下，多核苷酸序列(上文，SEQ ID NO：67，上)和氨基酸序列(下文，对应于SEQ ID NO：69的残基1-138)：
Figure BDA0000413462010001551
8i10γHC的氨基酸序列如下，具有以下鉴定的特异性结构域(根据Kabat方法限定的CDR序列)：
以下是克隆至表达载体pcDNA3.1中的8i10的γHC可变结构域的实例，所述表达载体已经含有γHC恒定区(上多核苷酸序列对应于SEQ ID NO：78，下多核苷酸序列对应于SEQ IDNO：79，氨基酸序列对应于以上显示的SEQ ID NO：69)。非下划线的碱基表示pcDNA3.1载体序列；下划线的碱基表示克隆的抗体序列。
Figure BDA0000413462010001561
γHC的框架4区(FR4)通常结束于两个丝氨酸(SS)，使得完整的框架区4区应当是WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：80)。载体中接受Xho1位点和Xho1位点下游的一个另外的碱基，其中克隆了γHC恒定区和γHC可变区，提供了最后一个碱基，其编码框架4的这最后一个氨基酸。然而，初始载体没有调节形成Xho1位点(CTCGAG，SEQ ID NO：81)和含有Xho1位点的“A”核苷酸下游时形成的沉默突变，其引起框架4末端的氨基酸变化：丝氨酸至精氨酸(S至R)取代，存在于所有工作γHC克隆中。因此，完整的框架4区为WGQGTLVTVSR(SEQ ID NO：82)。将形成将来的构建体，其中Xho1位点下游碱基是“C”核苷酸。因此，在可替换的实施方案中，用于γHC可变区序列克隆的Xho1位点的形成是沉默突变，并且将框架4氨基酸序列恢复成正确的WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：80)。这对于本文中所述的所有M2γHC克隆是真实的。
克隆21B15：
将抗M2克隆21B15的κLC可变区克隆为Hind III至BsiW1片段，并且通过以下的多核苷酸序列以及SEQ ID NO：83和SEQID NO：84来编码。
HindIII
AAGCTTCCACCATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGCTTCGAAGGTGGTACCTGTACTCCCAGGAGCGAGTCGAGGACCCCGAGGACGATGAGACCGAGGCTCCACGCAGATGTGACATCCAGGTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCGTCTACACTGTAGGTCCACTGGGTCAGAGGTAGGAGGGACAGACGTAGACATCCTCTGTCTCAGTGGTAGACTTGCCGCGCGAGTCAGAACATTTACAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAGACCAGGGAAAGCCCCTATGAACGGCGCGCTCAGTCTTGTAAATGTTCATAAATTTAACCATAGTCGTCTCTGGTCCCTTTCGGGGATAGGGCCTGATCTCTGCTGCATCCGGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTCCCGGACTAGAGACGACGTAGGCCCAACGTTTCACCCCAGGGTAGTTCCAAGTCACCGTCACCTAGACCGACAGATTTCACTCTCACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTCTGTCTAAAGTGAGAGTGGTAGTGGTCAGACGTTGGACTTCTAAAACGTTGAATGATGACAGTTGTCTCA
BsiWl
TACAGTCCCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAGGGTGGATATCAAACGTACGATGTCAGGGGGAGAGTGAAAGCCGCCTCCCTGGTCCCACCTATAGTTTGCATGC
21B15κLC可变区的翻译如下，多核苷酸序列(上文，SEQID NO：83，上)和氨基酸序列(下文，对应于SEQ ID NO：320)：
Figure BDA0000413462010001581
21B15κLC可变区的氨基酸序列如下，具有以下鉴定的特定结构域(根据Kabat方法限定的CDR序列)：
用于克隆κLC可变区的引物延伸穿过多样性区，并且在其设计中具有不稳定位置。因此，在框架4区中，可以出现D或E氨基酸。在一些情况中，救助抗体中的该位置的氨基酸可以不是在B细胞中产生的初始母体氨基酸。在大部分κLC中，该位置是E。关注以上的克隆(21B15)，观察到框架4(DIKRT)(SEQID NO：321)中的D。然而，关注周围的氨基酸，作为引物的结果发生，并且可以是人造的。来自B细胞的天然抗体在该位置可以具有E。
将21B15γHC可变区克隆为Hind III至Xho1片段，并且通过以下多核苷酸序列以及SEQ ID NO：85(上)和SEQ ID NO：86(下)来编码：
HindIII
AAGCTTCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGCTGGGTCCTTCGAAGGTGGTACTTTGTGGACACCAAGAAGGAAGAGGACCACCGTCGAGGGTCGACCCAGGTGTCCCAGGTGCAATTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCACAGGGTCCACGTTAACGTCCTCAGCCCGGGTCCTGACCACTTCGGAAGCCTCTGGGACAGGGTCACCTGCACTGTCTCTGGTTCGTCCATCAGTAATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGTCCCAGTGGACGTGACAGAGACCAAGCAGGTAGTCATTAATGATGACCTCGACCTAGGCCGTCAGGGCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTTTATCTATTACGGTGGAAACACCAAGTACAATCCCTGTCCCTTCCCTGACCTCACCTAACCCAAATAGATAATGCCACCTTTGTGGTTCATGTTAGGGACCCTCAAGAGCCGCGTCACCATATCACAAGACACTTCCAAGAGTCAGGTCTCCCTGACGATGAGGGAGTTCTCGGCGCAGTGGTATAGTGTTCTGTGAAGGTTCTCAGTCCAGAGGGACTGCTACTGCTCTGTGACCGCTGCGGAATCGGCCGTCTATTTCTGTGCGAGAGCGTCTTGTAGTGGTGGTTCGAGACACTGGCGACGCCTTAGCCGGCAGATAAAGACACGCTCTCGCAGAACATCACCACCAA
Xho1
ACTGTATCCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGTGACATAGGAACTGATGACCCCGGTCCCTTGGGACCAGTGGCAGAGCTC
21B15γHC的翻译如下，多核苷酸序列(上文，SEQ IDNO：87，上)和氨基酸序列(下文，对应于SEQ ID NO：69的残基1-138)。
Figure BDA0000413462010001591
21B15γHC的氨基酸序列如下，具有以下鉴定的特定结构域(根据Kabat方法限定的CDR序列)：
Figure BDA0000413462010001592
Figure BDA0000413462010001601
克隆23K12：
将抗M2克隆23K12的κLC可变区克隆为Hind III至BsiW1片段(参见下文)，并且通过以下的多核苷酸序列SEQ ID NO：88(上)和SEQ ID NO：89(下)来编码。
HindIII
AAGCTTCCACCATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTTCGAAGGTGGTACCTGTACTCCCAGGAGCGAGTCGAGGACCCCGAGGACGATGAGACCGAGGCTCCTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACGGTCTACACTGTAGGTCTACTGGGTCAGAGGTAGGAGGGACAGACGTAGACATCCTCTGTCTCAGACCATCACTTGCCGGACAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGATGGTAGTGAACGGCCTGTTCAGTCTCGTAATCGTCGATAAATTTAACCATAGTCGTCTTTGGTCCCTAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGTTCGGGGATTTGAGGACTAGATACGACGTAGGTCAAACGTTTCACCCCAGGGTAGTTCCAAGTCACCCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACCTACGTCACCTAGACCCTGTCTAAAGTGAGAGTGGTAGTCGCCAGACGTTGGACTTCTAAAACGTTGGATG
BsiW1
TACTGTCAACAGAGTTACAGTATGCCTGCCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGATGACAGTTGTCTCAATGTCATACGGACGGAAACCGGTCCCCTGGTTCGACCTCTAGTTTGCATGC
23K12的κLC可变区的翻译如下，多核苷酸序列(上文，SEQ ID NO：90，上)和氨基酸序列(下文，对应于SEQ ID NO：91)。
Figure BDA0000413462010001602
23K12的κLC可变区的氨基酸序列如下，具有以下鉴定的特异性结构域(根据Kabat方法限定的CDR序列)：
Figure BDA0000413462010001603
Figure BDA0000413462010001611
将23K12γHC可变区克隆为Hind III至Xho1片段，并且通过以下多核苷酸序列以及SEQ ID NO：97(上)和SEQ ID NO：98(下)来编码。
HindIII
AAGCTTCCACCATGGAGTTGGGGCTGTGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTTTCGAAGGTGGTACCTCAACCCCGACACGACCCAAAAGGAACAACGATAAAATTTTCCACAGGTCAGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGAATCTCCTCACTCCACGTCGACCACCTCAGACCCCCTCCGAACCAGGTCGGACCCCCCAGGGACTCTTAGAGGAGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAGCAACTACATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGCACGTCGGAGACCTAAGTGGCAGTCATCGTTGATGTACTCAACCCAGGCGGTCCGAGGTCCCTTCCGGCTGGAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCACCGACCTCACCCAGAGTCAATAAATATCACCACCATCGTGTATGATGCGTCTGAGGCACTTCCCGTGATTCTCCTTCTCCAGAGACAACTCCAAGAACACAGTGTTTCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGCTAAGAGGAAGAGGTCTCTGTTGAGGTTCTTGTGTCACAAAGAAGTTTACTTGTCGGACTCTCGGCAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGATGTCTGAGCAGGATGCGGGGTTACGGTTTAGACGTCTTCCTGTGCCGACACATAATGACACGCTCTACAGACTCGTCCTACGCCCCAATGCCAAATCTGCAGA
Xho1
GGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAG
CCCCGGTTCCCTGGTGCCAGTGGCAGAGCTC
23K12γHC可变区的翻译如下，多核苷酸序列(上文，SEQID NO：99，上)和氨基酸序列(下文，对应于SEQ ID NO：100)：
23K12γHC可变区的氨基酸序列如下，具有以下鉴定的特异性结构域(根据Kabat方法限定的CDR序列)：
Figure BDA0000413462010001621
实施例3：保守抗体可变区的鉴定
比对三个抗体κLC和γHC可变区的氨基酸序列来鉴定保守区和残基，如下所示。
Figure BDA0000413462010001631
Figure BDA0000413462010001641
克隆8I10和21B15来自两个不同的供体，当仍然具有确实相同的γHC，在κLC中，仅在框架1区的位置4有一个氨基酸不同(氨基酸M vs.V，参见上文)，(排除κLC的框架4中的不稳定位置的D vs.E)。
抗体可变区的序列比较揭示了克隆8i10的重链源自种系序列IgHV4，而轻链源自种系序列IgKV1。
抗体可变区的序列比较揭示了21B15的重链源自种系序列IgHV4，而轻链源自种系序列IgKV1。
抗体可变区的序列比较揭示了21K12的重链源自种系序列IgHV3，而轻链源自种系序列IgKV1。
实施例4：M2抗体的产生和表征
通过293PEAK细胞中的大规模瞬时转染以毫克含量来产生上述抗体。将粗制的未纯化抗体上清液用于在ELISA平板上检测抗体与A型流行性感冒A／Puerto Rico／8／1932(PR8)病毒的结合，然后与对照抗体14C2的结合相比较，对照抗体14C2也是通过大规模瞬时转染产生的。抗-M2重组人单克隆抗体结合流行性感冒，而对照抗体不结合(图9)。
还对用PR8病毒感染的MDCK细胞测试了结合(图10)。对照抗体14C2和三个抗M2E克隆：8I10、21B15和23K12，全部显示出与PR8感染细胞表面上表达的M2蛋白的特异性结合。在未感染细胞上未观察到结合。
在蛋白A柱上从上清液纯化抗体。使用1μg／ml浓度的纯化抗体进行FAC分析，以检测抗体与瞬时转染的在细胞表面上表达M2蛋白的293PEAK细胞的结合。测量了结合，以测试与模拟的转染细胞和用流行性感冒亚型H1N1、A／Fort Worth／1／50或A／Hong Kong／483／1997HK483M2蛋白瞬时转染的细胞的结合。作为正对照，使用了抗体14C2。未染色的和二抗单独对照帮助测定了背景。对于全部三个克隆，观察到了用M2蛋白转染的细胞的特异性染色。此外，所有三个克隆非常充分地结合了高通路毒株A／Vietnam／1203／2004和A／Hong Kong／483／1997M2蛋白，与A／Vietnam／1203／2004M2蛋白结合弱得多，与A／HongKong／483／1997M2蛋白没有结合。参见图11。
抗体21B15、23K12和8I10结合稳定表达M2蛋白的293-HEK细胞的表面，但没有结合载体转染的细胞(参见图1)。此外，5mg／ml24-mer M2抗体的存在没有与这些抗体的结合竞争，而对抗线性M2蛋白产生的对照嵌合小鼠V-区／人IgG1κ14C2抗体(hu14C2)完全受到M2肽的抑制(参见图1)。这些数据证明这些抗体结合细胞或病毒表面上表达的M2e中存在的构象表位，与线性M2e肽相反。
实施例5：人抗流感单克隆抗体的病毒结合
将UV-灭活的A型流行性感冒病毒(A／PR／8／34)(AppliedBiotechnologies)以PBS中1.2μg／ml涂布于384-孔MaxiSorp平板(Nunc)中，25μl／孔，并且在4℃下孵育过夜。然后用PBS将平板洗涤三次，并用PBS中的1％脱脂奶粉阻断，50μl／孔，然后在室温下孵育1hr。用PBS第二次洗涤后，以所述浓度加入MAb，重复三份，并且将平板在室温下孵育1小时。用PBS另一次洗涤后，向每个孔中加入25μl PBS／1％奶中1／5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人IgG Fc(Pierce)。用PBS最后一次洗涤后，以25μl／空加入HRP底物1-StepTMUltra-TMB-ELISA(Piere)，并且在黑暗中在室温下进行反应。用25μl／孔1N H2SO4停止试验，并且在SpectroMax Plus平板阅读器上阅读450nm处的光吸光度(A450)。将数据标准化至10μg／mlMab8I10结合的吸光度。结果显示于图2A和2B中。
实施例6：人抗流行性感冒单克隆抗体与全长M2变体的结 合
选择M2变体(包括在体内具有高病理表型的那些)用于分析。对于序列，参见图3A。
在HEK293细胞中瞬时转染M2cDNA构建体，并且如下分析：为了通过FACS分析瞬时转染体，用0.5ml细胞解离缓冲液(Invitrogen)处理10cm组织培养板上的细胞，并收集。在含有1％FBS、0.2％NaN3的PBS(FACS缓冲液)中洗涤细胞，并重悬浮于0.6ml补充了100μg／ml兔子IgG的FACS缓冲液中。将每个转染体与0.2ml FACS缓冲液中的1μg／ml的所示Mab混合，5×105至106细胞／样品。用FACS缓冲液将细胞洗涤三次，并且将每个样品重悬浮于0.1ml含有1μg／ml alexafluor(AF)647-抗人IgG H&L(Invitrogen)中。将细胞再次洗涤，并在FACSCanto设备(Becton-Dickenson)上进行流式细胞计数。将数据表示为M2-D20瞬时转染体的平均荧光的百分比。用于变体结合的数据是2个实验的表示。用于丙氨酸突变的数据是来自3个分开实验的平均读数，使用标准误差。结果显示于图3B和3C中。
实施例7：丙氨酸扫描诱变来评价M2结合
为了评价抗体结合位点，如通过定点诱变所示，在单独的氨基酸位置取代丙氨酸。
在HEK293细胞中瞬时转染M2cDNA构建体，并且按照以上实施例6中所述的进行分析。结果显示于图4A和4B中。图8显示了表位是M2多肽的氨基端的高保守区。如图4A、4B和图8中所示，表位包括M2多肽的位置2的丝氨酸、位置5的苏氨酸和位置6的谷氨酸。
实施例8：表位阻断
为了确定Mab8I10和23K12是否结合相同的位点，在CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系DG44中稳定表达表示流行性感冒毒株A／HK／483／1997的M2蛋白。用细胞解离缓冲液(Invitrogen)处理细胞，并收集。将细胞在含有1％FBS、0.2％NaF3(FACS缓冲液)的PBS中洗涤，并以107细胞／ml重悬浮于补充了100μg／ml兔子IgG的FACS缓冲液中。通过10μg／ml的MAb(或2N9对照)将细胞在4℃下预先结合1hr，然后用FACS缓冲液洗涤。然后将直接偶联的AF647-8I10或-23K12(用
Figure BDA0000413462010001681
蛋白标记试剂盒(Invitrogen)标记)用于将1μg／ml的三个预阻断细胞样品染色，每个样品106细胞。按照之前所述的，使用FACSCanto进行流式细胞计数分析。数据是来自3个分开试验的读数，使用标准误差。结果显示于图5中。
实施例9：人抗流行性感冒单克隆抗体与M2变体和截短的 M2肽的结合
通过ELISA评价mAb8i10和23K12与其他M2肽变体的交叉反应性。肽序列如图6A和6B中所示。另外，使用相似的ELISA试验来确定与M2截短肽的结合活性。
简而言之，将每个平底384孔平板(Nunc)覆盖浓度为2μg／mL的肽和25μL／孔的PBS缓冲液，在4℃下过夜。将平板洗涤三次，并且用1％奶／PBS在室温下阻断1小时。洗涤三次后，加入MAb滴定物，并且在室温下孵育一小时。洗涤三次后，将稀释的HRP偶联的山羊抗人免疫球蛋白FC特异性(Pierce)加入每个孔中。将平板在室温下孵育一小时，并且洗涤三次。加入25μl／孔的1-StepTM Ultra-TMB-ELISA(Piere)，并且在黑暗中在室温下进行反应。用25μl／孔1N H2SO4停止试验，并且在SpectroMax Plus平板阅读器上阅读450nm处的光吸光度(A450)。结果显示于图6A和6B中。
实施例10：人抗流行性感冒单克隆抗体保护致命病毒攻击的 能力的体外评价
测试了抗体23K12(TCN-031)和8I10(TCN-032)保护小鼠免受高通路禽流感毒株(A／Vietnam／1203／04(VN1203))致病病毒攻击的能力.
将雌性BALB／c小鼠随机分成5组，每组10只。在感染前一天(-1天(减一))和感染后两天(+2天(加二))，通过200μl腹膜内注射给药200μg抗体。在第0天(零)，鼻内给药30μl体积中大约LD90(致命剂量90)的A／Vietnam／1203／04流行性感冒病毒。从感染后第1天至第28天观察存活率。结果显示于图7中。
实施例11：M2抗体3241G23,3244I10,3243J07,3259J21, 3245O19,3244H04,3136G05,3252C13,3255J06,3420I23, 3139P23,3248P18,3253P10,3260D19,3362B11和 3242P05的表征
FACS.合成(Blue Heron Techonology)全长M2cDNA(A／Hong Kong／483／97)并且克隆至质粒载体pcDNA3.1中，然后用Lipofectamme(Invitrogen)将其转染至CHO细胞中，以形成稳定的CHO-HK M2-表达细胞的集合。对于抗-M2Mab组，将来自每个IgG重链和轻链组合的瞬时转染的20μl上清液样品用于将CHO-HK M2稳定细胞系染色。用Alexafluor647-偶联的山羊抗-人IgG H&L抗体(Invitrogen)，在活细胞上观察到结合的抗-M2mab。用FACSCanto进行了流式细胞计数，并且在附随的FACSDiva软件(Becton Dickenson)上进行了分析。
ELISA.生物合成(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotn，Pierce)由β-丙内酯灭活的纯化A型流行性感冒(A／Puerto Rico／8／34)，并且在4℃下，吸附至预先覆盖neutravidin(Pierce)的384-孔平板中的25μl PBS中16小时。用PBS中的BSA阻断平板，并且加入1：5最终稀释的来自每个IgG重链和轻链组合的瞬时转染的上清液样品，接着加入HRP偶联的山羊抗人Fc抗体(Pierce)，并且用TMB底物(ThermoFisher)发色。
这个分析的结果显示于以下的表2中。
Figure BDA0000413462010001701
正对照：来自mAb8I10的IgG重链和轻链组合的瞬时转染的上清液
负对照：来自mAb2N9的IgG重链和轻链组合的瞬时转染的上清液
MFI＝平均荧光强度
实施例12：人抗体揭示了保护性表位。这在人和非人A型 流行性感冒病毒中是高度保守的
流行性感冒仍然是全世界严重的公众健康威胁。疫苗和抗病毒可用于提供保护以免受感染。然而，由于流行性感冒基因组的可塑性，新型毒株持续出现，这使得每年重新配制疫苗抗原成为必要，并且对抗病毒药的抗性快速出现，在循环的病毒群中确立。此外，由于工程化和制造有效疫苗需要的时间，新流行毒株的传播难以除尽。靶向高度保守的病毒表位的单克隆抗体可能提供了可替换的保护范例。我们在本文中描述了分离一组源自健康人对象的IgG+记忆B细胞的单克隆抗体，其识别流行性感冒基质2蛋白外结构域M2e内的之前未知的构象表位。这个抗体结合区在A型流行性感冒病毒中是高度保守的，存在于迄今为止检测的几乎所有毒株内，包括主要感染禽和猪的高致病性病毒，和最近2009年的源于猪的H1N1大范围流行的毒株(S-OIV)。此外，这些人抗-M2e单克隆抗体保护小鼠免受H5N1或H1N1流行性感冒病毒的攻击。这些结果表明病毒M2e可以在人体内大范围地引发交叉反应性和保护性抗体。因此，这些人抗体的重组形式可以提供有用的治疗剂，来保护对抗由宽谱A型流行性感冒毒株引起的感染。
介绍
季节性流行性感冒传染使美国每年超过200,000的人就医，并且估计全世界死亡500,000人(Thompson，W.W.等(2004)JAMA292：1333-1340)。免疫系统在大部分的个体中仅仅提供对季节性毒株的部分保护作用，这是因为病毒基因组中经常产生的点突变，这导致称为抗原漂移的结构可变性。由于不同病毒间的基因重排事件(其导致病毒抗原决定簇更大范围的漂移)，大范围流行的毒株遇到甚至更低的免疫抗性。因此，大范围流行的流行性感冒具有引起分布广泛的疾病、死亡和经济破坏的潜能。疫苗和抗病毒剂可用于抗争流行性感冒传播和大范围流行。然而，必须以年为基础，在流行性感冒季之前，确定流行性感冒疫苗的毒株组成，并且预先预测哪个毒株将成为主要的是具有挑战性的。此外，逃避疫苗诱导的保护性免疫应答的毒株的出现相对快速，其常常导致不当的保护(Carrat F和A.Flahault A.(2007)Vaccine25：6852-6862)。
抗病毒药物包括奥司他韦和扎那米韦(zanamivir)，其抑制病毒蛋白神经氨酸酶(NA)的功能，以及金刚烷，其抑制病毒M2蛋白的离子通道功能(Gubareva L.V.等(2000)Lancet355：827-835；Wang C.等(1993)J Virol67：5585-5594)。抗病毒剂对于敏感性毒株是有效的，但快速地产生了病毒抗性，并且具有使这些药物无效的潜能。在2008-2009年US流行性感冒季，几乎100％测试的季节性H1N1或H3N2流行性感冒分离物分别对奥司他韦或金刚烷抗病毒剂是抗性的(CDC Influenza Survery：http：//www.cdc.gov/flu/weekly/weeklyarchives2008-2009/weekly23.htm)。
使用抗流行性感冒抗体的被动免疫表示了用于预防或治疗病毒感染的可替换范例。这种方法实用性的证据可追溯至接近100年前，1918年流行性感冒大范围流行期间，使用被动血清转移获得一些成功时(Luke T.C.等(2006)Ann Intern Med145：599-609)。尽管由于流行性感冒病毒的抗原异质性，抗流行性感冒单克隆抗体(mAb)提供的保护幅度通常是狭窄的，但最近报道了几组结合病毒红血球凝集素(HA)的茎干区内的保守性表位的保护性mAb(Okuno Y.等(1993)J Virol67：2552-2558；ThrosbyM等(2008)PLoS One.3：e3942；Sui J等(2009)Nat Struct Mol Biol16：265-273；Corti D等(2010)J Clin Invest doi：10.1172/JCI41902)。这些表位看上去限于一个流行性感冒病毒的子集；这些抗-HAmAb不会被表达来提供对抗H3和H7亚型病毒的保护作用。这些中，前者含有重要的循环人毒株的成分(Russell CA等，(2008)Science320：340-346)，而后者包括高致病性禽毒株，其已经引起了人类的死亡(Fouchier RA等，(2004)Proc Natl Acad Sci USA101：1356-1361；Belser J.A.等(2009)Emerg Infect Dis15：859-865)。
流行性感冒病毒的表面上存在的三个抗体目标中，病毒M2蛋白的胞外域(M2e)比HA或NA保守性要高得多，这使其成为吸引人的用于宽范围保护性mAb的目标。M2e的单克隆抗体已经显示出在体内是保护性的(Wang R等，(2008)Antiviral Res80：168-177；Liu W.等(2004)Immunol Lett93：131-6；Fu T.M.等(2008)Virology385：218-226；Treanor J.J.等(1990)J Virol64：1375-1357；Beerli R等(2009)Virology J6：224-234)，和几组已经证明了用基于M2e的疫苗策略对抗感染的保护(Fu T.M.等(2009)Vaccine27：1440-1447；Fan J.等(2004)Vaccine22：2993-3003；Slepushkin V.A.等(1995)Vaccine13：1399-1402；Neirynck S.等(1999)Nat Med5：1157-1163；Tompkins S.M.等(2007)Emerg Infect Dis13：426-435；Mozdzanowska K.等(2003)Vaccine21：2616-2626)。在这些情况中，源自M2e序列的纯化M2蛋白或肽已经用作免疫原，以在动物中产生抗-M2e抗体，或作为疫苗候选物。在本发明研究中，我们已经直接从结合病毒颗粒上和病毒感染细胞上展示的M2蛋白的人B细胞分离了mAb。此外，我们证明了这些抗体保护小鼠免受致命A型流行性感冒病毒攻击，并且它们可以识别源自多种人和动物A型流行性感冒病毒分离物的M2变体。这种特性的组合可以增强这些抗体预防和治疗A型流行性感冒病毒感染的实用性。
结果和讨论
从人B细胞分离抗-M2e mAb家族。为了探究人体中对自然流行性感冒感染的体液免疫应答，我们从M2e-血清反应阳性的患者的IgG+记忆B细胞分离了抗体。测试了来自140名健康成人、美洲来源供体的血清样品与用病毒M2基因转染的HEK293细胞表面上表达的M2e的反应性(源自A/Fort Worth/50H1N1)。将来自23名M2e血清反应阳性患者中5名的IgG+记忆B细胞在其中它们增殖和分化成IgG分泌浆细胞的条件下进行培养。筛选B细胞培养物孔与细胞表面M2e的IgG反应性，并且通过来自17个阳性孔的RT-PCR拯救免疫球蛋白重链和轻链可变区(VH和VL)基因，并且结合至人IgG1恒定区背景中，用于重组表达和纯化。17个抗-M2e mAb中的15个的VH和VL序列簇成两个相关组(表3)(
Figure BDA0000413462010001741
International ImMunoGeneTicsInformation
Figure BDA0000413462010001742
http：//www.imgt.org)。在组A中，种系VH基因区段的分配是IGHV4-59*01，而在组B中，种系基因区段是IGHV3-66*01。两个更远一些相关的mAb61B11和41G23(组C)利用种系V基因区段IGHV4-31*03，其与组A的种系V基因区段IGHV4-59*01只具有5个氨基酸残基差异。所有这些mAb利用相同的轻链V基因，IGKV1-39*01或其等位基因IGKV1D-39*01，并且显示出来自种系中重链或κ链序列的体细胞超突变的证据(图12)。竞争性结合实验显示出所有这些人mAb看来结合中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的表面上表达的天然M2e(图13)。从组A和B各自选择一个mAb，分别称为TCN-031和TCN-032，用于进一步表征。
表3.人抗-M2e抗体的免疫球蛋白区段使用
Figure BDA0000413462010001751
使用IMGT/V-QUEST分析每个mAb重链和轻链的参考序列，以确定基因使用
高亲和性结合流感病毒的表面。TCN-031和TCN-032以高亲和力直接结合HIN1病毒(A/Puerto Rico/8/34)，在约100ng/mL时具有半最大结合(图14a)。从TCN-031和TCN-032结合的病毒制备的Fab片段各自具有14和3nM的亲和性(KD)，如通过表面等离子体共振测定的(表4)。人mAb没有明显地结合对应于H1N1病毒(A/Fort Worth/1/50)的M2e结构域的23个氨基酸合成肽(图14b)。小鼠抗-M2e mAb14C2的嵌合衍生物(ch14C2)，最初通过用纯化的M2免疫来产生(Zebedee S.L.和R.A.Lamb(1988)J Vrol62：2762-2772)，呈现出与用人mAb观察到的相反行为，只有很少的结合病毒，但强烈结合分离的23mer M2e肽，在10ng/mL时具有半最大结合(图14a和14b)。令人感兴趣地，结合用H1N1病毒(A/Puerto Rico/8/34)感染的Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞表面的人mAb和ch14C2具有相似的亲和力(图14c)。因此，显示出病毒和感染细胞的表面上都存在由人抗-M2emAb识别的病毒表位并且是易接近的，而ch14C2结合的表位只在感染细胞的表面上才是易接近的。我们观察到人抗-M2e mAb没有明显结合源自M2e的固定化合成肽，而且进一步观察到这样的肽没有竞争这些抗体与哺乳动物细胞表面上表达的M2e的结合(图14d)，支持了M2e表位内的二级结构对于人抗体的结合是重要的概念。ch14C2结合塑料上固定的肽，表明高等结构对于这种mAb的结合不太重要。
表4抗-M2e Fab片段对流行性感冒病毒的亲和性。
Figure BDA0000413462010001761
保护H5N1和H1N1病毒的致命攻击。我们接着检测了人抗-M2e mAb TCN-031和TCN-032在小鼠的流行性感冒感染的致命攻击模型中的保护功效。用5×LD50单位的高致病性H5N1病毒(A/Vietnam/1203/04)鼻内攻击动物，在病毒攻击后一天启动治疗时，两种人mAb都是保护性的。相反，接受使用亚类相配的、无关对照mAb2N9(其靶向人巨细胞病毒gB的gp116部分的AD2表位)或使用载体对照的相似治疗方案的小鼠受到较低程度的保护，或根本没有保护，导致用人mAb治疗的小鼠70-80％存活vs.对照mAbd20％存活和载体的0％存活(图15a)。抗-M2e mAbch14C2在该模型中没有给药实质性的保护(20％存活；图15a)，尽管这种mAb已经显示出降低感染其他流行性感冒病毒的小鼠肺中的病毒滴定度(Treanor J.J.等(1990)J Virol64：1375-1357)。所有动物，包括TCN-031和TCN-032治疗组中的那些，从感染后第4至8天开始呈现出体重减轻，接着在存活的动物中体重逐渐增加，直至第14天的研究结束(图15b)，表明通过降低感染的严重性或程度而不是通过完全防止感染而获得了保护。实际上，来自每个治疗群中的其他动物的肺、脑和肝组织的免疫组织学和病毒负荷分子的结果与用人抗-M2e mAb治疗的动物中病毒从肺传播至脑以及可能肝的降低相一致，但与用chC14C2或亚类相配的对照mAb2N9不一致。然而，肺中人抗-M2e mAb对病毒负荷的作用vs.对照mAb的更适度(各自为，表5和图6)。
为了测试人抗-M2e mAb给药的保护是否反映出它们的宽泛结合行为，我们进行了相似的体内攻击研究，使用小鼠适应的相对不同的H1N1病毒A/Puerto Rico/8/34分离物。百分之百PBS-治疗的或亚类相配的、对照抗体治疗的小鼠被该病毒杀死，而用人抗-M2e mAb TCN-031he TCN-032治疗的大部分动物存活(60％；图.15c)。使用这种病毒，用ch14C2治疗的小鼠提供了与人抗-M2e mAb的相似存活益处(图15c)。在整个感染及其随后的消退过程中，每个治疗组的体重变化按照与H5N1病毒感染小鼠相似的模式(图15d)。
人抗-M2e mAb和ch14C2结合来自A/Vietnam/1203/04和A/Puerto Rico/8/34病毒的细胞表面表达的M2e(图19b，表6)和A/Puerto Rico/8/34感染的细胞(图14c)。抗体介导的保护的机制包括通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性杀灭感染的宿主细胞(Wang R等(2008)Antiviral Res80：168-177；Jegerlehner A.(2004)J Immunol172.5598-5605)。我们发现了使用人抗-M2e mAb和ch14C2的这两种机制的体外证据(图17和6)。通过高致病性禽病毒A/Vietnam/1203/04与A/Puerto Rico/8/34比较的攻击后，用人抗-M2e mAb与ch14C2相比较观察到的增强的体内保护的解释可能是由于人mAb直接结合病毒引起的，而ch14C2没有显示出结合流行性感冒病毒颗粒(图14a)。可以预期结合病毒的抗体的保护特性包括如下机制：抗体依赖性病毒溶解(Nakamura M.等(2000)Hybridoma19：427-434)和通过宿主细胞的调理吞噬的清除(Huber V.C.等(2001)J Immunol1667381-7388)。这些机制的一些需要抗体和宿主Fc受体之间的有效相互作用。在我们的小鼠攻击实验中，所有测试的mAb具有人恒定区；然而，其他研究已经表明人抗体可以与小鼠Fc受体有结果地相互作用(ClynesR.A.等(2000)Nat Med6：443-446)。
表5.用H5N1A/Vietnam/1203/04攻击后用抗-M2e mAbTCN-031和TCN-032治疗的小鼠的肺、肝和脑的病理学评价。
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在所有病毒攻击的小鼠的肺中检测到病理学变化和病毒抗原。所有组中的小鼠具有相似的肺损伤，尽管TCN-031和TCN-032组中小鼠具有肺中较低病毒抗原表达的趋势。在脑和肝中，在TCN-031组的小鼠中未检测到损伤，在TCN-032组中，三只小鼠中只有一只在脑中显示出一定的病毒抗原证据。病理变化/病毒抗原：+++严重/许多，++中度/中度，+轻度/很少，±不足/稀少，-未观察到/阴性。
Figure BDA0000413462010001791
顶部的M2e序列来自A/Brevig Mission/1/18(H1N1)并且用作参照序列，用于43个野生型变体的M2胞外域氨基酸1-23的比对。灰色格子表示与参照序列相同的氨基酸，而白色格子是氨基酸替代突变。除了HK、VN和D20，这个非同一性序列的列表源自参考文献11和27中所用的M2序列。序列数据来自国家生物技术信心中心(National Center for Biotechnology Information)的(流行性感冒病毒资源The Influenza Virus Resource)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)。
与M2e高保守的N-端区段的结合。为了更好地理解人抗-M2emAb独特的病毒结合特性，我们绘制了Me2结构域内的结合位点的图谱。人mAb与Me2衍生的线性肽的合适的结合的缺乏妨碍了合成肽进行表位的微细结构图谱绘制。替代地，通过流式细胞术来定量mAb与cDNA转染哺乳动物细胞表面上表达的M2e丙氨酸取代突变体和天然产生的M2变体的结合。
使用一组其中23个氨基酸M2胞外域中的每个位置被丙氨酸取代的M2突变蛋白的结合实验揭示了成熟(甲硫氨酸-截断的)M2多肽的第一个(S)、第四个(T)和第五个(E)位置对于TCN-031和TCN-032的结合都是关键的(图19a)。相反，在成熟M2的位置14丙氨酸取代时，选择性地消除了ch14C2的结合(图19a)。在使用一组不同的、天然产生的M2变体的研究中证实了这些观察；在位置4用脯氨酸取代(表6：A/Panama/1/1966H2N2、A/HongKong/1144/1999H3N2、A/Hong Kong/1180/1999H3N2和A/chicken/Hong Kong/YU427/2003H9N2)和位置5的甘氨酸(表6：A/chicken/Hong Kong/SF1/2003H9N2)与人抗-M2e mAb而不是ch14C2降低的结合相关(图19b，表6)。这些结果表明TCN-031和TCN-032都识别成熟M2eN-端的位置1-5的SLLTE核心序列。通过显示了这些mAb彼此有效竞争与CHO细胞表面上表达的M2e结合的数据支持了这一结果。相反，我们的结果表明ch14C2结合被人抗-M2e mAb识别的在空间上远离SLLTE核心并且在SLLTE核心下游的位点。实际上，之前的研究已经表明14C2在加工过的M2e的位置5-14结合相对宽的、线性的具有序列EVERTPIRNEW的表位(Wang R，等(2008)Antiviral Res80：168-177)。
尽管TCN-031和TCN-032识别的表位很可能非常相似，但在这些人mAb与几种M2e突变体结合之间存在一定的差异。例如，TCN-031在成熟M2e序列的残基2(L)和3(L)比TCN-032具有更高的依赖性(图19a)。这两个人mAb的VH区利用不同的变量、多样性和连接基因区段，这可以解释这些mAb之间观察到的少量结合差异。令人感兴趣地，尽管VH构成中的差异，这些人mAb利用相同的种系κ链V基因区段，虽然具有不同的κ链连接区段。
根据A型流行性感冒病毒之间这部分多肽显著的高序列保守性，人抗-M2e mAb的结合区域在Me2的N-端区的定位非常重要。编码M2的病毒M基因区段通过差别剪接也编码内部病毒蛋白M1。然而，剪接位点位于M2和M1共有N-端的下游，导致两个截然不同的成熟多肽，具有相同的8个氨基酸N-端序列(Lamb R.A.和P.W.Choppin(1981)Virology112：729-737)。从结合该区域的宿主抗-M2e抗体逃逸的病毒的选择可能限于N-端区域中的逃逸突变，不仅将导致M2的变化，也将导致M1蛋白的变化。实际上，M2e的这种N-端8氨基酸区段显示出在NCBI流行性感冒数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/multiple.cgi)目录中的1364个独特的全长M2变体中几乎完全相同，而在该区域的M2e序列下游中看到水平低得多的保守性(图19c)。实际上，核心人抗-M2e抗体表位SLLTE存在于NCBI流行性感冒数据库目录中的1364个独特全长M2e序列的～98％中，分别包括人、猪和禽的97％、98％和98％。这与用M2e肽或蛋白免疫引发的抗-M2e mAb线性结合位点内低得多的保守性相反。例如，14C2和Z3G1(Wang R.等(2008)Antiviral Res80：168-177)结合A型流行性病毒低于40％保守的序列，并且该区域内的保守性在禽和猪病毒中甚至更低(表7)。
肽引发的抗体识别的线性M2e肽对一些病毒分离物中存在的逃逸突变和天然取代更敏感。例如，已经将mAb14C2的P10L和P10H逃逸突变作图至M2e的中心部分(Zharikova D.等(2005)JVirol79：6644-6654)，并且在来自一些高致病性H5N1毒株的M2e变体中也出现了那些相同的取代。我们已经发现了人mAbTCN-031和TCN-032，而不是ch14C2，结合来自H5N1病毒A/HongKong/483/97(HK)的M2变体，其含有P10L取代(图19b，表6)。因此，具有与14C2相似特异性的单克隆抗体很可能与宽谱治疗剂一样，具有有限的实用性。
在5名人患者的检查中，我们发现了结合M2e保守N-端区域的17个独特的抗-M2e抗体，但没有观察到与含有被14C2和其他肽引发抗体识别的线性表位的M2e-衍生肽的IgG-反应性。与自然感染或接种疫苗的人体中对M2e的明显均一的抗体应答相反，用M2e衍生肽免疫的小鼠产生了在M2e内具有多种特异性的抗体，包括保守的N-端以及下游区域(Fu T.M.等(2008)Virology385：218-226)。吸引人的是推测人免疫系统已经产生了专门靶向M2e高度保守的N-端区段而不是更多变的并且因此低可持续保护性的下游位点的体液应答。尽管对于识别该M2e内部区域的人抗体缺乏证据，但M基因的进化分析表明这个M2e区域在人流行性感冒病毒中在强烈的正选择下(Furuse Y.等(2009)J Virol29：67)。对于这个发现的一种解释是通过免疫机制而不是抗体，将选择性压力针对该内部区域。例如，人T细胞表位已经作图于这些M2e位点(Jameson J.等(1998)J Virol72：8682-8689)。
表7.A型流行性感冒中，与源自免疫小鼠的mAb的那些结合位点相比，人抗-M2emAb的病毒结合位点的保守性。
2009H1N1S-OIV的识别。宽保护性的抗流行性感冒mAb可以用于被动免疫治疗中，以在高致病性的、大范围流行的毒株爆发事件中，保护或治疗人类。这样的mAb作为免疫治疗剂的潜能的关键测试是它们是否能够识别从将来的病毒基因重配(reassortment)事件中进化来的毒株。作为一个比较好的实例，测试了人抗-M2e mAb TCN-031和TCN-032识别目前的H1N1猪-源大范围流行毒株(S-OIV)的能力。这些mAb源自在2007年或更早采取的人血样，早于认为该毒株已经在人类出现的时间(Neumann G.等(2009)Nature459：931-939)。两种人mAb都结合感染了A/California/4/2009(S-OIV H1N1，大范围流行的)和A/Memphis/14/1996(H1N1，季节性的)的MDCK细胞，而ch14C2只结合感染了季节性病毒的细胞(图21)。如果这种宽的结合行为证明了与保护作用相关，与使用A/Vietnam/1203/2004和A/Puerto Rico/8/34的情况那样，那么预期这些人mAb对于预防或治疗S-OIV大范围流行毒株或可能在将来出现的其他大范围流行的毒株将是有用的。
尽管值得注意的是人具有制备给药对抗流行性感冒感染的几乎通用的保护作用的抗体的能力，但这种迄今未描述过的抗体类别的发现提出了为什么这种病毒能够在完全免疫活性个体中引发有效感染的问题。这种明显的悖论可以通过保护性M2e表位及其相关的免疫原性来解释。其他人已经注意到M2e似乎在人体中呈现出低免疫原性(Feng J.等(2006)Virol J3：102；Liu W.(2003)FEMS Immunol Med Microbio35：141-146)，尤其是与免疫显性病毒糖蛋白HA和NA相比时。因此，保护性抗-M2e抗体可以存在于许多个体中，但是次佳的滴定度。在这个观念的支持中是我们的观察：大部分个体没有展示出对Me2的可检测体液应答。在我们的健康患者群中取样的个体中低于20％(23/140)具有可检测血清水平的抗-M2e抗体。这种现象的原因不清楚，但在HCMV中存在相似的情况，其中只有少数HCMV血清反应阳性的患者具有对HCMV的gB复合物内的大范围保守的、中和AD2表位的可测量抗体(Meyer H.等(1992)J Gen Virol73：2375-2383；Ayata M.等(1994)J Med Virol43：386-392；Navarro D.等(1997)J Med Virol52：451-459)。
对流行性感冒威胁的免疫治疗解决方法的重要需求将是在先前存在的和正在出现的病毒中保守的保护性表位的鉴定。使用对天然流行性感冒M2的人免疫应答的大规模取样，我们已经鉴定出M2e的高保守N-端区域内的天然致免疫的和保护性的表位。针对该表位的人抗体，包括本发明研究中描述的那些，可以用于预防和治疗大范围流行的和季节性的流行性感冒。
方法
记忆B细胞培养。在IRB批准的知情同意下从正常捐献者收集全血样，并且通过标准技术纯化外周血单核细胞(PBMC)。按照之前所述的(Walker L.等(2009)Science326：289-293)，使用PBMC、用M2-表达细胞选择富集的B细胞或通过在磁珠上(Miletnyi，Auburn，CA)用CD3、CD14、CD16、IgM、IgA和IgD的抗体阴极耗尽(negative depletion)非-IgG+细胞从PBMC富集的IgG+记忆B细胞，来建立B细胞培养物。简而言之，为了促进B细胞激活、增殖、终末分化和抗体分泌，在饲养细胞和条件培养基的存在下，将细胞接种于384-孔微量滴定平板中，所述条件培养基产自健康捐献者的促细胞分裂剂刺激的人T细胞。8天后收集培养物上清液，并且使用荧光成像(FMAT系统，AppliedBiosystems)以高通量形式筛选与用流行性感冒病毒M2(A/FortWorth/50H1N1)稳定转染的HEK293细胞上表达的M2蛋白的结合反应性。
从B细胞培养物重建重组mAb。使用磁珠(Ambion)从溶解的B细胞培养物分离mRNA。用基因特异性引物反向转录(RT)后，使用两侧具有限制位点的VH、Vκ和Vλ家族特异性引物，将可变结构域基因进行PCR扩增(Walker L.等(2009)Science326：289-293)。使用96-孔E-凝胶(Invitrogen)鉴定了产生预期大小扩增子的PCR反应，并且将可变结构域扩增子克隆至含有人IgG1、Igκ或Igλ恒定区的pTT5表达载体(National Research ofCanada，Ottawa，加拿大)中。将每个VH集合与来自单个BCC孔的相应Vκ或Vλ集合组合，并且在293-6E细胞中瞬时转染，以产生重组抗体。在转染后3-5天，收集条件培养基，并且测试抗体与HEK-293细胞上表达的M2蛋白的结合。从阳性集合中分离出单个克隆，并且通过测序鉴定出独特的VH和VL基因。从这些，随后表达了单克隆抗体，并且重新测试结合活性。
ELISA。为了检测病毒抗原，将10.2μg/mL UV-灭活的H1N1A/Puerto Rico/8/34(PR8)病毒(Advanced Biotechnologies，Inc.)被动吸附至384-孔平板中的25μL PBS/孔中，在4℃下持续16hr，或将通过β-丙内酯(Advanced Biotechnologies，Inc.)灭活的PR8生物素化(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，Pierce)，并且同样吸附至覆盖了neutravidin(Pierce)的平板中。用分别含有1％奶或BSA的PBS阻断病毒覆盖的和生物素化病毒覆盖的平板。用HRP-偶联的山羊抗-人Fc抗体(Pierce)检测所示浓度下的mAb的结合，并且用TMB底物(ThermoFisher)来观察。M2e肽，SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(Genscript)，以1μg/mL被动吸附，并且通过相同的方法来检测抗体与肽的结合。
病毒感染的细胞的FACS分析。为了检测体外感染后的M2e，用60：1感染复数(MOI)的PR8处理MDCK细胞，在37℃下持续1hr，此后，替换培养基。将感染的MDCK细胞再培养16hr，接着收集，用所示的mAb将细胞染色。使用Alexafluor647偶联的山羊抗-人IgG H&L抗体(Invitrogen)在活细胞上观察结合的抗-M2mAb。在装配有FACSDiva软件的FACSCanto(Becton Dickenson)上进行流式细胞术。对于抗-M2mAb组，将来自每个IgG重链和轻链组合的瞬时转染的20μL上清液样品用于将表达A/HongKong/483/97的M2的293稳定细胞系染色。如上进行了FACS分析。
M2变体分析。合成了单独的全长M2cDNA突变体，在表示A/Fort Worth/1/1950(D20)的胞外域的每个位置具有单个ala突变，以及是四十三个天然产生的M2变体(Blue HeronTechnology)。将它们克隆至质粒载体pcDNA3.1中。用Lipofectamine(Invitrogen)瞬时转染后，用补充了1％胎牛血清和0.2％NaN3(FACS缓冲液)的PBS中的1μg/mL的所示mAb处理HEK293细胞。用Alexafluor647偶联的山羊抗-人IgG H&L抗体(Invitrogen)在活细胞上观察结合的抗-M2mAb。在装配有FACSDiva软件的FACSCanto(Becton Dickenson)上进行流式细胞术。将与天然产生变体的相对结合表示为D20瞬时转染细胞的代表性mAb染色的百分比，使用标准化MFI(％)公式100×(MFI实验-MFI模拟转染的)/(MFID20-MFI模拟转染的)。
小鼠中的治疗功效研究。在Institutional Animal Care and UseCommittee实验方案下进行动物研究。将六组10只小鼠(雌性，6-8周大BALB/C)鼻内接种5×LD50的A/Vietnam/1203/04(图15a和b)，或6组5只小鼠鼻内接种5×LD50A/Puerto Rico/8/34(图15c和d)。在感染后24、72和120小时，小鼠接受腹膜内注射400μg/200μL剂量的抗-M2e mAb TCN-031TCN-032、对照人mAb2N9、对照嵌合mAb ch14C2、PBS，或留下未治疗。小鼠每天称重，持续2周，并且当体重减轻超过注射前体重的20％时，将其安乐死(图15a和15b中显示的H5N1研究，以及图15c和15d中显示的H1N研究)。
与A/California/4/2009感染细胞的抗体反应性。将MDCK细胞感染单独的培养基或含有大约1的MOI的A/California/4/2009(H1N1)或A/Memphis/14/1996(H1N1)的培养基，并且在37℃下培养24小时。用胰蛋白酶将细胞与组织培养平板分离，彻底洗涤，然后在2％多聚甲醛中固定15分钟。用1μg/ml的所示抗体孵育细胞，并且用Alexafluor647偶联的山羊抗-人IgG H&L抗体(Invitrogen)检测一抗结合用Becton Dickinson FACSCalibur分析细胞，并且使用FlowJo软件处理数据。
抗体结合的竞争分析。在5μg/mL的M2e肽SLLTEVETPIRNEWGCRCND SSD(Genscript)的存在或不存在下，筛选含有抗体的瞬时转染上清液与用来自H1N1(A/FortWorth/50H1N1)的M2稳定转染的293细胞或模拟转染的细胞的结合。用含有10％FCS的DMEM中的700ng/ml的抗-huIgG FcFMAT Blue来检测结合的抗-M2mAb，并且通过荧光成像(FMAT系统，Applied Biosystems)来观察。
实施例13：用抗-M2e抗体和奥司他韦联合疗法治疗的5-20倍 LD50(5LD50-20LD50)的体内H5N1攻击
用A型流行性感冒感染攻击十(10)只小鼠的组，并且具体地，用5-20倍LD50剂量的H5N1(A/VN/1203/04)攻击，LD50是用于表示和比较化合物毒性的标准化测量。通常，LD50是杀灭一半(50％)测试动物的剂量，并且因此，“LD”是致命剂量的缩写。
用20mg/kg剂量的抗-M2e抗体(例如，TCN-032)或同种型负对照治疗受攻击的小鼠，一天一次。在第(1)天、第三(3)天和第五(5)天给药M2e或对照抗体。
替换地或另外地，用10mg/kg BID剂量(一天两次(twice或two times))的具有神经氨酸酶抑制剂活性的抗病毒药物(例如，奥司他韦、磷酸奥司他韦或TamifluTM)治疗受攻击的小鼠。在感染后第一(1)天至第五(5)天提供具有神经氨酸酶抑制剂活性剂的抗病毒药物(例如，奥司他韦、磷酸奥司他韦或TamifluTM)。
受攻击小鼠的对照组是“未治疗的”。给药这些小鼠磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而不是M2e抗体、奥司他韦或M2e抗体/奥司他韦联合治疗。
图22显示了在5倍LD50(5LD50)下，抗M2e抗体(TCN-032)和抗病毒药物(奥司他韦)的联合治疗促进了每只小鼠在感染后的整个15天研究中的存活。在不存在任何治疗的情况下(PBS或同种型负对照处理)，在感染后约9天时，小鼠开始死亡，而在15天的研究阶段结束时几乎所有小鼠死亡。联合治疗和未治疗条件之间的百分比存活的差异是统计学非常显著的(p＜0.0001)。术语统计学显著意思是描述例如小于0.05的p-值(p＜0.05)，并且优选，小于0.01的p-值(p＜0.01)。最优选，统计学显著值描述小于0.001的p-值(p＜0.001)。
图23显示了在5倍LD50(5LD50)下，抗M2e抗体(TCN-032)和抗病毒药物(奥司他韦)的联合治疗在感染后的整个15天研究中将患者与有害的体重变化隔离。联合治疗的益处与未攻击的并且未处理的小鼠群观察到的体重相当。
图24显示了在10倍LD50(10LD50)下，抗M2e抗体(TCN-032)和抗病毒药物(奥司他韦)的联合治疗不仅在感染后的整个15天研究中延长了每只小鼠的存活，而且还超越了用单独的TCN-032抗体或奥司他韦药物治疗的单独治疗能力。当单独提供TCN-032或奥司他韦药物时，在第8-9天，小鼠开始死亡，当提供TCN-032/奥司他韦联合治疗时，每只小鼠存活至15天研究的结束。如5倍LD50攻击过程中所示的，联合治疗和未治疗条件之间的百分比存活差异是统计学非常显著的(p＜0.0003)。此外，联合治疗和用单独的奥司他韦治疗之间的百分比存活差异也是统计学显著的(p＜0.029)。
图25显示了在10倍LD50(10LD50)下，抗M2e抗体(TCN-032)和抗病毒药物(奥司他韦)的联合治疗不仅在感染后的整个15天研究中将患者与有害的体重变化隔离，而且还超越了用单独的TCN-032抗体或奥司他韦药物治疗的单独治疗能力。联合治疗的益处与未攻击的并且未处理的小鼠群观察到的体重相当。
图26显示了在20倍LD50(20LD50)下，抗M2e抗体(TCN-032)和抗病毒药物(奥司他韦)的联合治疗不仅在感染后的整个15天研究中延长了每只小鼠的存活，而且还超越了用单独的TCN-032抗体或奥司他韦药物治疗的单独治疗能力。与10LD50攻击过程中所示的相同，联合治疗和用单独的奥司他韦治疗之间的百分比存活差异也是统计学显著的(p＜0.029)。
图27显示了在20倍LD50(20LD50)下，抗M2e抗体(TCN-032)和抗病毒药物(奥司他韦)的联合治疗在感染后的整个15天研究中将患者与有害的体重变化隔离，而且还超越了用单独的TCN-032抗体或奥司他韦药物治疗的单独治疗能力。联合治疗的益处与未攻击的并且未处理的小鼠群观察到的体重相当。
这些研究表明，尤其是在10LD50和20LD50下，M2e抗体(TCN-032)和抗病毒药物(奥司他韦)的组合协同工作，以维持面对致命攻击的存活。
实施例14：用抗M2e抗体或奥司他韦疗法治疗的5倍LD50 (5LD50)的体内H5N1攻击II
用A型流行性感冒感染，并且尤其是，用5倍LD50剂量(5LD50，也写成5XLD50或5XMLD50)剂量的H5N1(A/Vitenam/1203/04，(VN1203))攻击十(10)只balb/c雌性小鼠组(年龄6-10周，并且称重16-20克)。
用20mg/kg(或400μg/治疗)的抗-M2e抗体或同种型负对照治疗受攻击的小鼠，一天一次。在第(1)天、第三(3)天和第五(5)天给药M2e或对照抗体。抗-M2e抗体是TCN-031(也称为23K12)或TCN-032(也称为8i10)。使用了正对照抗体，ch14C2，和负对照同种型抗体，2N9。
或者，用10mg/kg BID剂量(“bis in die”，一天两次(twice或two times))的具有神经氨酸酶抑制剂活性的抗病毒药物(例如，奥司他韦、磷酸奥司他韦或TamifluTM)治疗受攻击的小鼠。在感染后第一(1)天至第五(5)天提供具有神经氨酸酶抑制剂活性剂的抗病毒药物(例如，奥司他韦、磷酸奥司他韦或TamifluTM)。
受攻击小鼠的对照组是“未治疗的”。给药这些小鼠磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而不是M2e抗体、奥司他韦或M2e抗体／奥司他韦联合治疗。
此外，留下一组小鼠未受攻击和未治疗，作为更多对照。
通过腹膜内注射给药治疗，包括PBS对照。
当感染后体重减轻超过感染前体重的20％时，将所有实验和对照组中的小鼠安乐死。
图29显示了在5倍LD50(5LD50)下，用TCN-031或TCN-032治疗的小鼠群内的存活百分比显著高于正或负对照抗体的百分比存活(即，在第14天用M2e抗体的治疗导致80％的存活率，在第14天使用对照抗体的治疗导致20％存活，并且未治疗组在第10天全部死亡)。
图30显示了在5倍LD50(5LD50)下，用TCN-031或TCN-032治疗的小鼠群内的存活百分比显著高于用10mg／kg奥司他韦治疗的那些小鼠群的百分比存活(不管是对于治疗+4-小时或治疗+1天方案)(即，在第14天用M2e抗体的治疗导致80％的存活率，感染后四小时开始的单独奥司他韦治疗在第14天导致20％存活率，在感染后一(1)天开始的奥司他韦治疗在第11天引起小鼠群全部死亡)。对于抗-M2e抗体优等性能的一种解释是TCN-031和TCN-032抗-M2e抗体的表位存在于超过98％的流行性感冒病毒中，包括非人病毒。
实施例15：用抗-M2e抗体或奥司他韦疗法治疗的5倍LD50 (5LD50)的体内H5N1攻击III
用A型流行性感冒感染，并且尤其是，用5倍LD50剂量(5LD50，也写成5XLD50或5XMLD50)剂量的H5N1(A／Vitenam／1203／04，(VN1203))攻击十(10)只balb／c雌性小鼠组(年龄6-10周，并且称重16-20克)。
用20mg／kg(或400μg／治疗)的抗-M2e抗体或同种型负对照治疗受攻击的小鼠，一天一次。在第(1)天、第三(3)天和第五(5)天给药M2e或对照抗体。抗-M2e抗体是TCN-031(也称为23K12)或TCN-032(也称为8i10)。使用了正对照抗体，ch14C2，和负对照同种型抗体，2N9。
或者，用10mg／kg q.d.剂量(quaque die，即，一天一次)的具有神经氨酸酶抑制剂活性的抗病毒药物(例如，奥司他韦、磷酸奥司他韦或TamifluTM)治疗受攻击的小鼠。在感染后第一(1)天至第五(5)天提供具有神经氨酸酶抑制剂活性剂的抗病毒药物(例如，奥司他韦、磷酸奥司他韦或TamifluTM)。
受攻击小鼠的对照组是“未治疗的”。给药这些小鼠磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而不是M2e抗体、奥司他韦或M2e抗体／奥司他韦联合治疗。
此外，留下一组小鼠未受攻击和未治疗，作为更多对照。
通过腹膜内注射给药治疗，包括PBS对照。
当感染后体重减轻超过感染前体重的20％时，将所有实验和对照组中的小鼠安乐死。
图31显示了在5倍LD50(5MLD50)下，用TCN-031或TCN-032治疗的小鼠群内的存活百分比显著高于正或负对照抗体的百分比存活(即，在第14天用M2e抗体的治疗导致80％的存活率，在第14天使用对照抗体的治疗导致20％存活，并且未治疗组在第10天全部死亡)。此外，用TCN-031或TCN-032治疗的小鼠群内的存活百分比显著高于用10mg／kg奥司他韦治疗的那些小鼠群的百分比存活(不管是感染后四小时开始的或是感染后一小时开始的)(即，感染后四小时开始的单独奥司他韦治疗在第14天导致20％存活率，在感染后一小时开始的奥司他韦治疗在第12天导致小鼠群全部死亡)。
图32显示了在5倍LD50(5MLD50)下，奥司他韦(TamifluTM)不能保护对抗感染或死亡，即使在感染四小时内给药化合物时。该研究群的百分比存活在第14天只有20％。形成鲜明的对照，用单独的抗-M2e抗体治疗的组证明了在第14天80％存活。
实施例16：用抗-M2e抗体或奥司他韦疗法治疗的10倍LD50 (10LD50)的体内H1N1攻击。
用A型流行性感冒感染，并且尤其是，用10倍LD50剂量(10LD50，也写成10XLD50或10XMLD50)剂量的H1N1(A／Solomon Islands／06(H1N1))攻击十(10)只balb／c雌性小鼠组(年龄6-10周，并且称重16-20克)。
用20mg／kg(或400μg／治疗)的抗-M2e抗体或同种型负对照治疗受攻击的小鼠，一天一次。在第(1)天、第三(3)天或第三(3)天和第五(5)天给药M2e或对照抗体(图33)。抗-M2e抗体是TCN-031(也称为23K12)或TCN-032(也称为8i10)。使用了正对照抗体，ch14C2(也称为TCN-040)，和负对照同种型抗体，2N9。
或者，用10mg／kg bid剂量(“bis in die”，一天两次(twice或two times))的具有神经氨酸酶抑制剂活性的抗病毒药物(例如，奥司他韦、磷酸奥司他韦或TamifluTM)治疗受攻击的小鼠。根据以下时间表之一提供神经氨酸酶抑制剂活性剂的抗病毒药物(例如，奥司他韦、磷酸奥司他韦或TamifluTM)：1)第一(1)天bid，第三(3)天bid或第一(1)天至第五(5)天bid。
受攻击小鼠的对照组是“未治疗的”。给药这些小鼠磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而不是M2e抗体、奥司他韦或M2e抗体／奥司他韦联合治疗。
此外，留下一组小鼠未受攻击和未治疗，作为更多对照。
通过腹膜内注射给药治疗，包括PBS对照。
所有实验和对照组中的小鼠没有安乐死。测定了个体的存活和体重参数。计算了百分比存活和平均体重。
图34显示了在10倍LD50(10MLD50)下，并且在第1和3天给药了抗体治疗(图33)，接受抗-M2e抗体TCN-032的小鼠证明了最延长的存活。TCN-032治疗组胜过接受了奥司他韦治疗的组。
图35显示了在10倍LD50(10MLD50)下，并且在第1和3天给药了抗体治疗(图33)，约10％的接受抗-M2e治疗(TCN-032)或奥司他韦治疗的小鼠都存活至第21天，在该点完成了研究。这些情况都优于PBS安慰剂或给药对照。
实施例17：用抗-M2e抗体或奥司他韦疗法治疗的2或4倍 LD50(2LD50或4LD50)的体内H1N1攻击V
用A型流行性感冒感染，并且尤其是，用2或4倍LD50剂量(2LD50或4LD50)剂量的H1N1(A／NWS／33(H1N1))攻击十(10)只balb／c雌性小鼠组(年龄6-10周，并且称重16-20克)。
用20mg／kg(或400μg／治疗)的抗-M2e抗体或同种型负对照治疗受攻击的小鼠。在感染后4小时或72小时(3天)给药M2e或对照抗体(图36)。抗-M2e抗体是TCN-031(也称为23K12)或TCN-032(也称为8i10)。使用了正对照抗体，ch14C2(也称为TCN-040)，和负对照同种型抗体，2N9。
或者，用10mg／kg bid剂量(“bis in die”，一天两次(twice或two times))的具有神经氨酸酶抑制剂活性的抗病毒药物(例如，奥司他韦、磷酸奥司他韦或TamifluTM)治疗受攻击的小鼠。
受攻击小鼠的对照组是“未治疗的”。给药这些小鼠磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而不是M2e抗体、奥司他韦或M2e抗体／奥司他韦联合治疗。
此外，留下一组小鼠未受攻击和未治疗，作为更多对照。
通过腹膜内注射给药治疗，包括PBS对照。
所有实验和对照组中的小鼠没有安乐死。测定了个体的存活和体重参数。计算了百分比存活和平均体重。
图37显示了在4倍LD50(4MLD50)下，用TCN-032M2e抗体治疗的小鼠群内的存活百分比显著高于负对照抗体或PBS安慰剂的百分比存活(即，用TCN-032抗体治疗在第21天导致40％的存活率，用负对照抗体治疗在第12天导致治疗组死亡，而用PBS安慰剂治疗导致在第21天大约25％的存活率)。将TCN-032抗M2e抗体治疗组提高的百分比存活与同种型对照相比，是统计学显著的(p<0.021)。用奥司他韦或正对照的治疗分别产生了100％存活率或60％存活率。
图38显示了在2倍LD50(2MLD50)下，用TCN-032或TCN-031M2e抗体治疗的小鼠群内的存活百分比显著高于负对照抗体或PBS安慰剂的百分比存活(即，用TCN-032抗体治疗在第21天导致55％的存活率，用TCN-031抗体治疗在第21天导致50％的存活率，用负对照抗体治疗在第21天导致大约20％的存活率，而用PBS安慰剂治疗导致在第21天大约20％的存活率)。用奥司他韦或正对照的治疗产生了90％的存活率。
实施例18：用抗-M2e抗体或奥司他韦疗法治疗的5倍LD50 (5LD50)的体内H1N1攻击VI
用A型流行性感冒感染，并且尤其是，用5倍LD50剂量(5LD50)剂量的H1N1(A／PR／8／34(H1N1))攻击十(10)只balb／c雌性小鼠组(年龄6-10周，并且称重16-20克)。
用20mg／kg(或400μg／治疗)的抗-M2e抗体或同种型负对照治疗受攻击的小鼠。在感染后第一(1)天、第三(3)天和第五(5)天给药M2e或对照抗体(图28)。抗-M2e抗体是TCN-031(也称为23K12)或TCN-032(也称为8i10)。使用了正对照抗体，ch14C2(也称为TCN-040)，和负对照同种型抗体，2N9。
或者，在感染后四(4)小时，用10mg／kg剂量的具有神经氨酸酶抑制剂活性的抗病毒药物(例如，奥司他韦、磷酸奥司他韦或TamifluTM)治疗受攻击的小鼠。
受攻击小鼠的对照组是“未治疗的”。给药这些小鼠磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而不是M2e抗体、奥司他韦或M2e抗体／奥司他韦联合治疗。
此外，留下一组小鼠未受攻击和未治疗，作为更多对照。
通过腹膜内注射给药治疗，包括PBS对照。
当感染后体重减轻超过感染前体重的20％时，将所有实验和对照组中的小鼠安乐死。
图39显示了在5倍LD50(5MLD50)下，用TCN-032或TCN-031M2e抗体治疗的小鼠群内的存活百分比显著高于负对照抗体或PBS安慰剂的百分比存活(即，用TCN-032、TCN-031或正对照抗体的治疗在第21天导致60％的存活率，用负对照抗体或PBS安慰剂的治疗在第7-8天导致小鼠群的消失)。用奥司他韦的治疗产生了80％的存活率。
实施例19：用抗-M2e抗体或奥司他韦疗法治疗的2.5倍LD50 (2.5LD50)的体内H1N1攻击VII
用A型流行性感冒感染，并且尤其是，用2.5倍LD50剂量(2.5LD50)剂量的H1N1(A／WI／WSLH34939／09(H1N1))攻击十(10)只balb／c雌性小鼠组(年龄6-10周，并且称重16-20克)。
用20mg／kg(或400μg／治疗)的抗-M2e抗体或同种型负对照治疗受攻击的小鼠。在感染后第一(1)天、第三(3)天和第五(5)天给药M2e或对照抗体(图28)。抗-M2e抗体是TCN-031(也称为23K12)或TCN-032(也称为8i10)。使用了正对照抗体，ch14C2(也称为TCN-040)，和负对照同种型抗体，2N9。
或者，用10mg／kg剂量的的具有神经氨酸酶抑制剂活性的抗病毒药物(例如，奥司他韦、磷酸奥司他韦或TamifluTM)治疗受攻击的小鼠。
受攻击小鼠的对照组是“未治疗的”。给药这些小鼠磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而不是M2e抗体、奥司他韦或M2e抗体／奥司他韦联合治疗。
此外，留下一组小鼠未受攻击和未治疗，作为更多对照。
通过腹膜内注射给药治疗，包括PBS对照。
当感染后体重减轻超过感染前体重的20％时，将所有实验和对照组中的小鼠安乐死。
图40显示了在2.5倍LD50(2.5MLD50)下，用TCN-032或TCN-031M2e抗体治疗的小鼠群内的存活百分比显著高于正对照抗体、负对照抗体或PBS安慰剂的百分比存活(即，用TCN-031或TCN-032治疗在第21天分别导致80％或60％的存活率，用正对照抗体治疗在第21天导致40％的存活，用负对照抗体或PBS安慰剂治疗在第21天导致20％的存活)。
实施例20：用抗-M2e抗体或奥司他韦疗法治疗的5倍LD50 (5LD50)的体内H1N1攻击VII
用A型流行性感冒感染，并且尤其是，用5倍LD50剂量(5LD50)剂量的H5N1(VN1203／04(H5N1))攻击小鼠组。
用20mg／kg或40mg／kg的抗-M2e抗体或同种型负对照治疗受攻击的小鼠。20mg／kg剂量组每组包括19只小鼠，40mg／kg剂量组每组包括5只小鼠。在感染后第一(1)天、第三(3)天和第五(5)天给药M2e或对照抗体(图41)。抗-M2e抗体是TCN-031(也称为23K12)或TCN-032(也称为8i10)。使用了正对照抗体，ch14C2(也称为TCN-040)，和负对照同种型抗体，2N9。
或者，用10mg／kg q.d.(一天一次)或bid(一天两次)剂量的具有神经氨酸酶抑制剂活性的抗病毒药物(例如，奥司他韦、磷酸奥司他韦或TamifluTM)治疗受攻击的小鼠，在感染后第一(1)天开始持续至第五(5)天(图41)。
受攻击小鼠的对照组是“未治疗的”。给药这些小鼠磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而不是M2e抗体、奥司他韦或M2e抗体／奥司他韦联合治疗。
此外，留下一组小鼠未受攻击和未治疗，作为更多对照。
通过腹膜内注射200μl给药治疗，包括PBS对照。
在感染后第三(3)天和第六(6)天从20mg／kg研究组获取三只小鼠，以测定肺、脑和肝病毒复合滴定度。在感染后第六(6)天从40mg／kg研究组获取另外三只小鼠，用于组织病理学检查。
图42显示了在5倍LD50(5MLD50)下，并且关于接受了20mg／kg剂量的抗-M2e抗体治疗的研究组，用TCN-032或TCN-031M2e抗体治疗的小鼠群内的存活百分比实质性地高于负对照抗体或PBS安慰剂的百分比存活(即，用TCN-032或TCN-031的治疗在第14天分别导致80％或70％存活，用负对照抗体治疗在第14天导致20％存活，用PBS安慰剂治疗导致在第14天小鼠群消失)。每天给药两次的奥司他韦治疗优于抗-M2e抗体治疗，然而，一天给药一次的奥司他韦治疗的有效性低于抗-M2e抗体治疗(用TCN-032或TCN-031的治疗在第14天分别导致80％或70％存活，用奥司他韦bid治疗在第14天导致90％存活，用奥司他韦q.d.治疗在第14天导致50％存活)。接受TCN-032vs.同种型负对照的小鼠群证明的提高的百分百存活是统计学显著的(p<0.012)。此外，接受奥司他韦(q.d.或bid)vs.PBS安慰剂的小鼠群证明的提高的百分比存活是统计学显著的(q.d.p<0.006和bid p<0.0001)。
图43显示了在5倍LD50(5MLD50)下，并且关于接受了40mg／kg剂量的抗-M2e抗体治疗的研究组，用TCN-032或TCN-031M2e抗体治疗的小鼠群内的存活百分比实质性地高于负对照抗体或PBS安慰剂的百分比存活(即，用TCN-032或TCN-031的治疗在第14天分别导致100％或80％存活，用负对照抗体治疗在第14天导致40％存活，用PBS安慰剂治疗导致在第14天小鼠群消失)。每天给药两次的奥司他韦治疗优于TCN-031抗-M2e抗体治疗，而不是TCN-032。一天给药一次的奥司他韦治疗的有效性低于抗-M2e抗体治疗(用TCN-032或TCN-031的治疗在第14天分别导致100％或80％存活率(之间的差异是没有统计学显著的)，用奥司他韦bid治疗在第14天导致90％存活，用奥司他韦q.d.治疗在第14天导致50％存活)。接受TCN-032vs.同种型负对照的小鼠群证明的提高的百分百存活是统计学显著的(p<0.004)。此外，接受奥司他韦(q.d.或bid)vs.PBS安慰剂的小鼠群证明的提高的百分比存活是统计学显著的(q.d.p<0.006和bid p<0.0001)。
抗-M2e抗体限制病毒从患者的气道传播至其他组织(表7)。
表7
图44提供了表7中所提供数据的代表性照片，显示了抗-M2e抗体，包TCN-031和TCN-032，限制病毒从患者的气道传播至其他组织。图44A显示了在接受TCN-031治疗的病毒攻击的小鼠中，具有病毒抗原的肺损伤分布在多个肺叶中，但损伤趋向于限制在每个肺叶的一部分中。图44B显示了在接受TCN-031治疗的病毒攻击的小鼠中，没有检测到炎症损伤或病毒抗原。图44C显示了在接受TCN-031治疗的病毒攻击的小鼠中，没有检测到炎症损伤或病毒抗原。图44D显示了在PBS安慰剂的病毒攻击的小鼠中，具有病毒抗原的肺损伤在肺叶的一部分中。图44E显示了在接受PBS安慰剂的病毒攻击的小鼠中，存在具有病毒抗原的小坏死损伤。图44F显示了接受PBS安慰剂的病毒攻击的小鼠中，可以在神经和胶质细胞中发现大范围的病毒抗原染色。
图45提供了表7和图44中提供的分析的定量。数据表明用抗-M2e抗体(TCN-031或TCN-032)治疗，显示了流感病毒从气道传播至不相关的组织。具体地，在抗-M2e治疗情况中，与肺相比，在第3和第6天，肝和脑中的流行性感冒病毒降低。
实施例21：用抗-M2e抗体或奥司他韦疗法治疗的5倍LD50 (5LD50)的体内H5N1攻击VIX
用A型流行性感冒感染，并且具体地，用5倍LD50剂量(5LD50)剂量的H5N1(VN1203／04(H5N1))攻击十只(10)小鼠组。
用40mg／kg(800μg)的抗-M2e抗体或同种型负对照治疗受攻击的小鼠。根据以下时间表之一给药M2e或对照抗体：1)在感染后第一(1)天、第三(3)天和第五(5)天，2)在感染后第二(2)天、第四(4)天和第六(6)天，3)在感染后第三(3)天、第五(5)天和第七(7)天或4)在感染后第四(4)天、第六(6)天和第八(8)天(图46)。抗-M2e抗体是TCN-031(也称为23K12)或TCN-032(也称为8i10)。使用了正对照抗体，ch14C2(也称为TCN-040)，和负对照同种型抗体，2N9。
受攻击小鼠的对照组是“未治疗的”。给药这些小鼠磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而不是M2e抗体、奥司他韦或M2e抗体／奥司他韦联合治疗。
此外，留下一组小鼠未受攻击和未治疗，作为更多对照。
通过腹膜内注射200μl给药治疗，包括PBS对照。
图47显示了在5倍LD50(5MLD50)下，并且在感染后第1、3和5天提供抗-M2e治疗时，用TCN-032或TCN-031M2e抗体治疗的小鼠群内的存活百分比显著高于用正对照抗体、负对照抗体或PBS安慰剂治疗的组的百分比存活(即，用TCN-031或TCN-032治疗在第14天各自导致50％或40％的存活率，用正对照抗体治疗在第12天导致小鼠群消失，用负对照抗体的治疗在第9天导致小鼠群消失，而用PBS安慰剂的治疗在第8天导致小鼠群消失)。通过接受TCN-031或TCN-032vs.同种型负对照的小鼠群证明的提高的百分比存活是统计学显著的(TCN-031，p<0.008和TCN-032，p<0.004)。此外，通过接受TCN-031或TCN-032vs.未治疗但攻击的对照的小鼠群证明的提高的百分比存活也是统计学显著的(TCN-031，p<0.0007和TCN-032，p<0.003)。
图48显示了在5倍LD50(5MLD50)下，并且在感染后第2、4和6天提供抗-M2e治疗时，相同的一般趋势是真实的，然而，两种M2e治疗效果相等(即，用TCN-031或TCN-032的治疗在第14天导致50％存活)。通过接受TCN-031或TCN-032vs.同种型负对照的小鼠群证明的提高的百分比存活是统计学显著的(TCN-031，p<0.001和TCN-032，p<0.009)。此外，通过接受TCN-031或TCN-032vs.未治疗但攻击的对照的小鼠群证明的提高的百分比存活也是统计学显著的(TCN-031，p<0.0005和TCN-032，p<0.003)。
图49显示了在5倍LD50(5MLD50)下，并且在感染后第3、5和7天提供了抗-M2e治疗时，用TCN-031M2e抗体治疗的小鼠群内的存活百分比显著高于用正对照抗体、负对照抗体或PBS安慰剂治疗的组的百分比存活(即，用TCN-031的治疗在第14天导致50％存活率，用正对照抗体的治疗在第14天导致20％存活率，用负对照抗体的治疗导致第14天导致10％存活率，用PBS安慰剂治疗在第14天导致10％存活率，未治疗但攻击的小鼠群在第9天消失)。令人感兴趣地，使用这种给药方案，TCN-031抗体治疗比TCN-032抗体治疗更有效。然而，应当注意到TCN-032抗体治疗与正对照进行地同样好。通过接受TCN-031抗体vs.同种型负对照的小鼠群证明的提高的百分比存活是统计学显著的(p<0.039)。此外，通过接受TCN-031或TCN-032抗体治疗vs.未治疗但攻击的对照的小鼠群证明的提高的百分比存活也是统计学显著的(TCN-031，p<0.0002和TCN-032，p<0.023)。
图50显示在5倍LD50(5MLD50)下，并且在感染后第4、6和8天提供抗-M2e治疗时，相同的一般趋势是真实的，然而，两种M2e治疗效果相等(即，用TCN-031或TCN-032的治疗在第14天导致60％存活)。通过接受TCN-031vs.同种型负对照的小鼠群证明的提高的百分比存活是统计学显著的(p<0.046)。此外，通过接受TCN-031或TCN-032抗体vs.未治疗但攻击的对照的小鼠群证明的提高的百分比存活也是统计学显著的(TCN-031，p<0.0009和TCN-032，p<0.002)。
图51显示了在5倍LD50(5MLD50)下，并且在感染后第1、3和5天提供抗-M2e治疗时，用TCN-031或TCN-032M2e抗体治疗的小鼠群内剩余的重量百分比与用正对照抗体治疗的小鼠群内剩余的重量百分比相似(在TCN-032的情况中)或实质性地较高(在TCN-031的情况中)。令人感兴趣地，使用这种给药方案，TCN-031抗体治疗比TCN-032抗体治疗更有效。然而，应当注意到TCN-032抗体治疗与正对照抗体进行地同样好或高于正对照抗体，如通过数据中的相似趋势所证明的，但TCN-032治疗组中的数据延伸至研究的完成。
图52显示了在5倍LD50(5MLD50)下，并且在感染后第2、4和6天提供抗-M2e治疗时，用TCN-031或TCN-032M2e抗体治疗的小鼠群内剩余的重量百分比相似地高于用正对照抗体治疗的小鼠群内剩余的重量百分比。使用这种给药方案，当TCN-031治疗的组中的动物的重量明显急剧恢复时，两种M2e抗体的性能非常相似，直至最后的数据点，。
图53显示了在5倍LD50(5MLD50)下，并且在感染后第3、5和7天提供抗-M2e治疗时，用TCN-031或TCN-032M2e抗体治疗的小鼠群内剩余的重量百分比高于用正对照抗体治疗的小鼠群内剩余的重量百分比。此外，使用这种方案，TCN-032治疗的小鼠中重量减轻的恢复明显强于TCN-031治疗的小鼠中重量减轻的恢复。然而，在所有点，TCN-031抗-M2e抗体治疗组的重量减轻显著低于正对照抗体。实际上，在第14天，TCN-032治疗组中的小鼠的重量等于未治疗且未攻击组的。
图54显示了在5倍LD50(5MLD50)下，并且在感染后第4、6和8天提供抗-M2e治疗时，用TCN-031或TCN-032M2e抗体治疗的小鼠群内剩余的重量百分比低于用正对照抗体治疗的小鼠群内剩余的重量百分比。值得注意的，两种抗-M2e抗体治疗剩余的百分比重量值在整个实验中是相似的。
实施例22：用抗-M2e抗体、奥司他韦或其组合治疗的5、10 和20倍LD50(5X、10X和20X MLD50)的体内H5N1攻击X
用A型流行性感冒感染，并且具体地，用5X、10X或20XMLD50剂量的H5N1(A／Vietnam／1203／04(VN1203))攻击十只(10)balb／c雌性小鼠组(年龄6-10wk，并且称重为16-20克)。
用20mg／kg(400μg)的抗-M2e抗体(TCN-032，也称为8i10)或同种型负对照(TCN-202)治疗受攻击的小鼠。在感染后第一(1)天、第三(3)天和第五(5)天给药M2e或对照抗体(图55)。通过腹膜内注射给药抗体治疗。
替换地，或另外地，在感染后第一(1)天开始用10mg／kg bid(一天两次)剂量的具有神经氨酸酶抑制剂活性的抗病毒药物(例如，奥司他韦、磷酸奥司他韦或TamifluTM)治疗受攻击的小鼠，并且持续五(5)天(图55)。口服给药奥司他韦。
受攻击小鼠的对照组是“未治疗的”。给药这些小鼠磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而不是M2e抗体、奥司他韦或M2e抗体／奥司他韦联合治疗。
此外，留下一组小鼠未受攻击和未治疗，作为更多对照。
当感染后重量减轻超过30％感染前重量时，将小鼠安乐死。
图56显示了在5倍LD50(5X MLD50)下，通过预防流行性感冒感染介导的死亡，用奥司他韦单一疗法或TCN-032和奥司他韦的联合疗法治疗的小鼠群内的存活百分比在整个研究中完全保护了小鼠。单独的TCN-032M2e抗体的给药提供了优于对照情况的实质性保护(即，用TCN-032抗-M2e抗体单一疗法的治疗在第15天导致60％存活率，用同种型对照抗体的治疗在第15天导致10％存活率，用PBS(未治疗的状况或给药对照)在第15天导致10％存活率)。通过接受TCN-032抗-M2e抗体单一疗法vs.同种型负对照的小鼠群证明的提高的百分比存活是统计学显著的(p<0.027)。此外，通过接受TCN-032和奥司他韦联合疗法vs.同种型负对照和奥司他韦的联合疗法的小鼠群证明的提高的百分比存活也是统计学显著的(p<0.012)。与未处理状况(只给药了PBS)相比时，通过接受TCN-032抗体、联合疗法(TCN-032和奥司他韦)和奥司他韦单一疗法的群证明的提高的存活是统计学显著的(TCN-032p<0.031、TCN-032和奥司他韦p<0.0001和奥司他韦p<0.0001)。
图57显示了在5倍LD50(5X MLD50)下，通过预防流行性感冒感染介导的重量减轻或死亡，用奥司他韦单一疗法或TCN-032和奥司他韦联合疗法治疗的小鼠群内剩余的重量百分比在整个研究中完全保护了小鼠。
图58显示了在10倍LD50(10X MLD50)下，通过预防流行性感冒感染介导的死亡，用TCN-032和奥司他韦联合疗法治疗的小鼠群内的存活百分比在整个研究中完全保护了小鼠。单独的TCN-032M2e抗体或单独的抗病毒药物奥司他韦的给药提供了优于对照状况的实质性保护(即，用TCN-032抗-M2e抗体单一疗法的治疗在第15天导致70％的存活率，用奥司他韦单一疗法的治疗在第15天导致60％的存活率，用同种型对照抗体的治疗在第12天导致小鼠群消失，并且用PBS的治疗(未治疗状况或给药对照)在第15天导致20％的存活率)。接受TCN-032抗-M2e抗体单一疗法vs.同种型负对照的小鼠群证明的提高的百分比存活是统计学显著的(p<0.001)。此外，接受TCN-032和奥司他韦联合疗法vs.奥司他韦单一疗法的小鼠群证明的提高的百分比存活也是统计学显著的(p<0.029)。与未治疗的状况(只给药PBS)相比时，接受TCN-032抗体或联合疗法(TCN-032和奥司他韦)的群证明的提高的存活是统计学显著的(TCN-032p<0.037，以及TCN-032和奥司他韦p<0.0003)。
图59显示了在10倍LD50(10X MLD50)下，通过预防流行性感冒介导的重量减轻或死亡，用TCN-032和奥司他韦的联合疗法治疗的小鼠群内剩余的重量百分比在整个研究中完全保护了小鼠。用TCN-032或奥司他韦单一疗法治疗的群剩余更多重量，并且因此，比同种型对照或PBS-对照群进行地更好。
图60显示了在20倍LD50(20X MLD50)下，通过预防流行性感冒介导的死亡，用TCN-032和奥司他韦联合疗法治疗的小鼠群内的存活百分比在整个研究中完全保护了小鼠。单独的TCN-032M2e抗体或单独的抗病毒药物奥司他韦的给药提供了优于对照状况的实质性保护(即，用TCN-032抗-M2e抗体单一疗法的治疗在第15天导致70％的存活率，用奥司他韦单一疗法的治疗在第15天导致60％的存活率，用同种型对照抗体的治疗在第12天导致小鼠群消失)。这些结果表明TCN-032和奥司他韦以协同方式作用，以完全保护人类免受致命流行性感冒攻击。通过接受TCN-032抗-M2e抗体单一疗法vs.同种型负对照的小鼠群证明的提高的百分比存活是统计学显著的(p<0.002)。此外，通过接受TCN-032和奥司他韦联合疗法vs.包括同种型对照抗体和奥司他韦的联合疗法的小鼠群证明的提高的百分比存活是统计学显著的(p<0.012)。通过接受TCN-032和奥司他韦的联合疗法vs.奥司他韦单一疗法的小鼠群证明的提高的百分比存活也是统计学显著的(p<0.029)。
图61显示了在20倍LD50(20X MLD50)下，通过预防流行性感冒感染介导的重量减轻或死亡，用TCN-032和奥司他韦联合疗法治疗的小鼠群内剩余的重量百分比在整个过程中完全保护了小鼠。
实施例23：用抗-M2e抗体、奥司他韦或其组合治疗的20倍 LD50(20X MLD50)的体内H5N1攻击X
用A型流行性感冒感染，并且具体地，用20X MLD50剂量的H5N1(A／Vietnam／1203／04(VN1203))攻击十只(10)balb／c雌性小鼠组(年龄6-10wk，并且称重为16-20克)。
用20mg／kg的抗-M2e抗体(TCN-032，也称为8i10)或同种型负对照(TCN-202)治疗受攻击的小鼠。根据以下时间表之一来给药M2e或对照抗体：1)在感染后第一(1)天、第三(3)天和第五(5)天给药，2)在感染后第三(3)天、第五(5)天和第七(7)天给药，3)在感染后第四(4)天、第七(7)天和第九(9)天给药，(图62)。通过腹膜内注射给药抗体治疗。
替换地，或另外地，在感染后第一(1)天开始，在感染后第三(3)天、第四(4)天或第五(5)天，用10mg／kg bid(一天两次)剂量的具有神经氨酸酶抑制剂活性的抗病毒药物(例如，奥司他韦、磷酸奥司他韦或TamifluTM)治疗受攻击的小鼠，并且持续五(5)天(图55)。口服给药奥司他韦。
受攻击小鼠的对照组是“未治疗的”。给药这些小鼠磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而不是M2e抗体、奥司他韦或M2e抗体／奥司他韦联合治疗。
此外，留下一组小鼠未受攻击和未治疗，作为更多对照。
图63显示了在20倍LD50(20X MLD50)下，并且关于第一个研究，通过预防流行性感冒介导的死亡，用TCN-032和奥司他韦联合疗法治疗的小鼠群内的存活百分比在整个研究中完全保护了小鼠。单独的TCN-032M2e抗体或单独的抗病毒药物奥司他韦的给药提供了优于对照状况的实质性保护(即，用TCN-032抗-M2e抗体单一疗法的治疗在第15天导致70％的存活率，用奥司他韦单一疗法的治疗在第15天导致60％的存活率，用同种型对照抗体的治疗在第12天导致小鼠群消失)。这些结果表明TCN-032和奥司他韦以协同方式作用，以完全保护人类免受致命流行性感冒攻击。关于第二个研究，通过防止90％小鼠中流行性感冒感染介导的死亡，用TCN-032和奥司他韦联合疗法治疗的小鼠群内的存活百分比在整个研究中完全保护了小鼠。该存活率非常接近未攻击且未治疗小鼠群的100％存活率。单独的TCN-032M2e抗体的给药提供了一定的优于对照状况的保护(即，用TCN-032抗M2e-抗体单一疗法的治疗在第14天导致10％的存活率，用奥司他韦单一疗法的治疗在第11天导致小鼠群的消失，用PBS(给药对照)的治疗在第11天导致小鼠群的消失)。这些结果表明TCN-032和奥司他韦以协同方式作用，以保护小鼠免受致命流行性感冒攻击。
研究一在2010年6月进行。该研究的目的是确定抗-M2e抗体和奥司他韦的联合是否产生了协同结果。此外，确定联合疗法可以保护对抗的病毒攻击有多显著。研究二在2010年10月进行。当时，只是用了20X LD50水平的病毒攻击，然而，第一次治疗开始的时间在第1、3、4或5天之间变化。这从研究1到研究2，具有“桥接”作用，因为研究2的第1天治疗组基本上是研究1中的20x LD50的精确重复。
研究2中给药的病毒攻击，尽管设计成与研究1的20x LD50组中给药的相同，但更致命。因为只需要如此少的病毒颗粒，因此产生了这种结果。1XLD50等于大约2个病毒颗粒。因此，即使病毒攻击储备物制备中的小变化也可以层叠成大的致命性差异。
图64显示了在20倍LD50(20X MLD50)下，并且在感染后第1、3和5天给药抗体治疗时，通过防止90％小鼠的流行性感冒感染介导的死亡，用TCN-032和奥司他韦联合疗法治疗的小鼠群内的存活百分比在整个研究中完全保护了小鼠。该存活率非常接近未攻击且未治疗小鼠群的100％存活率。单独的TCN-032M2e抗体的给药提供了一定的优于对照状况的保护(即，用TCN-032抗M2e-抗体单一疗法的治疗在第14天导致10％的存活率，用奥司他韦单一疗法的治疗在第11天导致小鼠群的消失，用PBS(给药对照)的治疗在第11天导致小鼠群的消失)。这些结果表明TCN-032和奥司他韦以协同方式作用，以保护小鼠免受致命流行性感冒攻击。
图64显示了在20倍LD50(20X MLD50)下，并且在感染后第3、5和7天给药抗体治疗时，通过防止50％小鼠的流行性感冒感染介导的死亡，用TCN-032和奥司他韦联合疗法治疗的小鼠群内的存活百分比在整个研究中部分地保护了小鼠。单独的TCN-032M2e抗体的给药提供了优于对照状况的相似保护(即，用TCN-032抗M2e-抗体单一疗法的治疗在第14天导致40％的存活率，用奥司他韦单一疗法的治疗在第9天导致小鼠群的消失，用PBS(给药对照)的治疗在第11天导致小鼠群的消失)。
图64显示了在20倍LD50(20X MLD50)下，并且在感染后第4、6和8天给药抗体治疗时，通过防止70％小鼠的流行性感冒感染介导的死亡，用TCN-032和奥司他韦联合疗法治疗的小鼠群内的存活百分比在整个研究中部分地保护了小鼠。单独的奥司他韦单一疗法的给药提供了低于对照状况的相似保护(即，用奥司他韦单一疗法的治疗在第9天导致小鼠群消失，而用PBS(给药对照)的治疗在第11天导致小鼠群的消失)。
图64显示了在20倍LD50(20X MLD50)下，并且在感染后第5、7和9天给药抗体治疗时，通过防止大约40％小鼠的流行性感冒感染介导的死亡，用TCN-032和奥司他韦联合疗法治疗的小鼠群内的存活百分比在整个研究中保护了小鼠。单独的TCN-032M2e抗体的给药提供了优于对照状况的实质性保护(即，用TCN-032抗M2e-抗体单一疗法的治疗在第14天导致40％的存活率，用TCN-031抗-M2e抗体单一疗法的治疗在第14天导致10％的存活率，用奥司他韦单一疗法的治疗在第9天导致小鼠群的消失，用PBS(给药对照)的治疗在第11天导致小鼠群的消失)。
图65显示了在20倍LD50(20X MLD50)下，并且在感染后第1、3和5天给药抗体治疗时，通过防止明显的流行性感冒介导的重量减轻或死亡，用TCN-032和奥司他韦联合疗法治疗的小鼠群内剩余的重量百分比在整个研究中明显地保护了小鼠。对于TCN-032和奥司他韦联合疗法治疗的小鼠，在每个时间点剩余的百分比重量与未攻击且未治疗小鼠(其接近正常对象)的非常相似。
图65显示了在20倍LD50(20X MLD50)下，并且在感染后第3、5和7天或第4、6和8给药抗体治疗时，用TCN-032和奥司他韦联合疗法治疗的小鼠群内剩余的重量百分比在整个研究中显著高于未治疗对照组(PBS给药对照)中剩余的重量百分比。因此，TCN-032和奥司他韦的联合疗法防止了明显的流行性感冒感染介导的重量减轻或死亡。
图65显示了在20倍LD50(20X MLD50)下，并且在感染后第5、7和9天给药抗体治疗时，用TCN-032和奥司他韦联合疗法治疗的小鼠群内剩余的重量百分比与未治疗对照组(PBS给药对照)中剩余的重量百分比相似，直至大约第10天，而联合疗法实质性地恢复了小鼠群的重量，并且将丢失减少大约一半。令人感兴趣地，TCN-032抗体单一疗法组在研究结束时恢复了其重量减轻。
实施例24：用抗-M2e治疗的LD90(LD90)的体内H5N1／ 预防攻击XII
用A型流行性感冒感染，并且具体地，用1X MLD90剂量的H5N1(A／Vietnam／1203／04(VN1203))攻击十只(10)ba1b／c雌性小鼠组(年龄6-10wk，并且称重为16-20克)。
用10mg／kg，bid(一天两次)(200μg／治疗)的抗-M2e抗体(TCN-032，也称为8i10，或TCN-031，也称为23k12)、正对照抗体(ch14C2)或同种型负对照(2N9)治疗受攻击的小鼠。在减一天(-1，即，感染前一天)和感染后第二(2)天，给药抗-M2e或对照抗体，(图66)。通过腹膜内注射给药抗体治疗。
受攻击小鼠的对照组留下未攻击和未治疗。
在感染后第28天，收集组织，用于组织学分析和测定病毒负荷。
图67显示了1X IC90，人抗-M2e单克隆抗体，即，TCN-031(23K12)和TCN-032(8I10)，在H5N1感染的啮齿动物致命攻击模型中是保护性的。单独的TCN-031或TCN-032抗体治疗提供了优于正对照抗体治疗的保护(即，用TCN-031抗-M2e抗体单一疗法的治疗导致80％的存活率，用TCN-032抗-M2e抗体单一疗法的治疗导致70％的存活率，用正对照抗体的治疗导致60％的存活率，用负对照抗体的治疗导致20％的存活率)。与用负对照抗体的治疗相比时，通过接受TCN-031抗体、TCN-032抗体的群证明的提高的存活，并且正对照抗体是统计学显著的(TCN-031p＜0.004，TCN-032p＜0.0035和正对照p＜0.029)。
结果证明了人抗-M2e单克隆抗体，即，TCN-031(23K12)和TCN-032(8I10)，提供了对抗致命攻击的预防性保护。
实施例25：小鼠攻击实验的概述
表8提供了本文中所述的体内致命攻击实验。如表和数据揭示的，本发明的抗-M2e抗体是对抗流行性感冒感染保护性的。
表8.
Figure BDA0000413462010002141
实施例26：抗-M2e抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC) 研究
用A型流行性感冒病毒(A／Soloman Islands／3／2006)感染MDCK细胞。然后用抗-M2e单克隆抗体(例如，TCN-031或TCN-032)或同种型相配的负对照(抗-CMV抗体)预先培养这些细胞。然后将感染的和预先培养的MDCK细胞接触从单个人捐献者分离的人天然杀伤(NK)细胞。通过测量释放的乳酸脱氢酶(LDH)来定量细胞溶解。进行了两个独立的实验。
图68显示了通过用抗-M2e抗体预培养并将MDCK细胞接触人NK细胞诱导ADCC后，释放了大致相同量的LDH(左侧图)。抗-M2e抗体比负对照抗体介导了更有效的ADCC，如通过用负对照抗体治疗后降低的LDH释放所显示的。通过抗-M2e抗体诱导的ADCC介导的细胞溶解对于受感染的细胞也是特异性的，如通过图右侧的图中有利的效应物比目标物的比例所显示的。
图69证实了图68中所示的结果。
这些结果证明了在抗-M2e单克隆抗体的存在下观察到的受感染MDCK细胞的NK-介导的杀灭。因此，本发明的抗-M2e单克隆抗体(例如，TCN-031或TCN-032)介导或诱导了ADCC。
实施例27：抗-M2e抗体亲和性研究
在完整PR8病毒上使用单克隆抗体的FAb片段测定了抗-M2e单克隆抗体(例如，TCN-031或TCN-032)亲和性。表9中提供了结果。
表9
mAb kon(M-1s-1)X105 koff(s-1) KD(koff/kon)，nM
TCN-032 7.4 0.0023 3
TCN-031 10 0.014 14
14C2 .005 0.00286(8) 4000
实施例28：抗-M2e抗体免疫组织化学特征
在组织微矩阵(TMA)载玻片(Biochain-FDA Standard FrozenTissue Array，cat#T6234701，lot#B203071)上检测了冷冻肺组织的三个完整切片。
分析揭示了在用1.25μg／ml浓度的抗体TCN-031-FITC和TCN-032-FITC测试的任一个人组织中，没有高于背景的明显阳性染色的证据。在该的浓度下，正对照细胞系内的细胞子集是强烈阳性的，而负对照细胞系是阴性(图70和71)。
因此，图70和71中显示的免疫组织化学证明了本发明的抗-M2e抗体(例如，TCN-031和TCN-032)没有与未感染的组织交叉反应。实际上，用来自三名正常人捐献者的30个人组织组没有观察到明显的交叉反应性。
实施例29：通过补体依赖性淋巴细胞毒性(CDC)试验测定 的抗-M2e抗体功效
温度胁迫的抗-M2e抗体(例如，TCN-032)的流式细胞分析支持CDC试验的发展，作为次要的功效试验。因此，通过用CellTiter-Glo发光试剂盒检测细胞生活力来发展96-孔CDC试验(图72)。使用低传代M2-表达CHO细胞系(DG44.VNM2)测定了细胞生活力。
图73显示了抗-M2e抗体TCN-032(也称为8i10)比负对照抗-CMV抗体(TCN-202，也称为2N9)更有效。在更高百分比的人补体的存在下，TCN-032比负对照抗体特异性地溶解更高百分比的M2-表达CHO细胞(DG44.VNM2)。在5-10％(体积比体积，v／v)补体之间获得了最大细胞溶解。
将96-孔CDC试验转化成单一形式，以增强试验性能和流线型工作流(图74)。
图75证实和阐明了图73的结果。具体地，图75显示了抗-M2e抗体TCN-032(也称为8i10)比负对照抗-CMV抗体(TCN-202，也称为2N9)或无单克隆抗体对照更有效的。在更高百分比的人补体的存在下，TCN-032比负对照抗体或无抗体对照特异性地溶解更高百分比的M2-表达CHO细胞(DG44.VNM2)。用大约6.25％(体积比体积，v／v)的补体获得了具有最小的可忽略背景的最大目标细胞溶解。
图76显示了在高于60℃(＞60℃)下胁迫时，抗-M2e抗体TCN-032证明了降低的CDC活性。
其他实施方案
尽管为了说明的目的，本文中已经描述了本发明的特定实施方案，但可以形成各种改变，而没有脱离本发明的精神和范围。因此，本发明只受到所附权利要求的限制。
尽管已经结合其详述描述了本发明，但之前的描述打算用来说明本发明的范围，而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围来限定。其他方面、优势和改变在以下权利要求的范围内。
本文中提及的专利和科学文献确定了本领域技术人员可以利用的知识。本文中引用的所有美国专利以及公开或未公开的美国专利申请按引用并入。本文中引用的所有公开的外国专利和专利申请在此按引用并入。由本文中引用的登录号表示的Genbank和NCBI提交在此按引用并入。本文中引用的所有其他出版的参考文献、文件、手稿和科学文献在此按引用并入。
尽管已经参考其优选的实施方案特别地显示和描述了本发明，但本领域技术人员将理解其中可以形成各种形式和细节的变化，而没有脱离所附权利要求包括的本发明的范围。
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Claims (18)

1.一种组合物，其包含：
(a)分离的完全人单克隆抗-M2e抗体组合物，其中抗体包含：包含NYYWS(SEQ ID NO：72)的氨基酸序列的VH CDR1区；包含FIYYGGNTKYNPSLKS(SEQ ID NO：74)的VHCDR2区；包含ASCSGGYCILD(SEQ ID NO：76)的氨基酸的VH CDR3；包含RASQNIYKYLN(SEQ ID NO：59)的氨基酸序列的VL CDR1；包含AASGLQS(SEQ ID NO：61)的氨基酸序列的VL CDR2区；和包含QQSYSPPLT(SEQ IDNO：63)的氨基酸序列的VL CDR3区；和
(b)奥司他韦组合物。
2.一种组合物，其包含：
(a)分离的完全人单克隆抗-M2e抗体组合物，其中抗体包含：包含SNYMS(SEQ ID NO：103)的氨基酸序列的VH CDR1区；包含VIYSGGSTYYADSVK(SEQ ID NO：105)的氨基酸序列的VH CDR2区；包含CLSRMRGYGLDV(SEQ IDNO：107)的氨基酸序列的VH CDR3区；包含RTSQSISSYLN(SEQ ID NO：92)的氨基酸序列的VL CDR1区；包含AASSLQSGVPSRF(SEQ ID NO：94)的氨基酸序列的VLCDR2区；和包含QQSYSMPA(SEQ ID NO：96)的氨基酸序列的VL CDR3区；和
(b)奥司他韦组合物。
3.一种药物组合物，其包含权利要求1或2的组合物和药物载体。
4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，其中所述奥司他韦是磷酸奥司他韦。
5.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，进一步包含第二种抗A型流行性感冒抗体。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述第二种抗A型流行性感冒抗体是抗-M2e抗体或抗-HA抗体。
7.一种用于预防或治疗患者流行性感冒病毒感染的方法，包括将权利要求1-3任一项的组合物给药患者。
8.根据权利要求7所述的方法，其中以10至40mg／kg／天的剂量给药所述抗-M2e抗体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述抗M2e抗体每天给药一次或两次。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述奥司他韦组合物以10mg／kg的剂量给药。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述奥司他韦组合物每天给药一次或两次。
12.根据权利要求7所述的方法，其中在流行性感冒感染之前给药所述抗-M2e抗体或所述奥司他韦组合物。
13.根据权利要求7所述的方法，其中在流行性感冒感染之后给药所述抗-M2e抗体或所述奥司他韦组合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在流行性感冒感染4天或48小时内给药所述抗-M2e抗体。
15.根据权利要求7所述的方法，其中所述抗-M2e抗体和所述奥司他韦组合物同时或按序给药。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗-M2e抗体和所述奥司他韦组合物按序给药，并且在所述奥司他韦组合物之前给药所述抗-M2e抗体。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗-M2e抗体和所述奥司他韦组合物按序给药，并且在所述奥司他韦组合物之后给药所述抗-M2e抗体。
18.一种试剂盒，其包含权利要求3的组合物。
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