DD280119A1 - Verfahren zur herstellung von hbv-dna-rekombinantenklonen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von HBV-DNA-Rekombinatenklonen, bestehend aus Vektor und der DNA des Hepatitis B-Virus (Subtyp adw). Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin, speziell die Diagnostik und die Immunprophylaxe der Hepatitis B. Aus dem Serum eines Patienten mit chronischer Hepatitis B wurden HBV-Partikel isoliert, nach Auffuellung des unvollstaendigen DNA-Plusstranges des Genoms die DNA isoliert, mit Eco RI gespalten und in pUC 19 kloniert. Der Klon pAE2 (IMET 11355) ermoeglicht eine effektive biotechnologische Herstellung von Antigenen zur Diagnostik und Immunprophylaxe der Hepatitis B.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von HBV-DNA-Rekombinantenklonen, bestehend aus Vektor und der DNA des Hepatitis B-Virus, Subtyp adw. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin, speziell die Diagnostik und die Immunprophylaxe der Hepatitis B.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Alle bisher durchgeführten molekularen Klonierungen des kompletten Genoms des Hepatitis B-Virus (HBV) erfolgten auf prinzipiell ähnliche Weise: Der unvollständige Plusstrang der viralen DNA wurde mittels der endogenen DNA-Polymerase aufgefüllt, dann die zirkuläre DNA isoliert, mit geeigneten Restriktionsendonukleasen linearisiert und in geeignete Plasmid- oder Bakteriophagenvektoren eingefügt. Nach Vermehrung in E.coli erfolgte die Selektion HBV-DNA-haltiger Klone.

Als Klonierungsvektoren wurden die Plasmide pBR322, pBR325 und pSP65 sowie der PhageA gtWES. A verwendet.

Von 18 bekannten HBV-DNA-Klonen wurden 9 aus HBV-Präparaten des Subtyps adw hergestellt. Zur Verwendung kamen ausschließlich Virusmaterialien aus Japan, Indonesien und den USA.

Die DNA-Sequenzen der 9HBV(adw)-DNA-Klone unterscheiden sich um 1,1-2,7% voneinander. Okamoto, H. et al. (H 88).

J. gen. Virol 69,2575; Ono, Y. et al. (1983). Nucleic Acids Research 11,1747; Sastrosoewignjo, Rl. et al. (1985). ICMR Annals 5,39; Valenzuela, P. et al. (1980) !·. „Animal Virus Genetics" pp. 57. Herausgeber: Fields, B. N, Jaenisch, R. und Fox, C. F. New York und London: Academie Press.

Für eine eventuelle !mpfstoffproduktion benötigt man HBV-Proteine, die dem regional vorkommenden Erreger entsprechen.

Deshalb sind Proteine, die auf gentechnischem Wege, ausgehend von Viren aus geographisch weit entfernt liegenden Bereichen hergestellt wurden, für eine Impfprophylaxe weniger geeignet.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, einen Rekombinantenklon herzustellen, der DNA eines in der DDR vorkommenden Hepatitis B-Virus, Subtyp adw, enthält, um damit eine biotechnologische Herstellung von HBV-Proteinen zu ermöglichen, die dann als Antigene für die Diagnostik und Immunprophylaxe der Hepatitis B verwendet werden können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrundo, einen Rekombinantenklon herzustellen, der das komplette Genom einer in der DDR vorkommenden Hepatitis B-Virusvariante des Subtyps adw enthält. HBV-DNA-Teilsequenzen dieses Klons, in geeignete Expressionsvektoren umkloniert, sollen geeignet sein, in pro- oder eukaryotischen Zellsystemen HBV-Proteine zu exprimieren. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von HBV-DNA-Rekombinatenklonen, bestehend aus Vektor und der DNA des Hepatitis B-Virus, Subiyp adw, zeichnet sich dadurch aus, daß man aus dem Serum eines geeigneten DDR-Patienten mit chronischer Hepatitis B HBV-Partikel, Subtyp adw, abtrennt. Nach Auffüllung des unvollständigen DNA-Plusstrangs des Genoms mittels der endogenen DNA-Polymerase wird die zirkuläre DNA isoliert und mit Eco Rl linearisiert. Der Plasmidvektor PUC 19 (Yanish-Perron, C. et al. (1985) Gene 33,103.) wird ebenfalls mit Eco Rl linearisiert, mit alkalischer Phosphatase behandelt und dann mit der vorbereiteten HBV-DNA ligiert.

Nach Transformation von E.coli TG-1 und Ausplattieren bilden Bakterien mit rekombinanten pUC 19 auf Medien mit dem Farbstoff X-gal farblose Kolonien, pUC 19 ohne Insert erzeugt blaue Kolonien. Aus farblosen Kolonien wird Plasmid-DNA präpariert und nach Eco Rl-Spaltung und Agarosegelelektrophorese auf Anwesenheit von 3,2kb HBV-DNA geprüft. Man enthält 52 Rekombinantenklone.

Ein wesentlicher Unterschied zu den bisher bekannten HBV(adw)-DNA-Klonen besteht darin, daß der Klon pAE 2 (IMET11355) keinen Spaltort für die Restriktionsendonuklease Xba I besitzt, dafür weist er einen Schnittort für Sna Bl auf (Tab. 1).

Der HBV-DNA-Rekombinantenklon pAE2 wurde in der IMET-Hinterlegungsstelle unter der Nummer IMET11355 hinterlegt.

Durch die Erfindung ist eine effektive biotechnologische Herstellung von HBV-Proteinen möglich. Diese Proteine können vorteilhaft als Antigene zur Diagnostik und Immunprophylaxe von in Mitteleuropa auftretenden HBV-Erkrankungen eingesetzt werden.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Beispiel näher erläutert werden.

Beispiel 1

Alle Methoden wurden, falls nicht anders erwähnt, so wie von Maniatis et al. (Molecular Cloning, a Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982) beschrieben, durchgeführt.

Nach Immundiffusion unter Verwendung spezifischer Antikörper gegen HB₃Ag vom Subtyp adw (WHO-Referenz-Panel) und nach Messung der HBV-DNA-Polymeraseaktivität (Hirschmann, S. Z. et al. (19781. J. Med. Virol 2,61) wurde ein geeignetes Serum mit einem HBV(adw)-Gehalt > 10⁸ Partikpl/ml ausgewählt. lOOml Serum wurden mit 200ml PBS verdünnt und für 4Std. bei 100000g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1OmJ Tris. HCI (pH 7,4) suspendiert, auf einen diskontinuierlichen Sucrosegradienten (10,20 und 30% Sucrose) aufgetragen undfür4Std. bei 200000g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml 1OmM Trie. HCI (pH7,4) aufgenommen. 0,5ml der Virussuspension wurden verwendet, um mittels der enogenen DNA-Polymerasereaktion den inkompletten Plusstrang des Genoms zu vervollständigen (Hirschmann, S.Z. et al. (1978)).

Anschließend wurde das Material in Gegenwart von 5OmM EDTA und 0,4% SDS mit 1 mg/ml Protoinase K für 3,5Std. bei 37"C inkubiert. Die DNA wurde mit Phenol, Phenol/Chloroform und Chloroform ausgeschüttelt, mit Ethanol gefällt und ϊη25μΙΤΕ ge'jst. Nach Reinigung über Sephadex G-50 wurde die DNA nochmals mit Ethanol gefällt und dann mit Eco Rl gespalten. Der Klonierungsvektor pUC 19 wurde ebenfalls mit Eco Rl gespalten und um die Ausbeute an rekombinanter DNA zu erhöhen, mit alkalischer Phosphatase behandelt.

Vektor und HBV-DNA wurden mit T4-DNA-Ligase verknüpft. E.coli TG-1 wurde dann mit der Rekombinanten-DNA transformiert und auf X-gal-Agar ausplattiert. 52 farblose Baktorienkolonien mit rekombinantem pUC 19 wurden erhalten.

Aus 12 dieser Klone wurde Plasmid-DNA präpariert und nach Eco Rl-Spaltung und Agarosegelelektrophorese auf Anwesenheit von 3,2kb HBV-DNA geprüft. 4 Klone enthielan ein 3,2-kb-lnsert (pAE2, pAE3, pAE6, pAE 10), ein Klon enthielt ein unvollständiges, ein anderer ein nichtherausspaltbares Insert, 4 weitere Klone besaßen kein Insert. Mit den Klonen pAE 2 und pAE 10 wurde eine Restriktionsanalyse durchgeführt (Tab. 1) und mit den Daten anderer HBV-(adw)-DNA-Klone verglichen.

Danach sind die Klone pAE2 und pAE 10 identisch und unterscheiden sich von allen anderen Klonen durch das Fehlen eines Schnittortes für Xba I und den Besitz eines Sna Bl-Schnittortes.

Der HBV-DNA-Rekombinantenklon pAE 2 wurde in der IMET-Hinterlegungsstelle unter der Nummer IMET 11355 hinterlegt.

	pAE2,	PH3V933	pHBV3200	pJDW233	pODW282	plBW420
		(Οηο,Υ,)	(Valenzuela,	(Okamoto,	(Okamoto	(Okamoto,
			P.)	H.)	H.)	H.)
Acc I	I	2	2	3	3	3
Apal	I	1	1	0	2	0
ApaLI	1	1	1	1	1	1
BamHI	2	2	2	1	1	1
BgIII	2	3	3	2	3	2
CIaI	0	0	0	0	0	0
Eagl	0	0	0	0	0	0
Eco72l	0	0	0	0	0	0
Eco91l	1	1	1	1	1	1
Eco Rl	1	1	1	0	0	0
ECORV	1	1	1	1	1	1
Kpnl	0	0	0	0	1	1
Ncol	1	1	1	2	2	2
Pst I	1	1	1	0	0	0
Sacll	1	1	1	1	1	1
SnaBI	1	0	0	0	0	0
Sphl	1	1	1	1	1	1
Xba I	0	1	1	1	1	1
Xhol	0	0	0	0	0	0

Tab. 1: Anzahl der Schnittorte verschiedener HBV-(adw)-DNA-Klone für einige ausgewählte Restriktionsendonukleasen

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung von HBV-DNA-Rekombinantenklonen, bestehend aus Vektor und der DNA des Hepatitis B-Virus, Subtyp adw, gekennzeichnet dadurch, daß man aus dem Serum geeigneter Patienten mit chronischer Hepatitis B HBV-Partikel abtrennt, den unvollständigen DNA-Plusstrang des Genoms mittels der endogenen DNA-Polyrnerase auffüllt, die zirkuläre DNA isoliert, mit Eco R I linearisiert, in ein geeignetes Plasmid inseriert, die entstandene Rekombinanten-DNA in Bakterien einbringt, diese ausplattiert, die Plasmid-DNA der entstandenen Bakterienkolonien mittels Restriktionsanalyse auf die Anwesenheit von HBV-DNA überprüft und den Klon pAE2 (Nr. IMET11355) isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß HBV-Partikel (Subtyp adw) aus dem Serum eines Patienten verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Klonierungsvektor das Plasmid pUC 19 eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der linearisierte Vektor mit alkalischer Phosphatase behandelt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der E.coli-Stamm TG1 benutzt.