BRPI0820053A2 - anticorpos recombinantes, composições compreendendo os mesmos, métodos para a terapia e diagnóstico de influenza e kit de diagnóstico - Google Patents

Abstract

"composiçúes e métodos para a terapia e diagnóstico de influenza" a presente invenção fornece anticorpos anti-influenza humanos que se ligam a de- terminantes conformacionais de um homotetrâmero m2 e composições e métodos relacionados. esses anticorpos são usados no diagnóstico e tratamento da infecção por influenza.

Description

“ANTICORPOS RECOMBINANTES, COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO OS MESMOS, MÉTODOS PARA A TERAPIA E DIAGNÓSTICO DE INFLUENZA E KIT DE DIAGNÓSTICO”

Pedidos Relacionados

Esse pedido reivindica o privilégio dos pedidos provisórios USSN 60/987.353, depositado em 12 de novembro de 2007, USSN 60/987.355, depositado em 12 de novembro de 2007, USSN 61/053.840 depositado em 16 de maio de 2008, e USSN 61/095.208, depositado em 08 de setembro de 2008, cujos conteúdos de cada um é aqui incorporado por referência.

Campo da Invenção

A presente invenção está de modo geral relacionada com a terapia, diagnóstico e monitorização da infecção por influenza. A invenção está mais especificamente relacionada aos métodos de identificação da anticorpos proteína-específicos da matriz 2 do influenza e sua produção e utilização. Tais anticorpos são úteis em composições farmacêuticas para a prevenção e tratamento da influenza, e para o diagnóstico e monitorização da infecção por influenza.

Fundamentos da Invenção

O vírus influenza infecta de 5 a 20% da população e resulta em de30.000 a 50.000 de mortes a cada ano nos EUA. Embora a vacina contra influenza seja o principal método de prevenção de infecção, quatro drogas antivirals estão disponíveis também nos E.U.A: amantadina, rimantadina , oseltamivir e zanamivir. A partir de dezembro de 2005, apenas o oseltamivir (Tamiflu™) está recomendado para o tratamento da influenza A, devido à crescente resistência do vírus a amantadina e rimantidina resultante de uma substituição de aminoácido na proteína M2 do vírus.

A doença causada pela infecção viral pelo vírus influenza A é caracterizada pela sua natureza cíclica. A derivação e troca antigênica permitem às diferentes cepas A a emergir a cada ano. Somado a isso, a ameaça de cepas altamente patogênicas que contagiam a população em geral tem evidenciado a necessidade quanto a novas terapias para as infecções provocadas por influenza. A fração predominante de anticorpos neutralizantes é direcionado para as regiões polimórficas de proteínas hemaglutinina e neuraminidase. Assim, essa neutralização Mab pode presumivelmente apenas objetivar uma ou poucas cepas. A tendência mais recente tem sido sobre a relativamente invariável proteína da matriz 2 (M2). Potencialmente, um Mab neutralizante para M2 pode ser uma terapêutica adequada para todas as cepas de influenza A.

A proteína M2 é encontrada em um homotetrâmero que forma um canal iônico e é considerada auxiliar no desencapamento do vírus quando da entrada na célula. Após a infecção, M2 pode ser encontrado em abundância na superfície da célula. Ele é em seguida incorporado dentro da capa do virião, onde ele compreende apenas cerca de 2% do total da proteína teína do revestimento total. O domínio extracelular M2 (M2e) é curto, com os aminoácidos aminoterminais 2-24 exibidos fora da célula. MAbs anti-M2, até o momento têm sido direcionados no sentido a essa sequência linear. Desse modo, eles não podem apresentar as desejadas propriedades ligantes ao M2 expresso celularmente, incluindo os determinantes conformacionais no M2 natural.

Por conseguinte, existe de há muito uma necessidade no estado da técnica quanto a novos anticorpos que se liguem ao M2 expressos na célula e aos determinantes conformacionais no M2 natural.

Sumário d Invenção

A presente invenção proporciona anticorpos monoclonais totalmente humanos dirigidos especificamente contra M2e. Opcionalmente, o anticorpo é isolado formar uma célula-B de um doador humano. Anticorpos monoclonais exemplares incluem 8i10, 21B15 e 23K12 descritos. Alternativamente, o anticorpo monoclonal é um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo 8i10, 21B15 e 23K12. Os anticorpos aqui respectivamente referidos são huM2e. Desse modo, o anticorpo huM2e tem uma ou mais das seguintes características: a) se liga a um epítopo do domínio extracelular do polipeptídeo do ectodomínio da matriz 2 (M2e) de um vírus influenza; b) se liga a células infectadas por influenza A, ou c) se liga ao vírus influenza A.

O epítopo ao qual o anticorpo huM2e se liga é um epítopo não-linear de um polipeptídeo M2. Preferencialmente, o epítopo inclui a região amino terminal do polipeptídeo M2e. Mais preferivelmente o epítopo inclui de forma total ou parcial a seqüência aminoácido SLLTEV (SEQ ID NO: 42). A maioria, de preferência, o epítopo inclui o aminoácido na posição 2, 5 e 6 do polipeptídeo M2e quando numerado de acordo com SEQ ID NO: 1. O aminoácido na posição 2 é uma serina; na posição 5 é uma treonina, e na posição 6 é um ácido glutâmico.

Um anticorpo huM2e contém uma variável de cadeia pesada possuindo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NOS: 44 ou 50 e uma variável de cadeia leve possuindo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NOS: 46 ou 52. De preferência, os três CDRs de cadeia pesada incluem uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 92%, 95%, 97% a 98%, 99% ou mais idêntica à sequência de aminoácidos de NYYWS (SEQ ID NO: 72), FIYYGGNTKYNPSLKS ( SEQ ID NO: 74), ASCSGGYCILD (SEQ ID NO: 76), SNYMS (SEQ ID NO: 103), VIYSGGSTYYADSVK (SEQ ID NO: 105), CLSRMRGYGLDV (SEQ ID NO: 107) (tal como determinado pelo método Kabat) ou ASCSGGYCILD (SEQ ID NO: 76), CLSRMRGYGLDV (SEQ ID NO: 107), GSSISN (SEQ ID NO: 109), FIYYGGNTK (SEQ ID NO: 110), GSSISN (SEQ ID NO: 111), GFTVSSN (SEQ ID NO: 112), VIYSGGSTY (SEQ ID NO: 113) (tal como determinado pelo método Chothia) e uma cadeia leve, com três CD's que incluem uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90%, 92%, 95%, 97% a 98%, 99% ou mais, idênticos à seqüência de aminoácidos de RASQNIYQUILN (SEQ ID NO: 59), AASGLQS ( SEQ ID NO: 61), QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 63), RTSQSISSILN (SEQ ID NO: 92), AASSLQSGVPSRF (SEQ ID NO: 94), QQSYSMPA (SEQ ID NO: 96) (conforme determinado pelo método Kabat) ou RASQNIYQUILN (SEQ ID NO: 59), AASGLQS (SEQ ID NO: 61), QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 63), RTSQSISSILN (SEQ ID NO: 92), AASSLQSGVPSRF (SEQ ID NO: 94), QQSYSMPA (SEQ ID NO: 96) (conforme determinado pelo método Chothia). O anticorpo se liga a M2e.

A cadeia pesada de um anticorpo M2e é derivado de um gene de linhagem germinativa V (variável), tal como por exemplo, o gene da linhagem lgHV4 ou lgHV3.

Os anticorpos M2e da invenção incluem uma região variável de cadeia pesada (V_H) codificada por uma sequência de gene de linhagem germinativa lgHV4 ou lgHV3 humana. Uma seqüência genética da linhagem germinativa lgHV4 se apresenta, por exemplo, nos número de Acesso L10088, M29812, M95114, M95117 e X56360. A seqüência genética da linhagem germinativa lgHV3 se apresenta, por exemplo, nos números de acesso X92218, X70208, Z27504, M99679 e AB019437. Os anticorpos M2e da invenção incluem uma região VH que é codificado por uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos 80% homóloga à seqüência genética da linhagem germinativa lgHV4 ou lgHV3. Preferencialmente, a seqüência de ácido nucléico, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97% homóloga à seqüência genética da linhagem germinativa lgHV4 ou lgHV3, e mais preferivelmente, pelo menos, 98%, 99% homóloga à seqüência genética da linhagem germinativa lgHV4 ou lgHV3. A região V_H do anticorpo M2e é pelo menos 80% homóloga à seqüência de aminoácidos da região V_H codificada pelo gene da linhagem germinativa V_H de lgHV4 ou lgHV3. Preferencialmente, a seqüência de aminoácidos da região V_H do anticorpo M2e é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97% homóloga à seqüência de aminoácidos codificados pela seqüência genética da linhagem germinativa lgHV4 ou lgHV3, e mais preferivelmente, pelo menos 98%, 99% homóloga à seqüência codificada pela seqüência genética da linhagem germinativa lgHV4 ou lgHV3.

Os anticorpos M2e da invenção também incluemua região variável de cadeia leve (V_L) codificada por uma sequência genética da linhagem germinativa IgKVI humana, uma sequência genética da linhagem germinativa V_L de IgKVI humana é mostrada, por exemplo, números de acesso X59315, X59312, X59318, J00248 e Y 14865. Alternativamente, os anticorpos M2e incluem uma região V_L que está codificada por uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos 80% homóloga à sequência genética da linhagem germinativa IgKVI. Preferencialmente, a seqüência de ácido nucléico, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97% homóloga à sequência genética da linhagem germinativa IgKVI, e mais preferivelmente, pelo menos 98%, 99% homóloga à sequência genética da linhagem germinativa IgKVI. A região V_L de anticorpo M2e é pelo menos 80% homóloga relativamente à sequência de aminoácidos da região V_L codificada pela seqüência genética da linhagem germinativa IgKVI. Preferencialmente, a seqüência de aminoácidos da região V_L do anticorpo M2e é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97% homóloga relativamente à sequência de aminoácidos codificada pela sequência genética da linhagem germinativa IgKVI, e mais preferivelmente, pelo menos, 98%, 99% homóloga relativamente à seqüência codificada pela sequência genética da linhagem germinativa IgKVI.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição incluindo um anticorpo huM2e de acordo com a invenção. Em vários aspectos a composição inclui ainda uma droga anti-viral, um inibidor da entrada viral ou um inibidor da fixação viral. A droga anti-viral, por exemplo, é um inibidor da neuraminidase, um inibidor da HA, um inibidor do ácido siálico ou um inibidor de canal iônico da M2. O inibidor de canal iônico da M2 é por exemplo a amantadina ou rimantadina. O inibidor de neuraminidase é por exemplo zanamivir ou o fosfato de oseltamivir. Em um outro aspecto a composição inclui ainda um segundo anticorpo anti-influenza A.

Em um aspecto ainda mais os anticorpos huM2e acordo com a invenção são operavelmente ligados a um agente terapêutico ou um marcador detectável.

Além disso, a invenção fornece métodos para estimular uma resposta imune, tratar, prevenir ou aliviar um sintoma de uma infecção viral por influenza através da administração de um anticorpo huM2e a um indivíduo.

Opcíonalmente, o indivíduo é também administrado com um segundo agente, tal como, mas não limitado a, um anticorpo contra o vírus influenza, uma droga anti-viral, tal como um inibidor da neuraminidase, um inibidor da HA, um inibidor do ácido siálico ou um inibidor do canal iônico da M2, um inibidor da entrada viral ou um inibidor da fixação viral. O inibidor de canal iônico da M2 é por exemplo a amantadina ou rimantadina. O inibidor de neuraminidase é por exemplo zanamivir ou o fosfato de oseltamivir. O indivíduo está sofrendo ou está predisposto a desenvolver uma infecção pelo vírus influenza, tais como, por exemplo, uma doença auto-imune ou um distúrbio inflamatório.

Em outro aspecto, a invenção fornece métodos de administrar o anticorpo huM2e da invenção a um indivíduo, antes e/ou após a exposição ao vírus influenza. Por exemplo, o anticorpo huM2e da invenção é usado para tratar ou prevenir a infecção por rejeição do influenza. O anticorpo huM2e é administrado em uma dose suficiente para promover a depuração viral ou eliminar as células infectadas por influenza A.

Também incluído na invenção está um método para determinar a presença de uma infecção pelo vírus influenza em um paciente, mediante contatar uma amostra biológica obtida a partir do paciente com um anticorpo humM2e; detectar uma quantidade de anticorpo que se liga a amostra biológica e comparar a quantidade de anticorpo que se liga a amostra biológica com um valor de controle.

A invenção também fornece um kit de diagnóstico que compreende um anticorpo huM2e.

Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir do que é abrangido pela descrição detalhada e pelas reivindicações apresentadas adiante.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 mostra a ligação de três anticorpos da presente invenção e anticorpos hu12C2 controle para as células HEK 293 transfectadas com uma construto de expressão M2 ou vetor de controle, na presença ou ausência de peptídeo M2 livre.

As Figuras 2A e B são gráficos que mostram a ligação do anticorpo monoclonal humano com a influenza A / Puerto Rico/8/32.

A Figura 3 A é um gráfico que mostra seqüências de aminoácidos dos domínios extracelulares de variantes M2.

As Figuras 3B e C são gráficos de barras que mostram a ligação do anticorpo humano monoclonal anti-influenza que se ligam às variantes M2 mostrado na Figura 3A.

As Figuras 4A e B são gráficos de barras que mostram a ligação do anticorpo humano monoclonal anti-influenza que se ligam a peptídeos M2 submetido a mutagênese por varredura alanina.

A Figura 5 é uma série de gráficos de barras que mostra ligação de MAbs 8i10 e 23K12 a proteína M2 que representa a sequência da cepa influenza A/HK/483/1997 que foi expressa de forma estável na linhagem celular DG44 de CHO.

A Figura 6A é um gráfico mostrando a reatividade cruzada a ligação de anticorpos anti-M2 a variante peptídeos M2.

A Figura 6B é um gráfico que mostra a atividade de ligação de anticorpos M2 a peptídeos M2 truncados.

A Figura 7 é um gráfico que mostra a sobrevivência de ratos infectados com influenza tratados com anticorpos monoclonais anti-influenza humano.

A Figura 8 é uma ilustração que mostra a ligação de anticorpos anti-M2 a uma região altamente conservada no N-terminal de M2e.

A Figura 9 é um gráfico que mostra clones rHMAb anti-M2 provenientes do sobrenadante bruto ligado a influenza em ELISA, enquanto o controle rHMAb anti-M2s não se ligaram prontamente ao vírus.

A Figura 10 é uma série de fotografias mostrando rHMAbs anti-M2 ligado a células infectadas com a influenza. As células MDCK que foram ou não infectados com a ligação a influenza A/PR/8/32 e Ab proveniente do sobrenadante bruto foram testadas 24 horas mais tarde. Os dados foram obtidos a partir do scanner placa FMAT.

A Figura 11 é um gráfico que mostra clones rHMAb anti-M2 provenientes do sobrenadante bruto ligados a células transfectadas com subtipos influenza H3N2, HK483 e proteínas VN1203 M2. Plasmídeos que codificam cDNAs M2 de comprimento completo correspondentes às cepas de influenza H3N2, HK483 e VN 1203, bem como um controle do plasm ideo mock, foram transfectadas transitoriamente em 293 células. Os mABs 14C2, 8i10, 23K12, e 21B15 foram testados quanto à ligação aos transfectantes, e foram detectados com conjugado AF647 de anticorpo secundário IgG anti-humano. São mostradas as intensidades de fluorescência média de mAB específico ligados após análise FACS.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção proporciona anticorpos monoclonais totalmente humanos específicos contra o domínio extracelular do polipeptídeo da matriz 2 (M2). Os anticorpos aqui respectivamente referidos são anticorpos huM2e.

M2 é uma proteína transmembrana de 96 aminoácidos presentes como homotetrâmero na superfície do vírus influenza e de células infectadas por vírus. M2 contém ectodomínio de 23 aminoácidos (M2e) que é altamente conservada entre as linhagens de influenza A. Poucas mudanças de aminoácidos ocorreram desde que a cepa pandêmica de d918 e desse modo M2e é um alvo atraente para as terapias de influenza. Em estudos anteriores, os anticorpos monoclonais específicos para o ectodomínio M2 (M2e) foram obtidos após a imunização com um peptídeo correspondente à seqüência linear de M2e. Em contrapartida, a presente invenção fornece um novo processo pelo qual M2 de comprimento completo é expresso em linhagens celulares, que permite a identificação de anticorpos humanos que se ligam a esse M2e expresso na célula. Os anticorpos huM2e têm demonstrado o efeito de se ligar a determinantes conformacionais nas células M2transfectadas, bem como M2 nativas, quer em células infectadas por influenza, ou no vírus propriamente. Os anticorpos huM2e não se ligam ao peptídeo M2e linear, mas eles se ligam às diversas variantes M2 natural, também expressas quando da transfecção do DNA nas linhagens celulares. Assim, essa invenção permitiu a identificação e produção de anticorpos monoclonais humanos que apresentam novas especificidades quanto a uma faixa muito ampla de linhagens de vírus influenza A. Esses anticorpos podem ser utilizados para identificar de modo diagnóstico uma infecção por influenza A e para tratar terapeuticamente a infecção por influenza A.

Os anticorpos huM2e da invenção tem uma ou mais das seguintes características: o anticorpo huM2e se liga a) a um epítopo no domínio extracelular do polipeptídeo da matriz 2 (M2) de um vírus influenza; b) se liga a células infectadas por influenza A; e / ou c) se liga ao vírus influenza A (isto é, viriões). Os anticorpos huM2e da invenção eliminam as células infectadas por influenza através de mecanismos efetores tais como ADCC e promove a depuração viral direta mediante se ligar aos viriões influenza. Os anticorpos huM2e da invenção se ligam à região amino-terminal do polipeptídeo M2e em que o resíduo metionina

N-terminal está ausente. Sequências M2e representativas incluem aquelas listadas na Tabela I apresentada a seguir.

Tabela I

Tipo	Nome	Subtipo	Sequência M2e	SEQ ID NO:
A	BREVIG MISSION.1.1918	H1N1	MSLLTEVETPTRNEWGCRCNDSSD	SEQ ID NO: 1
A	FORT MONMOUTH.1.1947	H1N1	MSLLTEVETPTKNEWECRCNDSSD	SEQ ID NO: 2
A	SINGAPORE.02.2005	H3N2	MSLLTEVETPIRNEWECRCNDSSD	SEQ ID NO: 3
A	WISCONSIN.10.98	H1N1	MSLLTEVETPIRNGWECKCNDSSD	SEQ ID NO: 4
A	WISCONSIN.301.1976	H1N1	MSLLTEVETPIRSEWGCRCNDSSD	SEQ ID NO: 5
A	PANAMA. 1.66	H2N2	MSFLPEVETPIRNEWGCRCNDSSD	SEQ ID NO: 6
A	NEW YORK.321.1999	H3N2	MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSN	SEQ ID NO: 7
A	CARACAS .1.71	H3N2	MSLLTEVETPIRKEWGCRCNDSSD	SEQ ID NO: 8
A	TAIWAN.3.71	H3N2	MSFLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD	SEQ ID NO: 9
A	WUHAN.359.95	H3N2	MSLPTEVETPIRSEWGCRCNDSSD	SEQ ID NO: 10
A	HONG KONG.1144.99	H3N2	MSLLPEVETPIRNEWGCRCNDSSD	SEQ ID NO: 11
A	HONG KONG .1180.99	H3N2	MSLLPEVETPIRNGWGCRCNDSSD	SEQ ID NO: 12
A	HONG KONG.1774.99	H3N2	MSLLTEVETPTRNGWECRCSGSSD	SEQ ID NO: 13
A	NEW YORK.217.02	H1N2	MSLLTEVETPIRNEWEYRCNDSSD	SEQ ID NO: 14
A	NEW YORK.300.2003	H1N2	MSLLTEVETPIRNEWEYRCSDSSD	SEQ ID NO: 15
A	SWINE.SPAIN. 54008.20.04	H3N2	MSLLTEVETPTRNGWECRYSDSSD	SEQ ID NO: 16
A	GUANGZHOU.333.99	H9N2	MSFLTEVETLTRNGWECRCSDSSD	SEQ ID NO: 17
A	HONG KONG .1073.99	H9N2	MSLLTEVETLTRNGWECKCRDSSD	SEQ ID NO: 18
A	HONG KONG .1.68	H3N2	MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD	SEQ ID NO: 19
A	SWINE.HONG KONG.126.1982	H3N2	MSLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD	SEQ ID NO: 20
A	NEW YORK.703.1995	H3N2	MSLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD	SEQ ID NO: 21
A	SWINE.QUEBEC.192.81	H1N1	MSLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD	SEQ ID NO: 22
A	PUERTO RICO.8.34	H1N1	MSLLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD	SEQ ID NO:

				23
A	HONG KONG .485.97	H5N1	MSLLTEVDTLTRNGWGCRCSDSSD	SEQ ID NO: 24
A	HONG KONG.542.97	H5N1	MSLLTEVETLTKNGWGCRCSDSSD	SEQ ID NO: 25
A	SILKY CHICKEN.SHANTOU.1826. 2004	H2N2	MSLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD	SEQ ID NO: 26
A	CHICKEN.. TAIWAN.0305.04	H6N1	MSLLTEVETHTRNGWECKCSDSSD	SEQ ID NO: 27
A	CODORNA. ARKANSAS 0.16309-7,94	H7N3NS A	MSLLTEVKTPTRNGWECKCSDSSD	SEQ ID NO: 28
A	HONG KONG .486.97	H5N1	MSLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSD	SEQ ID NO: 29
A	CHICKEN.. PENNSILVANIA.13552- 1.98	H7N2NS B	MSLLTEVETPTRDGWECKCSDSSD	SEQ ID NO: 30
A	CHICKEN.. HEILONGJIANG.48.01	H9N2	MSLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD	SEQ ID NO: 31
A	SWINE.KOREA. S5.2005	H1N2	MSLLTEVETPTRNGWECKCNDSSD	SEQ ID NO: 32
A	HONG KONG .1073.99	H9N2	MSLLTEVETLTRNGWECKCSDSSD	SEQ ID NO: 33
A	WISCONSIN.3523.88	H1N1	MSLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD	SEQ ID NO: 34
A	LINHAGEM VACINAL X-31	H3N2	MSFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD	SEQ ID NO: 35
A	CHICKEN.. ROSTOCK.8.19.34	H7N1	MSLLTEVETPTRNGWECRCNDSSD	SEQ ID NO: 36
A	ENVIRONMENT.NEW YORK. 16326 1.2005	H7N2	MSLLTEVETPIRKGWECNCSDSSD	NEW SEQ ID NO: 37
A	INDONESIA.560H.2006	H5N1	MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD	SEQ ID NO: 38
A	CHICKEN. HONG KONG. SF1.03	H9N2	MSLLTGVETHTRNGWGCKCSDSSD	SEQ ID NO: 39
A	CHICKEN.. HONG KONG. YU4 27.03	H9N2	MSLLPEVETHTRNGWGCRCSDSSD	SEQ ID NO: 40

Em uma modalidade, os anticorpos huM2 da invenção se ligam a um M2e que inclui total ou parcialmente os resíduos de aminoácidos da posição 2 para a posição 7 de M2e quando numeradas de acordo com a SEQ ID NO: 1. Por exemplo, os anticorpos huM2 da invenção se ligam, total ou parcialmente a seqüência de aminoácidos SLLTEVET (SEQ ID NO: 41). Preferivelmente, os anticorpos huM2 da invenção se ligam, total ou parcialmente a seqüência de aminoácidos SLLTEV (SEQ ID NO: 42). Preferivelmente, os anticorpos huM2 da invenção se ligam a um epítopo não linear da proteína M2e. Por exemplo, os anticorpos se ligam a um epítopo huM2e compreendendo a posição 2, 5 e 6 do polipeptídeo M2e quando numeradas de acordo com SEQ ID NO: 1, onde o aminoácido a) em uma posição 2 é uma serina; b) na posição 5 é uma treonina e c) na posição 6 é um ácido glutâmico. Anticorpos monoclonais huM2e representativos que se ligam a esse epítopo são os anticorpos 8110, 21B15 ou 23K12I descritos aqui.

O anticorpo 8110 inclui uma região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO: 44) codificada pela seqüência de ácido nucléico mostrado abaixo na SEQ ID NO: 43, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID NO: 46) codificada pela seqüência de ácido nucléico mostrada na SEQ ID NO: 45.

Os aminoácidos abrangendo os CDRs conforme definido por Chothia, C. et al. (1989, Nature, 342: 877-883) estão sublinhadas e as definidas por Kabat e a et al. (1991, seqüências de proteínas de interesse imunológico, quinta edição., NIH Publication não. 913242 E.U. Departamento de Saúde e Serviços Humanos.) são destacadas em negrito nas seqüências abaixo.

CDRs de cadeia pesada do anticorpo 8110 tem as seguintes seqüências, por definição, Kabat: NYYWS (SEQ ID NO: 72), FIYYGGNTKYNPS LKS (SEQ ID NO: 74) e ASCSGGYCILD (SEQ ID NO: 76). CDRs cadeia leve do anticorpo 8110 tem as seguintes seqüências, por definição, Kabat: RASQNIYQUILN (SEQ ID NO: 59), AA SGLQS (SEQ ID NO: 61) e QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 63).

CDRs de cadeia pesada do anticorpo 8110 tem as seguintes seqüências, por definição Chothia: GSSISN (SEQ ID NO: 109), FIYYGGNTK (SEQ ID NO: 110) e ASCSGGYCILD (SEQ ID NO: 76). CDRs cadeia leve do anticorpo 8110 tem as seguintes seqüências, por definição Chothia: RASQNIYQUILN (SEQ ID NO: 59), AASGLQS (SEQ ID NO: 61) e QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 63).

> Sequência nucleotídica VH de 8110: (SEQ ID NO: 43)

CAGGTGCSATTGCAGGAGTCGGGCCCASGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCAC ctgcactgtctctggttcgtccatcagtaattactactggagctggatccggcãgtccccag GGMfíGGACTGGAGTGGATTGGGTTTATCTATTACGGTGGAAACACCAAGTACAATCCCTCC CTCAAGAGCCGCGTCACCATATCACãAGACACTTCCAAGAGTCAGGTCTCCCTGACGATGAG CTCTGTGACCGCTGCGGAATCGGCCGTCTATTTCTGTGCGAGAGCGTCTTGTAGTGGTGGTT ACTGTATCCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCG > Sequência de aminoácido VH de 8110: (SEQ ID NO: 44)

Kabat negrito, sublinhado Chothia

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> sequência nucleotídica VL de 8110: (SEQ ID NO: 45)

GACATCOIGATGACCCÃGTCTCCÃTCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT cacttgccgggcgagtcagaacatttacaagtatttaaattggtatcagcagagaccaggga AS.GCCCCTAAGGGCCTGATCTCTGCTGCATCCGGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTC AGTGGCAGTGGATCTGGGAmGATTTCACTCTCACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTT TQCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTCCCCCTCTCAOTTTCGGCGGAGGGA.CCAGGG >Sequência de aminoácido VL de 8110: (SEQ ID NO: 46)

Kabat negrito, sublinhado Chothia

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O anticorpo 21B15 inclui uma região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO: 44) codificado pela seqüência de ácido nucléico mostrado abaixo na SEQ ID NO: 47, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID NO: 46) codificado pela seqüência de ácido nucléico mostrado na SEQ ID NO: 48.

Os aminoácidos abrangendo os CDRs conforme definido por Chlothia et al.1989, estão sublinhadas e os definidos por Kabat et ai. 1991 são destaque em negrito as seqüências abaixo.

CDRs de cadeia pesada do anticorpo 21B15 têm as seguintes seqüências, por definição, Kabat: NYYWS (SEQ ID NO: 72), FIYYGGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 74) e ASCSGGYCILD (SEQ ID NO: 76). CDRs de cadeia leve do anticorpo 21B15 têm as seguintes seqüências, por definição, Kabat: RASQNIYQUILN (SEQ ID NO: 59), AASGLQS (SEQ ID NO: 61) e QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 63).

CDRs de cadeia pesada do anticorpo 21B15 têm as seguintes seqüências, por definição Chothia: GSSISN (SEQ ID NO: 111), FIYYGGNTK (SEQ ID NO: 110) e ASCSGGYCILD (SEQ ID NO: 76). Os CDRs cadeia leve do anticorpo 21B15 ter as seguintes seqüências, por definição Chothia: RASQNIYQUILN (SEQ ID NO: 59), AASGLQS (SEQ ID NO: 61) e QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 63).

> Sequência nucleotídica VH de 21B15: (SEQ ID NO: 47)

CAGGTGCAATTGCAGC3AGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCAC CTGCACTGTCTCTGGTTCGTCCÃTCAGTAA.TTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGTCCCCAG GGAAGGGACTGGAGT^ATTGGGTTTATCTATTACGGTGGAAAaACCAAGTACAATCCCTCC CTCAAGAGCCGCGTCACCÃTATCACAAGACACTTCCÃAGAGTCAGGTCTCCCTGACGATGAG CTCTGTGACCGCTGCQGAATCGGCCGTCTATTTCTGaxSCGAGAGCGTCTWrAGTGGTGGTT

> Sequência de aminoácido VH de 21B15: (SEQ ID NO: 44)

Kabat negrito, sublinhado Chothia

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I L· D YWGQGT L VTVS > Sequência nucleotídica VL de 21B15: (SEQ ID NO: 48)

GACATCCAGGTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCÃCCAT CACTTGCCGCGCGAGTCÀGAACATTTACAAGTATTTAAATTGGTATCAGCAGAGACCAGGGA. AAGCCCCTAAGGGCCTGATCTCTGCTGCATCCGGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTC AGTGSCAOTGGATCTGGGACAGA^TTCACTCT^CACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTl’ TGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTCCCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAGGG TGGA.TATCAAAC > Sequência de aminoacido VL de 21B15: (SEQ ID NO: 46)

Kabat negrito, sublinhado Chothia

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O anticorpo 23K12 inclui anticorpos inclui uma região variável da cadeia pesada (SEQ ID NO: 50) codificado pela sequência de ácido nucléico mostrado abaixo na SEQ ID NO: 49, e uma região variável da cadeia leve (SEQ ID NO: 52) codificado pela seqüência de ácido nucléico mostrado na SEQIDNO: 51.

Os aminoácidos abrangendo os CDRs conforme definido por Chlothia et al. 1989 estão sublinhadas e as definidas por Kabat et al. 1991 são destaque em negrito as sequências abaixo.

CDRs de cadeia pesada do anticorpo 23K12 têm as seguintes seqüências por definição Kabat: SNYMS (SEQ ID NO: 103), VIYSGGSTYYADSVK (SEQ ID NO: 105) e CLSRMRGYGLDV (SEQ ID NO: 107). CDRs cadeia leve do anticorpo 23K12 têm as seguintes seqüências, por definição, Kabat: RTSQSISSILN (SEQ ID NO: 92), AASSLQSGVPSRF (SEQ ID NO: 94) e QQSYSMPA (SEQ ID NO: 96).

CDRs de cadeia pesada do anticorpo 23K12 ter as seguintes seqüências por definição Chothia: GFTVSSN (SEQ ID NO: 112), VIYSGGSTY (SEQ ID NO: 113) e CLSRMRGYGLDV (SEQ ID NO: 107). Os CDRs cadeia leve do anticorpo 23K12 ter as seguintes seqüências, por definição Chothia: RTSQSISSILN (SEQ ID NO: 92), AASSLQSGVPSRF (SEQ ID NO: 94) e QQSYSMPA (SEQ ID NO: 96).

> Sequência nucleotídica VH 23K12: (SEQ ID NO: 49)

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGQGASGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGAATCTC

CTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAGCAACTACaTGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCAG

GGAAGGGGCTGaAGTGGGTCTCAGTTATTTATAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAmCTCC

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CAGCCTGAGAGCCSAGGACACGGCTGTSTA.TTACTGTGCGAGATGTCTGAGCAGGATGCGGG

GTTACGGTTTAGACGTCTGGGGCCAAÍ3SGACCACGGTCACCGTCTCG > Sequência de aminoácidos VH de 23K12: (SEQ ID NO: 50)

Kabat negrito, sublinhado Chothia

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> Sequência nucleotídica Vl_ de 23K12: (SEQ ID NO: 51)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCAT

CACTTGCCGGACAAGTCAGAGCATTAGCAGCTA.TTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGCSGA

AAGCCCCTAAACTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTC

AGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGGTCTGCAACCTGAAGATTI TGCAACCTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTATGCCTGCCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGG AGATCAAA > Sequência de aminoácido VL de 23K12: (SEQ ID NO: 52)

Kabat negrito, sublinhado Chothia

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Anticorpos huM2e da invenção incluem anticorpos que também incluem uma sequência de aminoácidos variável de cadeia pesada que é pelo menos 90%, 92%, 95%, 97% a 98%, 99% ou mais idêntica à seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 ou 49. e / ou uma sequência de aminoácidos variável de cadeia leve que é pelo menos 90%, 92%, 10 95%, 97% a 98%, 99% ou mais idêntica à seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46 ou

52.

Por outro lado, o anticorpo monoclonal é um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo 8110, 21B15 ou 23K12.

A cadeia pesada de um anticorpo M2e é derivada de um gene da linhagem - 15 germinativa V (variável), tal como, por exemplo, o gene da linhagem germinativa lgHV4 ou lgHV3.

Os anticorpos M2e da invenção incluem uma região variável de cadeia pesada (VH) codificada por um lgHV4 humana ou a seqüência genética da linhagem germinativa lgHV3. Uma seqüência genética da linhagem germinativa lgHV4 é mostrada, por exemplo, em 20 números de acesso L10088, M29812, M95114, M95117 e X56360. A seqüência genética da linhagem germinativa lgHV3 é mostrada, por exemplo, em números de acesso X92218, X70208, Z27504, M99679 e AB019437. Os anticorpos M2e da invenção incluem uma região VH que é codificada por uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos 80% homóloga à seqüência genética da linhagem germinativa lgHV4 ou lgHV3. Preferencialmente, a seqüência de ácido nucléico, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97% homóloga à seqüência genética da linhagem germinativa lgHV4 ou lgHV3, e mais preferivelmente, pelo menos, 98%, 99% homóloga à seqüência genética da linhagem germinativa lgHV4 ou lgHV3. A região VH do anticorpo M2e é peio menos 80% homóloga à seqüência de aminoácidos da região VH codificada pelo gene da linhagem germinativa VH de lgHV4 ou lgHV3. Preferencialmente, a seqüência de aminoácidos da região VH do anticorpo M2e é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97% homóloga à seqüência de aminoácidos codificados pela seqüência genética da linhagem germinativa lgHV4 ou lgHV3, e mais preferivelmente, pelo menos 98%, 99% homóloga à seqüência codificada pela seqüência genética da linhagem germinativa lgHV4 ou lgHV3.

Os anticorpos M2e da invenção também incluem uma região variável de cadeia leve (VL) codificada por uma sequência genética da linhagem germinativa IgKVI humana, uma sequência genética da linhagem germinativa VL de IgKVI humana é mostrado, por exemplo, números de acesso X59315, X59312, X59318, J00248 e Y 14865. Alternativamente, os anticorpos M2e incluem uma região VL que está codificada por uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos 80% homóloga à sequência genética da linhagem germinativa IgKVI. Preferencialmente, a seqüência de ácido nucléico, pelo menos, 90%, 95%, 96%, 97% homóloga à sequência genética da linhagem germinativa IgKVI, e mais preferivelmente, pelo menos 98%, 99% homóloga à sequência genética da linhagem germinativa IgKVI. A região de VL de anticorpo M2e é pelo menos 80% homóloga à seqüência de aminoácidos da região VL codificado pela sequência genética da linhagem germinativa IgKVI. Preferencialmente, a seqüência de aminoácidos da região VL do anticorpo M2e é pelo menos 90%, 95%, 96%, 97% homóloga à seqüência de aminoácidos codificada pela sequência genética da linhagem germinativa IgKVI, e mais preferivelmente, pelo menos, 98%, 99% homóloga à seqüência codificada pela sequência genética da linhagem germinativa IgKVI.

A menos que de outro modo definido, os termos técnicos e científicos utilizados em conjunto com a presente invenção terão os significados que são comumente entendidos por aqueles usualmente versados na técnica. Além disso, a menos que seja requerido pelo contexto, termos singulares incluem pluralidades e termos plural incluem o singular. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em conjunto com, e técnicas de, cultura de células e de tecidos, biologia molecular e proteínas e oligo-química e hibridização ou polinucleotídeo descritos neste documento são bem conhecidos e usads no estado da técnica. Técnicas padrões são usadas para o DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos e cultura e transformação de tecidos (por exemplo, eletroporação, lipofílico). Reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como é comumente realizada no estado da técnica ou como aqui descrito. A prática da presente invenção vai empregar, a menos que especificamente indicado em contrário, os métodos convencionais de virologia, imunologia, microbiologia, biologia molecular e técnicas de DNA recombinante contidas no estado da técnica, muitos dos quais são descritos a seguir para fins de ilustração. Tais técnicas são explicadas totalmente na literatura. Veja, por exemplo, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translação (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

A nomenclatura utilizada em conjunto com, e os procedimentos e técnicas de laboratório, química analítica, química orgânica sintética e medicamentos e química farmacêutica descritas neste documento são bem conhecidas e usadas no estado da técnica. Técnicas padrões são utilizadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e distribuição e tratamento dos pacientes.

As definições a seguir são úteis para a compreensão da presente invenção:

O termo “anticorpo” (Ab), tal como utilizado aqui inclui anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multispecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos, contanto que apresentem a desejada atividade biológica. O termo imunoglobulina (Ig) é usado aqui de forma intercambiável com anticorpos.

Um “anticorpo isolado” é aquele que foi separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que possam interferir com os usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos protéicas ou não-protéicas. Em modalidades preferidas, o anticorpo é purificado: (1) superior a 95% em peso do anticorpo como determinado pelo método de Lowry, e mais preferivelmente mais de 99%, em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência Nterminal ou aminoácido interno pelo uso de um sequenador de copo giratóro, ou (3) até homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando azul Coomassie ou, preferivelmente, manchamento em prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes desde que pelo menos um componente do anbiente natural do anticorpo não esteja presente. Usualmente, todavia, o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.

A unidade básica anticorpo de quatro cadeias é uma glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Um anticorpo IgM é composto por 5 das unidades heterotetrâmeros base, juntamente com uma cadeia adicional de polipeptídeo chamada J, e, portanto, contém 10 sítios de ligação antigênica, embora os anticorpos IgA secretados podem polimerizar para formar montagens polivalentes compreendendo de 2 a 5 das unidades básicas de 4 cadeias com a cadeia J. No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeias é geralmente de cerca de 150.000 daltons. Cada cadeia L é ligada a uma cadeia H por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H estão ligadas umas às outras por duas ou mais ligações dissulfeto dependendo do isotipo da cadeia H. Cada cadeia H e L também tem regularmente espaçados pontes dissulfeto intracadeia. Cada cadeia H tem no N-terminal, um domínio variável (V_H), seguido por três domínios constantes (C_H) para cada uma das cadeias α e γ e quatro domínios C_H para isotipos μ e ε . Cada cadeia L tem no N-terminal, um domínio variável (V_L), seguido por um domínio constante (C_L) em sua outra extremidade. O V_L está alinhado com o V_H e o C_L está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (C_H1)- Resíduos aminoácidos específicos são acreditados formar uma interface entre a cadeia de domínios variáveis da cadeia leve e cadeia pesada. O emparelhamento de V_H e V_L juntos formam um único sítio de ligação ao antígeno. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, ver, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71, and Chapter 6.

A cadeia L proveniente de quaisquer espécies de vertebrados pode ser consignada a um dos tipos claramente distintos, chamados Kappa (K) e lambda (λ), baseados em sequências de aminoácidos de seus domínios constante (C_L). Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas (C_H), as imunoglobulinas podem ser consignadas a diferentes classes ou isotipos. Há cinco classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, com cadeias pesadas designadas alfa (o), delta (δ), epsilon (ε), gama (γ) e mu (μ), respectivamente. As classes γ e α são divididas em subclasses, com base em diferenças relativamente pequenas da sequência C_H e função, por exemplo, os seres humanos expressam as seguintes subclasses: lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1, e lgA2.

O termo “variável” se refere ao fato de que determinados segmentos dos domínios V diferem amplamente em seqüência em meio aos anticorpos. O domínio V medeia a ligação antígeno e defina a especificidade de um anticorpo específico quanto ao seu antígeno específico. No entanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída em toda a extensão dos 110 aminoácidos dos domínios variáveis. Em vez disso, as regiões V consistem em trechos relativamente invariáveis chamados regiões de quadro (FRS) de 15 aminoácidos separados por regiões de menor variabilidade extrema chamado de regiões hipervariáveis, que são cada uma de 9-12 aminoácidos de comprimento. Os domínios das cadeias variáveis leves e pesadas naturais compreendem quatro FRs, que adotam em grande parte uma configuração laminar-β, ligada por três regiões hipervariáveis, que formam laços de ligação e, em alguns casos que fazem parte da estrutura laminar-β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade com o FRS e, com as regiões hipervariáveis da cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação antigênico de anticorpos (ver Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo de um antígeno, mas apresentam diferentes funções efetoras, tais como a participação dos anticorpos na citotoxicidade celular anticorpo dependente (ADCC).

O termo “região hipervariável”, quando utilizado aqui se refere aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação do antígeno. A região hipervariável geralmente compreende os resíduos de aminoácidos provenientes de uma “região determinante de complementaridade” ou “CDR” (por exemplo, nas proximidades dos resíduos 24-34 resíduos (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no V_L, e cerca de cerca de 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) na Vh quando numerados de acordo com o sistema de numeração de Kabat; Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e / ou os resíduos a partir de urn “loop hipervariável” (por exemplo, resíduos de 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no VL, e 26-32 (H1), 52-56 (H2) e 95-101 (H3) na V_H quando numerados de acordo com o sistema de numeração Chothia; Chothia e Lesk, J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987)), e / ou os resíduos de um loop hipervariável7CDR (por exemplo, os resíduos 27-38 (L1), 56-65 (L2) e 105-120 (L3) no VL e 27-38 (H1), 56-65 (H2) e 105-120 (H3) na V_H quando numerados de acordo com o sistema de numeração IMGT; Lefranc, MP et al. NucL Ácidos Res. 27:209- 212 (1999), Ruiz, M. e al. Nucl. Acid Res. 28:219-221 (2000)). Opcíonalmente, o anticorpo tem inserções simétrica em um ou mais dos seguintes pontos 28, 36 (L1), 63, 74-75 (L2) e 123 (L3) na V_L, e 28, 36 (HL), 63, 74-75 (H2) e 123 (H3) na VH quando numeradas de acordo com Aho; Honneger, A. e Plunkthun, AJ Moi. Biol. 309:657-670 (2001)).

Por “resíduo ácido nucléico da linhagem germinativa” é significado o resíduo ácido nucléico que naturalmente ocorre em um gene de linhagem germinativa que codifica uma região constante ou variável. “Gene da linhagem germinativa” é o DNA encontrado em células germinativas (ou seja, uma célula destinada a tornar-se um ovo ou no esperma). Uma “mutação da linhagem germinativa” se refere a uma alteração hereditária em um DNA especial que ocorreu em uma célula germinal ou no zigoto no estágio de célula única, e quando transmitido para a descendência, essa tal mutação fica incorporada em cada célula do corpo. Uma mutação germinativa está em contraste relativamente a uma mutação somática, que é adquirido em uma única célula. Em alguns casos, os nucleotídeos em uma sequência de DNA da linhagem germinativa que codifica uma região variável são alterados (isto é, uma mutação somática) e substituídos com um diferente nucleotídeo.

O termo “anticorpo monoclonal” como usado aqui se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais, incluindo a população são idênticos, exceto para possíveis mutações naturais que possam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos contra determinantes diferentes (resumos), cada um anticorpo monoclonal está direcionado contra um único determinante sobre o antígeno. Além de sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos na medida em que pode ser sintetizado de forma não contaminada por outros anticorpos. O modificador monoclonal não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais úteis na presente invenção podem ser preparados pela metodologia hibridoma primeiramente descrita por Kohler et al. Nature, 256:495 (1975), ou pode ser feita através de métodos de DNA recombinante em células bacterianas, eucarióticas animal ou vegetal (ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 4816567). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos fagos utilizando as técnicas descritas no Clackson et al. Nature, 352:624-628 (1991) e Marks etal. J. Moi. Biol, 222:581-597 (1991), por exemplo.

Os anticorpos monoclonais aqui incluem anticorpos quiméricos em que uma parte da cadeia pesada e / ou de cadeia leve é idêntica ou homóloga às correspondentes sequências em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma classe de anticorpos específicos ou subclasse, enquanto o restante da cadeia (s) é idêntica ou homólogos a sequências correspondentes em anticorpos derivada de uma outra espécie ou pertencente a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, enquanto exibem a atividade biológica desejada (veja Patente U.S. No. 4816567, e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A., 81:6851-6855 (1984)). A presente invenção fornece seqüências antígeno-ligantes de domínio variável derivadas de anticorpos humanos. Assim, os anticorpos quiméricos de interesse primário aqui incluem anticorpos possuindo uma ou mais sequências ligantes a antígeno humano (por exemplo, CDRs) e contendo uma ou mais seqüências derivadas de um anticorpo não-humanos, por exemplo, sequência de região FR ou C. Além disso, anticorpos quiméricos de interesse primário aqui incluem aquelas contendo uma sequência antígeno-ligante humano de domínio variável de uma classe ou subclasse de anticorpo e uma outra sequência, por exemplo, sequência de região FR ou C, derivada de uma outra classe ou subclasse de anticorpo. Anticorpos quiméricos de interesse aqui também incluem aquelas contendo sequências antígeno-ligantes de domínio variável relacionadas àquelas descritas aqui ou derivadas de uma espécie diferentes, tais como a de um primata não-humano (por exemplo, Old World Monkey, Ape, Etc.). Anticorpos quiméricos também incluem anticorpos primatizados e humanizados.

Além disso, anticorpos quiméricos podem conter resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para aperfeiçoar o desempenho de anticorpos. Para mais pormenores, ver Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988) e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992).

Um “anticorpo humanizado” é geralmente considerado como um anticorpo humano que tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Estes resíduos aminoácidos não-humanos são muitas vezes referidos como resíduos de importação, que normalmente são tomados a partir de um domínio variável de importação . Humanização é tradicionalmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al, Nature, 332:323327 (1988); Verhoeyen et al. Ciência , 239:1534-1536 (1988)), substituindo as seqüências de importação região hipervariável para as seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos (Patente U.S. No. 4816567) onde substancialmente menos que um domínio variável intacto humano foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não-humana.

Um “anticorpo humano” é um anticorpo contendo apenas seqüências presentes em um anticorpo produzido naturalmente por um ser humano. No entanto, tal como aqui utilizado, os anticorpos humanos podem conter resíduos ou modificações que não sejam encontradas em um anticorpo natural humano, incluindo as modificações e seqüências variantes aqui descritas. Estas são normalmente feitas para aperfeiçoar ou melhorar o desempenho de anticorpos.

Um “anticorpo intacto” é aquele que dispõe de um local de ligação ao antigeno, bem como uma C_L e pelo menos domínios constantes de cadeia pesada, C_H1, C_H2, e C_H3. Os domínios constantes podem ser domínios constante de sequência natural (por exemplo, domínios constante de sequência natural humana) ou variante da sequência de aminoácido dela proveniente. Preferivelmente, o anticorpo intacto tem uma ou mais funções efetoras.

Um “fragmento anticorpo” compreende uma parte de um anticorpo intacto, de preferência o antigeno ligante ou região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem Fab, Fab, F(ab’)2, e fragmentos Fv; diacorpos; anticorpos lineares (ver Patente U.S. No. 5641870; Zapata et al, Protein Eng. 8 (10) 1057-1062 [

1995]), moléculas de anticorpo de cadeia única, e os anticorpos multispecíficos formados a partir de fragmentos anticorpo.

A expressão fragmento ou análogo funcional” de um anticorpo é um composto com atividade biológica qualitativa em comum com um anticorpo de comprimento completo. Por exemplo, um fragmento ou análogo funcional de um anticorpo anti-lgE é um que pode se ligar a uma imunoglobulina IgE de tal maneira, de modo a prevenir ou reduzir substancialmente a capacidade dessa molécula de ter a capacidade de se ligar ao receptor de alta afinidade, Fc_cRI.

Digestão papaína de anticorpos produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antígeno, denominado fragmentos Fab fragmentos, e um fragmento residual Fc , uma designação que reflete a capacidade de cristalizar prontamente. O fragmento Fab consiste de uma cadeia L, juntamente com todo o domínio da região variável da cadeia H (V_H), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (C_H1). Cada fragmento Fab é monovalente com relação ao antígeno de ligação, ou seja, tem um único local de ligação ao antígeno. O tratamento pepsina de um anticorpo produz um único grande fragmento F (ab’)₂ que corresponde aproximadamente a dois fragmentos Fab ligados por dissulfeto possuindo atividade antígeno-ligante divalente.e ainda é capaz de realizar ligações cruzadas ao antígeno. Fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos Fab por possuir poucos resíduos adicionais no terminal carboxi do domínio C_H1 incluindo uma ou mais cisteínas provenientes da região de articulação ao anticorpo. Fab’-SH é a designação aqui para Fab' em que o resíduo de cisteína (s) dos domínios constantes suportam um grupo tiol livre. Fragmentos anticorpos F(ab’)₂ foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem articulações cisteínas entre eles. Outros acoplamentos químicos dos fragmentos anticorpos são também conhecidos.

A expressão fragmento “Fc” compreende as porções carboxi-terminal de ambas as cadeias H mantidas juntas por dissulfetos. As funções efetoras dos anticorpos são determinadas por seqüências da região Fc, a região é também a parte reconhecida por receptores Fc (FcR), encontrado em certos tipos de células.

“Fv” é o fragmento anticorpo mínimo que contém um completo reconhecimento do antígeno e do sítio de ligação. Este fragmento consiste de um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e de cadeia leve em íntima associação não covalente. A partir da multiplicação desses dois domínios emanam seis “loops” hipervariáveis (três “loops” cada um proveniente da cadeia H e L) que contribuem com os resíduos aminoácidos para a ligação antígeno e conferem especificidade de ligação antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv com apenas três CDRs específico para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, embora em menor afinidade do que todo o sítio ligante.

“Fv de cadeia única”, também abreviado como sFV ou scFv são fragmentos de anticorpos que compreendem os domínios V_H e V_L de anticorpo ligado a uma cadeia polipeptídica única. Preferencialmente, o polipeptídeo sFV compreende ainda um articulação polipeptídeo entre os domínios V_H e V_L que permite que o sFV formar a estrutura desejada para a ligação ao antígeno. Para uma revisão da sFV, consulte Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e eds Moore., SpringerVerlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.

O termo “diacorpos” se refere a pequenos fragmentos de anticorpos preparados mediante construir fragmentos sFV (ver parágrafo anterior), com articuladores curtos (cerca de 50 a 10 resíduos) entre os domínios V_H e V_L tal que o emparelhamentoa inter-cadeia mas não intra-cadeia do domínio V seja conseguido, resultando em um fragmento bivalente, isto é, fragmento possuindo dois sítios antígeno-ligantes. Diacorpos biespecíficos são heterodímeros de dois fragmentos sFV “cruzados” em que os domínios V_H e V_L dos dois anticorpos estão presentes em cadeias polipeptídicas diferentes. Diacorpos são descritos mais detalhadamente, por exemplo, em EP 404097; WO 93/11161 e Hollinger et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A., 90:6444-6448 (1993).

Como aqui utilizado, um anticorpo que internaliza” é um que é capturado (isto é, adentra) pela célula quando da ligação a um antígeno ou uma célula de mamífero (por exemplo, um polipeptídeo de superfície celular ou receptor). O anticorpo que internaliza irá naturalmente incluir fragmentos anticorpos, anticorpos humanos ou quiméricos, e conjugados anticorpo. Para certas aplicações terapêuticas, a internaiização in vivo é contemplada. O número de moléculas de anticorpos internalizado será suficiente ou adequado para matar uma célula ou inibir o seu crescimento, especialmente uma célula infectada. Dependendo da potência do anticorpo ou conjugado anticorpo, em alguns casos, a captura de uma única molécula de anticorpo na célula é suficiente para matar a célula-alvo ao qual se liga a anticorpos. Por exemplo, certas toxinas são altamente potentes na capacidade de aniquilação tal que a internalização de uma molécula da toxina conjugada ao anticorpo é suficiente para matar a célula infectada.

Tal como aqui utilizado, um anticorpo é dito ser immunospecírico” , “específico para” ou “especificamente se ligar” a um antígeno se ele reage a um nível detectável com o antígeno, de preferência com uma afinidade constante, Ka, maior ou igual a cerca de 10⁴M‘¹ , ou maior ou igual a cerca de 10⁵M'¹, maior ou igual a cerca de 10⁶M'¹, maior ou igual a cerca de 10⁷M'¹, maior ou igual a cerca de 10⁸M'¹. A afinidade de um anticorpo para seu antígeno cognato é também comumente expressa como uma constante de dissociação K_D e, em certas modalidades, o anticorpo huM2e se liga especificamente a M2e se ele se ligar com uma K_D menor ou igual a 10'⁴ M, menor ou igual a 10'⁵ M, menor ou igual a 10’⁶ M, menor ou igual a 10'⁷ M, menor ou igual a 10’⁸ M. As afinidades dos anticorpos podem ser facilmente determinadas usando técnicas convencionais, por exemplo, aquelas descritas por Scatchard et al. (Ann. N. Y. Acad. Sei. E.U.A. 51: 660 (1949)).

As propriedades ligantes de um anticorpo a antígenos, suas células ou tecidos pode ser geralmente determinadas e avaliadas utilizando métodos de imunodetecção, incluindo, por exemplo, ensaios de base imunofluorescência , tais como imuno-histoquímico (IHQ) e / ou separação de células ativadas por fluorescência (FACS).

Um anticorpo possuindo uma “característica biológica de um anticorpo designado é aquele que possui uma ou mais das características biológicas daquele anticorpo que o diferencia dos outros anticorpos. Por exemplo, em certas modalidades, um anticorpo com uma característica biológica de um anticorpo designado irá se ligar ao mesmo epítopo como aquele ligado pelo anticorpo designado e/ou possui uma função efetora comum como a do anticorpo designado.

O termo anticorpo “antagonista” é usado no sentido mais amplo, e inclui um anticorpo que parcialmente ou totalmente bloqueia, inibe ou neutraliza a atividade biológica de um epítopo, polipeptídeo ou célula ao qual ele se liga especificamente. Métodos para identificar anticorpos antagonistas podem incluir contatar um polipeptídeo ou célula especificamente ligada por um anticorpo antagonista candidato com o anticorpo antagonista candidato e medir uma alteração detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associada com o polipeptídeo ou célula.

Um anticorpo que inibe o crescimento de células infectadas ou um “inibidor de crescimento” é um anticorpo que se liga e resulta em mensurável inibição do crescimento de células infectadas expressando ou capazes de expressar um epítopo M2e ligado por um anticorpo. Anticorpos inibidores do crescimento preferidos inibem o crescimento de células infectadas em mais de 20%, de preferência de cerca de 20% a cerca de 50%, e ainda mais preferivelmente, por mais de 50% (por exemplo, de cerca de 50% a cerca de 100%) em relação ao controle adequado, o controle sendo tipicamente células infectadas não tratadas com o anticorpo a ser testado. A inibição do crescimento pode ser medida em uma concentração de anticorpos de cerca de 0,1 a 30 pg/mL ou cerca de 0,5 nm e 200 nm em cultura de células, onde a inibição do crescimento é determinada de 1 a 10 dias após a exposição das células infectadas com o anticorpo. A inibição do crescimento de células infectadas in vivo pode ser determinada de várias formas conhecidas no estado da técnica. O anticorpo é inibidor do crescimento in vivo se a administração do anticorpo em cerca de 1 pg/kg a cerca de 100 mg / kg de peso corporal resulta em redução da porcentagem de células infectadas ou do número total de células infectadas em cerca de 5 dias a 3 meses a partir da primeira administração do anticorpo, de preferência dentro de cerca de 5 a 30 dias.

Um anticorpo que induz apoptose é aquele que induz a morte celular programada, conforme determinado pela ligação de anexina V, fragmentação de DNA, retração das células, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular e/ou formação de vesículas de membrana (chamado de corpos apoptóticos). Preferencialmente, a célula é uma célula infectada. Vários métodos estão disponíveis para avaliar os eventos celulares associados a apoptose. Por exemplo, a translocação da fosfatidilserina (PS) pode ser medida através da ligação anexina; fragmentação do DNA pode ser avaliada através do escalonamento DNA; e a condensação nuclear/cromatina juntamente com a fragmentação do DNA pode ser avaliada por um aumento nas células hipodiplóide. Preferencialmente, o anticorpo que induz a apoptose é aquele que resulta em cerca de 2 a 50 vezes, de preferência cerca de 5 a 50 vezes, e mais preferivelmente cerca de 10 a 50 vezes, a indução da ligação anexina relativamente à célula não tratada em um ensaio ligante anexina.

Anticorpo com “funções efetoras” se referem àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência natural ou região Fc variante de sequência de aminoácido) de um anticorpo, e varia de acordo com o isotipo de anticorpos. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação C1q e citotoxicidade complemento dependente; ig receptor Fc; citotoxina célula-mediada anticorpo-dependente (ADCC); fagocitose; sub-regulação dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B) e ativação de células B.

“Citotoxicidade célula-mediada anticorpo-dependente” ou “ADCC” se refere a uma forma de citotoxicidade em que a Ig secretada se liga aos receptores Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, Natural Killer (NK), neutrófilos, e macrófagos) permite a essas células efetoras citotóxicas a se ligarem especificamente a uma célula-alvo portadora de antígeno e, em seguida, mata a célula-alvo com citotoxinas. Os anticorpos armam as células citotóxicas e são necessários para tal aniquilação. As células primárias para mediar ADCC, células NK, manifestar apenas FcyRIII , enquanto que os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoéticas é resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Immunol Rev. 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio in vitro ADCC, tal como o descrito na Patente U.S. No. 5500362 ou Patente U.S. No. 5821337 pode ser realizado. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como a divulgada no Clynes et al, PNAS (E.U.A.) 95:652-656 (1998).

“Receptor Fc” ou “FcR” descreve um receptor que se liga à região Fc de anticorpos. Em certas modalidades, o FcR é uma seqüência natural FcR humana. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gamma) e inclui os receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII , incluindo as variantes alélicas e alternativamente formas unidas desses receptores. Receptores FCyRII incluem FcyRIIA (um receptor de ativação”) e FcyRIIB (um “receptor de inibição”), que têm similar seqüências de aminoácidos que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação de base tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático, (ver pesquisa em M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs são pesquisados em Ravetch e Kinet, Annu. Immunol Rev. 9:457-92 (1991), Capel et al, Immunomethods 4:25-34 (1994) e de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs , incluindo aqueles que devem ser identificados no futuro, são abrangidos aqui pelo termo “FcR”. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs materno para o feto (Guyer et al, J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al, J. Immunol. 24:249 ( 1994)).

“Células efetoras humanas” são os leucócitos que expressam uma ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRII! e executam função efetora ADCC . Exemplos de leucócitos humanos que mediar ADCC incluem PBMC, as células NK, monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos, com as células NK e PBMCs de preferência. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte natural, por exemplo, a partir do sangue.

“Citotoxicidade complemento dependente” ou “CDC” se refere a lise da célula-alvo, na presença de complemento. A ativação da rota clássica do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema complemento (C1q) aos anticorpos (da subclasse apropriada) que são ligados ao seu antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio do CDC, por exemplo, conforme descrito no Gazzano, Santoro et al, J. Immunol. Métodos 202:163 (1996), pode ser realizado.

Os termos “influenza A” e “vírus influenza A” se referem a um gênero da família de vírus Orthomyxoviridae. O vírus influenza A inclui apenas uma espécie: vírus influenza A, que causa a influenza em aves, seres humanos, porcos e cavalos. Cepas de todos os subtipos do vírus influenza A foram isolados em aves selvagens, embora a doença seja incomum. Alguns isolados de doença do vírus influenza A causam graves doenças, tanto em aves domésticas e, raramente, em humanos.

Um “mamífero”, para fins de tratamento de uma infecção, se refere a qualquer mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de criação, e animais de zôo, de esportes, ou animais de estimação, tais como cães, gatos, bovinos, equinos, ovinos, suínos, caprinos, coelhos, etc. Preferivelmente, o mamífero é humano.

“tratar” ou “tratamento” ou “alívio” se refere a ambos tratamento terapêutico e profilático ou medidas preventivas, onde o objeto é o de impedir ou frear (diminuir) as condições patológicas ou o distúrbio objetivado. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles já com a doença, bem como aqueles propensos a terem a doença, ou aqueles em quem a doença deve ser prevenida. Um indivíduo ou um mamífero é “tratado” de forma bem sucedida se, depois de receber uma quantidade terapêutica de um anticorpo de acordo com os métodos da presente invenção, o paciente apresenta observáveis e / ou redução mensurável ou ausência de um ou mais dos seguintes: redução do número de células infectadas ou ausência das células infectadas, a redução no percentual do total de células que estão infectadas e / ou alívio de certa forma, um ou mais dos sintomas associados à infecção específica, redução da morbidade e mortalidade e melhoria dos quesitos relativos à qualidade de vida. Os parâmetros acima para avaliar o sucesso do tratamento e melhoria da doença são facilmente mensuráveis por procedimentos de rotina familiares a um médico.

O termo quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a uma quantidade de um anticorpo ou um medicamento eficaz para tratar uma doença ou distúrbio em um indivíduo ou um mamífero. Consulte a definição anterior de tratar.

A administração “crônica” se refere a administração do agente (s) em um modo contínuo, ao contrário de um modo agudo, de modo a manter o efeito terapêutico inicial (atividade) por um período prolongado de tempo. Administração “intermitente” é o tratamento que não é feito de forma consecutiva sem interrupção, mas é de natureza cíclica.

A administração “em combinação com” de um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui a administração (concorrente) e administração consecutiva em qualquer ordem.

“veículos”, tal como usado aqui incluem veículos, excipientes, ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis que não são tóxicoas para a célula ou mamífero a ser exposto na dosagem e concentrações utilizadas. Muitas vezes, o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa de tampão de pH. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões, tal como o fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, hidratos de carbono como polivinilpirrolidona; aminoácidos como a glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros incluindo a glicose, manose, ou dextrina; quelantes como EDTA, álcoois de açúcar, tal como o manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal tais como o sódio, e/ou tensoativos nãoiônicos, tais como o polietileno glicol TWEEN ™ (PEG), e PLURONICS ™.

O termo agente citotóxico como aqui utilizado refere-se a uma substância que inibe ou impede que a função das células e / ou provoca a destruição das células. O termo visa incluir isótopos radioativos (por exemplo, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos, por exemplo, o metotrexato, adriamicin, alcalóides de vinca (vincristina, vinblastina, etoposide), doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucil, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes, enzimas e fragmentos das mesmas, tais como enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas, tais como toxinas molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativa de bactérias, plantas, fungos ou de origem animal, incluindo fragmentos e/ou suas variantes, e antitumorais ou vários agentes anticancerígenos divulgados abaixo. Outros agentes citotóxicos são descritos abaixo.

Um “agente inibidor do crescimento” quando usado aqui se refere a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, seja in vitro ou in vivo. Exemplos de agentes inibidores de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular, tais como os agentes que induzem o aprisionamento G1 e aprisionamento da faseM. Clássicos bloqueadores da fase-M incluem os alcalóides de vinca (vincristína, vimblastina e vinorelbina), taxanos e inibidores da topoisomerase II, tal como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposide e bleomicina. Aqueles agentes que aprisionam G1 também se difundem sobre o aprisionamento da fase-S, por exemplo, agentes de alquilação do DNA tais como o tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5fluorouracil e ara-C. Mais informações podem ser encontradas em a base molecular do câncer, Mendelsohn e Israel, eds. capítulo 1, intitulado “Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs” por Murakami et al. (W B Saunders: Philadelphia, 1995), especíalmente p. 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são as drogas anticâncer ambos derivados da árvore de teixo. Docetaxel (Taxotere ™, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semi-sintético da paclitaxel (Taxol ®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel e docetaxel promovem a montagem dos microtúbulos a partir dos dímeros de tubulina e estabilizam os microtúbulos prevenindo a despolimerização, o que resulta na inibição da mitose nas células.

“Rótulo” como usado aqui se refere a composto ou composição detectável que é conjugado diretamente ou indiretamente ao anticorpo de modo a gerar um anticorpo “marcado”, o anticorpo de modo a gerar um anticorpo marcado. O rótulo pode ser detectável por si só (por exemplo, rótulos por radioisótopos ou rótulos fluorescentes), ou no caso de uma marcação enzimática, pode catalisar alteração química de um composto ou composição de substrato que seja detectável.

O termo “epítopo marcado” como aqui utilizado refere-se a um polipeptídeo quimérico compreendendo um polipeptídeo fundido a um “polipeptídeo marcado”. O polipeptídeo marcado tem resíduos suficientes para fornecer um epítopo contra um anticorpo que pode ser feito, e ainda é pequeno o suficiente de modo que não interfira com a atividade do polipeptídeo em que está fundido. O polipeptídeo etiqueta também é bastante singular, de preferência de modo que o anticorpo não reaja substancialmente com reações cruzadas com outros epítopos. Polipeptídeos etiqueta adequados possuem geralmente pelo menos seis resíduos de aminoácidos e, geralmente, entre cerca de 8 a 50 resíduos de aminoácidos (de preferência, entre 10 e 20 resíduos de aminoácidos).

Uma “molécula pequena” é definida aqui ter um peso molecular inferior a cerca de 500 Daltons.

Os termos “ácidos nucléicos” e “polinucleotídeo” são utilizados alternadamente aqui para se referir a um RNA, DNA de fita única ou de fita dupla, ou polímeros mistos. Os polinucleotídeos podem incluir seqüências genômicas, extra-genômicas e sequências plasmídeos, e segmentos produzidos por engenharia genética que expressam, ou que possam ser adaptados para expressar polipeptídeos.

Um “ácido nucléico isolado” é um ácido nucléico que está substancialmente separado das outras sequências DNA genômicas bem como de proteínas ou complexos tais como ribossomos e polimerases, que, naturalmente, acompanham uma seqüência natural. O termo abrange uma seqüência de ácido nucléico que foi removido de seu ambiente natural, e inclui isolados DNA recombinantes ou clonaos e análogos quimicamente sintetizados ou análogos biologicamente sintetizados em sistemas heterólogos. Um ácido nucléico substancialmente puro inclui formas isoladas do ácido nucléico. Naturalmente, isto se refere ao ácido nucléico, tal como originalmente isolado e não exclui genes ou seqüências posteriormente adicionadas ao ácido nucléico isolado por meio da mão do homem.

O termo “polipeptídeo” é usado no seu significado convencional, ou seja, tal como uma seqüência de aminoácidos. Os polipeptídeos não estão limitados a um período específico do produto. Peptídeos oligopeptídeos e proteínas estão incluídas na definição de polipeptídeo, e esses termos podem ser usados de forma intercambiável neste salvo indicação em contrário. Este termo também não se refere a excluir modificações pósexpressao do polipeptídeo, por exemplo, glicosilações, acetilações, fosforilações e similares, bem como outras modificações conhecidas no estado da técnica, tanto natural e não natural. Um polipeptídeo pode ser uma proteína completa, ou uma sua sub-sequência. Polipeptídeos particulares de interesse no contexto da presente invenção são sub-sequências de aminoácidos compreendendo CDRs e sendo capazes de se ligar a um antígeno ou a uma célula infectada por influenza A.

Um “polipeptídeo isolado” é aquele que tenha sido identificada e separada e/ou recuperada a partir de um componente do seu ambiente natural. Em modalidades preferidas, o polipeptídeo isolado será purificado (1) superior a 95% em peso do anticorpo como determinado pelo método de Lowry, e mais preferivelmente mais de 99%, em peso, (2) a um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência N-terminal ou aminoácido interno pelo uso de um sequenador de copo giratóro, ou (3) até homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando azul Coomassie ou, preferivelmente, manchamento em prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes desde que pelo menos um componente do anbiente natural do anticorpo não esteja presente. Usualmente, todavia, o anticorpo isolado será preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.

Um polinucleotídeo de “sequência natual” é aquele que tem a mesma seqüência de nucleotídeos como um polinucleotídeo derivado da natureza. Um polipeptídeo de “sequência natural” é aquele que tem a mesma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo (por exemplo, anticorpos), derivados da natureza (por exemplo, de qualquer espécie). Essa seqüência de polinucleotídeos e polipeptídeos nativo pode ser isolado da natureza ou pode ser produzido por meio recombinante ou sintético.

Uma “variante” polinucleotídeo, tal como o termo usado aqui, é um polinucleotídeo que normalmente difere de um polinucleotídeo especificamente aqui divulgado em uma ou mais substituições, supressões, acréscimos e/ou inserções. Tais variações podem ser naturalmente ocorrentes ou podem ser geradas sinteticamente, por exemplo, pela modificação de uma ou mais sequências polinucleotídeos da invenção e avaliando uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo codificado como aqui descrito e/ou utilizando qualquer de um número de técnicas bem conhecidas no estado da técnica.

Um “variante” polipeptídeo, tal como o termo é usado aqui, é um polipeptídeo que geralmente difere de um polipeptídeo especificamente aqui divulgado em uma ou mais substituições, supressões, acréscimos e/ou inserções. Tais variações podem ser naturais ou geradas sinteticamente, por exemplo, pela modificação de uma ou mais das sequências de polipeptídeo da invenção e avaliando uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo como descrito aqui e/ou utilizando qualquer um de uma série de técnicas bem conhecidas no estado da técnica.

Modificações podem ser feitas na estrutura dos polinucleotídeos e polipeptídeos da presente invenção e ainda obter uma molécula funcional que codifica um polipeptídeo variante ou um derivado com características desejáveis. Quando se deseja alterar a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo para criar um equivalente, ou mesmo uma melhorada, variante ou parte de um polipeptídeo da invenção, aquele usualmente versado na técnica irá tipicamente alterar um ou mais dos códons da sequência codificadora do DNA.

Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura de proteína, sem perda significativa de sua capacidade de se ligar a outros polipeptídeos (por exemplo, os antígenos) ou células. Uma vez que é a capacidade de ligação e a natureza de uma proteína que definem essa atividade funcional biológica da proteína, algumas substituições de seqüência de aminoácidos pode ser feita em uma seqüência de proteína, e, naturalmente, na sua seqüência que codifica o DNA subjacente, e não obstante obter uma proteína com propriedades semelhantes. É desse modo contemplado que diversas alterações podem sr feitas nas sequências peptídeo das composições reveladas, ou correspondentes sequências DNA que codificam os referidos peptídeos sem apreciável perda de suas utilidades ou atividades biológicas.

Em muitos casos, uma variante polipeptídeo irá conter uma ou mais substituições conservadoras. Uma “substituição conservative” é aquela em que um aminoácido é substituído por outro aminoácido com propriedades semelhantes, tal que aqueles usualmente versado na técnica da química peptídeo pode esperar a estrutura secundária e a natureza hidropática do polipeptídeo estar inalterada.

Ao fazer essas alterações, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerada. A importância do índice hidropático do ácido amino em conferir função biológica interativa em uma proteína é geralmente entendido no estado da técnica (Kyte e Doolittle, 1982). Admite-se que o relativo caráter hidropático do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, que por sua vez, defina a interação da proteína com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, receptores, DNA, anticorpos, antígenos, e assim por diante. Cada aminoácido está consignado a um índice hidropático, com base em suas características de hidrofobicidade e carga (Kyte e Doolittle, 1982). Estes valores são os seguintes: isoleucina (4,5), valina (4,2), leucina (3,8), fenilalanina (2,8); cisteína / cistina (2,5), metionina (1,9); alanina (1,8), glicina (-0,4); treonina (-0,7), serina (0,8), triptofano (-0,9), tirosina (-1,3), prolina (-1,6), histidina (-3,2), glutamato (-3,5), glutamina (-3,5), aspartato (-3,5); asparagina (-3,5), lisina (-3,9) e arginina (-4,5).

É sabido no estado da técnica que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos com um semelhante índice hidropático ou pontuação e ainda resultar em uma proteína com atividade biológica semelhante, ou seja, ainda obter uma proteína biológica funcionalmente equivalente. Ao fazer tais mudanças, a substituição de aminoácidos, cujos índices hidropático estão dentro de ± 2 é o preferido, os ± 1 são particularmente preferido, e aqueles dentro de ± 0,5 são ainda mais particularmente preferido. Entende-se igualmente no estado da técnica que, tal como a substituição de aminoácidos pode ser feita de forma eficaz com base na hidrofilicidade. A Patente U.S. No. 4.554.101 estabelece que a maior hidrofilicidade local média de uma proteína, que são regidas pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com uma propriedade biológica da proteína.

Conforme detalhado na Patente US. No. 4554101, os valores de hidrofilicidade apresentados a seguir foram consignados a resíduos aminoácidos: arginina (3,0), lisina (3,0), aspartato (3,0 ± 1), glutamato (3,0 ± 1); serina (0,3); asparagina (0,2), glutamina (0,2), glicina (0), treonina (-0,4), prolina (-0,5 ±1), alanina aminotransferase (-0,5), histidina (-0,5); cisteína (-1,0), metionina (-1,3), valina (-1,5), leucina (-1,8), isoleucina (-1,8), tirosina (-2,3), fenilalanina (-2,5), triptofano (-3,4). Entende-se que um aminoácido pode ser substituído por outro com um valor similar de hidrofilicidade e ainda obter uma proteína biologicamente equivalente e, em particular, uma proteína imunologicamente equivalente. Em tais alterações, a substituição de aminoácidos cujos valores são hidrofilicidade ± 2 é o preferido, os ± 1 são particularmente preferido, e aqueles dentro de ± 0,5 são ainda mais particularmente preferidos.

Como descrito acima, substituições de aminoácidos são, portanto, geralmente baseados na relativa similaridade dos substituintes aminoácidos de cadeia lateral, por exemplo, sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho, etc. Substituições representativas que levam em consideração diversas das características mencionadas são bem conhecidos por aqueles usualmente versados na técnica e incluem: arginina e lisina, glutamato e aspartato, serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina.

As substituições de aminoácidos pode ainda ser feita com base na similaridade com a polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e / ou a natureza anfipática dos resíduos. Por exemplo, carregada negativamente aminoácidos incluem o ácido aspártico e ácido glutâmico; positivamente carregada incluem ácidos aminoácidos lisina e arginina, aminoácidos e com grupos de cabeça polar sem carga com valores semelhantes hidrofilicidade incluir leucina, isoleucina e valina, glicina e alanina, asparagina e glutamina; e serina, treonina, fenilalanina e tirosina. Outros grupos de aminoácidos, que podem representar mudanças conservadoras incluem: (1), ala, Pro, Gly, Glu, asp, gin, ASN, Ser, Thr, (2) Cys, Ser, Tyr, thr, e (3) vai, ile , leu, met, ala, phe (4); lys, arg, his e (5) Phe, Tyr, Trp, dele. Uma variante pode também, ou alternativamente, conter alterações não conservadoras. Em uma modalidade preferida, polipeptídeos variante diferente de uma seqüência natural por substituição, supressão ou acréscimo de cinco aminoácidos ou menos. As variantes podem também (ou alternativamente) ser modificada, por exemplo, a supressão ou adição de aminoácidos que têm pouca influência sobre a imunogenicidade, estrutura secundária e natureza hidropática do polipeptídeo.

Os polipeptídeos podem incluir uma sequência sinalizadora (ou líder) na extremidade N-terminal da proteína, que direciona co-traducionalmente ou póstraducionalmente a transferência da proteína. O polipeptídeo pode também ser conjugado com um articulador ou outra seqüência, para facilitar a síntese, purificação e identificação do polipeptídeo (por exemplo, poli-His), ou para melhorar a ligação do polipeptídeo para um suporte sólido. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser conjugado a uma região Fc da imunoglobulina.

Quando comparando sequências de polinucleotídeo e polipeptídeo, as duas sequências são ditas serem “idênticas” se a sequência de nucleotídeos ou de aminoácidos nas duas sequências é a mesma quando alinhadas para uma correspondência máxima, tal como descrito adiante. As comparações entre as duas seqüências são normalmente realizadas por comparação das seqüências sobre uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade da sequência. Uma “janela de comparação” como utilizado aqui, refere-se a um segmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguas, geralmente de 30 a 75, 40 a 50, em que uma sequência pode ser comparada a uma seqüência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas seqüências serem plenamente alinhadas.

O alinhamento ótimo da sequências para comparação pode ser realizada utilizando o programa Megalign Lasergene na suíte de software de bioinformática (DNASTAR, Inc., Madison, Wl), utilizando parâmetros predefinidos. Este programa engloba vários regimes de alinhamento descrito nas seguintes referências: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726730.

Por outro lado, o alinhamento das seqüências ideal para a comparação pode ser realizada através do algoritmo de identidade local de Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, by the identity alignment algorithm of Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, by the search for similarity methods of Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, através de implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wl), ou por inspeção.

Um exemplo preferido de algoritmos que são adequados para determinar o percentual de identidade de sequência e similaridade da se são os algoritmos BLAST e BLAST 2,0 , que são descritos no Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 podem ser usados, por exemplo, com os parâmetros descritos neste documento, para determinar a identidade de seqüência por cento para os polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção. Software para realização de análises BLAST está disponível ao público através do

National Center for Biotechnology Information.

Em um exemplo ilustrativo, as pontuações cumulativas podem ser calculadas utilizando, para sequências nucleotídeos, os parâmetros M (índice de recompensa por um par de correspondência de resíduos; sempre> 0) e N (pontuação pena de descasamento de resíduos; sempre <0). Extensão da palavra hits em cada direção são interrompidas quando: a pontuação cumulativa alinhamento cai pela quantidade X a partir de seu valor máximo alcançado, a pontuação acumulada vai para zero ou menos, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo com pontuação negativa, ou o fim de uma seqüência seja alcançado. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências de nucleotídeos) usa como padrão um wordlength (W), de 11, e a expectativa (E) de 10, e o BLOSUM62 Matriz de pontuação (ver Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. LSg E.U.A. 89: 10915) alinhamentos, (B) de 50, a expectativa (E) de 10, M = 5, N =- 4 e uma comparação entre as duas vertentes.

Para as seqüências de aminoácidos, uma matriz de pontuação pode ser usado para calcular a pontuação cumulativa. Extensão da palavra hits em cada direção são interrompidas quando: a pontuação cumulativa alinhamento cai pela quantidade X de seu valor máximo alcançado, a pontuação acumulada vai para zero ou menos, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos resíduo negativo de pontuação , ou o fim de uma seqüência seja alcançado. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinar a sensibilidade e a velocidade do alinhamento.

Em uma abordagem, a “porcentagem de identidade de sequência” é determinado pela comparação de duas seqüências alinhadas de forma ótima durante uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, onde a parte da sequência de polinucleotídeo ou de polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou apagamentos (isto é, lacunas) de 20 por cento ou menos, geralmente 5 a 15 por cento, ou 10 a 12 por cento, em comparação com as seqüências de referência (que não incluem acréscimos ou supressões) para o alinhamento ideal das duas sequências. O percentual é calculado através da determinação do número de posições em que as bases ácidos nucléicos ou de resíduos aminoácidos idênticos ocorrem em ambas as sequências para produzir o número de posições compatibilizadas, dividindo o número das posições compatibilizadas pelo número total das posições na sequência de referência (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando os resultados por 100 para produzir a porcentagem de identidade da sequência.

“Homologia se refere à percentagem de resíduos na variante da sequência do polinucleotídeo e polipeptídeo que são idênticos aos da seqüência não-variante após o alinhamento das seqüências e da introdução de lacunas, se necessário, para atingir o máximo percentual de homologia. Em modalidades particulares, variantes polinucleotídeos ou polipeptídeos possuem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos, 95%, pelo menos, 98%, ou, pelo menos, 99% de homologia de polinucleotídeo ou polipeptídeo com um polinucleotídeo ou polipeptídeo descrito aqui.

“Vetor” inclui vetores de transporte e de expressão. Normalmente, a construção do plasmídeo irá também incluir uma origem de replicação (por exemplo, a origem ColE1 de replicação) e um marcador de seleção (por exemplo, ampicilina ou tetraciclina resistência), para a replicação e seleção, respectivamente, do plasmídeo em bactérias. Um “vetor de expressão” se refere a um vetor que contém as seqüências de controle ou de elementos regulatórios necessários para a expressão dos anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpos da invenção, em células bacterianas ou eucarióticas. Vetores adequados são divulgados a seguir.

Conforme utilizado no presente relatório e as reivindicações anexo, as formas singular a, um e “o” incluem as referências no plural a menos que o conteúdo claramente indique de outra maneira.

A presente invenção inclui anticorpos HuM2e compreendendo um polipeptídeo da presente invenção, incluindo os polipeptídeos codificados por uma seqüência de polinucleotídeo estabelecidos no Exemplo 1 e seqüências de aminoácidos definidas no Exemplo 1 e 2, e fragmentos e variantes do mesmo. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo aqui designado como 8i10, 21B15, ou 23K12. Esses anticorpos se ligam preferencialmente, ou se ligam especificamente a influenza A de células infectadas em relação às células controle não infectadas do mesmo tipo de célula.

Em modalidades particulares, os anticorpos da presente invenção se ligam à proteína M2. Em certas modalidades, a presente invenção fornece anticorpos HuM2 que se ligam a epítopos dentro de M2e que estão apenas presentes na conformação natural, ou seja, tal como expresso nas células. Em modalidades particulares, esses anticorpos não se ligam especificamente a um polipeptídeo M2e isolado, por exemplo, os 23 resíduos de aminoácidos do fragmento M2e. Entende-se que estes anticorpos reconhecem epítopos não-lineares (isto é, conformacional) (s) do peptídeo M2.

Estes epítopos conformacionais específicos dentro da proteína M2, em particular no âmbito M2e, podem ser utilizados como vacinas para prevenir o desenvolvimento de infecção de influenza dentro de um indivíduo.

Como será compreendido por aqueles usualmente versados na técnica, a descrição geral de anticorpos e de métodos aqui realizada de preparação e de utilização dos mesmos também se aplicam aos constituintes polipeptídeo do anticorpo individual e de fragmentos anticorpo.

Os anticorpos da invenção podem ser policlonais ou anticorpos monoclonais. No entanto, em modalidades preferidas, são monoclonais. Em modalidades particulares, os anticorpos da presente invenção são anticorpos completamente humanos. Métodos de produção de anticorpos policlonais e monoclonais são conhecidos no estado da técnica e descritos em geral, por exemplo, na Patente US. No. 6824780. Normalmente, os anticorpos da presente invenção são produzidos por recombinanação, utilizando vetores e métodos disponíveis no estado da técnica, tais como os descritos a seguir. Os anticorpos humanos podem também ser gerados in vitro por células B ativadas (ver Patente U.S. No. 5567610 e 5229275).

Os anticorpos humanos podem ser produzidos em animais transgênicos (por exemplo, ratos), que são capazes de produzir um repertório cheio de anticorpos humanos, na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, tem sido descrito que a deleção homozigótica dos anticorpos de cadeia pesada que se juntam à região (J_H) do gene em linhagem quimérica e germinativa mutante de ratos resulta na completa inibição da produção de anticorpo endógeno. A transferência do arranjo genético imunoglobulina da linhagem germinativa humana para dentro de tais ratos mutantes de linhagem germinativa resulta na produção de anticorpos humanos quando da provocação pelo antígeno. Veja, por exemplo, Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A., 90:2551 (1993); Nature Jakobovits et al, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al, Year in Immuno., 7:33 (1993); Patente U.S. No. 5545806, 5569825, 5591669 (todos de GenPharm); Patente U.S. No. 5545807, e WO 97/17852. Esses animais podem ser geneticamente modificados para produzir anticorpos humanos que compreendem um polipeptídeo da presente invenção.

Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção são anticorpos quiméricos que compreendem seqüências derivadas de fontes humanos e não humanos. Em modalidades particulares, esses anticorpos quiméricos são humanizados ou primatizados™. Na prática, os anticorpos são anticorpos humanizados tipicamente humanos em que alguns resíduos de região hipervariável e, possivelmente, alguns resíduos FR estão substituídos por resíduos provenientes de sítios análogos em anticorpos de roedores.

No contexto da presente invenção, os anticorpos quiméricos também incluem anticorpos completamente humanos em que a região hipervariável humano ou um ou mais CDRs são mantidos, porém uma ou mais outras regiões da seqüência foram substituídas por seqüências correspondentes de um animal não-humano.

A escolha de seqüências não-humanas, tanto leves e pesadas, para serem usadas na produção de anticorpos quiméricos é importante para reduzir a antigenicidade e respostas de anticorpo humano anti-não-humano quando o anticorpo é destinado ao uso terapêutico no ser humano. Além disso, é importante que os anticorpos quiméricos mantenham afinidade de ligação para com o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir esse objetivo, de acordo com um método preferido, anticorpos quiméricos são preparados por um processo de análise das seqüências parentais e de vários produtos conceituais quiméricos que utilizam modelos tridimensionais das sequências parentais humanas e não humanas. Modelos tridimensionais imunoglobulina são comumente disponíveis e são familiares para aqueles usualmente versados na técnica. Programas de computador estão disponíveis, que ilustram e mostram as prováveis estruturas conformacionais tridimensionais das sequências imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, ou seja, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidato a se ligar ao seu antígeno. Desse modo, os resíduos FR podem ser selecionados e combinados a partir do receptor e importar sequências de modo que as desejadas características do anticorpo, tais como aumentada afinidade quanto ao(s) antígeno-alvo, seja conseguida. No geral, os resíduos da região hipervariável estão diretamente e muito substancialmente envolvidos no contexto de influenciar a ligação antígeno.

Como já foi referido, os anticorpos (ou imunoglobulinas) pode ser dividido em cinco classes diferentes, com base em diferenças nas sequências de aminoácidos na região constante das cadeias pesadas. Todas as imunoglobulinas de uma determinada classe possuem regiões constantes de cadeia pesada muito semelhantes. Essas diferenças podem ser detectadas por estudos de seqüência ou, mais comumente, por meio sorológicos (ou seja, o uso de anticorpos dirigidos a estas diferenças). Os anticorpos, ou fragmentos dos mesmos, da presente invenção pode ser qualquer classe, e pode, portanto, têm uma cadeia pesada gama, mu, alfa, delta, ou épsilon. A cadeia gamma pode ser gama 1, gama 2, gama 3, ou gama 4, e uma cadeia alfa pode ser alfa-1 ou alfa 2.

Em uma modalidade preferida, um anticorpo da presente invenção, ou um seu fragmento , é uma IgG. A IgG é considerada a mais versátil imunoglobulina, porque é capaz de realizar todas as funções de moléculas de imunoglobulinas. A IgG é a única classe de Ig que atravessa a placenta. IgG também fixa complemento, embora a subclasse lgG4 não. Macrófagos, monócitos, PMN e alguns linfócitos têm receptores Fc para a região Fc da IgG. Nem todas as subclasses de ligam igualmente bem; a lgG2 e lgG4 não se ligam a receptores Fc. Uma consequência da ligação aos receptores de Fc em PMN's, monócitos e macrófagos é que a célula pode agora internalizar o antígeno melhor. IgG é um opsoninas que aumenta a fagocitose. A ligação da IgG aos receptores Fc em outros tipos de células resulta na ativação de outras funções. Anticorpos da presente invenção podem ser de qualquer subclasse de IgG.

Em outra modalidade preferida, um anticorpo ou seu fragmento, da presente invenção é uma IgE. A IgE ro é a menos comum Ig no so, uma vez que se liga fortemente aos receptores de Fc em basófilos e mastócitos, mesmo antes de interagir com o antígeno.

Como conseqüência de sua ligação a basófilos e mastócitos, IgE está envolvido nas reações alérgicas. Vinculação do alergênio a IgE em células resulta na liberação de vários mediadores farmacológicos que resultam em sintomas alérgicos. IgE também desempenha um papel em doenças parasitárias intestinais. Os eosinófilos possuem receptores Fc de IgE e de eosinófilos e a ligação de eosinófilos a helmintos revestidos de IgE resulta na aniquilação do parasita. A IgE não fixa complemento.

Em várias modalidades, os anticorpos da presente invenção, e fragmentos dos mesmos, compreendem uma cadeia variável leve que é ou kappa ou lambda. A cadeia lamba pode ser qualquer um dos subtipos, incluindo, por exemplo, lambda 1, lambda 2, lambda 3, e lambda 4.

Como já foi referido, a presente invenção prevê ainda fragmentos de anticorpos que compreende um polipeptídeo da presente invenção. Em determinadas circunstâncias, há vantagens do uso de fragmentos de anticorpos, em vez de anticorpos todo. Por exemplo, o menor tamanho dos fragmentos permite a eliminação rápida, e pode levar a um melhor acesso a determinados tecidos, tais como tumores sólidos. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem: fragmentos Fab, Fab, F(ab’)2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; anticorpos de cadeia única, e os anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

Diversas técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, esses fragmentos foram obtidos através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (veja, por exemplo, Morimoto et al. Jornal de métodos bioquímicos e biofísicos 24:107-117 (1992) e Brennan et al. Science, 229:81 (1985 )). No entanto, esses fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos anticorpos Fab, Fv e ScFv podem ser expressos e secretados a partir de E. coli, permitindo a fácil produção de grandes quantidades desses fragmentos. Fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Carteret al. Bio / Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com uma outra abordagem, fragmentos F(abj₂ pode ser isolado diretamente da cultura da célula hospedeira recombinante. Fragmentos Fab e F(ab’)₂ in vivo com aumentada meia-vida in vivo que compreendem um receptor de resgateque se liga a resíduos epítopos são descritos na Patente U.S. No. 5869046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos será evidente para o profissional qualificado.

Em outras modalidades, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Veja WO 93/16185, Patente U.S. No. 5571894 e 5587458. Fv e sFV são as únicas espécies que combina com sítios intactos que são desprovidos de regiões constantes. Assim, eles são adequados para reduzir a ligação não específica durante a utilização in vivo. sFV proteínas de fusão podem ser construídos para proporcionar a fusão de uma proteína efetora em ambos os aminoácidos ou o término carbóxi de um sfv. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. O fragmento de anticorpo também pode ser um anticorpo linear, por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. No. 5641870, por exemplo. Esses fragmentos de anticorpos lineares podem ser mono ou biespecíficos.

Em certas modalidades, os anticorpos da invenção atual são biespecíficos ou multiespecíficos. Anticorpos anticorpos biespecíficos são anticorpos que têm especificidades obrigatórias pelo menos dois epítopos diferentes. Anticorpos biespecíficos representativos podem se ligar a dois epítopos diferentes de um único antígeno. Outros anticorpos podem combinar um antígeno primeiro sítio de ligação com um local obrigatório para um segundo antígeno. Alternativamente, um braço anti-M2e pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula de desencadeamento de um leucócito, tal como uma molécula do receptor de células T (por exemplo, CD3), ou de receptores Fc para IgG (FcyR), tais como FcyRI ( CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD 16), de modo a concentrar e localizar os mecanismos de defesa celular para a célula infectada. Anticorpos biespecíficos também podem ser usados para posicionar os agentes citotóxicos para as células infectadas. Estes anticorpos possuem um braço M2e ligante e um braço que liga o agente citotóxico (saporin por exemplo, anti-interferon-α, alcalóides da vinca, cadeia de ricina A, metotrexato ou isótopo radioativo hapteno). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos F(ab’)₂ biespecíficos). WO 96/16673 descreve um anticorpo anti-ErbB2/anti-FcYRIII biespecíficos e Patente US. No. 5837234 divulga um anticorpo anti-ErbB2/anti-FcvRI biespecífico. Um anticorpo anti-ErbB2/Fca biespecíficos é mostrado na WO98/02463. Patente US. No. 5821337 ensina um anticorpo anti-ErbB2/anti-CD3 biespecíficos.

Métodos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos no estado da técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na co-expressão de dois pares imunoglobulina de cadeia pesada-cadeia leve, onde as duas cadeias possuem diferentes especificidades (Millstein et al, Nature, 305:537-539 (1983)). Devido à variedade aleatória de imunoglobulina cadeias pesadas e leves, estes hibridomas (quadromas) potencial de produzir uma mistura de moléculas de anticorpos, frequentemente, diferentes, dos quais apenas um possui a estrutura biespecífica correta. Purificação da molécula correta, que geralmente é feito por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante trabalhosa, e o rendimento do produto é baixo. Procedimentos semelhantes são divulgados no WO 93/08829 e, Traunecker et al, EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente, os domínios de anticorpos variável com as especificidades de ligação desejada (antígeno-anticorpo combina sítios) são fundidos à imunoglobulina seqüências de domínio constante. Preferencialmente, a fusão é com uma cadeia pesada de Ig domínio constante, que compreende pelo menos uma parte da articulação, regiões C_H2, e C_H3 . É preferível ter a primeira região constante de cadeia pesada (C_H1), contendo o sítio necessário para a ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. DNAs codificando a fusão de imunoglobulina de cadeia pesada e, se necessário, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão individual, e são co-transfectadas em uma célula hospedeira apropriada. Isso proporciona uma maior flexibilidade no ajuste as proporções entre as três fragmentos de polipeptídeos em proporções desiguais quando modalidades das três cadeias polipeptídicas utilizados na construção proporcionam o melhor rendimento do desejado anticorpo biespecífico. É possível, contudo, inserir as seqüências que codificam duas ou três cadeias polipeptídicas em um único vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias polipeptídicas em relações iguais resultam em altos rendimentos ou quando as relações não têm efeito significativo sobre o rendimento da desejada combinação de cadeia.

Em uma modalidade preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de um híbrido de imunoglobulina de cadeia pesada com uma primeira especificidade ligante em um braço e um par imunoglobulina de cadeia pesada-cadeia leve (fornecendo uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Apurou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação dos desejados compostos biespecíficos das indesejadas combinações da cadeia de imunoglobulinas, na medida que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica fornece uma maneira fácil de separação. Esta abordagem é divulgada no WO 94/04690. Para mais detalhes de gerar anticorpos biespecíficos ver, por exemplo, Suresh et al, Métodos em Enzimologia, 121: 210 (1986).

De acordo com outra abordagem descrita na Patente U.S. No. 5731168, a interface entre um par de moléculas de anticorpos podem ser projetados para maximizar a percentagem de heterodímeros que são recuperados a partir de cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio CH 3. Neste método, uma ou mais pequenas cadeias laterais de aminoácidos a partir da interface da molécula do primeiro anticorpo são substituídos por grandes cadeias de lado (por exemplo, tirosina e triptofano). “Cavidades” compensatórias de tamanho idêntico ou similar ao das grandes cadeias laterais são criados na interface da segunda molécula anticorpo, substituindo as grandes cadeias de aminoácidos lado com menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isto fornece um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero sobre outros indesejados produtos finais, tais como homodímeros.

Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos de ligações cruzadas ou “heteroconjugados”. Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, o outro à biotina. Tais anticorpos têm, por exemplo, sido propostos a atingir as células do sistema imunitário às células indesejadas (Patente US. No. 4676980), e para o tratamento da infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos através de qualquer método conveniente de ligação cruzada. Meios adequados de ligações cruzadas são bem conhecidos no estado da técnica, e são divulgados na Patente US. No. 4676980, junto com uma série de técnicas de ligações cruzadas.

Técnicas para gerar anticorpos biespecíficos de fragmentos de anticorpos também têm sido descritos na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos pode ser preparado utilizando uma ligação química. Brennan et al, Science, 229: 81 (1985) descrevem um procedimento no qual os anticorpos são intacta proteoliticamente clivados para gerar fragmentos F(ab’)2. Estes fragmentos estão reduzidas na presença do agente complexante ditiol, arsenito de sódio, para estabilizar ditióis vicinal e evitar a formação de dissulfeto intermoleculares. Os fragmentos Fab’ gerados são então convertidos em tionitrobenzoato (TNB) derivados. Um dos derivados Fab'-ΤΝΒ é, então, reconvertida para o Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar dos outros Fab'-TNB derivados para formar o anticorpo biespecíficos. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser utilizados como agentes para a imobilização de enzimas seletivo.

O progresso recente tem facilitado a recuperação direta de fragmentos Fab'-SH de E. coli, que pode ser quimicamente ligado a formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al. J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descrevem a produção de uma molécula de anticorpo F(ab’)2 biespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab’ foi segregada separadamente de E. coli e submetidos ao acoplamento químico dirigido in vitro para formar o anticorpo biespecíficos. O anticorpo biespecíficos assim formado foi capaz de se ligar às células com superexpressão do receptor ErbB2 e células T normais humanas, bem como acionar a atividade lítica de recursos humanos linfócitos citotóxicos contra alvos do tumor de mama humano.

Várias técnicas para fazer e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente da cultura de células recombinantes também têm sido descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos através de zíperes de leucina. Kostelny et al, J. Immunol, 148 (5):1547-1553 (1992). Os peptídeos zipper da leucina Fos e proteínas Jun foram relacionadas a partes do Fab’ de dois anticorpos diferentes, por fusão do gene. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de articulação de forma monômeros e, em seguida, re-oxidado para formar o heterodímeros de anticorpos. Este método também pode ser utilizado para a produção de anticorpos homodímeros. A tecnologia “diacorpo” descrita por Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A., 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para a tomada de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um VH conectado a um VL por um articulador que é demasiado curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Assim, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios complementários de VL e VH de um outro fragmento, formando desse modo dois sítios antígeno-ligantes. Uma outra estratégia para a tomada de fragmentos de anticorpos biespecíficos pelo uso de dímeros Fv (sFV) de cadeia única também foi relatada. Ver Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994).

Os anticorpos com mais de duas valências contempladas. Por exemplo, anticorpos trispecíficos pode ser preparado. Tutt et al, J. Immunol. 147: 60 (1991). Um anticorpo multivalente podem ser internalizadas (e / ou catabolizada) mais rápido do que um anticorpo bivalente por uma célula de expressar um antígeno ao qual a ligação de anticorpos. Os anticorpos da invenção podem ser anticorpos multivalentes com três ou mais sítios de ligação antigênica (por exemplo, , Anticorpos tetravalente), que pode ser facilmente produzida pela expressão recombinantes de ácidos nucléicos que codificam as cadeias de polipeptídeos de anticorpo. O anticorpo multivalente pode incluir um domínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação antigênica. O domínio de dimerização preferida compreende (ou consiste em) uma região Fc ou uma região de articulação. Neste cenário, o anticorpo compreende uma região Fc e três ou mais sítios de ligação antigênica amino-terminal da região Fc. O anticorpo multivalente preferido aqui compreende (ou consiste em) de três a oito, mas de preferência quatro sítios de ligação antigênica. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia polipeptídica (e de preferência duas cadeias polipeptídicas), onde a cadeia polipeptídica (s) compreende dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a cadeia polipeptídica (s) podem conter VDL (XI) n-VD2 (X2) n-Fc, onde VDL é um domínio variável em primeiro lugar, é um domínio VD2 segunda variável, Fc, é uma cadeia polipeptídica de uma Fc região, X1 e X2 representa um aminoácido ou polipeptídeo, e n é 0 ou 1. Por exemplo, a cadeia polipeptídica (s) podem incluir: cadeia de região VHCH1-articulador flexível-VH-CH1-Fc ; ou cadeia de região VH-CH1-VH-CH1-Fc. O anticorpo multivalente aqui, de preferência ainda compreende pelo menos dois (e de preferência quatro) polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. O anticorpo multivalente aqui podem, por exemplo, compreendem de cerca de dois a oito polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve aqui contemplado compreende um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, também compreende um domínio C_L.

Os anticorpos da presente invenção incluem ainda os anticorpos de cadeia única.

Em modalidades particulares, os anticorpos da invenção atual são anticorpos internalizantes.

A modificação da sequência de aminoácido dos anticorpos aqui descrito é contemplada. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de sequência de aminoácidos do anticorpo podem ser preparadas através da introdução de alterações nucleotídicas adequado em um polinucleotídeo que codifica os anticorpos, ou uma cadeia mesmo, ou por síntese de peptídeos. Tais modificações incluem, por exemplo, supressões e / ou em inserções e/ou substituições de, resíduos dentro das seqüências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de eliminação, inserção e substituição pode ser feita para chegar ao final de anticorpos, desde que a construção final possui as características desejadas. As mudanças de aminoácidos também podem alterar os processos post-traducional do anticorpo, tal como alterar o número ou a posição dos sítios de glicosilação. Qualquer das variações e alterações descritas acima para polipeptídeos da presente invenção podem ser incluídos em anticorpos da presente invenção.

Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiões de um anticorpo que são locais preferenciais para a mutagênese é chamado de varredura mutagênese alanina, tal como descrito por Cunningham e Wells na revista Science, 244:1081-1085 (1989). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvo são identificados (por exemplo, acusado de resíduos, tais como arg, asp, seu, lys, e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (alanina, ou mais preferivelmente polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com antígeno PSCA . Esses locais de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional para as substituições, são em seguida refinados através da introdução de variantes mais ou menos outros, ou para os sítios de substituição. Assim, embora o sítio para introduzir uma variação da seqüência de aminoácidos seja determinada, a natureza da mutação, por si só não precisa ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um determinado sítio, a varredura ala ou a mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região alvo e as variantes anti-anticorpo expressas são classificadas quanto à atividade desejada.

Inserções de sequência de aminoácido incluem fusões amino- e/ou caraboxilterminais variando em comprimento desde um resíduo até polipeptídeos contendo uma centena ou mais de resíduos, bem como inserções intraseqüenciais de um ou vários aminoácidos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo Nterminal metionil ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras variantes de inserção de um anticorpo incluem a fusão ao N- ou C-terminal do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo.

Outro tipo de variação é uma variante de substituição de aminoácidos. Essas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para a mutagênese substitucional inclui as regiões hipervariáveis, mas alterações FR também são contemplados.

Substituições conservatives e não-conservativas são contempladas.

Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas mediante selecionar substituições que diferem significativamente em seus efeitos sobre a manutenção:

(a) da estrutura da cadeia estrutural polipeptídeo na área de substituição, por exemplo, tal como uma conformação laminar ou helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local de destino, ou (c) a maior parte da cadeia lateral.

Qualquer resíduo de cisteína que não estão envolvidos na manutenção da conformação dos anticorpos também podem ser substituídos, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e impede crosslinking aberrante. Por outro lado, ligações cisteína podem ser adicionadas ao anticorpo para melhorar a sua estabilidade (sobretudo quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal como um fragmento Fv).

Um tipo de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo gerador. Geralmente, a variação resultante selecionada para maior desenvolvimento terá melhorado as propriedades biológicas em relação ao anticorpo gerador a partir do qual eles são gerados. Uma maneira conveniente para gerar tais variantes de substituição implica a maturação de afinidade utilizando exibição fago. Em resumo, vários sítios hipervariável região (por exemplo, 6-7 sítios) são transformados para gerar todas as substituições possíveis aminoácidos em cada local. As variantes anticorpos assim geradas são apresentadas na forma monovalente de partículas do fago filamentoso como fusões com o produto do gene III de M 13 empacotado dentro de cada partícula. As variantes fago-indicadas são então selecionados para a sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação) como aqui divulgadas. A fim de identificar sítios candidatos da região hipervariável para modificação, mutagênese varredura alanina podem ser realizadas para identificar resíduos da região hipervariável que contribuem significativamente para ligação ao antígeno . Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar a estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contacto entre o anticorpo e um antígeno ou células infectadas. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos à substituição de acordo com as técnicas elaboradas aqui. Uma vez que as variantes sejam geradas, o painel de variantes é submetido a um exame como descrito aqui e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios pertinentes podem ser selecionados para um maior desenvolvimento.

Um outro tipo de variante aminoácidos do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Por alterar é significado eliminar um ou mais carboidratos encontrados nos anticorpos e / ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estejam presentes no anticorpo.

A glicosilação de anticorpos costuma ser N-articulada ou O-articulada. N-articulada se refere a anexação da fração carboidrato à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As sequência tripeptídeos asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a fixação enzimática do carboidrato na cadeia lateral asparagina. Assim, a presença de qualquer dessas seqüências tripeptídeo de um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. Glicoiíação O-articulada se refere à anexação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose em um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5 - hidroxiprolina ou 5-hidróxi-lisina também possa ser usado.

A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizado, alterando a seqüência de aminoácidos tal que contenha um ou mais dos acima descritos seqüências tripeptídeo (para sítios glicosilação N-ligada). A alteração também pode ser feita através da adição ou da substituição por uma ou mais resíduos de serina ou treonina para a seqüência do anticorpo original (para sítios glicosilação O-ligados).

O anticorpo da invenção é modificado com relação à função efetora, por exemplo, de forma a reforçar citotoxicidade antígeno-dependente mediada por células (ADCC) e / ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) do anticorpo. Isto pode ser conseguido através da introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos em uma região Fc do anticorpo. Em alternativa ou adicionalmente, resíduo de cisteína (s) podem ser introduzidos na região Fc, permitindo a formação de ligação de bissulfeto intercadeias nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter melhor capacidade de interiorização e/ou aumento da morte celular mediada por complemento e anticorpo citotoxicidade celular dependente (ADCC). Veja Caron et ah, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) e shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). homodimérica anticorpos com actividade anti-infecção reforço também pode ser preparado usando heterobifuncional cross-articuladores conforme descrito no Wolff et ah, 53:2560-2565 Cancer Research (1993). Como alternativa, um anticorpo pode ser projetado que tem dupla regiões Fc, podendo assim ter melhorada lise complementar e capacidades de ADCC. Veja Stevenson et al, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989).

Para aumentar a meia-vida sérica do anticorpo, pode-se incorporar um receptor de resgate epítopo de ligação no anticorpo (fragmento de um anticorpo especíalmente), conforme descrito no Patente US. No. 5739277, por exemplo. Como usado aqui, o termo epítopo ligante a receptor de resgate refere-se a um epítopo da região Fc de uma molécula de IgG (por exemplo, IGGI, lgG2, lgG3 ou lgG4), que é responsável por aumentar in vivo a meia-vida sérica da molécula de IgG.

Os anticorpos da presente invenção também pode ser modificados para incluírem um epítopo etiqueta ou rótulo, por exemplo, para uso em aplicações de purificação ou de diagnóstico. A invenção também refere-se à terapia com Imunoconjugados compreendendo um conjugado anticorpo a um agente anti-câncer como um agente citotóxico ou um agente inibidor de crescimento. Agentes quimioterapêuticos úteis na geração de Imunoconjugados foram descritos acima.

Conjugados de anticorpos e uma ou mais toxinas de molécula pequena, tal como uma Ocalicheamicin, maitansinóides, um trichothene, CC e 1065, e os derivados destas toxinas que têm a atividade toxina, também estão contempladas neste documento.

Em uma modalidade preferida, um anticorpo (comprimento total ou fragmentos) da invenção é conjugado a um ou mais moléculas maitansinóide. Maitansinóides são inibidores mitóticos que agem inibindo a polimerização da tubulina. Maitansina foi isolada pela primeira vez a partir do arbusto Maitenus serrata do leste Africano (Patente US. No. 3896111). Posteriormente, descobriu-se que certos micróbios também produzem maitansinóides, tal como maitansinol e C-3 ésteres maitansinol (Patente US. No. 4151042). Maitansinol sintéticos e derivados e análogos da mesma são divulgados, por exemplo, nas Patentes US. Nos. 4137230; 4248870; 4256746, 4260608, 4265814, 4294757, 4307016, 4308268, 4308269, 4309428, 4313946, 4315929, 4317821, 4322348, 4331598, 4361650, 4364866, 4424219, 4450254, 4362663 e 4371533.

Em uma tentativa de melhorar o seu índice terapêutico, Maitansina e maitansinóides foram conjugados com anticorpos liga especificamente a antígenos de células tumorais. Imunoconjugados contendo maitansinóides e seu uso terapêutico são divulgados, por exemplo, na Patente US. No. s 5208020, 5416064 e Patente Européia EP 0 425 235 Bl. Liu et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 93:8618-8623 (1996) descreveram Imunoconjugados compreendendo um maitansinóide designado DML C242 ligado ao anticorpo monoclonal dirigido contra o câncer colorectal humano. O conjugado foi encontrado para ser altamente citotóxica para células de câncer de cólon cultivadas, e mostrou atividade antitumoral em um ensaio in vivo de crescimento tumoral. [172] conjugados anticorpo-maitansinóide são preparados por um anticorpo que liga quimicamente a uma molécula maitansinóide sem diminuir significativamente a atividade biológica de cada anticorpo ou a molécula maitansinóide. Uma média de 3-4 moléculas maitansinóide conjugados de anticorpos por molécula tem demonstrado eficácia no aumento da citotoxicidade das células-alvo sem afetar negativamente a função ou a solubilidade dos anticorpos, embora mesmo uma molécula da toxina / anticorpo seria esperado para reforçar a citotoxicidade sobre o uso de anticorpo nu. Maitansinóides são bem conhecidos no estado da técnica e podem ser sintetizados através de técnicas conhecidas ou isolados de fontes naturais. Maitansinóides adequados são divulgados, por exemplo, na Patente US. No. 5208020 e outras patentes no nonpatent e publicações referidas anteriormente. Maitansinóides preferidos são maitansinol e análogos do maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula do maitansinol, tal como diversos ésteres de maitansinol.

Há muitos grupos de ligação conhecidos no estado da técnica de fazer os conjugados de anticorpos, incluindo, por exemplo, aqueles divulgados na Patente US. No. 5208020 ou patente EP 0 425 235 Bl e Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992). Os grupos de ligação incluem grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos ácido lábil, grupos fotolábil, grupos peptidase lábil, ou grupos estearase labeis, conforme divulgado nas patentes acima identificado, sendo os grupos dissulfeto e tioether os preferidos.

Imunoconjugados podem ser produzidos usando uma variedade de agentes de ligação proteína bifuncional , tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N maleimidometil) ciclohexano-l-carboxilato, iminotiolane ( IT), derivados de Imidoésteres bifuncional (tal como dimetil adipimidate HCL), ésteres de ativos (como disuccinimidil suberate), aldeídos (como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), bis-diazônio derivados (como o bis (p-diazoniumbenzoil) etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tal como 1,5 difluoro-2 ,4-dinitrobenzeno). Agentes de acoplamento particularmente preferidos incluem N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et al. Biochem. J. 173:723-737 [1978]) e N-succinimidil-4-(2-piridiltio ) pentanoato (SPP) para assegurar uma ligação de dissulfeto. Por exemplo, um immunotoxina ricina pode ser preparada como descrito no Vitetta et al, Science 238: 1098 (1987). Carbono-14marcado ácido isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminepentaacético (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação do radionucleotídeo ao anticorpo. Ver WO94/11026. O articulador pode ser um “articulador clivável que facilita a liberação do medicamento citotóxico na célula. Por exemplo, um articulador ácido-lábil, Cancer Research 52: 127-131 (1992); Patente US. No. 5208020) pode ser utilizado.

Outro immunoconjugado de interesse compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas calicheamicin. A família calicheamicin de antibióticos é capaz de produzir rupturas no DNA de dupla fita em concentrações sub-picomolares. Para a preparação de conjugados da família calicheamicin, consulte as Patentes U.S. Nos. 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001, 5877296 (todos da norte-americana Cianamid Company). Outra droga à qual o anticorpo pode ser conjugado é a QFA que é um antifolato. Ambos calicheamicin e QFA tem sítios intracelulares de ação e não atravessam facilmente a membrana plasmática. Portanto, a captação celular desses agentes por meio de internalização mediada por anticorpos aumenta consideravelmente os seus efeitos citotóxicos.

Exemplos de outros agentes que podem ser conjugados com os anticorpos da invenção incluem BCNU, streptozoicin, vincristina e 5-fluorouracil, a família dos agentes conhecidos coletivamente complexo E33288-LL descrito nas Patentes U.S. Nos. 5053394, 5770710, bem como esperamicinas (Patente US. No. 5877296).

Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser usados incluem, por exemplo, cadaeia da difteria A, fragmentos ativos não ligantes de toxina difteria, cadeia da exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia ricina A, cadeia abrin A, cadeia modeccina A, proteínas alfa-sarcin, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor da Momordica charantia, curcin, crotin, inibidor da sapaonaria officinalis, gelonin, mitogellin, restrictocina, fenomycin, enomycin e tricothecenes. Ver, por exemplo, WO 93/21232.

A presente invenção também inclui um immunoconjugate formada entre um anticorpo e um composto com atividade nucleolítica (por exemplo, a ribonuclease ou DNA endonuclease como uma desoxirribonuclease; DNase).

Para a destruição seletiva de células infectadas, os anticorpos inclui um átomo altamente radioativo. Uma variedade de isótopos radioativos estão disponíveis para a produção de anticorpos anti-PSCA radioconjugados. Exemplos incluem At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y90, Re¹⁸⁶, Rc¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² e isótopos radioativos de Lu. Quando o conjugado é utilizado para o diagnóstico, que pode incluir um átomo radioativo para estudos de cintilografia, por exemplo, ou Tc^99m I¹²³, ou um rótulo de spin por ressonância magnética nuclear (RMN) de imagem (também conhecida como imageamento por ressonância magnética), tal como o iodo - 123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.

A rádio-etiqueta ou outra etiqueta é incorporada no conjugado de formas conhecidas. Por exemplo, o peptídeo pode ser biossintetizado ou pode ser sintetizado por reação química do ácido amino usando precursores adequados de aminoácidos que envolvem, por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio. Rótulos como Tc99m ou 1123, Re186, Re188 In111 e pode ser ligada através de um resíduo de cisteína no peptídeo. ítrio90 pode ser ligada através de um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker ai. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57) pode ser usado para incorporar iodo-123. anticorpos monoclonais em Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press, 1989) descreve outros métodos em detalhes.

Por outro lado, uma proteína de fusão que compreende o anticorpo e citotóxico é feita, por exemplo, por meio de técnicas de recombinação ou síntese de peptídeos. O comprimento do DNA pode incluir as respectivas regiões de codificação das duas parcelas do conjugado ou adjacentes um ao outro ou separados por uma região que codifica um peptídeo articulador que não destrói as propriedades desejadas do conjugado.

Os anticorpos da invenção também são usados na terapia por prodrogas enzimamediada anticorpo-dependente (ADET) mediante conjugar o anticorpo a uma enzima ativadora da prodroga que converte uma prodroga (por exemplo, um agente quimioterapêutico peptidila, ver WO81/01145) a uma droga anti-câncer ativa (ver, por exemplo, WO 88/07378 e Patente U.S. No. 4975278).

O componente enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui todas as enzimas capazes de atuar sobre uma pró-droga de tal forma, de modo a convertê-la em sua forma mais ativa, citotóxica. Enzimas que são úteis no método da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, fosfatase alcalina útil para a conversão de fosfato contendo prodrogas em drogas livres; arilsulfatase útil para converter contendo sulfato de pró-fármacos em fármacos livres; citosina deaminase útil para a conversão não tóxico fluorocitosina 5 em que a droga anti-câncer, 5-fluorouracil, proteases, tal como a protease serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como as catepsinas B e L), que são úteis para a conversão de peptídeo pró-fármacos contendo em drogas livres ; Dalanilcarboxipeptidases, útil para converter pró-fármacos que contêm substituintes Daminoácido, enzimas, carboidratos, tais como divagem β-galactosidase e neuraminidase útil para converter pró-fármacos glicosilada em drogas livres; útil β-lactamase para a conversão de drogas derivadas com β-lactâmicos em drogas livres, e amidases penicilina, tal como penicilina amidase V ou penicilina amidase G, útil para a conversão de drogas derivatizados na sua nitrogênios amina com grupos fenoxiacetil ou fenilacetila, respectivamente, em medicamentos gratuitamente. Alternativamente, anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos no estado da técnica como abzimas, pode ser usado para converter o pró-drogas da invenção em livre drogas ativas (ver, por exemplo, Massey, Nature 328: 457458 (1987)). conjugados de anticorpos abzima pode ser preparado como descrito aqui para a entrega dos abzyme a uma população de células infectadas.

As enzimas desta invenção podem ser ligadas covalentemente aos anticorpos através de técnicas bem conhecidas no estado da técnica, tal como o uso de reagentes de ligação cruzada heterobifuncional discutido acima. Em alternativa, as proteínas de fusão compreendendo pelo menos a região ligada ao antígeno de um anticorpo da invenção ligada a pelo menos uma parte funcionalmente ativa de uma enzima da invenção pode ser construída usando técnicas de DNA recombinante conhecidas no estado da técnica (ver, por exemplo, Neuberger et al, Nature, 312: 604-608 (1984).

Outras modificações do anticorpo são contempladas neste documento. Por exemplo, o anticorpo pode ser ligada a um de uma variedade de polímeros nonproteinaceous, por exemplo, glicol de polietileno, polipropileno glicol, polioxialquilenos, ou copolímeros de polietileno glicol e polipropileno glicol. Os anticorpos também podem ser aprisionadas em microcápsulas preparados, por exemplo, técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial (por exemplo, idroxymetilcellulose ou gelatina, as microcápsulas e poli-metilmetacilate () microcápsulas, respectivamente) , em sistemas de distribuição de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Ciências Farmacêuticas da Remington, edição 16, Oslo, A., ed., (1980 ).

Os anticorpos também são divulgados aqui formulado como imunolipossomas . Um “lipossoma” é uma vesícula pequena composta de vários tipos de lipídios, fosfolipídios e / ou tensoativo que é útil para a entrega de um medicamento a um mamífero. Os componentes dos lipossomas são normalmente organizados em uma formação de bicamada, similar ao arranjo lipídico das membranas biológicas. Lipossomas contendo o anticorpo são preparadas por métodos conhecidos no estado da técnica, tal como descrito no Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. , 82:3688 (1985); Hwang et al, Proc. Natl Acad. Sci. E.U.A., 77:4030 (1980); Patente US. No. s 4485045 e 4544545, e publicada WO97/38731 23 de outubro de 1997. lipossomas com o tempo de circulação melhorado são divulgados na Patente U.S. No. 5013556.

Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação em fase reversa com uma composição lipídica compreendendo fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina PEG-derivatizados (PEG-PE). Lipossomas são extrudadas através de filtros de tamanho de poros definidos para produzir lipossomas com o diâmetro desejado, fragmentos Fab de anticorpo da invenção pode ser conjugado com os lipossomos, tal como descrito em Martin et al, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) através de uma reação de troca de dissulfeto. Um agente quimioterapêutico, opcíonalmente, é contido dentro do lipossoma. Cancer Inst Veja Gabizon et al, J. Nacional. 81 (19) 1484 (1989).

Os anticorpos da invenção atual, ou fragmentos dos mesmos, podem possuir qualquer de uma variedade de características biológicas ou funcionais. Em certas modalidades, esses anticorpos são anticorpos da Influenza A proteína específica ou M2 específico, indicando que eles se ligam especificamente ou, preferencialmente, se ligam a Influenza A ou a sua proteína M2, respectivamente, em comparação a uma célula controle normal. Em modalidades, por exemplo, os anticorpos são anticorpos HuM2e, indicando que eles se ligam especificamente a uma proteína M2e, de preferência a um epítopo do domínio M2e que só está presente quando a proteína M2 é expressa em células ou presentes em um vírus, em comparação a uma célula controle normal.

Em modalidades particulares, um anticorpo da invenção é um anticorpo antagonista, que bloqueia ou inibe total ou parcialmente, a atividade biológica de um polipeptídeo ou célula à qual ele se liga especificamente ou preferencialmente. Em outras modalidades, um anticorpo da invenção é um crescimento de anticorpos inibidores, que total ou parcialmente, os blocos ou inibem o crescimento de uma célula infectada para que ela se liga. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção atual induz apoptose. Entretanto, numa outra modalidade, um anticorpo da invenção atual induz ou promove citotoxicidade célula-mediada anticorpo-dependente ou citotoxicidade complemento dependente.

Métodos de identificação e produção de anticorpos específicos para o vírus influenza

A presente invenção fornece novos métodos para a identificação de anticorpos HuM2e, tal como exemplificado no Exemplo 4. Estes métodos podem ser facilmente adaptados para identificar anticorpos específicos para outros polipeptídeos expressos na superfície das células por agentes infecciosos, ou mesmo polipeptídeos expressos na superfície de um agente infeccioso propriamente.

Em geral, os métodos incluem a obtenção de amostras de soro de pacientes que foram infectados ou vacinados contra um agente infeccioso. Estas amostras de soro são então selecionadas para identificar aqueles que contêm anticorpos específicos para um polipeptídeo particular associado com o agente infeccioso, como, por exemplo, um polipeptídeo especificamente expresso na superfície das células infectadas com o agente infeccioso, mas não as células não infectadas. Em modalidades, por exemplo, as amostras de soro são selecionadas entre em contato com as amostras com uma célula que tem sido transfectadas com um vetor de expressão que expressa a polipeptídeos expressos na superfície das células infectadas.

Quando o paciente é identificado como tendo soro contendo um anticorpo específico para o agente infeccioso polipeptídeo de interesse é identificado, mononuclear e / ou células B obtido a partir de um mesmo paciente são usados para identificar uma célula ou um clone dele que produz os anticorpos, usando qualquer dos métodos descritos aqui ou disponível no estado da técnica. Uma vez que uma célula B que produz o anticorpo é identificado, cDNAs que codificam as regiões variável ou seus fragmentos do anticorpo pode ser clonado utilizando vetores padrão de RT-PCR e iniciadores específicos para seqüências conservadas de anticorpos, e subclonado para vetores de expressão utilizados para a produção recombinante de anticorpos monoclonais específicos para o agente infeccioso polipeptídeo de interesse.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de identificação de um anticorpo que se liga especificamente a influenza A infecção de células, compreendendo: contatar o vírus Influenza A, ou uma célula que expressa a proteína M2, com uma amostra biológica obtida a partir de um paciente infectado pelo Influenza A, determinando uma quantidade de anticorpos na amostra biológica que se liga à célula, e compara o valor determinado com um valor de controle, onde se o valor determinado é pelo menos duas vezes maior do que o valor de controle, um anticorpo que se liga especificamente a influenza A células infectadas é indicado. Em várias modalidades, as células que expressam uma proteína M2 são as células infectadas com o vírus Influenza A ou as células foram transfectadas com um polinucleotídeo que expressa a proteína M2.

Alternativamente, as células podem expressar uma porção da proteína M2, que inclui o domínio M2e e seqüência M2 suficiente adicionais que a proteína continua a ser associado com a célula e o domínio M2e é apresentado na superfície da célula da mesma maneira como quando presentes no comprimento total proteína M2. Métodos de preparação de um 5 vetor de expressão e M2 que transfecta uma célula apropriada, incluindo as aqui descritas, podem ser facilmente realizados, tendo em conta a seqüência M2 de disponibilização ao público. Veja, por exemplo, a Influenza Sequence Database (DSI) (flu.lanl.gov na World Wide Web, descrito no Macken et al. 2001, The value of a database in surveillance and vaccine selection in Options for the Control of Influenza IV. A.D.M.E., Osterhaus & 10 Hampson (Eds.), Elsevier Science, Amsterdam, pp. 103-106) and the Microbial Sequencing

Center (MSC) at The Institute for Genomic Research (TIGR) (tigr.org/msc/infl_a_virus.shtml on the World Wide Web).

Células ou vírus expressando M2e descritas acima são usadas para selecionar a amostra biológica obtida a partir de um paciente infectado com influenza A quanto à 15 presença de anticorpos que se ligam a células que expressam o polipeptídeo M2 usando técnicas biológicas. Por exemplo, em certas modalidades, os anticorpos podem ser rotulados, e a presença de rótulo associado com a célula detectado, por exemplo, usando análise FMAT ou FACs. Em modalidades particulares, a amostra biológica é sangue, soro, plasma, lavado brônquico ou saliva. Os métodos da presente invenção pode ser praticado 20 com técnicas de elevada capacidade.

Anticorpos humanos identificados podem ser também caracterizados. Por exemplo, os epítopos conformacionais com particular na proteína M2e que são necessários ou suficientes para a ligação do anticorpo pode ser determinada, por exemplo, utilizando mutagênese sítio-dirigida de polipeptídeos expressos M2e. Estes métodos podem ser 25 facilmente adaptadas para identificar anticorpos humanos que se ligam a proteína expressa em qualquer superfície da célula. Além disso, esses métodos podem ser adaptados para determinar a ligação de anticorpos para o vírus, ao contrário de uma célula recombinante expressando M2e ou infectada com o vírus.

Sequências polinucleotídeos que codificam os anticorpos, regiões variáveis do 30 mesmo, ou seus fragmentos antígeno-litantes podem ser subclonaas na forma de vetores de expressão para a produção recombinante de anticorpos HuM2e. Em uma modalidade, isto é conseguido através da obtenção de células mononucleares do paciente a partir do soro contendo o anticorpo identificado HuM2e que foi obtido; produzir clones de células B a partir de células mononucleares; induzir as células B para se tornarem células plasmáticas 35 produtoras de anticorpos; e classificar os sobrenadantes produzidos pelas células plasmáticas para determinar se contêm o anticorpo HuM2e. Uma vez que um clone de células B, que produz um anticorpo HuM2e é identificado, reação em cadeia da polimerase transcrição reversa (RT-PCR) é realizada para clonar os DNAs codificando as regiões variáveis ou partes dos mesmos do anticorpo HuM2e. Essas seqüências são então subcloned em vetores de expressão adequados para a produção de anticorpos humanos recombinantes HuM2e. A especificidade de ligação pode ser confirmado através da determinação da capacidade de anticorpos recombinantes para células que expressam vincular polipeptídeo M2e.

Em modalidades particulares dos métodos aqui descritos, as células B isoladas do sangue periférico ou linfonodos são ordenados, por exemplo, com base naqueles que são CD19 positivos, e plaqueados, por exemplo, tão baixos quanto a especificidade de uma célula única por cava, por exemplo, em configurações de 96, 384, ou 1536 cavas. As células são induzidas a se diferenciarem em células produtoras de anticorpos, por exemplo, células do plasma, e os sobrenadantes de cultura são colhidas e testadas para a ligação com as células que expressam o polipeptídeo agente infeccioso em sua superfície, utilizando, por exemplo, ou a análise FMAT FACS. As cavas positivas são então submetidas a RT-PCR integral por cava para amplificar regiões variáveis de cadeia pesada e leve da molécula de IgG expressos pelas células de plasma clonal filha. Os produtos de PCR resultantes que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e leve, ou suas porções, são subclonados na forma de vetores de expressão anticorpo humano quanto a expressão recombinante. Os anticorpos recombinantes resultants são então testados para confirmar sua especificidade ligante original e podem ser posteriormente testados quanto a especificidade abrangente para os diversas isolados de cepas do agente infeccioso.

Assim, em uma modalidade, um método de identificação de anticorpos HuM2e é praticado da seguinte forma. Primeiro, cDNAs de M2 de comprimento total ou de comprimento aproximadamente total são transfectados em uma linhagem de células de expressão da proteína M2. Em segundo lugar, as amostras de plasma humano, individual ou soros são testados para detecção de anticorpos que se ligam a células expressando M2 . E, finalmente, MAbs derivados do plasma ou indivíduos soro-positivos são caracterizados para se ligarem ao mesmo M2 expresso na célula. Definição adicional das especificidades finas dos Mabs podem ser realizadas nesse momento.

Estes métodos podem ser praticados para identificar uma variedade de anticorpos diferentes HuM2e, incluindo anticorpos específicos para (a epítopos) de um peptídeo M2e linear, (b) epítopos comuns em múltiplas variantes de M2e, (c) determinantes conformação de um M2 homotetramer, e (d) comum determinantes conformacional de múltiplas variantes do homotetrâmero M2. A última categoria é particularmente oportuna, já que esta especificidade é, talvez, um específico para todas as cepas de influenza.

Polinucleotídeos que codificam os anticorpos HuM2e ou partes dos mesmos da presente invenção pode ser isolado a partir de células que expressam anticorpos HuM2e, de acordo com os métodos disponíveis no estado da técnica e aqui descrito, incluindo amplificação por reação em cadeia da polimerase utilizando iniciadores específicos para regiões conservadas do ser humano polipeptídeos de anticorpo. Por exemplo regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve podem ser clonadas a partir da célula B de acordo com técnicas de biologia molecular descrito no WO 92/02551; Patente U.S. No. 5627052, ou Babcook et al, Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 93:7843-48 (1996). Em certas modalidades, polinucleotídeos codificando toda ou uma região de ambas as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia levei da molécula de IgG expressos pelas células plasmáticas filhas clonais expressando o anticorpo HuM2e são subclonadas e seqüenciadas. A seqüência do polipeptídeo codificado pode ser facilmente determinada a partir da seqüência de polinucleotídeo. Isolados polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo da presente invenção pode ser subclonado em um vetor de expressão recombinante para produzir anticorpos e polipeptídeos da presente invenção, através de procedimentos conhecidos no estado da técnica e aqui descritos.

Propriedades ligantes de um anticorpo (ou fragmento dele) a M2e ou células ou tecidos infectados pode geralmente ser determinadas e avaliadas através de métodos de imunodetecção, incluindo, por exemplo, imunofluorescência de base, tais como imunohistoquímico (IHQ) e / ou de separação de células ativadas por fluorescência (FACS). Métodos de imunoensaio podem incluir controles e procedimentos para verificar se os anticorpos se ligam especificamente a M2e de uma ou mais cepas específicas de Influenza A, e não reconhecem ou reação cruzada com células normais do controle.

Em seguida da pré-classificacao do soro para identificar os pacientes que produzem anticorpos contra um agente infeccioso ou um seu polipeptídeo, por exemplo M2, os métodos da presente invenção tipicamente incluem o isolamento ou purificação de células B a partir de uma amostra biológica obtida anteriormente a partir de um paciente ou indivíduo. O paciente ou o indivíduo pode estar atualmente ou previamente diagnosticado ou suspeito ou ter uma determinada doença ou infecção, o paciente ou indivíduo pode ser considerada livre ou uma determinada doença ou infecção. Normalmente, o paciente ou indivíduo é um mamífero e, em modalidades particular, um ser humano. A amostra biológica pode ser uma amostra que contém células B, incluindo mas não limitado a, linfonodo ou tecido do linfonodo, derrame pleural, sangue periférico, ascite, o tecido do tumor, ou líquido cefalorraquidiano (LCR). Em várias modalidades, as células B são isoladas de diferentes tipos de amostras biológicas, tais como uma amostra biológica afetada por uma determinada doença ou infecção. No entanto, entende-se que qualquer amostra biológica constituída por células B pode ser utilizado para qualquer uma das concretizações da presente invenção.

Depois de isoladas, as células B são induzidas a produzir anticorpos, por exemplo, através da cultura de células B, em condições que sustentam a proliferação das células B ou desenvolvimento em um plasmacito, plasmablasto, ou célula plasmática. Os anticorpos são então selecionados, geralmente usando técnicas de elevada capacidade, para identificar um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno alvo, por exemplo, um tecido especial, celular, agente infeccioso, ou polipeptídeo. Em certas modalidades, o antígeno específico, por exemplo, o polipeptídeo da superfície celular ligado pelo anticorpo não é conhecida, enquanto que em outras modalidades, o antígeno específico ligado ao anticorpo é conhecido.

De acordo com a presente invenção, as células B podem ser isoladas de uma amostra biológica, por exemplo, um tumor, de tecidos, sangue periférico ou amostra dos linfonodos, por qualquer meio conhecido e disponível no estado da técnica. As células B são geralmente classificadas por FACS com base na presença em sua superfície de um marcador específico de células B, por exemplo, CD19, CD138, e / ou IgG de superfície. No entanto, outros métodos conhecidos no estado da técnica podem ser empregados, como, por exemplo, purificação em coluna usando CD 19 esferas magnéticas ou IgG específicos esferas magnéticas, seguido pela eluição da coluna. No entanto, o isolamento magnético de células B, utilizando qualquer marcador pode resultar em perda de certas células B. Assim, em certas modalidades, as células isoladas, que não são ordenados, mas sim células mononucleares ficol-purificadas isoladas de tumor são banhadas diretamente ao número adequado ou desejável de especificidades por cava.

A fim de identificar as células B que produzem anticorpos específicos do agente infeccioso, as células B são geralmente banhadas em baixa densidade (por exemplo, uma especificidade única célula por cava, 1-10 células por cava, 10-100 células por cava , 100100 células por cava, a menos de 10 células por cava ou inferior a 100 células por cava) em placas multi-cavas ou de mitrotítulação, por exemplo, em configurações de 96, 384, 1536 ou cavas. Quando as células B são inicialmente plaqueadas com uma densidade maior do que uma célula por cava, então os métodos da presente invenção podem incluir a etapa de posteriormente diluir as células em uma cava idnetificada como produtora de uma ntic antígeno-específico, até que uma única especificidade de célula por cava seja conseguida, facilitando desse modo a identificação da célula B que produz o anticorpo antígenoespecífico. Os sobrenadantes das células ou uma parte dele e/ou células podem ser congeladas e armazenadas para testes futuros e posterior recuperação de polinucleotídeos de anticorpos.

Em determinadas concretizações, as células B são cultivadas em condições que favorecem a produção de anticorpos pelas células B. Por exemplo, as células B podem ser cultivadas em condições favoráveis para a proliferação das células B e a diferenciação de rendimento plasmablast produtoras de anticorpos, plasmócitos ou células de plasma. Em modalidades particular, as células B são cultivadas na presença de um mitógeno de células

B, tal como lígante de lipopolissacarídeo (LPS) ou CD40 . Em uma modalidade específica, as células B se diferenciam em células produtoras de anticorpos através da cultura delas com células nutridas e/ou outros ativadores de células B, tal como o ligante CD40.

Os sobrenadantes de cultura de células ou anticorpos obtidos podem ser testados quanto à sua capacidade de se ligar a um antígeno alvo, utilizando métodos de rotina disponíveis no estado da técnica, incluindo os aqui descritos. Em modalidades particular, sobrenadantes de cultura são testados quanto a presença de anticorpos que se ligam a um antígeno alvo utilizando métodos de alto rendimento. Por exemplo, as células B podem ser cultivadas em placas multi-cavas ou de microtitulação, de modo que os manipuladores robóticos da placa podem ser utilizados para simultaneamente múltiplos sobrenadantes de células e testar quanto a presença de anticorpos que se ligam a um antígeno alvo. Em modalidades, por exemplo, os antígenos são ligados a microesferas, por exemplo, paramagnéticas ou esferas de látex) para facilitar a captura de complexos de anticorpos / antígenos. Em outras modalidades, os antígenos e anticorpos são marcados fluorescentemente (com nomes diferentes) e FACS análise é realizada para identificar a presença de anticorpos que se ligam ao antígeno alvo. Em uma modalidade, a ligação do anticorpo é determinada usando análise FMAT ™ e instrumentação (Applied Biosystems, Foster City, CA). FMAT ™ é uma plataforma de fluorescência confocal para classificação em alto débito, que mistura e faz leitura de ensaios não-radioatios utilizando células vivas ou microesferas.

No contexto de comparação a ligação de um anticorpo de um antígeno-alvo específico (por exemplo, uma amostra biológica, tais como tecido infectado, células ou agentes infecciosos), em comparação com uma amostra de controle (por exemplo, uma amostra biológica, tal como não infectados células, ou outro agente infeccioso), em diversas modalidades, o anticorpo é considerado preferencialmente ligar um antígeno alvo particular, se pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos cinco vezes, ou pelo menos, dez vezes mais anticorpo se liga ao antígeno alvo específico em relação à quantidade que se liga a uma amostra de controle.

Polinucleotídeos que codificam cadeias de anticorpos, as regiões variáveis da mesma, ou fragmentos dos mesmos, podem ser isoladas a partir de células utilizando qualquer meio disponível no estado da técnica. Em uma modalidade, polinucleotídeos isolados utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR), por exemplo, transcrição reversa-PCR (RT-PCR) utilizando iniciadores que se ligam especificamente a cadeia pesada ou leve codificaçãa seqüências de polinucleotídeo ou complementos, utilizando procedimentos de rotina disponíveis no estado da técnica. Em uma modalidade, os poços positivos serão submetidos a todo bem RT-PCR para amplificar as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia levei da molécula de IgG expressos pelas células de plasma clonal filha. Estes produtos de PCR pode ser seqüenciado.

Os produtos resultantes da PCR codificação das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia levei ou partes deles são então subcloned em vetores de expressão humana e anticorpo recombinante expressa de acordo com procedimentos de rotina no 5 estado da técnica (ver, por exemplo, Patente LIS. No. 7112439). As moléculas de ácido nucléico que codifica um anticorpo tumor-específico ou fragmento dele, conforme descrito aqui, podem ser propagadas e expressas de acordo com qualquer um de uma variedade de procedimentos conhecidos para a excisão de ácido nucléico, laqueadura, transformação e transfecção. Assim, a expressão em determinadas modalidades de um fragmento de 10 anticorpo pode ser preferido em uma célula hospedeira procarióticas, tais como Escherichia coli (ver, por exemplo, Pluckthun et al, Métodos Enzymol. 178:497-515 (1989)). Em certas outras modalidades expressão do anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser preferido em uma célula hospedeira eucarioticas, incluindo leveduras (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe e Pichia pastoris);

células animais (incluindo as células de mamíferos), ou células vegetais. Exemplos de células animais apropriados incluem, mas não estão limitados a, mieloma, COS, CHO, ou células de hibridoma. Exemplos de células vegetais são o tabaco, milho, soja, arroz e células. Pelos métodos conhecidos para ter as competências comuns do estado da técnica e com base na informação atualmente, um vetor de ácido nucléico pode ser projetado para 20 expressar seqüências de estrangeiros em um sistema hospedeiro em particular, e, em seguida, as seqüências polinucleotídeo codificando os anticorpos tumor-específicos (ou fragmento dela) podem ser inseridos. Os elementos de regulação irá variar de acordo com o hospedeiras particular.

Um ou mais replicáveis vetores de expressão contendo um polinucleotídeo que 25 codifica uma variável e / ou região constantes podem ser preparados e utilizados para transformar uma linhagem celular adequada, por exemplo, uma linhagem de células de mieloma não produzem, tal como uma linhagem NSO de ratinhos ou uma bactéria, tal como E.coli, em que a produção do anticorpo irá ocorrer. A fim de obter a transcrição e tradução eficiente, a seqüência de polinucleotídeo em cada vetor deve incluir seqüências regulatórias 30 adequadas, por exemplo a um promotor e a seqüência líder operativamente ligada à seqüência de domínio variável. Métodos específicos para a produção de anticorpos, desta forma são geralmente bem conhecidas e rotineiramente utilizadas. Por exemplo, os procedimentos de biologia molecular são descritos por Sambrook et al. (Clonagem Molecular, um manual de laboratório, 2 ^a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, em Nova York, 35 1989; ver também Sambrook et al. 3 ed., Cold Spring Harbor Laboratory, em Nova York, (2001)). Embora não seja necessário, em determinadas modalidades, as regiões de polinucleotídeos codificando os anticorpos recombinantes podem ser seqüenciado.

seqüenciamento de DNA podem ser realizados como descrito em Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 74:5463 (1977)) e do Amersham International Handbook seqüenciamento pic, incluindo respectivos melhoramentos a estes.

Em modalidades, por exemplo, os anticorpos recombinantes resultantes ou fragmentos dele são então testados para confirmar sua especificidade original e podem ser testados quanto à especificidade pan, por exemplo, relacionados com agentes infecciosos. Em modalidades particular, um anticorpo identificado ou produzidos de acordo com métodos descritos aqui é testado para matar células através da citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) ou a apoptose e/ou bem como sua capacidade de internalizar.

Polínucleotídeos

A presente invenção, em outros aspectos, prevê composições polinucleotídeo. Em modalidades preferidas, estes polínucleotídeos codificam um polipeptídeo da invenção, por exemplo, uma região de uma cadeia de variáveis de um anticorpo que se liga a Influenza A, M2, ou M2e. Polínucleotídeos da invenção são fita única (codificação ou antisense) ou 15 double-stranded DNA (genômico, cDNA ou sintéticas) ou moléculas de RNA. Moléculas de RNA incluem, mas não limitado a, de moléculas HnRNA, que contêm introns e correspondem a uma molécula de DNA, de forma um-a-um, e moléculas de mRNA, que não contêm introns. Alternativamente, ou adicionalmente, a codificação ou não são sequências codificantes presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção. Além disso, em 20 alternativa, ou além disso, um polinucleotídeo está ligado a outras moléculas e/ou materiais de apoio da invenção. Polínucleotídeos da invenção são usados, por exemplo, em ensaios de hibridização, para detectar a presença de um anticorpo de Influenza A em uma amostra biológica, e na produção recombinante de polipeptídeos da invenção.

Portanto, de acordo com outro aspecto da presente invenção, composições 25 polinucleotídeo são fornecidas que incluem alguns ou todos de uma seqüência de polinucleotídeo estabelecidos no Exemplo 1, complementa de uma seqüência de polinucleotídeo estabelecidos no Exemplo 1, e degeneraras variantes de um polinucleotídea seqüência estabelecida no Exemplo 1. Em certas modalidades preferidas, as seqüências de polinucleotídeo aqui estabelecidos codificam polipeptídeos capazes de ligação de uma 30 célula preferencialmente Influenza A-infectados, em comparação com um controle normal de células não infectadas, incluindo um polipeptídeo tendo uma seqüência de enunciados em exemplos 1 ou 2. Além disso, a invenção inclui todos os polínucleotídeos que codificam nenhum polipeptídeo da presente invenção.

Em outras modalidades relacionados, a invenção apresenta variantes 35 polinucleotídeo ter identidade substancial para as seqüências estabelecidas na Figura 1, por exemplo, aquelas que fazem parte da identidade seqüência de pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75%, 80%, 85%, 90% , identidade de seqüência de 95%, 96%, 97%,

98% ou 99% ou mais, em comparação com uma seqüência de polinucleotídeo desta invenção, tal como determinado usando os métodos descritos neste documento (por exemplo, a análise BLAST usando parâmetros padrão). Um técnico no assunto reconhece que estes valores podem ser adequadamente ajustados para determinar a identidade 5 correspondente de proteínas codificadas por duas seqüências de nucleotídeos, tendo em conta a degeneração codon, a similaridade de aminoácidos, a leitura de posicionamento de quadro, e assim por diante.

Normalmente, as variantes polinucleotídeo contêm uma ou mais substituições, adições, exclusões e / ou inserções, preferivelmente tal que as propriedades ligantes 10 imunogênicas do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo variante não sejam substancialmente diminuídas relativamente a um polipeptídeo codificado por uma sequência polinucleotídeo especificamente aqui apresentado. Em modalidades adicionais, a presente invenção fornece fragmentos polinucleotídeo compreendendo vários comprimentos de trechos contíguos de seqüência idêntica ou complementar a uma ou mais das seqüências 15 aqui divulgadas. Por exemplo, polinucleotídeos são fornecidos por esta invenção que compreende pelo menos cerca de 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 ou 1000 ou mais nucleótidos contíguos de um ou mais dos as seqüências divulgados aqui, bem como todos os comprimentos intermediários há entre eles. Como usado aqui, o termo comprimentos intermediários serve para descrever qualquer comprimento entre os valores 20 cotados, tais como 16, 17, 18, 19, etc; 21, 22, 23, etc, 30, 31, 32, etc .; 50, 51, 52, 53, etc, 100, 101, 102, 103, etc, 150, 151, 152, 153, etc, incluindo todos os inteiros de 200-500, 5001000, e assim por diante .

Em outra modalidade da invenção, as composições são fornecidos polinucleotídeo que são capazes de hibridizar sob condições de severidade moderada a alta para uma 25 seqüência de polinucleotídeo aqui prevista, ou um fragmento da mesma, ou uma seqüência complementar da mesma. Técnicas de hibridização são bem conhecidas no estado da técnica de biologia molecular. Para fins de ilustração, adequadas condições moderadamente rigorosas para testar a hibridização de um polinucleotídeo desta invenção polinucleotídeos com outros incluem pré-lavagem em uma solução de 5 X SSC, SDS 0,5%, 1,0 mM EDTA 30 (pH 8,0); hibridização a 50 ° C- 60 ° C, 5 X SSC, durante a noite, seguido de lavagem por duas vezes em 650C por 20 minutos com cada um de 2X, 0,5X e 0,2X SSC contendo SDS 0,1%. Aquele versado na técnica irá compreender que o rigor da hibridização pode ser facilmente manipulado, tal como alterando o teor de sal da solução de hibridização e / ou da temperatura em que a hibridização é realizada. Por exemplo, em outra modalidade, 35 adequadas condições de hibridização altamente restritivas incluem os descritos acima, com a ressalva de que a temperatura de hibridização é aumentada, por exemplo, a 60-65 °C ou de 65 a 70 °C.

Em modalidades preferidas, o polipeptídeo codificado pela variante ou fragmento de polinucleotídeo tem a mesma especificidade de ligação (ou seja, especificamente ou, preferencialmente, se liga a ao mesmo epítopo ou cepa Influenza A ) como polipeptídeos codificados pelo polinucleotídeo natural. Em certas modalidades preferidas, os polinucleotídeos descrito acima, por exemplo, as variantes polinucleotídeo, fragmentos e seqüências de hibridização, codificam polipeptídeos que possuem um nível de atividade obrigatória de pelo menos cerca de 50%, de preferência pelo menos cerca de 70% e mais de preferência pelo menos cerca de 90 % de que, para uma seqüência de polipeptídeos especificamente nele previstos.

Os polinucleotídeos da presente invenção, ou fragmentos dos mesmos, Índependentemente da duração da seqüência de codificação em si, podem ser combinados com outras seqüências de DNA, tais como os promotores, os sinais de poliadenilação, sítios de enzimas de restrição suplementar, múltiplos sítios de clonagem, com codificação segmentos, e assim por diante, de modo que seu comprimento pode variar consideravelmente. Um fragmento de ácido nucléico de quase todo o comprimento é empregado, com o comprimento total, de preferência sendo limitado pela facilidade de preparação e utilização do protocolo destina-se DNA recombinante. Por exemplo, segmentos ilustrativos polinucleotídeo com um comprimento total de cerca de 10.000, cerca de 5000, cerca de 3000, cerca de 2.000, cerca de 1.000, cerca de 500, cerca de 200, cerca de 100, cerca de 50 pares de base de comprimento, e assim por diante, (incluindo todos os comprimentos intermediários ) estão incluídos em muitas implementações desta invenção.

Será apreciado por aqueles técnicos no assunto que, tal como resultado da degeneração do código genético, existem várias seqüências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo como aqui descritas. Alguns desses polinucleotídeos possuem homologia mínima em relação a seqüência de nucleotídeos de um gene nativo. No entanto, polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo da presente invenção, mas que podem variar devido às diferenças no uso do códon são especificamente contemplados pela invenção. Além disso, os alelos dos genes, incluindo as sequências de polinucleotídeo contidas neste documento estão dentro do escopo da invenção. Alelos são genes endógenos que são alterados como resultado de uma ou mais mutações, tais como rasuras, acréscimos e/ou substituições de nucleotídeos. Os resultantes mRNA e proteína podem, mas não necessariamente, possuir uma estrutura ou função alterada. Alelos podem ser identificados por técnicas convencionais (como a hibridização, ampliação e/ou comparação de seqüências de banco de dados).

Em determinadas modalidades da presente invenção, mutagênese das seqüências de polinucleotídeo divulgado é realizada a fim de alterar uma ou mais propriedades do polipeptídeo codificado, tais como a sua especificidade de ligação ou força vinculativa.

Técnicas de mutagênese são bem conhecidas no estado da técnica, e são amplamente utilizadas para criar variantes de ambos os polipeptídeos e polinucleotídeos. Uma abordagem de mutagênese, tais como mutagênese sítio-específico, é utilizado para a elaboração de variantes e/ou derivados dos polipeptídeos aqui descrito. Por esta 5 abordagem, modificações específicas em uma seqüência de polipeptídeos são feitas através de mutagênese da base polinucleotídeos que os codificam. Estas técnicas fornecem uma abordagem simples para preparar e testar variações de seqüências, por exemplo, incorporando uma ou mais das considerações precedentes, através da introdução de uma ou mais alterações na seqüência de nucleotídeos no polinucleotídeo. A mutagênese sítio10 específico permite a produção de mutantes através da utilização de seqüências de oligonucleotídeos específicas incluem a seqüência de nucleotídeos a mutação desejada, bem como um número suficiente de nucleotídeos adjacentes, para proporcionar uma seqüência de iniciador de tamanho e complexidade suficiente para formar uma seqüência estável duplex em ambos os lados da junção de eliminação a ser percorrida. As mutações 15 são empregadas em uma seqüência de polinucleotídeo selecionada para melhorar, alterar, reduzir, modificar ou alterar as propriedades do polinucleotídeo propriamente, e/ou alterar as propriedades, atividade, composição e estabilidade, ou seqüência primária do polipeptídeo codificado.

Em outras modalidades da presente invenção, as sequências de polinucleotídeos 20 aqui mencionadas são usadas como sondas ou iniciadores de ácido nucléico, por exemplo, tal como iniciadores de PCR. A capacidade de tais sondas de ácidos nucléicos para hibridizar especificamente a uma seqüência de interesse que lhes permitam detectar a presença de seqüências complementares de uma dada amostra. No entanto, outros usos são também abrangidas pela invenção, tal como o uso da informação de seqüência para a 25 preparação de iniciadores espécie mutante, ou iniciadores utilizados na preparação de outras construções genéticas. Como tal, os segmentos de ácido nucléico da invenção que inclui uma regiãa seqüência de pelo menos cerca de 15 nucleotídeos longa seqüência contígua que tem a mesma sequência, ou complementar, a 15 nucleotídeos longa seqüência contígua divulgado aqui é particularmente útil. Mais contígua seqüências 30 idênticas ou complementares, por exemplo, os cerca de 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 (incluindo todos os comprimentos intermédios), incluinda seqüências de comprimento total, e todas as distâncias entre elas, também são usados em determinadas modalidades .

Moléculas polinucleotídeos possuindo regiões de sequência constituídas por trechos contíguos de 10-14, 15-20, 30, 50, ou mesmo de 100-200 nucleotídeos ou menos 35 (incluindo comprimentos intermédios, bem), idênticas ou complementares a uma seqüência de polinucleotídeo divulgados aqui, são particularmente contempladas como sondas de hibridização para uso em, por exemplo, borrão Southern e Northern Norte , e / ou iniciadores para uso em, por exemplo, a reação em cadeia da polimerase (PCR). O tamanho total do fragmento, bem como o tamanho do trecho complementar (es), em última análise, depende do uso pretendido ou aplicação do segmento particular ácido nucleico. Os fragmentos menores são geralmente utilizados em modalidades de hibridização, onde o comprimento da 5 região contígua complementares podem ser variados, tais como entre cerca de 15 e cerca de 100 nucleotídeos, mas estende-se maior complementaridade contíguas podem ser utilizados, de acordo com o comprimento de seqüências complementares que se deseja detectar.

O uso de uma sonda de hibridização de cerca de 15-25 nucleotídeos de comprimento, permite a formação de uma molécula de duplex que é estável e seletiva. Moléculas com seqüências complementares contíguas sobre trechos superiores a 12 bases de comprimento, são geralmente preferidos, embora, a fim de aumentar a estabilidade e seletividade dos híbridos, e assim melhorar a qualidade e o grau de especificidade de moléculas híbridas obtidas. Moléculas de ácido nucléico ter trechos de genes complementares de 15 a 25 nucleotídeos contíguos, ou até maior onde desejado, são geralmente preferidos.

Sondas de hibridização são selecionados a partir de qualquer parte de qualquer uma das seqüências aqui divulgadas. Tudo o que é necessário é pesquisar as seqüências aqui estabelecidas, ou a qualquer parte contínua das seqüências, de cerca de 15-25 20 nucleotídeos de comprimento e incluir a seqüência de comprimento total, que se pretende utilizar como sonda ou iniciador. A escolha do teste e as seqüências de iniciador é regida por vários fatores. Por exemplo, pode-se desejar utilizar a partir de iniciadores para o términos da seqüência total.

Os polinucleotídeos da presente invenção, ou fragmentos ou derivados dos mesmos, são facilmente preparados, por exemplo, diretamente sintetizar o fragmento por meios químicos, tal como é comumente praticada através de um sintetizador de oligonucleotídeos automatizado. Além disso, os fragmentos são obtidos pela aplicação da tecnologia de reprodução de ácidos nucléicos, tais como a tecnologia de PCR ™ Patente US. No. 4683202, através da introdução de seqüências selecionadas em vetores recombinantes para a produção recombinante, e por outras técnicas de DNA recombinante, geralmente conhecido por aqueles técnicos no assunto da biologia molecular.

Vetores, células hospedeiras e métodos de recombinacão

A invenção fornece vetores e células hospedeiras compreendendo um ácido nucléico da presente invenção, bem como as técnicas de recombinação para a produção de 35 um polipeptídeo da presente invenção. Vetores da invenção incluem aqueles capazes de replicação em qualquer tipo de célula ou organismo, incluindo, por exemplo, os plasmídeos, fago, cosmídeos e mini cromossomos. Em várias modalidades, vetores compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção são vetores adequados para reprodução ou replicação do polinucleotídeo, ou vetores adequados para expressar um polipeptídeo da presente invenção. Tais vetores são conhecidos no estado da técnica e disponíveis comercialmente.

Polinucleotídeos da presente invenção são sintetizados, inteiros ou em partes que são então combinadas e inseridas em um vetor usando rotina e técnicas de biologia molecular da célula, incluindo, por exemplo, subclonagem do polinucleotídeo em um vetor linearizado com adequados sítios de restrição e enzimas de restrição. Polinucleotídeos da presente invenção são amplificados pela reação em cadeia da polimerase utilizando iniciadores complementares a cada fita do polinucleotídeo. Estes iniciadores também incluem sítios de restrição da enzima de divagem para facilitar a subclonagem em um vetor. Os componentes do vetor replicável em geral incluem, mas não estão limitados a uma ou mais das seguintes características: uma seqüência de sinais, a origem de replicação, e um ou mais genes ou marcador selecionável.

A fim de expressar um polipeptídeo da presente invenção, as sequências nucleotídicas que codificam o polipeptídeo ou equivalentes funcionais, são inseridas em um vetor de expressão adequado, ou seja, um vetor que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução dos inserida seqüência de codificação. Métodos conhecidos para aqueles técnicos no assunto são usados para construir vetores de expressão contendo seqüências que codificam um polipeptídeo de interesse e de elementos de controle adequados de transcrição e tradução. Estes métodos incluem in vitro de técnicas de DNA recombinante, técnicas de síntese, e na recombinação genética vivo. Tais técnicas são descritas, por exemplo, em Sambrook, J., et ai. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., and Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.

Uma grande variedade de vetor de expressão I sistemas hospedeiros são utilizados para conter e expressar seqüências de polinucleotídeo. Estes incluem, mas não estão limitados a, os microrganismos, tal como bactérias transformadas com o bacteriófago recombinante, plasmídeos ou vetores de expressão cosmid DNA; levedura transformada com os vetores de expressão de levedura, os sistemas de células de inseto infectadas com o vírus vetores de expressão (por exemplo, baculovírus); sistemas de células vegetais transformada com os vetores de vírus de expressão (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou com vetores de expressão bacterianos (por exemplo, ou pBR322 plasmídeos Ti), ou sistemas de células animais. Dentro de uma modalidade, as regiões variáveis do gene expressando um anticorpo 35 monoclonal de interesse são amplificados a partir de uma célula de hibridoma utilizando iniciadores de nucleotídeos. Estes iniciadores são sintetizados por um técnico no assunto, ou podem ser adquiridos a partir de fontes comercialmente disponíveis (ver, por exemplo,

Stratagene (La Jolla, Califórnia), que vende iniciadores para amplificar mouse e regiões variáveis humana. Iniciadores são usados para amplificar regiões cadeia pesada ou leve variável, que são inseridos em vetores, tais como ImmunoZAP ™ ™ H ou ImmunoZAP L (Stratagene), respectivamente. Estes vetores são então introduzidos em E. coli, levedura, ou sistemas de base mamíferos para a expressão. Grande quantidades de uma proteína de cadeia simples, contendo uma fusão dos domínios Vh e Vl são produzidos por esses métodos (ver Bird et al, Science 242:423-426 (1988)).

Os elementos controle ou “sequências regulatórias” presentes em um vetor de expressão são as regiões não-traduzidas do vetor, por exemplo, intensificadores, promotores, regiões não traduzidas 5’ e 3’, que interagem com proteínas celulares hospedeiras para transportar a transcrição e tradução. Tais elementos podem variar na sua força e especificidade. Dependendo do sistema de vetor e hospedeiro utilizado, qualquer número de elementos de transcrição e tradução adequada, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, são utilizados.

Exemplos de promotores adequados para uso com hospedeiros incluem o promotor procariótico phoa, sistemas promotor β-lactamase e lactose, promotor da fosfatase alcalina, o sistema promotor triptofano (trp), promotores e híbridos, tal como o promotor tac. No entanto, outros conhecidos promotores bacterianos são adequados. Promotores para uso em sistemas de bactérias normalmente também contêm uma seqüência de Shine-Dalgarno operavelmente ligado ao DNA que codifica o polipeptídio. promotores induzíveis, tal como o promotor híbrido lacZ do fagemídeo pBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Califórnia) ou PSPORTI plasmídeo (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) e semelhantes são usados.

Uma variedade de seqüências promotoras são conhecidos por qualquer eucariotos e são utilizados de acordo com a presente invenção. Praticamente todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT localizado a cerca de de 25-30 bases a montante do local onde se inicia a transcrição. Outra seqüência encontrada de 70-80 bases a montante a partir do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer um de nucleotídeos. Na extremidade 3’ da maioria dos genes eucarióticos está uma seqüência AATAAA que pode ser o sinal de adição da cauda poli A à extremidade 3' da seqüência de codificação. Todas estas sequências são devidamente inseridas em vetores de expressão eucariótica.

Nos sistemas de células de mamíferos, os promotores provenientes de genes de mamíferos, ou provenientes de vírus de mamíferos são geralmente preferidos. A expressão polipeptídeo provenientes de vetores em células hospedeiras de mamíferos são controladas, por exemplo, pelos promotores obtidos a partir do genoma de vírus como o vírus polioma, vírus da bouba aviária, adenovirus (por exemplo, adenovirus 2), o vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma de influenza aviária, o citomegalovírus (CMV) , um retrovirus, vírus, hepatite B e de preferência mais Simian Virus 40 (SV40), de promotores heterólogos mamíferos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulinas, e dos promotores de choque térmico, desde que os promotores sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira . Se for necessário para gerar uma linhagem de células que contém múltiplas cópias da seqüência que codifica um polipeptídeo de vetores com base em SV40 ou EBV pode ser vantajosamente usado com um marcador adequado selecionável. Um exemplo de um vetor de expressão adequado é pcDNA-3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), que inclui um promotor CMV.

Um número de sistemas de expressão de base viral estão disponíveis para a expressão de mamíferos de polipeptídeos. Por exemplo, nos casos em que o adenovirus é usado como um vetor de expressão, seqüências que codificam um polipeptídeo de interesse pode ser ligada em um adenovirus transcrição / tradução complexo composto pelo promotor tarde e seqüência líder tripartite. Inserção em uma região E1 e E3 não essencial do genoma viral pode ser usado para obter um vírus viável, que é capaz de expressar o polipeptídeo em células hospedeiras infectado (Logan, J. e Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci 81.:36553659). Além disso, intensificadores de transcrição, tais como o estimulador do vírus do sarcoma de Rous (RSV) , pode ser usado para aumentar a expressão em células de mamíferos.

Em sistemas bacterianos, de um sem número de vetores de expressão são selecionados, dependendo do uso pretendido para o polipeptídeo expressa. Por exemplo, quando grandes quantidades são desejados, os vetores que a expressão direta nível elevado de proteínas de fusão que são facilmente purificadas são usados. Tais vetores incluem, mas não estão limitados a, a E. coli multifuncional clonagem e vetores de expressão como BlueScript (Stratagene), no qual a seqüência que codifica o polipeptídio de interesse pode ser ligado no vetor no quadro com as seqüências de amino-terminal Met e subsequentes 7 resíduos de β-galactosidase, de modo que uma proteína híbrida é produzida; vetores PIN (Van Heeke, G. e SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503 5509), e assim por diante. pGEX Vetores (Promega, Madison, Wl) também são utilizados para expressar os polipeptídeos estrangeiros como proteínas de fusão com glutationa Stransferase (GST). Em geral, essas proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas de células lisadas por adsorção glutationa-agarose contas seguido pela eluição na presença de glutationa livre. Proteínas produzidas em tais sistemas são projetados para incluir a heparina, a trombina, ou fator de sítios de divagem da protease XA para que o polipeptídeo clonados de interesse pode ser liberado a partir da fração GST à vontade.

Na levedura Saccharomyces cerevisiae, um número de vetores contendo constitutiva ou induzida promotores, tal como o fator alfa, oxidase de álcool e PGH são usados. Exemplos de outras seqüências de promotor adequado para uso com máquinas de levedura incluem os promotores para 3 - fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, tal como enolase, desidrogenase gliceraldeído-3-fosfato, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutoquinase, isomerase de glucose-6-fosfato, 3 -fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, isomerase triosefosfato, isomerase Fosfoglicose e glucoquinase. Para pesquisa, ver Ausubel et al. (Supra) e Grant et al. (1987) Métodos Enzymol. 153:516-544. Outros promotores de leveduras que são promotores induzíveis possuindo a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento incluem as regiões de promotor da álcool-desidrogenase 2, C isocytochrome, fosfatase ácida, enzimas de degradação associadas com o metabolismo do nitrogênio, metalotioneína, desidrogenase gliceraldeído-3-fosfato e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Adequados vetores e promotores para uso na expressão levedura estão descritos na EP 73657. Potencializadores de levedura também são utilizados vantajosamente com os promotores de levedura.

Nos casos onde vetores de expressão vegetais são usados, a expressão de seqüências que codificam polipeptídeos são conduzidas por qualquer um de um número de promotores. Por exemplo, os promotores virais, tal como promotores 35S e 19S de CaMV são utilizados isoladamente ou em combinação com a seqüência líder omega de TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311). Alternativamente, os promotores de tais instalações como a subunidade menor da RUBISCO ou promotores de choque térmico são utilizados (CORUZZI, G. et al. (1984) EMBO J. 5:1671-1680; Brogue, R. et al (1984) Science 224:838-843, e de Inverno , J„ et al (1991) resulta Probl. Cell Differ. 77:85-105). Estas construções podem ser introduzidas nas células vegetais por transformação direta DNA ou por transfecção patógeno-mediada. Essas técnicas são descritas em um número de pesquisas geralmente disponíveis (ber, por exemplo, Hobbs, S. or Murry, L. E. em McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196).

Um sistema inseto também é usado para expressar um polipeptídeo de interesse. Por exemplo, em um* sistema desse tipo, vírus da poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) é usado como um vetor para expressar genes exógenos em células de Spodoptera frugiperda e em larvas Trichoplusia. As seqüências que codificam os polipeptídeos são clonados em uma região não-essencial do vírus, tal como o gene poliedrin, e colocado sob controle do promotor poliedrin. A inserção bem sucedida da sequência que codifica peptídeo torna o gene poliedrin inativo e produz vírus recombinantes carente de proteína capsidial. Os vírus recombinantes são então utilizados para infectar, por exemplo, as células de S. frugiperda e larvas Trichoplusia, no qual o polipeptídeo de interesse é expresso (Engelhard, ΕΚ et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci 91.:3224-3227 ).

Sinais específicos de iniciação também são utilizados para alcançar tradução mais eficiente das seqüências que codificam um polipeptídeo de interesse. Tais sinais incluem o códon de iniciação ATG e seqüências adjacentes. Nos casos em seqüências que codificam o polipeptídeo, o seu códon de iniciação e seqüências upstream são inseridos no vetor de expressão adequado, sem sinais adicionais de controle transcricional ou translacional pode ser necessária. No entanto, nos casos em que só seqüência de codificação, ou parte dele, é inserida, o controle de translação sinais exógenos, incluindo o códon de iniciação ATG são fornecidos. Além disso, o códon de iniciação está no quadro de leitura correto para garantir a tradução correta do polinucleotídeo inserido. Elementos exógenos de translação e códons de iniciação são de origens diversas, tanto naturais como sintéticos.

A transcrição de um DNA que codifica um polipeptídeo da invenção é frequentemente aumentada pela inserção de uma seqüência de estímulo para o vetor. Muitas seqüências de estímulo são conhecidos, incluindo, por exemplo, aqueles identificados em genes que codificam globina, elastase albumina, α-fetoproteína, e insulina. Normalmente, no entanto, um realçador de um vírus de célula eucariótica é usado. Exemplos incluem o estimulador SV40 no lado final da origem de replicação (bp 100-270), o facilitador do promotor citomegalovírus cedo, o realçador polioma no lado final da origem de replicação, e intensificadores de adenovirus. Veja também Yaniv, Natureza 297:17-18 (1982), relativo aos elementos de reforço para a ativação de promotores eucarióticos. O estimulador é emendado no vetor na posição 5’ou 3' a seqüência de polipeptídeos de codificação, mas de preferência localizado em um sítio 5’ do promotor.

A expressão usada vetores em células hospedeiras eucarióticas (leveduras, fungos, insetos, plantas, animais, humanos ou de células nucleadas de outros organismos multicelulares) normalmente também contêm sequências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização do mRNA. Tais seqüências são comumente disponíveis a partir do 5’ e, ocasionalmente, 3', das regiões não traduzidas dos DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Essas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA do anticorpo de codificação anti-PSCA . Um componente de terminação da transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. Ver WO94/11026 e o vetor de expressão ali revelado.

Células hospedeiras adequadas para a clonagem ou a expressão da DNA nos vetores aqui são procariotos, leveduras, plantas ou mais células eucariotas descrito acima. Exemplos de procariontes adequado para esse fim incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou gram-positivas, por exemplo, Enterobacteriaceae, tal como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enter obacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium , Serratia, por exemplo, marcescans Serratia e Shigella, bem como bacilos, tal como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 4 IP divulgada no DD 266.710 publicado 12 de abril, 1989), Pseudomonas aeruginosa, tais como P. e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli é E. coli

294 (ATCC 31446), embora outras espécies como E. coli B, E. coli XI 776 (ATCC 31537) e E. coli W3110 (ATCC 27325) são adequados. Estes exemplos são ilustrativos, em vez de limitar.

Saccharomyces cerevisiae, ou fermento de padeiro comum, é o mais utilizado entre os menores microorganismos hospedeiras eucarióticas. No entanto, uma série de outros gêneros, espécies e variedades são comumente disponíveis e utilizados aqui, tal como Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces hospedeiros como, por exemplo, lactis K, K.fragilis (ATCC 12424), bulgaricus K. (ATCC 16045), K wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), thermotolerans K. e K. Marxianus; Yarrowia (PE 402.226); Pichia pastoris. (PE 183.070); Candida; Trichoderma reesia (PE 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como occidentalis Schwanniomyces e fungos filamentosos, tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e hospedeiros, tal como Aspergillus nidulans e A. niger, A.

Em certas modalidades, a linhagem de uma célula hospedeira é escolhido por sua capacidade de modular a expressão das seqüências inseridas ou para processar a proteína expressa na forma desejada. Tais modificações do polipeptídeo incluem, mas não estão limitados a, acetilação, carboxilação. glicosilação, fosforilação, lipidation e acilação. processamento pós-translacionais que cliva uma forma prepro da proteína também é usada para facilitar a inserção correta, dobra e/ou função. Diferentes células hospedeiras, tal como CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293 e WI38, que possuem maquinário celular específico e mecanismos característicos para tais atividades pós-traducionais, são escolhidos para garantir a correta modificação e transformação da proteína estranha.

Métodos e reagentes especificamente adaptados para a expressão de anticorpos ou fragmentos dele são igualmente conhecidos e disponíveis no estado da técnica, incluindo os descritos, por exemplo, nas Patentes US. Nos. 4816567 e 6331415. Em várias modalidades, as cadeias pesadas e leves de anticorpos, ou fragmentos dos mesmos, são expressos os vetores de expressão ou mesmo separados. Em uma modalidade, ambas as cadeias são expressas na mesma célula, facilitando a formação de um anticorpo ou fragmento funcional do mesmo.

Anticorpo de comprimento completo, fragmentos anticorpo, e proteínas de fusão de anticorpo são produzidos em bactérias, em particular quando glicosilação e função efetora Fc não são necessários, tal como quando o anticorpo terapêutico é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, uma toxina) e o immunoconjugado propriamente, demonstra eficácia na destruição das células infectadas. Para a expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, ver, por exemplo, as Patentes US. Nos 5648237, 5789199 e 5840523, que descreve a região de iniciação de tradução (TIR) e as seqüências de sinais para otimizar a expressão e secreção. Depois da expressão, o anticorpo é isolado da massa de células de E. coll em uma fração solúvel e pode ser purificado através de, por exemplo, uma coluna de proteína A ou G, dependendo do isotipo. Final de purificação pode ser realizado através de um processo similar ao utilizado para a purificação de anticorpos expressa, por exemplo, em células CHO.

Células hospedeiras adequadas para expressão de polipeptídeos glicosilados e anticorpos são provenientes de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem plantas e células de inseto. Numerosas cepas baculovirais e variantes e correspondentes células hospedeiras permissivas de insetos a partir de hospedeiros, tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopicius (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori foram identificados. Uma variedade de cepas virais de perfeição trans estão disponíveis ao público, por exemplo, a variante L1 de Autographa californica NPV e a linhagem Bm-5 de Bombyx mori NPV, e os vírus são utilizados como o vírus aqui de acordo com a presente invenção, em particular para a transfecção de células Spodopterafrugiperda. culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco também são utilizados como hospedeiros.

Os métodos de propagação de polipeptídeos de anticorpos e seus fragmentos em células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) são abrangidos pela invenção. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos utilizadas nos métodos da invenção são de rim de macaco linhagem CV1 transformado por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (293 ou 293 células subclonadas para o crescimento em cultura de suspensão, Graham et al, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10), células de ovário de hamster chinês /-DHFR (CHO, Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)), células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70), células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL1587), células de carcinoma cervical (HELA, ATCC CCL 2), células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34), células de fígado de rato de búfala (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células do pulmão (W138, ATCC CCL 75 ), células de fígado humano (Hep G2, HB 8065), tumor mamário em camundongos (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRL (Mather et al, Anais NY. Acad. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4, e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

Células hospedeiras são transformadas com a expressão acima descrita ou por vetores de clonagem para a produção de polipeptídeo e cultivado em meios de cultura convencional modificado, adequado para incentivar os promotores, a seleção de transformantes, ou ampliando os genes que codificam as seqüências desejadas.

Para a produção de longo prazo, de alta produção de proteínas recombinantes, a expressão estável é geralmente preferida. Por exemplo, linhagens de células que expressam de forma estável um polinucleotídeo de interesse são transformadas usando vetores de expressão que contém as origens da replicação viral e/ou elementos endógenos e expressão de um gene marcador selecionável no mesmo ou em um vetor separado. Na sequência da introdução do vetor, as células podem crescer por 1-2 dias em meio enriquecido antes que eles estão ligados a meios seletivos. A finalidade do marcador de selecção consiste em conferir resistência à seleção, sua presença e permite o crescimento e recuperação de células que expressam o êxita sequências introduzidas, clones resistentes de células estavelmente transformadas são proliferaram através de técnicas de cultura de tecido adequadas para o tipo de célula.

Uma pluralidade de sistemas de seleção é usada para recuperar linhagens de células transformadas. Estes incluem, mas não estão limitados a, o herpes simplex vírus da timidina quinase (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) e fosforibosiltransferase adenina (Lowy, I. et al. (1990) Cell 22: 817-23) os genes que são empregados em células tk’ou aprT, respectivamente. Além disso, a resistência a antimetabólitos, antibióticos ou resistência a herbicida é usada como base para a selecção, por exemplo, dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler, M. et al . (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. 77:3567 - 70); npt, que confere resistência aos aminoglicosídeos, neomicina e G-418 (Colbere-Garapin, F. et α /. (1981) J. Mol . Biol. 750:1-14) e ais ou pat, que confere resistência à fosfinotricina acetiltransferase e chlorsulfuron, respectivamente (Murry, supra). Adicionais genes selecionáveis foram descritos. Por exemplo, trpB permite que as células utilizem indol no lugar de triptofano, e hisD permite que as células utilizem histinol no lugar de histidina (Hartman, SC e RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 55:8047-51). O uso de marcadores visíveis ganhou popularidade com marcadores, tais como antocianinas, beta-glucuronidase e GUS seu substrato, e luciferase e seu substrato luciferina, sendo amplamente usada não apenas para identificar transformantes, mas também para quantificar a quantidade a expressão transiente ou estável da proteína atribuível a um sistema vetor específico (Rhodes, CA et al . (1995) Métodos de Mol. Biol. 55:121-131).

Embora a presença / ausência de expressão de gene marcador sugere que o gene de interesse também está presente, a sua presença e de expressão, é confirmada. Por exemplo, se a seqüência codificando um polipeptídeo é inserida dentro de uma seqüência de gene marcador, células recombinantes contendo seqüências são identificados pela ausência de função do gene marcador. Alternativamente, um gene marcador é colocado em paralelo com uma seqüência de polipeptídeos de codificação sob o controle de um único promotor. Expressão do gene marcador em resposta a indução ou a seleção geralmente indica a expressão do gene tandem também. Alternativamente, células hospedeiras que contêm e expressam uma seqüência de polinucleotídeos desejados são identificadas por uma variedade de procedimentos conhecidos pelos técnicos no assunto. Estes procedimentos incluem, mas não estão limitados a, técnicas de hibridizações DNA-DNA ou DNA-RNA e de bioensaio ou imunoensaio de proteína que incluem, por exemplo, tecnologias de base membrana, solução, ou tecnologias de chip para detecção e/ou quantificação de ácidos nucléicos ou de proteínas .

Uma variedade de protocolos para detectar e medir a expressão dos produtos polinucleotídeo-codificados, usando anticorpos policlonais ou monoclonais específicos para o produto são conhecidas pela técnica. Exemplos não limitantes incluem ensaio imunosorvente enzima-ligados (ELISA), radioimunoensaio (RIA), e fluorescência de separação de células ativadas (FACS). Um imunoensaio de base monoclonal de dois sítios que utiliza anticorpos monoclonais reativos a dois epítopos não interferentes em um dado polipeptídeo é preferido para algumas aplicações, mas um ensaio de ligação competitiva também pode ser utilizado. Estes e outros ensaios são descritos, entre outros lugares, em Hampton, R. et al. (1990; métodos sorológicos, um manual de laboratório, APS Press, São Paulo. Minnesota) e Maddox, DE et al (1983; J. Exp. Med. 755:1211-1216).

Diversos rótulos e técnicas de conjugação são conhecidos por aqueles técnicos no assunto e são usados em vários ácidos nucléicos e ensaios de aminoácidos. Meios de produção marcado hibridização ou sondas PCR para detectar seqüências relacionadas a polinucleotídeos incluem oligo-marcação, tradução nick, marcação final ou amplificação de PCR usando um nucleotídeo marcado. Alternativamente, as seqüências, ou qualquer parte dele são clonados em um vetor para a produção de uma sonda de mRNA. Tais vetores são conhecidos pela técnica, estão disponíveis comercialmente, e são usados para sintetizar as sondas de RNA in vitro, a adição de uma RNA polimerase adequadas, tais como T7, T3, ou SP6 e nucleótidos marcadas. Estes procedimentos são realizados utilizando uma variedade de kits disponíveis comercialmente. Moléculas mensageiras adequadas ou etiquetas, que são utilizados incluem, mas não estão limitados a, radionuclídeos, enzimas fluorescentes, quimioluminescência ou agentes cromogênicos, bem como substratos, cofatores, inibidores, partículas magnéticas, e assim por diante.

O polipeptídeo produzido por uma célula recombinante é segregado ou contido intracelularmente dependendo da seqüência e / ou do vetor utilizado. Vetores de expressão contendo polinucleotídeos da invenção são projetados para conter as seqüências de sinais que direcionam a secreção do polipeptídeo codificado através de uma membrana celular procariótica ou eucariótica.

Em certas modalidades, um polipeptídeo da invenção é produzido como um polipeptídeo de fusão, inclusive com um domínio polipeptídeo que facilita a purificação de proteínas solúveis. Tal purificação de facilitar domínios incluem, mas não estão limitados a, peptídeos quelantes metálicos, tais como módulos de histidina-triptofano, que permitem a purificação de metais imobilizados, domínios proteína que permitem uma purificação de imunoglobulina imobilizada, e o domínio utilizado no sistema de purificação extensão FLAGS/afinidade (Amgen, Seattle, WA). A inclusão de seqüências articulador clivável tais como aqueles específicos para o fator Xa ou enteroquinase (Invitrogen. San Diego, CA) entre o domínio e purificação do polipeptídeo codificado são utilizados para facilitar a depuração. Um vetor de expressão exemplar prevê expressão de uma proteína de fusão contendo um polipeptídeo de interesse e um ácido nucléico codificando 6 resíduos de histidina que antecedem a tioredoxin ou um sítio de divagem enteroquinase. Os resíduos de histidina facilitam a purificação em IMIAC (cromatografia de afinidade iônica metal imobilizado), conforme descrito no Porath, J. et al. (1992, Prot. Exp. Purif. 5:263-281), enquanto o sítio de divagem enteroquinase fornece um meio para purificar o polipeptídeo desejado a partir da proteína de fusão. A discussão de vetores usados para a produção de proteínas de fusão é fornecido em Kroll, DJ et al. (1993; DNA Cell Biol. 72:441-453).

Em certas modalidades, um polipeptídeo da presente invenção é fundido com um polipeptídeo heterólogo, que pode ser uma seqüência de sinal ou outro polipeptídeo tendo uma divagem específica no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeo. A seqüência de sinal heteróloga selecionada de preferência é aquela que é reconhecida e processada (ou seja, clivada por uma peptidase sinal) pela célula hospedeira. Para as células hospedeiras procariótico, a seqüência de sinal é selecionada, por exemplo, do grupo da fosfatase alcalina, penicilinase, 1 pp ou líderes enterotoxina II termicamente estáveis. Para a secreção de levedura, a seqüência de sinal é selecionada, por exemplo, do líder da invertase de levedura, líder do fator α (incluindo Saccharomyces e Kluyveromyces de líderes factor), ou do líder da fosfatase ácida, do líder da C.albicans, ou do sinal descrito no WO 90 / 13646. Na expressão de células de mamíferos, sequências de sinal de mamíferos bem como lideres secretores virais, por exemplo, o sinal gD do herpres simplex, são disponíveis.

Ao usar técnicas de recombinação, o polipeptídeo ou anticorpo é produzido intracelularmente, no espaço periplásmico, ou diretamente secretados para o meio. Se o polipeptídeo ou anticorpo é produzido intracelularmente, tal como um primeiro passo, de partículas de detritos, ou células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Carter et al. Bio / Technology 10:163-167 (1992) descrevem um procedimento para isolar anticorpos que são secretados para o espaço periplásmico de E. coli. Resumidamente, pasta celular é descongelado na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) durante cerca de 30 min. Restos celulares são removidos por centrifugação. Sempre que o polipeptídeo ou anticorpo é secretado no meio, sobrenadantes dos sistemas de expressão, são geralmente primeiramente concentrados utilizando um filtro de concentração de proteínas comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore

Pellicon. Opcionalmente, um inibidor de protease PMSF como está incluído em nenhuma das etapas anteriores para inibir a proteólise e antibióticos são inclusos para impedir o crescimento de contaminantes acidentais.

O polipeptídeo anticorpo ou composição preparada a partir de células são purificadas, utilizando, por exemplo, cromatografia em hidroxiapatita, eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, cromatografia de afinidade com a técnica de purificação sendo preferido. A adequação de proteína A como lígante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc da imunoglobulina, que está presente no polipeptídeo ou anticorpos. A proteína é usada para purificar os anticorpos ou fragmentos dos mesmos, que são baseados em cadeias pesadas humanas γ1 , γ2 ou γ4 (Lindmark et ah, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). Proteína G é recomendado para todos os isotipos mouse e γ3 humano (Guss et ah, EMBO 5:15671575 J. (1986)). A matriz em que o lígante de afinidade é anexado é na maioria das vezes agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como o vidro de porosidade controlada ou poli (styrenedivinil) benzeno para permitir taxas de fluxo mais rápido e menor tempo de processamento que pode ser alcançado com agarose. Sempre que o polipeptídeo ou anticorpo compreende um domínio CH3 , a resina ABX Bakerbond resina ™ (JT Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para a purificação. Outras técnicas de purificação de proteínas, tais como fracionamento em coluna de troca iônica, precipitação do ethanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em silica, cromatografia em Sepharose cromatografia de heparina ™ em um ânion ou resina de troca catiônica (tais como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocalização, SDS-PAGE, e precipitação de sulfato de amônio também estão disponíveis, dependendo do polipeptídeo ou anticorpo para ser recuperado. Em seguida a qualquer etapa de purificação preliminar (s), a mistura compreendendo o polipeptídeo anticorpo ou contaminantes de interesse e estão sujeitos a baixos valores de pH de cromatografia de interação hidrofóbica utilizando um tampão de eluição em um pH entre cerca de 2,5-4,5, de preferência, realizada em baixas concentrações de sal (por exemplo, sal de cerca de 0 a 0,25 M).

Composições farmacêuticas

A invenção também inclui formulações farmacêuticas incluindo um polipeptídeo, anticorpo ou modulador da presente invenção, a um grau desejado de pureza, e um transportador farmaceuticamente aceitável, excipiente, ou estabilizador (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). Em certas modalidades, formulações farmacêuticas estão preparados para aumentar a estabilidade do polipeptídeo anticorpo ou durante o armazenamento, por exemplo, sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. veículos Aceitável, excipientes ou estabilizadores são tóxicos para os pacientes nas dosagens e concentrações utilizadas, e incluem, por exemplo, tampões, tais como acetato de Tris, fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos, incluindo antioxidantes ácido ascórbico e metionina; conservantes (como octadecildimetilbenzil cloreto de amônio, cloreto hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetónio, álcool, fenol ou butil benzílico; parabens alquila tais como metil ou propilparabeno, catecol, ciclohexanol, resorcinol, 3-pentanol, e m-cresol), de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos) polipeptídeos, proteínas, tal como albumina, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos como a glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina ou, monossacarídeos, dissacarídeos e outros hidratos de carbono, incluindo glicose, manose, ou dextrina, agentes quelantes como EDTA; tonicifiers como trealose e cloreto de sódio, açúcares como a sacarose, manitol, sorbitol e trealose; tensoativo como polisorbato; -sal formando contra-íons, tal como sódio, complexos metálicos ( por exemplo, complexos de proteína-Zn) e / ou de superfície não iónicos, tal como TWEEN ™, PLURONICS ou polietileno glicol (PEG). Em certas modalidades, a formulação terapêutica de preferência compreende o polipeptídeo ou anticorpo em uma concentração entre 500-200 mg / ml, de preferência entre 10-100 mg / mL.

As formulações aqui também contêm um ou mais agentes terapêuticos adicionais adequados para o tratamento da indicação particular, por exemplo, infecção a ser tratada, ou para evitar efeitos colaterais indesejáveis. Preferencialmente, o agente terapêutico adicional tem uma atividade complementar ao polipeptídeo ou anticorpo a ressentir-se da invenção, e os dois não prejudicam uns aos outros. Por exemplo, para além do polipeptídeo ou anticorpo da invenção, um anticorpo adicional ou segundo, o agente anti-viral do agente anti-infeccioso e/ou cardioprotetor é adicionado à formulação. Tais moléculas estão adequadamente presentes na formulação farmacêutica em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida.

Os ingredientes ativos, por exemplo, polipeptídeos e anticorpos da invenção e outros agentes terapêuticos, também preso em microcápsulas preparados, por exemplo, técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, idroxymetilcellulose ou gelatina, as microcápsulas e polimetilmetacilate) microcápsulas , respectivamente, nos sistemas de distribuição de drogas coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgados no Remingion de Ciências Farmacêuticas 16 ^a edição, Osol, A. Ed. (1980).

Preparações de liberação sustentada são preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem, mas não estão limitados a, matrizes semipermeável de sólidos polímeros hidrofóbicos contendo o anticorpo, que as matrizes são na forma de artigos em forma, por exemplo, os filmes, ou microcápsulas. Exemplos não limitantes de matrizes de liberação prolongada inclui poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli (2-hidroxietil metacrilato) ou poli (vinil)alcool)), polilactides (Patente US. No. 3773919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etílico -L-glutamato, não-degradável etileno-acetato de vinila, copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico, tal como o LUPRON DEPOT ™ (injetável composto de microesferas de copolímero de ácido lático, ácido glicólico e acetato de leuprolide), e ácido poli-D-(-) -3 - hidroxibutírico.

Formulações para ser usado na administração vivo são preferivelmente estéreis. Isto é facilmente realizada por filtração através de membranas de filtração estéril.

Usos Diagnóstico

Anticorpos e seus fragmentos, e composições terapêuticas, da invenção especificamente se ligam ou preferencialmente se ligam a células ou tecidos infectados, em comparação às células controle normal e tecido. Assim, esses anticorpos da influenza A são usados para detectar células ou tecidos infectados em um paciente, amostra biológica, ou população de células, utilizando qualquer uma de uma variedade de métodos diagnósticos e prognósticos, incluindo as aqui descritas. A capacidade de um anticorpo anti-M2e específicos para detectar células infectadas depende da sua especificidade de ligação, que é facilmente determinada através de testes a sua capacidade de se ligar às células ou tecidos infectados obtidos de indivíduos diferentes, e / ou de pacientes infectados com cepas de influenza A. Métodos de diagnóstico geralmente envolvem contatar uma amostra biológica obtida a partir de um paciente, como, por exemplo, sangue, soro, saliva, urina, escarro, swab de células de uma amostra, ou uma biópsia do tecido, com influenza A, por exemplo, o anticorpo HuM2e e determinar se o anticorpo se liga a preferencialmente a amostra em comparação com uma amostra de controle ou predeterminado valor de corte, indicando desse modo a presença de células infectadas. Em modalidades particulares, pelo menos, duas vezes, três vezes, ou cinco vezes mais anticorpos HuM2e se liga a a uma célula infectada, em comparação a um controle adequado de células normais ou amostra de tecido. Um valor predeterminado de corte é determinado, por exemplo, pela média da quantidade de anticorpo HuM2e que se liga a várias diferentes amostras de controle adequadas, nas mesmas condições utilizadas para efetuar o teste de diagnóstico da amostra biológica que está sendo testada.

O anticorpo ligado é detectado através de procedimentos aqui descritos e conhecidos pela técnica. Em certas modalidades, os métodos de diagnóstico da invenção são praticados utilizando anticorpos HuM2e que são conjugados a uma marcação detectável, por exemplo, um fluoróforo, para facilitar a detecção de anticorpos ligados. No entanto, eles também são praticados através de métodos de detecção secundária do anticorpo HuM2e. Estas incluem, por exemplo, RIA, ELISA, precipitação, aglutinação, fixação de complemento e imunofluorescência.

Em certos procedimentos, os anticorpos HuM2e são rotulados. O rótulo é detectado diretamente. Rótulos representativos que são detectados diretamente incluem, mas não estão limitados a, rádio-etiquetas efluorcromos. Em alternativa, ou além disso, os rótulos são frações, tal como enzimas, que devem ser reagido ou derivatizados para serem detectados. Exemplos não limitantes de rótulos de isótopos são 99Tc, 14C, 1311, 1251, 3H, 32P e 35S. Materiais fluorescentes que são usadas incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, e seus derivados de fluoresceína, rodamina e seus derivados, auramina, dansil, umbelliferone, Luciferia, 2,3-diidrophthalazinediones, peroxidase, fosfatase alcalina, lisozima e glicose desidrogenase de 6-fosfato.

Uma etiqueta enzima é detectada por qualquer das atualmente utilizadas técnicas colorimétrica, espectrofotométrica, fluorospectro-fotométrico ou gasométricas. Muitas enzimas que são utilizadas nestes procedimentos são conhecidas e utilizadas pelos métodos da invenção. Exemplos não limitantes são peroxidase, fosfatase alcalina, βglucuronidase, β-D-glicosidase, β-D-galactosidase, urease, glicose oxidase mais peroxidase, galactose oxidase mais peroxidase e fosfatase ácida.

Os anticorpos são marcados com tais rótulos através de métodos conhecidos. Por exemplo, agentes de acoplamento, tal como aldeídos, carbodiimidas, dimaleimida, imidatos, succinimidas, benzadina bi-diazotada e semelhantes são usados para marcar os anticorpos fluorescentes com os acima descritos rótulos de quimioluminescência e etiquetas enzima. Uma enzima é tipicamente combinada com um anticorpo usando moléculas de transição, tal como carbodiimidas, periodato, diisocianatos, glutaraldeído e outros. Várias técnicas de marcação por rótulo estão descritas em Morrison, Methods in Enzymology 32b, 103 (1974), Syvanen et al, J. Biol. Chem. 284, 3762 (1973) and Bolton and Hunter, Biochem J. 133, 529(1973).

Antics HuM2e anticorpos da presente invenção são capazes de diferenciar entre pacientes com e pacientes sem infecção por influenza A, e determinar se um paciente tem uma infecção, utilizando-se o representante ensaios previsto. De acordo com um método, uma amostra biológica é obtido de um paciente com suspeita ou conhecida por ter uma infecção por vírus influenza A. Em modalidades preferidas, a amostra biológica inclui as células do paciente. A amostra é contactado com um anticorpo HuM2e, por exemplo, por um tempo e sob condições suficientes para permitir que o anticorpo HuM2e para ligar às células infectadas presentes na amostra. Por exemplo, a amostra é contactada com um anticorpo HuM2e por 10 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 6 horas, 12 horas, 24 horas, três dias ou em qualquer ponto entre eles. A quantidade de anticorpos HuM2e ligada é determinada e comparada com um valor de controle, que pode ser, por exemplo, um valor predeterminado ou um valor determinado a partir de amostra de tecido normal. Um aumento da quantidade de anticorpo ligado à amostra do paciente em relação à amostra de controle é indicativo da presença de células infectadas na amostra do paciente.

Em um método relacionado, uma amostra biológica obtida a partir de um paciente é contatado com um anticorpo HuM2e por um tempo e sob condições suficientes para permitir ao anticorpo a se ligar a células infectadas. O anticorpo ligado é então detectado, e a presença do anticorpo ligado indica que a amostra contém células infectadas. Esta modalidade é particularmente útil quando o anticorpo HuM2e não se liga a células normais em um nível detectável. Diferentes anticorpos HuM2e possuem diferentes características e especificidade de ligação. Dependendo dessas características, por exemplo, anticorpos HuM2e são usados para detectar a presença de uma ou mais cepas de influenza A. Por exemplo, alguns anticorpos se ligam especificamente a apenas uma ou várias cepas do virus influenza, enquanto outros se ligam a todos ou à maioria das diferentes linhagens do vírus Influenza. Os anticorpos específicos para uma única cepa de Influenza A são usados para identificar a linhagem de uma infecção.

Em certas modalidades, os anticorpos que se ligam a uma célula infectada preferentemente gera um sinal indicando a presença d© uma infecção em pelo menos cerca de 20% dos pacientes com a infecção sendo detectada, mais preferivelmente em pelo menos cerca de 30% dos pacientes. Em alternativa, ou além disso, os anticorpos que gera um sinal negativo, indicando a ausência da infecção em pelo menos cerca de 90% dos indivíduos sem a infecção sendo detectada. Cada anticorpo satisfaz os critérios acima, no entanto, os anticorpos da presente invenção são usados em conjunto para melhorar a sensibilidade.

A presente invenção também inclui kits úteis na realização de ensaios de diagnóstico e prognóstico com os anticorpos da presente invenção. Kits da invenção incluem um recipiente adequado, compreendendo um anticorpo HuM2e da invenção com ou sem rótulo. Além disso, quando o anticorpo é fornecido de forma marcada adequada para um ensaio indireto de ligação, o kit inclui ainda os reagentes para a realização do ensaio apropriado indiretos. Por exemplo, o kit inclui um ou mais recipientes adequados, incluindo os substratos da enzima ou agentes derivados, dependendo da natureza do rótulo. As amostras de controle e/ou instruções também estão incluídas.

Usos Terapêuticos / Profiláticos

A imunização passiva tem provado ser uma estratégia eficaz e segura para a prevenção e o tratamento de doenças virais. (Veja Keller et al. Clin. Microbiol. Rev. 13:60214 Casadevall (2000);, Nat. Biotechnol. 20:114 (2002), Shibata et al. Nat. Med. 5:204-10 ( 1999) e Igarashi et al. Nat. Med. 5:211-16 (1999), cada um dos quais são aqui incorporadas por referência)). A imunização passiva com anticorpos monoclonais humanos proporcionar uma estratégia de tratamento imediato para a profilaxia de emergência e tratamento de influenza.

Anticorpos HuM2e e fragmentos dos mesmos, e composições terapêuticas, da invenção ou, preferencialmente, se ligam especificamente se ligam a células infectadas, em relação ao controle normal de células não infectadas e tecidos. Assim, esses anticorpos HuM2e são usados para alvejar seletivamente as células ou tecidos infectados de um paciente, amostra biológica, ou população de células. À luz das propriedades de ligação infecção-específicas, desses anticorpos, a presente invenção fornece métodos de regular (por exemplo, inibir) o crescimento de células infectadas, métodos de aniquilar células infectadas, e métodos de indução de apoptose das células infectadas. Estes métodos incluem contatar m uma célula infectada com um anticorpo HuM2e da invenção. Estes métodos são praticados in vitro, ex vivo e in vivo.

Em várias modalidades, os anticorpos da invenção são intrinsecamente terapeuticamente ativo. Alternativamente, ou em complemento, os anticorpos da invenção são conjugados a um agente citotóxico ou agente inibidor de crescimento, por exemplo, um radioisótopo ou toxina, que é usado no tratamento de células infectadas ou ligados contactado pelo anticorpo.

Em uma modalidade, a invenção fornece métodos de tratar ou prevenir a infecção em um paciente, incluindo as etapas de fornecer um anticorpo HuM2e da invenção de um paciente diagnosticado com, no risco de desenvolvimento ou com suspeita de infecção de influenza A . Os métodos da invenção são usados no tratamento de primeira linhagem da infecção, acompanhamento, tratamento ou no tratamento de uma infecção recorrente ou refratário. O tratamento com um anticorpo da invenção é um tratamento autônomo. Alternativamente, o tratamento com um anticorpo da invenção é um componente ou fase de um regime de terapia combinada, em que um ou mais agentes terapêuticos adicionais também são usados para tratar o paciente.

Indivíduos com risco para uma doença relacionada com vírus influenza ou distúrbios incluem os pacientes que entram em contato com uma pessoa infectada ou que tenham sido expostos ao vírus influenza de alguma outra forma. A administração de um agente profilático pode ocorrer antes da manifestação dos sintomas característicos da doença do vírus influenza-relacionadas ou desordem, de tal forma que uma doença ou distúrbio é impedida ou, alternativamente, atraso na sua progressão.

Em vários aspectos, a huM2e é administrada substancialmente simultaneamente com ou após a infecção do indivíduo, ou seja, o tratamento terapêutico. Em outro aspecto, o anticorpo fornece um benefício terapêutico. Em vários aspectos, um benefício terapêutico inclui a redução ou a diminuição da progressão, gravidade, frequência, duração ou a probabilidade de um ou mais sintomas ou complicações de uma infecção por influenza, vírus título, a replicação do vírus ou uma quantidade de uma proteína viral de uma ou mais cepas da influenza, ainda um outro aspecto, um benefício terapêutico inclui apressar ou acelerar a recuperação de um indivíduo da infecção por influenza.

Métodos para prevenir um aumento da titulação do vírus influenza, a replicação do vírus, a proliferação de vírus ou uma quantidade de uma proteína viral da influenza em um indivíduo ainda são fornecidos. Em uma modalidade, um método inclui administrar ao indivíduo uma quantidade de um anticorpo huM2e eficaze para evitar um aumento da titulação do vírus influenza, a replicação do vírus ou de uma quantidade de uma proteína viral influenza de uma ou mais cepas ou isolados influenza no indivíduo.

Métodos de protecção de um objecto de uma infecção ou diminuindo a susceptibilidade a um indivíduo a infecção por uma ou mais cepas de influenza / ou subtipos isolados, ou seja, métodos profiláticos, são também fornecidos. Em uma modalidade, um método inclui administrar ao indivíduo uma quantidade de anticorpo huM2e que especificamente se liga a influenza M2 efetiva para proteger o indivíduo da infecção, ou efetiva para reduzir a suscetibilidade do indivíduo à infecção, por um ou mais cepas/isolados de influenza ou subtipos .

Opcionalmente, o indivíduo é adicionalmente administrado com um segundo agente, tal como, mas não limitado a, um anticorpo contra o vírus influenza, uma droga antiviral, tal como um inibidor da neuraminidase, um inibidor da HA, um inibidor do ácido siálico ou inibidor do canal iônico da M2, um inibidor da entrada viral ou um inibidor da fixação viral. O inibidor de canal iônico da M2 é por exemplo a amantadina ou rimantadina. O inibidor de neuraminidase é por exemplo zanamivir ou o fosfato de oseltamivir.

Sintomas ou complicações da infecção por influenza que pode ser reduzida ou diminuída incluem, por exemplo, calafrios, febre, tosse, dor de garganta, congestão nasal, congestão nasal, infecção nasal, sinusite, dor no corpo, dor de cabeça, fadiga, pneumonia , bronquite, infecção no ouvido dor de ouvido, ou a morte.

Para tratamento in vivo de pacientes humanos e não humanos, o paciente é geralmente administrado ou provido com uma formulação farmacêutica que inclui um anticorpo HuM2e da invenção. Quando usado no tratamento in vivo, os anticorpos da invenção são administrados ao paciente em quantidades terapeuticamente eficazes (isto é, as quantias que eliminar ou reduzir a carga viral do paciente). Os anticorpos são administradas a um paciente humano, de acordo com métodos conhecidos, tais como a administração intravenosa, por exemplo, tal como um bolus ou por infusão contínua durante um período de tempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerobrospinal, subcutânea, intra-articular, intra-sinovial, vias intratecal, oral, tópica, ou inalação. Os anticorpos podem ser administrados por via parentérica, quando possível, no local da célula de destino, ou por via intravenosa. A administração intravenosa ou subcutânea do anticorpo é preferido em determinadas modalidades, composições terapêuticas da invenção são administradas a um paciente ou indivíduo de forma sistêmica, por via parenteral, ou localmente.

Para a administração parenteral, os anticorpos são formulados em uma unidade de dosagem forma injetável (solução, suspensão emulsão), em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável, parenteral. Exemplos de tais veículos são a água, soro fisiológico, solução de Ringer, solução de dextrose, e 5% de albumina de soro humano, veículos não aquosos, tais como óleos fixos e oleato de etila também são usados. Os lipossomas são utilizados como portadores. O veículo contém pequenas quantidades de aditivos, tais como substâncias que melhoram isotonicidade e estabilidade química, por exemplo, , Amortecedores e conservantes. Os anticorpos são geralmente formulados em tais veículos, em concentrações de aproximadamente 1 mg / mL a 10 mg / mL.

A dose e posologia depende de uma variedade de fatores facilmente determinada por um médico, tais como a natureza da infecção e das características do agente especial, agente citotóxico ou inibidor de crescimento conjugado ao anticorpo (quando utilizado), por exemplo, seu índice terapêutico, o paciente, e a história do paciente. Geralmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo é administrado a um paciente. Em modalidades, por exemplo, a quantidade de anticorpos é administrada no intervalo de cerca de 0,1 mg / kg a 50 mg / kg de peso corporal do paciente. Dependendo do tipo e gravidade da infecção, cerca de 0,1 mg / kg a 50 mg / kg de peso corporal (por exemplo, cerca de 0,115 mg / kg / dose), da dosagem de anticorpos é um candidato inicial para a administração ao paciente, se , por exemplo, por uma ou mais administrações distintas, ou por infusão contínua. O progresso dessa terapia é facilmente controlada por métodos convencionais e ensaios e com base em critérios conhecidos para o médico ou outros técnicos no assunto.

Em uma modalidade particular, uma immunoconjugate incluindo o conjugado anticorpo com um agente citotóxico é administrado ao paciente. Preferencialmente, o immunoconjugate é internalizado pela célula, resultando em aumento da eficácia terapêutica do immunoconjugate em matar a célula a que se vincula. Em uma modalidade, os objetivos citotóxico ou interfere com o ácido nucléico na célula infectada. Exemplos de tais agentes citotóxicos estão descritos acima e incluem, mas não estão limitados a, maitansinóides, calicheamicinas, ribonucleases e endonucleases DNA.

Outros esquemas terapêuticos são combinados com a administração do anticorpo HuM2e da presente invenção. A administração combinada inclui a co-administração, utilizando formulações distintas ou uma única formulação farmacêutica e da administração consecutivos em qualquer ordem, de preferência onde existe um período de tempo, enquanto ambos (ou todos os agentes) que trabalham simultaneamente exercer suas atividades biológicas. Preferencialmente, tais resultados combinados de terapia a um efeito terapêutico sinérgico.

Em certas modalidades, é desejável combinar a administração de um anticorpo da invenção com um outro anticorpo dirigido contra um outro antígeno associado com o agente infeccioso.

Apesar da administração da proteína anticorpo ao paciente, a invenção fornece métodos de administração do anticorpo pela terapia gênica. Essa administração de ácido nucléico que codifica o anticorpo é abarcado pela expressão a administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo. Ver, por exemplo, pedido de publicação de Patente No. WO96/07321 sobre a utilização da terapia genética para gerar anticorpos intracelulares.

Em outra modalidade, os anticorpos anti-M2e da invenção são usados para determinar a estrutura do antígeno ligado, por exemplo, epítopos conformacionais, cuja estrutura é então usado para desenvolver uma vacina que tenha ou que imita essa estrutura, por exemplo, através de produtos químicos métodos de modelagem e SAR. Tal vacina podería ser usada para prevenir a infecção da Influenza A.

Todas as patentes EUA, publicações de pedidos de Patente U.S., pedidos de Patente U.S., patentes estrangeiras, pedidos de patentes estrangeiras e publicações nãopatentes referidos nessa especificação e/ou listadaas nas numerações aqui apresentadas são incorporadas por referência em suas totalidades.

Exemplos

Exemplo 1: Seleção e Caracterização de Anticorpos M2e-específicos Presentes no Plasma Humano Utilizando Células que Expressam Proteína M2e Recombinante

Anticorpos monoclonais totalmente humanos específicos para M2 e capazes de se ligar a células infectadas por influenza A e o vírus influenza propriamente foram identificadas em soro de paciente, como descrito adiante.

Expressão de Linhagens Celulares M2

Um construto de expressão contendo o cDNA de comprimento completo do M2, correspondente à sequência M2 derivada encontrada no subtipo influenza H3N3, foi transfectada em 293 células.

O cDNA M2 é codificado pela seqüência de polinucleotídeo seguinte e SEQ ID NO: 53:

ATGAGTCTTCTAÃCCGÃQGTCGAAaCGCCTATCâGAAACQaATGGQGQTGCAGATGCAACGATTCAÃGTGATCCTCTT GTTGTTGCCGCAAGTÃTCRTTGGGATCCTGCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTÃT CGTCTCTTTÃAACACGGTeTGAAM.GAGGGCCTTCrrâOGeASGGAGTACCÃQAGTCTATGAGGGAAQÃA^ATCSAAÃG gMCAGCAGAGTOCTGTQGÃTSCTSACGaiAGTCATTTOTCMiCATAGAaCTGGAG

A expressão da superfície celular de M2 foi confirmada com o peptídeo anti-M2e específico MAb 14C2. Duas outras variantes de M2, de A / Hong Kong/483/1997 (HK483) e A / Vietnã / 1203 / 2004 (VN1203), foram utilizados para análises posteriores, e sua expressão foi determinada utilizando anticorpos monoclonais M2e-específico da presente invenção, uma vez que a ligação 14C2 pode ser revogada por diversas substituições de aminoácidos na M2e.

Triagem de anticorpos no sangue periférico.

Mais de 120 amostras de plasma individual foram testadas para anticorpos que M2 ligado. Nenhum deles apresentou ligação específica para o peptídeo M2e. No entanto, 10% das amostras de plasma que continham anticorpos ligados especificamente à linhagem celular de 293 M2 H3N2. Isso indica que os anticorpos poderíam ser classificados como ligantes para determinantes conformacional de um homotetrâmero M2, e ligante para os determinantes conformacional de múltiplas variantes do homotetrâmero M2, que não podiam ser específicos para o peptídeo M2e linear.

Caracterização de Mabs anti-M2

Os MAbs humanos identificados através deste processo mostrou-se ligam a epítopos conformacionais na homotetrâmero M2. Eles se ligam ao transfectante 293-M2 original, bem como as outras duas variantes M2 célula expressa. O MAb 1402, além de ligação do peptídeo M2e, mostrou-se mais sensíveis às seqüências M2 variante. Além disso, 14C2 não se liga prontamente aos viriões influenza, embora os Mabs anti-Me de conformação específicos o façam.

Estes resultados demonstram que os métodos da invenção prevê a identificação dos MAbs M2 provenientes de respostas imuno de humanos normais ao influenza sem a necessidade quanto a uma imunização específica de M2. Se for utilizado para a imunoterapia, esses Mabs totalmente humanos possuem o potencial para serem mais bem tolerados pelos pacientes que os anticorpos humanizados provenientes de ratinhos. Adicionalmente, e em contraste ao 14C2 e o MAbs Gemini Biosciences , que se ligam ao peptídeo M2e linear, os MAbs da invenção se ligam aos epítopos conformacionais de M2, e são específicos não só para as células infectadas com uma cepa de influenza, mas também para o vírus propriamente. Uma outra vantagem do MAbs da invenção é que eles podem cada um se ligar a totalidade das varianes M2 já testaadas, indicando que eles não estão restringidos a uma sequência de aminoácido linear específica.

Exemplo 2: identificação de anticorpos M2-específicos

Células mononucleares ou células B expressando três dos MAbs identificados no soro humano, conforme descrito no Exemplo 1, foram diluídos em populações clonais e induzidas a produzir anticorpos, sobrenadantes contendo anticorpos foram testados para a ligação a células 293 FT transfectadas estavelmente com a proteína M2e de comprimento completo de cepa influenza subtipo H3N2 da influenza. Sobrenadantes que apresentaram coloração/ligação positiva foram reclassificadas novamente em células 293 FT transfectadas de modo estável com a proteína M2e de comprimento completo proveniente de cepa influenza do subtipo influenza H3N3 e em células transfectadas no vetor sozinho como um controle.

As regiões variáveis dos anticorpos foram então clonados em resgate a partir das cavas de célula B cujos sobrenadantes apresentaram ligação positiva, dos poços de células B, cuja ligação sobrenadantes mostrou positiva. Sobrenadantes reconstituídos dos anticorpo foram classificados quanto à ligação a células 293 FT transfectadas estavelmente com a proteína M2 de comprimento completo como acima detalhado para identificar os anticorpos anti-M2E resgatados. Três diferentes anticorpos foram identificados: 8i10, 21B15 e 23K12. Um quarto clone anticorpo adicional foi isolado por telas de resgate, 4C2. No entanto, não 5 foi o único e teve a exata mesma sequência como o clone 8i10 apesar de advir de um diferente doador que o do clone 8i10.

As sequências das regiões variáveis kappa e gamma desses anticorpos são fornecidas abaixo.

Clone 8110

A região variável kappa LC do clone anti M2 8i10 foi clonada como Hind iii ao fragmento BsiW1 (ver abaixo), e é codificado por sequências polinucleotídicas seguintes e SEQ ID NO: 54 (em cima) e SEQ ID NO: 55 (inferior):

íW3CTTCCACCATQGACATGAGGQTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCQAGGTG TTCGAAGGTGGTACCTGTACTCCCAGGAGCÕAGTOGAGGACCCCGãSGACGâTGAGACCGÃGGCTCCAC CCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCA.CCA GaTCTACACTGTAGSTCTACTtKGTCAGAÔGTASSAGGaACAGACGTAGACATCCTCTGTCTCAGTGGT TCACTTGCCGGGCGAGTCAGAACATTTACAAGTATTTAãATTGGTATCAGCAGAGACCAGGGAAAGÇCC

AGTGÃACGGCCCGCTCAGTCTTí3T.AaATGTTCATAAATTTAACCATAGTOGTCTCTGGTCCCTTTCGGG CTAA.GGGCCTGATCTCTGCTGCATCCGGGTTGCAÃAGTGGGGTCCCATCSAGGTTCAGTGGCAGTGGAT GATTCCCGGACTACaGACGACGTAGGCCCAACGTTTCACCCCAGGGTÃGTTCCAíi.GTCACagTCACCTÃ CTGGGACAGATrTCACTCTCACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAAC GACCCTGTCTAAAGTGAGAGTGGTAGTGGTCAGACGTTGGACTTCTAAAaCGTTGAATGATGACAGTTG

A tradução da região variável 8i10 kappa LC é como apresentado a seguir, seqüência de polinucleotídeo (acima, SEQ ID NO: 54, em cima) e seqüência de 15 aminoácidos (abaixo, correspondendo a SEQ ID NO: 56):

1«I1

SAGCTTCCACCATGGACATGAGGGTCCTCGCTCÃGCTCCTQGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCSAGGTG M 0 » « v i. A a l l <s i„ I. t L W L R e

CCAGíATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGCaGACAGAGTCA.CCA

A « C D I Q T Q õ P S S 1 S A S ¥ □ O R ¥T

TCACTTGCWGGCGAGTCAG^.CATTTAC»GTATTTAÃATTGGTATCAGCAGAGACCAO^AAA^CCC

Ϊ ΐ C i? A 8 Q $ I ¥ K y L W ¥ <2 Q q p KÃ

CTAAGGGCCTGATCTCTGCTGCÃTCOGGGTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGAT P K β L I S Ã A $ β U a $ S v P 3 . R F 3 β 93

CTGGGACAGATTTCACTCTCACCATC&CCAGTCTGCAACCTGAÃGATTTTGCÃACTTfiCTACTGTCAAC ® w T D F T L T I z 3 L Q P p £> F A Γ ¥ ¥ CQ

Bs^M AGAGTTACAGTCCCCCTCTCACrTTCGGCGGAGGGACCAGGGTaGAGATCAAACGTACG SSVS-PPl TFeaGTRVg í K « ΤΑ seqüência de aminoácidos da região variável 8i10 Kappa LC é o seguinte, com áreas específicas identificadas abaixo (CDR seqüências definidas de acordo com métodos Kabat):

B.m..WJLQ..,a.....E..S._S.....LOjXS..B...R..g..IlI-C

R A S q H i ¥ S Y ί N

BX,.aA

AASGLQS

G V P S R F S G S G S G T D F T LTITSLQ

ΟΧΪΧΕΧΗ.

F ..s...s....s...T....a...yg t k

ELI

VKteadw(SEQ 10 NO; 87)

FR1 (8EQ ID NO: S8)

CDRKSEQ ID NO: 59)

FR2 (SEQ ID NO; 80)

CDR2ÍSEQID NO: 61}

E D F A T ¥ ¥ C FR3 {SEQ ID NO: 62)

CDR3 (SEQ ID NO; 63)

FR4 (SEQ IO NO; 84) início da região constante kappa

O seguinte é um exemplo da da região variável 8i10 kappa LC clonada no vetor de expressão pcDNA3.1 que já continha da região constante 8i10 kappa LC (seqüência de polinucleotídeo superior corresponde a SEQ ID NO: 65, seqüência de polinucleotídeo inferior corresponde a SEQ ID NO: 66, seqüência de aminoácidos corresponde a SEQ ID 5 NO: 56 acima). Bases em preto representa pcDNA3.1 seqüências do vetor, bases azuis representam as seqüências de anticorpos clonados. Os anticorpos descritos aqui também foram clonados no vetor de expressão pCEP4.

«Ml Μ (TOO* (êio:

GCTCaQCTCCTGGGGCTCCTSCTACTCTGGCTCCGftGGTGCCAGATOTGACATCCAG.KroACCCAGTCT

- -AGTCGAGGÃCCZG Ά -CAGGATGZG-A: ’CGA aT'-TJv V? ?T7iG>“CTACG”.^lGTCAC-A * α i. t o i. i> i I. w t r α * r c a i >a μ τ α s

CCA’rCCTCCCTGTCTGCATCTGrAGGAGACAGAGTCACCAi'CACi'TGCCGGGCGAGTCASAACATTTAC JGGTAGaAfiGQMaGACGTAGACATCCTCTGTCTCAGTGS'rAGTGAACGGCCCGCTCAGTCTTGTAAATG BessisAsveoevTi t c » * * a « i y .AAGGATTTAAAíTGGTATCAGCAGAGACCAGGGAAMíCCCCTAAGGGCCTGATCTCTeCTGGATCCGGG 'üTmGAAAI^TAACCATAGTCGTCTCTGGTCCCTTTCGGGGATTCCCGGACTAGMaCGâCGTAGGCCC

IB K Y í « W Ύ 0 a R R SJ K A » K 9 I I S A A 3 B

TTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAOGT’rCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTT^CACTCTCACCATCACC iaCGTTTCÃCCCCAfiGCTAGTTCCAAGTCÃCCGTCACCTAGACCCTGrCTAAAGTGAGAaTaGTAGTGG

L *1 g í3 V ? s R; § 0 S G S G T Q F T L T I T

AGTCTGCAACCTGÃAGSTTCTGCAACTTACTftCTGTCAACaGAGrTACAGTCCCCCTCTCACTCTCGSC —TCA.GACGTTGGACTTCTAAAACGTTGAATGATGA.CAGTTGICTCAATGTCACíGGGGAGftGTGAAAGCCG BI a t o p β o f a t r y e q g g ¥ a f » _u tf «

BalWI üGAGGG/4CCAGGGTGGAGATC.MACcH»o:xHKK3c^cftcraTc?iwxYrTcaT;OTi^xK»7j!TCTiX3s®?a£?CASTBWAnx.YTOQ

tat Kappa oínsism

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TTCAoaaAcacAaCTK^cGiaAaaACTrATimAmrraoQírnzixrrcciaímTcwsiCTKXTTc^ t A · v V « l t N H f y p r k a κ v « w K v e N A i α a « h « tSeSVTEeaSKDSlVSLSSTLTLSKAQ-rEKHKV

0Μβ Í1W :m ( isss-.fcai («sej 'í^Ti&^CCTSWCICGCOSãiraC&FaiCSUãCTTCyãCTia^STOiSTGTjSSWXWiTr&SaíSGGnXJSTTTaAíí

Mtxx^cQCTTCMmaaTMKxxicaraxHMogaxwsOTTn^^

V .* e E V T H a â L S S F V T Κ β F » S> S> E C

O região variável 8i10 Gamma HC foi clonado como um Hind III a um fragmento Xho , e é codificada nas sequências polinucleotídicas seguinte e SEQ ID NO: 67 (em cima) e SEQ ID NO: 68 (inferior).

Hindi II

AAGCTTCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGCTGGGT

TTCGAAGGTGGTACTTTGTGGACACCÃAGAAGGÃAGAGGACCACCGTCGAGGGTCGACCCA

CCTGTCCCAGGTGCAATTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTG

GGACAGGGTCCACGTTAACGTCCTCAGCCCGGGTCCTGACCACTTCGG.AAGCCTCTGGGAC

TCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTTCGTCCATCAGTAATTACTACTGGAGCTQGATCCGGC

AGGGAGTGGACGTGACAGAGACCAAGCAGGTAGTCATTAATGATGACCTCGACCTAGGCCG

AGTCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGGTTTATCTATTACGGTGGAAACxACCAAGTA tcaggggtcccttccctgacctcacctaacccaaatagataatgccacctttgtggttcat caatccctccctcaagagccgcgtcaccatatcacaagacacttccaagagtcaggtctcc

GTTAGGGAGGGAGTTCTCGGCGCAGTGGTATAGTGTTCTGTGAACJGTTCTCAGTCCAGAGG ctgacgatgagctctgtgaccqctgcggaatcgqccgtctatttctgtgcgagagcgtctt

GACTGCTACTCGAGACACTGGCGACGCCTTAGCCGGCãGATAAAGACACGCTCTCGCAGAA

GTAGTGGTíGGTTACTGTATCCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAG

CATCACCACCAATGACATAGGAAGTGATGACCCCGGTCCCTTGGGACCAGTGGCAGAGCTC

A tradução do 8i10 Gamma HC é o seguinte, seqüência de polinucleotídeo (acima, SEQ ID NO: 67, em cima) e seqüência de aminoácidos (abaixo, correspondendo a SEQ ID NO: 69):

HM>I AAGCTTCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGCTGGGTC

Μ K H L. W F T 1. L L V A A P S W ¥ CTGTCCCAGGTGCAATTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTG t-savatosSGPôLVKPseTt

TCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTTCGTCCATCAGTAATTACTACTGGAGCTGGATCCGG

LTCTVSG3S I S N Y Y W S W I R

CAGTCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATT^GGTTTATCTATTACGGTGGAAACACCAAG «SPGKGLSWIGI» I r y <j S N r K

TACAATCCCTCCCTCAAGAfíCCGCGTCACCÃTATCACAAGACACTTCCAAGÃGTCAGGTC

YIMP81K9R V T I 8Q0TSK8Q V

TCCCTGACGATGAGCTCTGTGACCGCTGCGG.AATCGGCCGTCTATTTCTGTGCGAGAGCG s L T M S.3 ¥ T A A E S A. V ¥ F C A R «

TCTTGTAGTC3GTGGTTACTGTATCCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTC ç 8 C 6 Y C I LOiTWGQG TLVTV

TCGAG s

A seqüência de aminoácidos de 8i10 Gamma HC é o seguinte, com áreas específicas identificadas abaixo (CDR seqüências definidas de acordo com métodos Kabat):

M.....Ο..ί...Β...Ε.Ι....Ι. ί ..ί. V A A P S W V L S	vh leader (SEQ ID NO: 70}
QvqiqE S.s.e g l v k p s e t l s l t c t vs g s s i s	FR1 (SEQ ID NO: 71)
M.,Y„X„,g„5	CDR1(SEQ ID NO: 72]
.....E. ..6 .....G	FR2(SEQ IO NO: 73)
F 1 Y Y S G.....Η T K ¥ N P S L K S	CDR2 (SEQ ID NO: 74)
S.ν„·Ι4„·£.·8··£··1^Α^...<ν..1.....LI C A 1¾	FR3 (SEQ IO NO: 75)
	CDR3 (SEQ IO NO; 7S)
Υ^·£·9„„.^Ι·„ι.ν„Χ·.ν,8	FR4 ÇSEQ IO NO: 77)

O seguinte é um exemplo da região variável de Gama HC de 8i10 clonado no vetor de expressão pcDNA3.1 que já continha a região constante Gamma HC (seqüência de polinucleotídeo superior corresponde a SEQ ID NO: 78, seqüência de polinucleotídeo inferior corresponde a SEQ ID NO: 79, seqüência de aminoácidos corresponde a SEQ ID NO: 69 acima). Bases em preto representa pcDNA3.1 seqüências do vetor, bases azuis 5 representam as seqüências de anticorpos clonados.

W) i«íi (SW'1 c α λAGGTCjgT.ACTTI’GTGGA.CACCAA.

M K H l W F

F L L L V A & R ® W V L $ Q V Q Q g .& ® p

GGACTGGTGAAGCGWCGGAGACCCTGTCCCTCAGCTGCACTGTCTCTGGTTCGTCCATCAGTAATT _eCCTGACCACTTCGGAAGCCTC?TGGaACAGGGAGTGGACGTGACAGAGACCAAG€AGGTAGT€ATTAA glvkpset -l s l. t C T V S G S £ I S M

ACTACTGGAGCTGGATa^mQCAGTCCCCAGGGAAGGGAOTGGAGTGGATTCGGTTTATCTA^TACGG ^TGATGACCTaSACCTAGGCCGTCAGGGGTCCCTTCCCTGACCTCACCTÃACCCAAÃTAGATAATGÇC ®Y V W S W Í R α & p G K & L. Ê; W I G F I V Y G

TGGAAACACCAAGTACAATCCCTCCCTCAAGAG.CCGCGTCACCAIATCACAAGACACTTCCAAGAGT

aAGGTCTCCCTGACGATGAGCTCTCTGACCKTCrcGAATraGCCCTCTATTTCTGTCCGAGAGaST

GTCOGMGCACl^^ACrCGAGACACTGGCGACGCCTTAGCCGGCAGATAAAGACACGCrCTCGCA low $ L T M S .S V T A Â E S A V V F C A R Á <13311

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Wl (23®» F^SI (2.W)

ü k i i. s i â f α κ:

A região do quadro estrutural 4 (FR4) de Gamma HC normalmente termina com duas serinas (SS), de modo que a estrutura completa quatro região deve ser W G Q G T L V

Τ V S S (SEQ ID NO: 80). A aceitação Xho um sítio e uma base adicional a jusante do local Xhol no vetor, no qual o região constante Gamma HC que as regiões variáveis Gamma HC são clonados, fornece as últimas bases que codificam esse aminoácido final do quadro estrutural 4. No entanto, o vetor original não ajustou quanto à mutação silente feita quando o sítio Xho1 (CTCGAG, SEQ ID NO: 81) foi criado e continha um nucleotídeo “A” a jusante do sítio Xho1, que induziu uma alteração aminoácido no final do quadro estrutural 4: uma substituição serina para arginina (S para R) presente na totalidade dos clones Gamma HC de trabalho. Desse modo a região do quadro estrutural 4 completo lêWGQGTLVTVS R (SEQ ID NO: 82). Futuros construtos estão sendo criados em que a base a jusane do sítio Xho 1 é um nucleotídeo “C”. Desse modo, a criacoa do sítio Xho 1 usado para clonar as sequências da região variável Gamma HC nas modalidades altrnativas é uma mutação silente e restaura a sequência de aminoácido do quadro estrutural 4 aos seus apropriados WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 80). Isto é verdade para todos os clones M2 Gamma HC descritos aqui.

Clone 21B15:

A região variável Kappa LC do clone anti M2 21B15 foi clonado como fragmento Hind III ao fragmento BsiWI, e é codificado por sequências polinucleotídicas seguintes e SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NO: 84:

«hsiiii ââGCTTCCACCATGGaCATGAGGGTCCTCGCTCaaCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGGTGC TTCGftÃGGTGGTACCTGTACTCCCÃGGAGCGA.GTCGAGGACCCCGA®3ACGATGAGACCGAGGCTCCACG CAGATGTGACATCCAGGTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATC GTCTACACTGTAGGTCCACTGGGTCAGAGGTAGGAGèGGACAGACGTAGACATCCTCTGTCTCAGTGGTÃG ACTTGCCGmCGAGTCAGAACATTTACAAGTATTTAAATTGGTATCAGCftGAGACCAGGGAAAGCCCCTÃ TGAACGGCGmCTCAGTCTTGTAAATGTTCATAAATTTAACCATAGTCGTCrCTGGTCCCTTTCGGGGAT ÃGGacCTGATCTCTGCTGCATCCGGGTTCCAAÃGTGGGaTCCCATCAAGGTTCAGTGÕCASTGGATCTGG tcccggactagagacgacgtaggcccaacgtttcaccccãgggtagttccaagtcaccgtcacctagacc GACAGATTTCACTCTCACCATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAA.CAGAGT CTGTCTAAAGTGAGAGTGGTAGTGGTCAaACGTTGaACTTCTAAAACGTTGÃATGATGACAflTTGTCTCA BS!»!

TACAGTCCCCCTCTCACTTTCGGCOGAGGGACCAGGGTGGATATCAAACGTACG ATGTCAGGGGGAG^TGAAAGCCGCCTCCCTGGTCCCÃCCTATMSTTTSCATGC

A tradução da região variável kappa LC 21B15 é como o 2 15 Kappa IB região variável LC é o seguinte, seqüência de polinucleotídeo (acima, SEQ ID NO: 83, em cima) e seqüência de aminoácidos (abaixo, correspondendo a SEQ ID NO: 56):

H.íftdO

AAGCTTCCACCATGGACATGâ^GTCCTCSCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTÃCTCTGgCTCCGAGGT

M o a R O l A α l l O l L l L W L R G

GCCAGATGTGACATCCAGGTGACCCAGTCTaCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGQAGAÇAGAGTCACC asco i <s v t α s p e s l. a a s v α a a v τ

ATCACTTGCCGCGCGAGTCAGAàCàTTTACAÃGTATTTAÃATTGGTATCÃGCAGAGACCAGGGÃAÃGCC i TORAS OH ÍTK VI. fjWV etSRPSKA

CCTAftGGGCCTGATCTCTGCTGCATCCGGGTTGCAAAGTG’GGGTCCCATGAAGGTTCAGTGGCAGTGGA

F K 0 l I 3 A A S g L Q S β V F S R r # S S β tctgggacagatttcactctcaccatcaccagtctgc.aacctgaagattttgcaacttactactgtcaa

S s T 0 F T í T i T S l β p g0 F A Τ V ¥ C Q

MM

CAGÃGTTACAGTCCCCCTCTCACTTTCGGO3GAGGGACCAGGGTGGATATCAAACGTACG ά4Υ«ΡΡ1ΤΡ««βΤΚ ¥0 I K fí T

A seqüência de aminoácidos da região variável kappa LC 21B15 é como a seguinte, com áreas específicas identificadas abaixo (CDR seqüências definidas de acordo com métodos Kabat):

VK leader (SCQ 10 W: 57)

O d RVTI TC

Ff?1 (SEQ ID NO: SS)

CDR1 (SEQ ID NO; $â}

FR2 (SEQ ID NO: 60)

A .a„.s_g_l_2_s

CDR2(SEQID NO: 61)

E 0 EA....I..Y Y C FR3 (SEQ ID NO: 62)

CDR3(SEQIDNO:63)

F G G C. T..R..V.D.L.K

Fí?4 (SEQ ID NO: 64)

R T Início da recião constante Kappa

O iniciador utilizado para clonar a região variável kappa LC estendida em uma região da diversidade e tinha uma posição base oscilante na sua concepção. Assim, na região do quadro estrutural 4 um aminoácido D ou E podem ocorrer. Em alguns casos, os aminoácidos nessa posição no anticorpo resgatado pode não ser o aminoácido parental original que foi produzido na célula B. Na maioria das kappa LCs a posição é uma E. Observando o clone acima (21B15) um D em um quadro estrutural 4 (D I K R T) (SEQ ID NO: 84) foi observado. No entanto, olhando para os ácidos aminados ao redor, isso pode ter ocorrido como resultado do iniciador e pode ser um artefato. O anticorpo natural da célula B pode ter tido um E nesta posição.

A região variável Gamma HC 21B15 clonada como um Hind III a um fragmento Xho , e é codificado por sequências polinucleotídicas seguinted e SEQ ID NO: 85 (em cima), e SEQIDNO: 86 (em baixo):

H Mi 11

AAGCTTCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGCTGGGTCC

TTCGAAGGTGGTACTTTGTGGACACCAAGAAGGÃAGAGGACCACCGTCGAgGGTCGACCCAGG

TGTCCCAGGTGCAATTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTC3AAGCCTTCGGAGACCCTGTCCC

ACAGGGTCCACGTTAACGTCCTCAGCCCGGGTCCTGACCACTrCGGAAeCCTCTGGGACAGGG

TCACCTGCACTGTCTCTGGTTCGTCCATCAGTAATTACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGTCCC

AGTGGACGTGACAÕAGâCCAAGCAGGTAGTCATTAATGâTGACCTCGACCTAGaCCGTCAGGG

CAGGGAAÔGGACTGGAGTGGATTGGGTTTATCTATTACGGTGQAAACACCAAGTACAATCCCT

GTCCCTTCCCTGACCTGACCTAACCCAAATAGATAATGCCACCTTTGTGGTTCÃTGTTAGGGA

CCCTCAAGAGCCGCGTCÃCCATÃTCACâAGACACTTCCAAGAGTCAGGTCTCCCTGACGATGA

GGGàGTTCTCGGCGCÃGTGGTATAGTGTTCTGTGÃÃGSTTCTCAGTCCÃGAGGGACTGCT&CT

GCTCTGTGACCGCTGCGGAATCGGCCGTCTATTTCTGTGCGAGAGCGTCTTGTAGTGGTGGTT

CGAGACACTGGCGACGCCTTAGCCGGCACSATAAAGACACGCTCTCGCAGAACATCACCACCAA

WksI

ACTGTATCCTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCÃCCGTCTCGAG

TGACATAGGAACTGATGACCCCGGTCCCTTGGGACCAGTGGCAGAGCTC

A tradução de Gamma HC 21B15 é como o seguinte, seqüência de polinucleotídeo (acima, SEQ ID NO: 87, em cima) e seqüência de aminoácidos (abaixo, correspondendo a SEQ ID NO: 69):

Hind!!!

AAGCTTCCACCATQAAACA.CCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGCTGGGTC

Μ K H L W F F !.. L L V A A P S W V

CTGTCCCAGGTGCAATTGCAGeAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCC

L8<JV®l<lE8®PeLVKPSeTLS . CTCACCTGCACTGTCTCTGGTTCGTCCATCAGTAATTACTACTíSGAGCTGGATCCGGCAGTCC ILTC TVSGSS I S N Y Y W S W I R Q S . ccagggaagggactggagtggãttggõttta.tctattacggtggaaacaocaagtãcaatccc

IfSKBLSWI 6 F ιΥ ναβΝΤΚνΜΡ . AGCTCTGTGACCGCTGCGGAATCGGCCGTCTATTTCTGTGCGAGAGCGTCTTGTA-GTGGTGGT

I S S V T Λ * E S * V ¥ F c A R * 8 C 3 S S

TACTGTATCCTTG/iCTACTGGGGCCAGCSGAACCCTGGTCACCGTCTCQAG ¥ c i LOYwaasTLvrve

A seqüência de aminoácidos da Gamma HC 21B15 é como a seguinte, com áreas específicas identificadas abaixo (CDR seqüências definidas de acordo com métodos Kabat):

MKHLWFFLLLVAAPSWVLS líder VH (SEQ ID NO 70)

MKHLWFFLLLVAAPSWVLS uxiâ

VH teter(SEQ ID NO: 70)

FR1 (SEQ IO NO: 7Ί )

CDR1 (SEQ IO NO: 72)

W 1 R Q S P G K G L E W I G

Π ¥ Y G S B T K ¥ N P 8 l K S

FR2 (SEQ ID NO: 73)

CDR2 (SEQ ID NO: 74}

R V.I.I.S ft D..T $K S fl V S ...I .a AESAVYFCAR FR3 (SEQ ID NO: 75}

A3ÇS,a GYCiLO.

CDR3 (SEQ ID NO: 76)

FR4(SEQ IBNO; 77}

Clone 23K12:

A região variável Kappa LC do clone anti M2 23K12 foi clonado como Hind III ao fragmento BsiW1 (veja abaixo), e é codificada pelo seguinte sequências polinucleotídicas SEQ ID NO: 88 (em cima) e SEQ ID NO: 89 (abaixo).

HÍWIM

AAGCTTCCACCATGGACATGAOSGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTACTCTGGCTCCGAGG

TTCGAAGGTGGTACCTGTACTCCCAGGAGCGAGTCGAGGACCCCGaGGACGATGAGACCGAGGCTCC

TGCCAGATGTGACATCCAGATGâCCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTC

ACGGTCTACACTGTAGGTCTACTGGGTCAGAGGTAGGAGGGACAGACGTAGACATCCTCTGTCTCAG accatcacttgccggacaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccaggga

TGGTASTGAACCXSCCTGTTCAGTCTCGTAATCGTCGATAAATTTAACCATAGTCGTCTTTGGTCCCT

AA&CCCCTAAACTCCTGATCTATCCTGCaTCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGG

TTCGGGGATTrGAGGACTAGATACGACGTAGGTCAAACGTTTCACCCCAGSGTAGTTCCAAGTCACC

CAGTGGATCTCOSACÃGATTTCACTCTCACCATCAGCGGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCaACCTAC GTCACCTAGACCCTGTCTAAAGTGAGA.GTGGTAGTCGCCAGACGTTGGACTTCTAAAACaTTGGATG

MM

TACTGTCAACAGAGTTACAGTATGCCTGCCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGMJATCAAACGTACG

ATGACAGTTGTCTCAATGTCaTACGGACGGAAACCGGTCCCCTGGTTCGACCTCTAGTTTGCATGC

A tradução da região variável Kappa LC 23K12 é como a seguinte, seqüência de polinucleotídeo (acima, SEQ ID NO: 90, em cima) e seqüência de aminoácidos (abaixo, correspondendo a SEQ ID NO: 91).

Hinàsil

AAGCTTCCACCATGGACATGAGGGTCCTCGCTCAGCTCCTGGGGCTCeTGCTACTCTGGCTCCGAGG K S M a V L Λ α í. L G L L l í. W L R S

-rGCCAGAIGTGACATCCâGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTSTCTGCATCTCTAGGAGACAGAGTC

ARCO » a Μ I <SSI»SSí.SASVeCRV

ACCATCACTTGCCGGACAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATrGGTATCAGCAGÃAACCAGGGA * i t e r r 8 a s i s « v ι » w v α o x: s» e

AAGCCCCTAAACTCCIGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGG

K . Λ f» K l I I Y A A S S l O 8 β V P 3 t F 3 S

CAGTGGATCTGGGAGAGATTTCACTCTCACCATCAGCGGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACCTAC

S β S G T δ F T í. T I S G l Ο P B β F A T Y aswi

TACTGTCAACAGAGTTACAGTATGCCTGCCTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACG

V C. Q Q S V 8 U P A F 6 O S T K l ê j K R T

A seqüência de aminoácidos da região variável Kappa LC 23K12 é como a seguinte, com áreas específicas identificadas abaixo (CDR seqüências definidas de acordo com métodos Kabat):

M D M. R V.L.A q L L O L L.L1..W.L R G ARÇ

VK featfer (SEQ ID NO: 57)

2JjgLMX2 lX^

FR1 (SEQ IO NO: 58) ft T S.............S

CDR1 (SEQ ID NO: 92)

FR2(SEQIDNO:£3)

AASSLQSGVPSRF

CDR2 (SEQ ID NO: 94)

S^_£_Q_G_LP f I ί IJ S O LfiLP-L-b F A T Y Y ¢FR3(S£QIDNO:9e)

CDR3 (SEQ 10 NO: S6)

F6Q6TKLEIK

FR4 (SEQ ID NO: 114)

R T Início da região constante kappa LC

A região variável Gamma HC 23K12 foi clonada como um fragmento Hind Illa Xho

1, e é codificada por sequências polinucleotídicas seguinte e SEQ ID NO: 97 (em cima) e

SEQ ID NO: 98 (inferior).

Hwn

AAGCTTCCACCATGGAGTTGGGGCTGTGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAaAGGTGTCCAGT TTCGAAGGTGGTACCTCAACCCCGÃCACGACCCAàAAGGAACÍAACGÃTAAAATTTTCCÃCAGGTCa.

GTGAGGTGCaGCTGGTGGAGTCTGGgGGAGGCTTGGTCCAGCX'TGGGGGGTCCCTGACMATCTCCT

CACTCCACGTCGACCACCTCAGACCCCCTCCGAACCAGGTCGGACCCCCCAGGGÃCTCTTAGAGGÃ

GTGCAGCCTCTGGA.TTCACCGTCAGTAGCAACTACATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCOiGGGAAGG

CACGTCGGAGAOTAAGTGGCAGTCATCGTTGATGTACTCÃACCCAGGCGGTCCGÃGGTCKCTTCC

GGCTGQAGTGGGTCTCAGTTATTTATAgTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTG.AAGGGCâ

CCGACCTCACCCAGAGTCAATAAATATCACCACCATCGTGTATGATGCGTCTGAGGCACTTCCCGT

GATTCTCÇTTCTCCAaAGACAACTCCAAGAACACAGTGTTTCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCG

CTAAGAGGAAGAGGTCTCTGTTGAGGTTCTTGTGTCACAAAGAAGTTTA.C:rTGTCGGACTCTCGGC AGGACACGGCTGTQTATTA.CTGTGCGAaATGTCTGAGCAGGATGCGGGGTTACGGTÍTAGACGTC'? TCCTGTGCCGÀCÃCATAÂTGACACGCTCTACâGACTCGTCCTACGCCCCAATGCCAAATCTGCAGA »»ι

GGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCGAG

CCCCGGTTCCCTGGTGCCAGTGGCAGAGCTC

A tradução da região variável Gamma HC 23K12 é como a seguinte, seqüência de polinucleotídeo (acima, SEQ ID NO: 99, em cima), e a seqüência de aminoácidos (abaixo, correspondendo a SEQIDNO: 100):

AAGCTTCCACCATGGAGTTGGGGCTGTGCTGGGTTTTCCTTGTTGCTATTTTAAAAGGTGTCCAG £ l. O L 0 W ¥ F L ¥ A ! i. K G V Q . TGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGflGGAGGCrTSSTCCAGCCTGG^GGTCCCTGAGAATCTCC

I C E V Q L V E « o β (3 L V Q * O <3 S L R I s . TGTGCAGCCTCTGGATTCâCCGTCAGTAGCAACTACATGAGTTGGGTCCGCCAGGCTCCASGGAAG * Á A 8 8 F T y s: s $ Y 5 »$· ¥ F< Q A p Q κ

. AGATTCTCCTTCTCCAGAGACAÃCTCCAAGAACACAGTGTTTCTTCAAATG.AACAGCCTGAGAGCC

I ·-. h 3 F Ô ft G A Sf K Η ? v r 1 M & $ L % A . GAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGATGTCTGAGCAGGATGCGaSGTTACGGTrTAGACGTC

I E D r A V Y ¥ C A R, C L S F, M R G Y G t £> y

X-KH ₍ TGGGGCCSAGGGACCAC^TCACCGTCTCGAG

I w e q e t t v t v s

A seqüência de aminoácidos da região variável Gamma HC 23K12 é como a seguinte, com áreas específicas identificadas abaixo (CDR seqüências definidas de acordo com métodos Kabat):

aX,.k.^^aX£.O.A.LkXAX.aX VH leader (SEQ IO NO; 101)

EL.V..a........L.Y E S...........5 £ G Q S L RI S S A A S G E T V S FR1 (SEQ id NO: 102)

CDR1 (SEQ IO NO: 103)

RR2 (SEQ IO NO: 104) VÍYSGGSTYYÃDSVK CDR2 (SEQ'ID NO: 105)

P EB T A VY, Y c A R FR3 (SEQ ID HO 10«) g;.L.S.....R....M R G Y ..G....L.....P....V CDR3 (SEQ ID NO: 107}

^...^.α,,.,Ο,Τ,,,Τ,.,ν,,,Τ,,,ν,,β FR4 (SEQ ID NO: 10β)

Exemplo 3: Identificação de regiões variáveis conservadas do anticorpo

As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis Kappa LC e Gamma HC de três anticorpos foram alinhadas para identificar rgs e resíduos conservados, como mostrado abaixo.

O alinhamento da sequência de aminoácido das regiões variáveis kappa LC dos três clones:

J.»»

S-ÍÇ

HH 4J»

BB íí

Η» ____________

O alinhamento da sequência de aminoácido das regiões variáveis Gamma HC dos três clones:

itnçis ΓΤΤΚ

U' . H JWJ W ,» *

| s ' ’ | l | i ] « 1 a | h i	taa's o
ΟΒΚ.ΪΏ O SSSSE3KM O__- BKEBOBMKMEM	Ο OK3 O O

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Os clones 8i10 e 21B15 vieram provenientes de dois diferentes doadores, ainda que eles possuíssem o mesmo exato Gamma HC e diferissem no Kappa LC por apenas um aminoácido na posição 4 na região do quadro estrutural 1 (aminoácidos M versus V, ver 10 acima), (excluindo D versus E posição oscilante no quadro estrutural 4 de Kappa LC).

A comparação de seqüências das regiões variáveis dos anticorpos revelou que a cadeia pesada da 8i10 clone foi derivado sequências germinativas de HgHV4 e que a cadeia leve foi obtida a partir da sequências da linahgem germinativa de IgKVI.

A comparação de seqüências das regiões variáveis dos anticorpos revelou que a 15 cadeia pesada do clone 21B15 foi obtido a partir sequências germinativas de HgHV4 e que a cadeia leve foi obtida a partir da sequências da linahgem germinativa de IgKVI.

A comparação de seqüências das regiões variáveis dos anticorpos revelou que a cadeia pesada do clone 23K12 foi obtido a partir sequências germinativas de HgHV3 e que a cadeia leve foi obtida a partir da sequências da linahgem germinativa de IgKVI.

Exemplo 4; Produção e caracterização de anticorpos M2

Os anticorpos acima descritos foram produzidos em quantidades miligramas por maior escala transfections transiente em células 293 PEAK. Os sobrenadantes em bruto anticorpos não purificados foram utilizados para analisar a ligação do anticorpo para o vírus influenza A / Puerto Rico/8/1932 (PR8) em placas de ELISA, sendo comparada com a ligação do anticorpo 14C2 controle, que também foi produzido pela maior escala transitória transfecção. Os anticorpos monoclonais humanos recombinantes anti-M2 se libaram ao influenza enquanto que o anticorpo controle não o fez (Figura 9).

A ligação também foi testada em células MDCK infectadas com o vírus PR8 (figura 10). O controle anticorpo 14C2 e três clones anti M2E: 8110, 21B15 e 23K12, todos mostraram a ligação específica com a proteína M2 expressa na superfície das células infectadas PR8. Nenhuma ligação foi observada nas células não infectadas.

Os anticorpos foram purificados por colunas de proteína A do sobrenadante. A análise foi realizada utilizando anticorpos FACs purificados em uma concentração de 1 ug / mL para analisar a ligação dos anticorpos a células 293 PEAK transfectadas de modo transiente expressando proteínas M2 sobre a superfície da célula. A ligação foi medida pelo teste de ligação a células transfectadas mock e células transfectadas de modo transiente com o influenza subtipo H3N3, A / Vietnã / 1203 / 2004 (VN1203), ou A / Hong Kong/483/1997 HK483 proteínas M2. Como um controle positivo o anticorpo 14C2 foi usado. Controles sozinhos do anticorpo não manchado e secundário ajudaram na determinação da base de referência. O manchamento específico para as células transfectadas com a proteína M2 foi observada para todos os três clones. Além disso, todos os três clones se ligaram a cepas de proteínas M2 de alto trânsito A / Vietnã / 1203/2004 e A / Hong Kong/483/1997 M2 muito bem, enquanto que o controle positivo 14C2 que s ligou bem a proteína H3N2 M2, se ligou muito mais fracamente à proteína M2 A / Vietnã / 1203 / 2004 e não se ligou à proteína M2 A / Hong Kong/483/1997. Ver Figura 11.

Anticorpos 21B15, 23K12 e 8110 ligado à superfície de células HEK-293 expressam estavelmente a proteína M2, mas não as células transfectadas pelo vetor (ver Figura 1). Além disso, a ligação desses anticorpos não foi competiu pela presença de 5 mg / mL peptídeo M2 24-mer, ao passo que a ligação do controle quimérico mouse V-região /humano kappa lgG1 anticorpo 14C2 (hu12C2) gerada contra o peptídeo M2 linear foi completamente inibida pelo peptídeo M2 (ver Figura 1). Estes dados confirmam que esses anticorpos se ligam aos epítopos conformacionais presentes no M2e expresso sobre a superfície da célula ou do vírus, como em oposto ao peptídeo M2e linear.

Exemplo 5: Ligação Viral de Anticorpos monoclonais anti-influenza humanos

Vírus influenza A inativados por UV (A/PR/8/34) (Biotecnologias Aplicadas) foram semeados em placas de 384 poços Maxisorp (Nunc) de 1,2 mg / ml em PBS, com 25 uL / cava, e foi incubada a 40 ⁰ C durante a noite. As placas foram então lavadas três vezes com PBS e bloqueados com leite desnatado seco em 1% PBS, 50 ul / cava, e, em seguida, foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. Após uma segunda lavagem com PBS, MAbs foram adicionados nas concentrações indicadas, em triplicado, e as placas foram incubadas à temperatura ambiente por 1 hora. Após outra lavagem com PBS, a cada cava foi adicionado 25 pl de uma diluição de 1 / 5000 de horseradish peroxidase (HRP) conjugado de cabra anti-lgG humano Fc (Pierce) em PBS leite / 1%, e as placas foram deixadas à temperatura ambiente por 1 hr. Após a lavagem PBS final, o substrato HRP um passo ™ Ultra-TMB-ELISA (Pierce) foi adicionado em 25 uL / cava, e a reação continuou no escuro à temperatura ambiente. O ensaio foi interrompido com 25 uL / bem em H2SO4, e absorção de luz em 450 nm (A450) foi lido em um leitor de placas SpectroMax Plus. Os dados são normalizados para a absorção do ligante MAb 8110 a 10 μg / ml. Os resultados são mostrados nas Figuras 2 A e 2B.

Exemplo 6: A ligação de anticorpos monoclonais anti-influenza humano a variantes M2 de comprimento completo

Variantes M2 (incluindo aqueles com um fenótipo de patologia de alta in vivo) foram selecionados para análise. Veja a Figura 3A para seqüências.

Construtos cDNA M2 foram transitoriamente transfectados em células HEK293 e analisados como segue: para analisar os transfectantes transientes por FACS, as células sobre placas de cultura de tecido com 10 cm foram tratadas com 0,5 mL de tampão de dissociação celular (Invitrogen), e colhidas. As células foram lavadas em PBS contendo 1% FBS, 0,2% NaN3 (tampão FACS) e ressuspenso em 0,6 ml de tampão FACS suplementada com 100 mg / mL de IgG de coelho. Cada transfectant foi misturado com os MAbs indicada na 1 mg / mL em 0,2 ml tampão FACS, com 5 x 105 a 106 células por amostra. As células foram lavadas três vezes com tampão FACS, e cada amostra foi ressuspenso em 0,1 mL contendo 1 mg / mL alexafluor (AF) 647 anti-lgG humana H & L (Invitrogen). As células foram novamente lavadas e citometria de fluxo foi realizada em um dispositivo FACSCanto (Becton-Dickenson). Os dados são expressos como uma porcentagem da média de fluorescência do transfectante transiente M2-D20. Dados para variante de ligação são representativos de dois experimentos. Dados para os mutantes alanina são leituras média de três experimentos separados com erro padrão. Os resultados são mostrados na Figura 3 Be 3C.

Exemplo 7: Mutaqênese de Varredura Alanina para avaliar a ligação M2

Para avaliar a sítios de ligação do anticorpo, alanina foi substituído em posições individuais de aminoácidos como indicada pela mutagênese sítio-direcionada.

Construtos

Construtos cDNA M2 foram transitoriamente transfectadas em células HEK293 e analisados como descrito acima no Exemplo 6. Os resultados são mostrados na Figura 4 A e 4B. A Figura 8 mostra que o epítopo está em uma região amino-terminal altamente conservada do polipeptídeo M2. Como mostrado nas Figuras 4A, 4B e Figura 8, o epítopo 5 inclui a serina na posição 2, a treonina na posição 5 e do ácido glutâmico na posição 6 do polipeptídeo M2.

Exemplo 8: Bloqueio do Epítopo

Para determinar se os MAbs 8110 e 23K12 se ligam ao mesmo sítio, a proteína M2 representando a sequência da cepa influenza A/HK/483/1997 foi expressa de forma estável 10 em linhagem celular CHO (ovário de hamster chinês) DG44 . As células foram tratadas com tampão de dissociação celular (Invitrogen), e colhidas. As células foram lavadas em PBS contendo 1% FBS, 0,2% NaN3 (tampão FACS) e ressuspenso em 107 células / mL em tampão FACS suplementada com 100 mg / mL de IgG de coelho. As células foram préligadas a um ou outro de MAb (ou o controle 2N9) com 10 mg / mL durante 1 hora a 4 °C , e 15 depois foram lavadas com tampão FACS. AF647-8I10 ou -23K12 diretamente conjugados (rotulado com o AlexaFluor ® 647 Proteína Marcando kit (Invitrogen) foi então usado para manchar a três amostras de células pré-b bloqueada a 1 mg / mL para 10⁶ células por amostra. Análises de citometria de fluxo procedeu como antes com o FACSCanto. As leituras de dados são a média de três experimentos separados com erro padrão. Os 20 resultados são mostrados na Figura 5.

Exemplo 9: Ligação de anticorpos monoclonais anti-influenza humano a variantes M2 e peptídeos M2 truncados

A reatividade cruzada de mAbs 8i10 23KI e 2 a outras variantes do peptídeo M2 foi avaliada por ELISA, seqüências peptídicas são mostrados nas Figuras 6 A e 6B. Além disso, 25 um teste de ELISA semelhante foi utilizado para determinar a atividade ligante aos peptídeos M2 truncados.

Em resumo, Em breve, cada peptídeo foi revestido a 2 mg / mL para uma placa de fundo chato com 384 poços (Nunc) em 25 uL / cava de tampão PBS de um dia para o outro a 4 ° C. As placas foram lavadas três vezes e bloqueados com 1% leite / PBS durante uma 30 hora a temperatura ambiente. Após a lavagem três vezes, títulos MAb foram adicionados e incubados por uma hora em temperatura ambiente. HRP conjugados de cabra antiimunoglobulina humana específica FC (Pierce) foi adicionado a cada cava após a lavagem três vezes. As placas foram incubadas durante uma hora à temperatura ambiente e lavadas por três vezes. 1 - Etapa ™ Ultra-TMB-ELISA (Pierce) foi adicionado em 25 uL / cava, e a 35 reação continuou no escuro à temperatura ambiente. O ensaio foi interrompido com 25 uL / bem em H2SO4, e absorção de luz em 450 nm (A450) foi lido em um leitor de placas SpectroMax Plus. Os resultados são mostrados nas Figuras 6 A e 6B.

Exemplo 10: avaliação in vivo da capacidade dos anticorpos monoclonais antiinfluenza humano em proteger de provocação viral letal.

A capacidade de anticorpos, 23K12 e 8110, para proteger ratos de desafio viral com a cepa letal de influenza aviária de alta rota foi testado.

Ratos fêmeas BALB / c foram randomizados em 5 grupos de 10. Um dia antes (dia 1 (menos um)) e dois dias após a infecção (Dia 2 (mais dois), 200 ug de anticorpos foi dada através de 200 ul injeção intra-peritoneal. No dia 0 (zero), uma DL90 aproximada (dose letal 90) de vírus influenza A / Vietnã /1203-1204 , em um volume de 30 pl foi dada intra-nasal. A taxa de sobrevivência foi observada a partir do dia 1 até dia 28 pós-infecção. Os resultados são mostrados na Figura 7.

Outras modalidades

Embora modalidades específicas da invenção tenham sido descritas aqui para os propósitos de ilustração, diversas modificações podem ser feitas sem se desviar do espírito e escopo da invenção. Assim, a invenção não é limitada, exceto como pelas reivindicações anexas.

Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a descrição detalhada dos mesmos, a descrição acima é destinada a ilustrar e não limitar o âmbito de aplicação da invenção, que é definido pelo alcance das reivindicações anexas. Outros aspectos, as vantagens e as modificações estão dentro do escopo das reivindicações que se seguem.

A patente e da literatura científica aqui referida, estabelece o conhecimento que está disponível para aqueles técnicos no assunto. Todas as patentes Estados Unidos e pedidos de patentes EUA publicados ou não publicados mencionados são incorporados por referência. Todas as patentes publicadas estrangeira e aplicações de patentes citados são incorporados por referência. NCBI Genbank e observações indicadas pelo número de acesso citados são incorporados por referência. Todas as outras referências, documentos, manuscritos e literatura científica citados são incorporados por referência.

Embora esta invenção tenha sido especialmente apresentada e descrita com referências às suas modalidades preferidas, será entendido por aqueles técnicos no assunto que várias mudanças na forma e detalhes podem ser feitos nela, sem se afastar do âmbito de aplicação da invenção abrangidos pelas reivindicações anexas.

Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo monoclonal recombinante do ectodomínio da anti-matriz
2. 2 (M2e) totalmente humano, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo compreende,

   a) uma região V_H CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de NYYWS

   5 (SEQ ID NO: 72), uma região V_H CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de FIYYGGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 74), uma região V_HCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de ASCSGGYCILD (SEQ ID NO: 76), uma região V_LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de RASQNIYKYLN (SEQ ID NO: 59), uma região V_L CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de AASGLQS (SEQ ID NO: 61), uma região 10 V_LCDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 63), ou

   b) uma região V_H CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SNYMS (SEQ ID NO: 103), uma região V_H CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de VIYSGGSTYY ADSVK (SEQ ID NO: 105), uma região V_H CDR3 compreendendo a sequên-

   15 cia de aminoácidos de CLSRMRGYGLDV (SEQ ID NO: 107), uma região V_LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de RTSQSISSYLN (SEQ ID NO: 92), uma região V_L CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de AASSLQSGVPSRF (SEQ ID NO: 94), e uma região V_L CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQSYSMPA (SEQ ID NO: 96).

   20 2. Anticorpo monoclonal recombinante do ectodomínio da anti-matriz 2 (M2e) totalmente humano, CARACTERIZADO pelo fato de que se liga ao mesmo epítopo como uma anticorpo compreendendo,

   a) uma região V_H CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de NYYWS (SEQ ID NO: 72), uma região V_H CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de

   25 FIYYGGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 74), uma região V_H CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de ASCSGGYCILD (SEQ ID NO: 76), uma região V_LCDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de RASQNIYKYLN (SEQ ID NO: 59), uma região Vl CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de AASGLQS (SEQ ID NO: 61), uma região V_L CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 63), 30 ou

   b) uma região V_H CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SNYMS (SEQ ID NO: 103), uma região V_H CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de VIYSGGSTYY ADSVK (SEQ ID NO: 105), uma região V_H CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de CLSRMRGYGLDV (SEQ ID NO: 107), uma região V_LCDR1 compre-

   35 endendo a sequência de aminoácidos de RTSQSISSYLN (SEQ ID NO: 92), uma região V_L CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de AASSLQSGVPSRF (SEQ ID NO: 94), e uma região V_L CDR3 compreendendo a sequência de aminoácidos de QQSYSMPA (SEQ ID NO: 96).
3. 3. Anticorpo recombinante do ectodomínio da anti-matriz 2 (M2e), CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma região V_H CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos de NYYWS (SEQ ID NO: 72); uma região V_H CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos de FIYYGGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 74); uma região V_H CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos de ASCSGGYCILD (SEQ ID NO: 76); uma região V_L CDR1 compreendendo a sequência de aminoácidos de RASQNIYKYLN (SEQ ID NO: 59); uma região V_L CDR2 compreendendo a sequência de aminoácidos de AASGLQS (SEQ ID NO: 61); e uma região V_L CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos de QQSYSPPLT (SEQ ID NO: 63).
4. 4. Anticorpo recombinante do ectodomínio da anti-matriz 2 (M2e)„ CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo compreende uma região V_H CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos de SNYMS (SEQ ID NO: 103); uma região V_H CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos de VIYSGGSTYY ADSVK (SEQ ID NO: 105); uma região V_H CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos de CLSRMRGYGLDV (SEQ ID NO: 107); uma região V_L CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácidos de RTSQSISSYLN (SEQ ID NO: 92); uma região V_L CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácidos AASSLQSGVPSRF (SEQ ID NO: 94); e uma região Vl CDR3 compreendendo a seqüência de aminoácidos de QQSYSMPA (SEQ ID NO: 96).
5. 5. Anticorpo monoclonal recombinante do ectodomínio da anti-matriz 2 (M2e) totalmente humano, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

   a) uma seqüência de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e uma seqüência de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 46 ou

   b) uma seqüência de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 e uma seqüência de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 52.
6. 6. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-5 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
7. 7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que adicionalmente compreende uma droga antiviral, um inibidor da entrada viral ou um inibidor da fixação viral.
8. 8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida droga antiviral é um inibidor da neuraminidase, um inibidor da HA, um inibidor do ácido siálico ou um inibidor do canal iônico da M2.
9. 9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido inibidor do canal iônico da M2 é a amantadina e rimantadina.
10. 10. Composição, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido inibidor da neuraminidase é zanamivir ou fosfato de oseltamivir.
11. 11. Composição, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que adicionalmente compreende um segundo anticorpo anti-influenza A.
12. 12. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo está operativamente ligado a um agente terapêutico ou um marcador detectável.
13. 13. Composição, compreendendo a composição conforme definida na reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de ser para estimular uma resposta imune em um indivíduo.
14. 14. Composição, compreendendo a composição conforme definida na reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de ser para o tratamento ou prevenção de uma infecção por vírus influenza em um indivíduo.
15. 15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição adicionalmente compreende uma droga antiviral, um inibidor da entrada viral ou um inibidor da fixação viral.
16. 16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida droga anti-viral é um inibidor da neuraminidase, um inibidor da HA, um inibidor do ácido siálico ou um inibidor de canal iônico da M2.
17. 17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido inibidor de canal iônico da M2 é amantadina ou rimantadina.
18. 18. Composição, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADA pelo fato de que o referido inibidor da neuraminidase é zanamivir ou fosfato de oseltamivir.
19. 19. Composição, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que adicionalmente compreende um segundo anticorpo anti-influenza A.
20. 20. Composição, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida composição é fornecida antes ou após a exposição ao vírus influenza.
21. 21. Composição, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida composição é fornecida em uma dose suficiente para promover a depuração viral ou eliminar as células infectadas por influenza A.
22. 22. Método para determinar a presença de uma infecção por vírus influenza em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:

    a) contatar uma amostra biológica obtida do paciente com o anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-5;

    b) detectar uma quantidade do anticorpo que se liga à amostra biológica; e

    c) comparar a quantidade de anticorpo que se liga à amostra biológica com um valor de controle, e a partir daí determinar a presença do vírus influenza no paciente.
23. 23. Kit de diagnóstico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-5.