DD280119A1 - METHOD FOR PRODUCING HBV DNA RECOMBINANT CLONES - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von HBV-DNA-Rekombinatenklonen, bestehend aus Vektor und der DNA des Hepatitis B-Virus (Subtyp adw). Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin, speziell die Diagnostik und die Immunprophylaxe der Hepatitis B. Aus dem Serum eines Patienten mit chronischer Hepatitis B wurden HBV-Partikel isoliert, nach Auffuellung des unvollstaendigen DNA-Plusstranges des Genoms die DNA isoliert, mit Eco RI gespalten und in pUC 19 kloniert. Der Klon pAE2 (IMET 11355) ermoeglicht eine effektive biotechnologische Herstellung von Antigenen zur Diagnostik und Immunprophylaxe der Hepatitis B.The invention relates to a method for producing recombinant HBV-DNA clones consisting of vector and the DNA of the hepatitis B virus (subtype adw). The field of application of the invention is medicine, in particular the diagnosis and immunoprophylaxis of hepatitis B. HBV particles were isolated from the serum of a patient with chronic hepatitis B, the DNA isolated after filling in the incomplete DNA plug of the genome, digested with Eco RI and cloned into pUC19. The clone pAE2 (IMET 11355) enables effective biotechnological production of antigens for the diagnosis and immunoprophylaxis of hepatitis B.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von HBV-DNA-Rekombinantenklonen, bestehend aus Vektor und der DNA des Hepatitis B-Virus, Subtyp adw. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin, speziell die Diagnostik und die Immunprophylaxe der Hepatitis B.The invention relates to a method for producing HBV DNA recombinant clones consisting of vector and the DNA of the hepatitis B virus, subtype adw. The field of application of the invention is medicine, especially the diagnosis and immunoprophylaxis of hepatitis B.
Alle bisher durchgeführten molekularen Klonierungen des kompletten Genoms des Hepatitis B-Virus (HBV) erfolgten auf prinzipiell ähnliche Weise: Der unvollständige Plusstrang der viralen DNA wurde mittels der endogenen DNA-Polymerase aufgefüllt, dann die zirkuläre DNA isoliert, mit geeigneten Restriktionsendonukleasen linearisiert und in geeignete Plasmid- oder Bakteriophagenvektoren eingefügt. Nach Vermehrung in E.coli erfolgte die Selektion HBV-DNA-haltiger Klone.All previously performed molecular cloning of the complete genome of the hepatitis B virus (HBV) was carried out in a basically similar manner: The incomplete plus strand of the viral DNA was filled in by means of the endogenous DNA polymerase, then the circular DNA was isolated, linearized with suitable restriction endonucleases and into appropriate Plasmid or bacteriophage vectors inserted. After propagation in E. coli, the selection of HBV DNA-containing clones was carried out.
Als Klonierungsvektoren wurden die Plasmide pBR322, pBR325 und pSP65 sowie der PhageA gtWES. A verwendet.As cloning vectors, the plasmids pBR322, pBR325 and pSP65 and the phageA gtWES. A used.
Von 18 bekannten HBV-DNA-Klonen wurden 9 aus HBV-Präparaten des Subtyps adw hergestellt. Zur Verwendung kamen ausschließlich Virusmaterialien aus Japan, Indonesien und den USA.Of 18 known HBV DNA clones 9 were prepared from HBV preparations of the adw subtype. Only virus materials from Japan, Indonesia and the USA were used.
Die DNA-Sequenzen der 9HBV(adw)-DNA-Klone unterscheiden sich um 1,1-2,7% voneinander. Okamoto, H. et al. (H 88).The DNA sequences of the 9HBV (adw) DNA clones differ by 1.1-2.7% from each other. Okamoto, H. et al. (H 88).
J. gen. Virol 69,2575; Ono, Y. et al. (1983). Nucleic Acids Research 11,1747; Sastrosoewignjo, Rl. et al. (1985). ICMR Annals 5,39; Valenzuela, P. et al. (1980) !·. „Animal Virus Genetics" pp. 57. Herausgeber: Fields, B. N, Jaenisch, R. und Fox, C. F. New York und London: Academie Press.J. gen. Virol 69, 2575; Ono, Y. et al. (1983). Nucleic Acids Research 11, 1747; Sastrosoewignjo, Rl. et al. (1985). ICMR Annals 5,39; Valenzuela, P. et al. (1980)! "Animal Virus Genetics" pp. 57. Editors: Fields, B. N, Jaenisch, R. and Fox, C. F. New York, and London: Academie Press.
Für eine eventuelle !mpfstoffproduktion benötigt man HBV-Proteine, die dem regional vorkommenden Erreger entsprechen.For a possible vaccine production one needs HBV proteins, which correspond to the locally occurring exciter.
Deshalb sind Proteine, die auf gentechnischem Wege, ausgehend von Viren aus geographisch weit entfernt liegenden Bereichen hergestellt wurden, für eine Impfprophylaxe weniger geeignet.Therefore, proteins produced by genetic engineering from viruses in geographically distant regions are less suitable for vaccine prophylaxis.
Die Erfindung hat das Ziel, einen Rekombinantenklon herzustellen, der DNA eines in der DDR vorkommenden Hepatitis B-Virus, Subtyp adw, enthält, um damit eine biotechnologische Herstellung von HBV-Proteinen zu ermöglichen, die dann als Antigene für die Diagnostik und Immunprophylaxe der Hepatitis B verwendet werden können.The object of the invention is to prepare a recombinant clone containing DNA of a GDR hepatitis B virus, subtype adw, in order to enable biotechnological production of HBV proteins, which are then used as antigens for the diagnosis and immunoprophylaxis of hepatitis B can be used.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrundo, einen Rekombinantenklon herzustellen, der das komplette Genom einer in der DDR vorkommenden Hepatitis B-Virusvariante des Subtyps adw enthält. HBV-DNA-Teilsequenzen dieses Klons, in geeignete Expressionsvektoren umkloniert, sollen geeignet sein, in pro- oder eukaryotischen Zellsystemen HBV-Proteine zu exprimieren. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von HBV-DNA-Rekombinatenklonen, bestehend aus Vektor und der DNA des Hepatitis B-Virus, Subiyp adw, zeichnet sich dadurch aus, daß man aus dem Serum eines geeigneten DDR-Patienten mit chronischer Hepatitis B HBV-Partikel, Subtyp adw, abtrennt. Nach Auffüllung des unvollständigen DNA-Plusstrangs des Genoms mittels der endogenen DNA-Polymerase wird die zirkuläre DNA isoliert und mit Eco Rl linearisiert. Der Plasmidvektor PUC 19 (Yanish-Perron, C. et al. (1985) Gene 33,103.) wird ebenfalls mit Eco Rl linearisiert, mit alkalischer Phosphatase behandelt und dann mit der vorbereiteten HBV-DNA ligiert.The invention has for its object to produce a recombinant clone containing the complete genome of a occurring in the GDR hepatitis B virus variant of the subtype adw. HBV partial DNA sequences of this clone, cloned into suitable expression vectors, should be suitable for expressing HBV proteins in prokaryotic or eukaryotic cell systems. The method according to the invention for the production of HBV-DNA recombinant clones, consisting of vector and the DNA of the hepatitis B virus, Subiyp adw, is characterized in that HBV particles from the serum of a suitable DDR patient with chronic hepatitis B, Subtype adw, separates. After filling the incomplete DNA plus strand of the genome by means of the endogenous DNA polymerase, the circular DNA is isolated and linearized with Eco RI. The plasmid vector PUC 19 (Yanish-Perron, C. et al. (1985) Gene 33, 103) is also linearized with Eco RI, treated with alkaline phosphatase and then ligated with the prepared HBV DNA.
Nach Transformation von E.coli TG-1 und Ausplattieren bilden Bakterien mit rekombinanten pUC 19 auf Medien mit dem Farbstoff X-gal farblose Kolonien, pUC 19 ohne Insert erzeugt blaue Kolonien. Aus farblosen Kolonien wird Plasmid-DNA präpariert und nach Eco Rl-Spaltung und Agarosegelelektrophorese auf Anwesenheit von 3,2kb HBV-DNA geprüft. Man enthält 52 Rekombinantenklone.After transformation of E. coli TG-1 and plating, bacteria with recombinant pUC 19 on media with the dye X-gal form colorless colonies, pUC 19 without insert produces blue colonies. From colorless colonies, plasmid DNA is prepared and tested for Eco RI cleavage and agarose gel electrophoresis for the presence of 3.2 kb HBV DNA. One contains 52 recombinant clones.
Ein wesentlicher Unterschied zu den bisher bekannten HBV(adw)-DNA-Klonen besteht darin, daß der Klon pAE 2 (IMET11355) keinen Spaltort für die Restriktionsendonuklease Xba I besitzt, dafür weist er einen Schnittort für Sna Bl auf (Tab. 1).An essential difference to the hitherto known HBV (adw) -DNA clones is that the clone pAE 2 (IMET11355) has no cleavage site for the restriction endonuclease Xba I, but he has a cut location for Sna Bl (Table 1).
Der HBV-DNA-Rekombinantenklon pAE2 wurde in der IMET-Hinterlegungsstelle unter der Nummer IMET11355 hinterlegt.The HBV DNA recombinant clone pAE2 has been deposited in the IMET depository under the number IMET11355.
Durch die Erfindung ist eine effektive biotechnologische Herstellung von HBV-Proteinen möglich. Diese Proteine können vorteilhaft als Antigene zur Diagnostik und Immunprophylaxe von in Mitteleuropa auftretenden HBV-Erkrankungen eingesetzt werden.The invention enables effective biotechnological production of HBV proteins. These proteins can be used advantageously as antigens for the diagnosis and immunoprophylaxis of HBV diseases occurring in Central Europe.
Ausführungsbeispielembodiment
Die Erfindung soll nachfolgend durch ein Beispiel näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail by way of example.
Alle Methoden wurden, falls nicht anders erwähnt, so wie von Maniatis et al. (Molecular Cloning, a Laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982) beschrieben, durchgeführt.All methods were, unless otherwise stated, as described by Maniatis et al. (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (1982).
Nach Immundiffusion unter Verwendung spezifischer Antikörper gegen HB3Ag vom Subtyp adw (WHO-Referenz-Panel) und nach Messung der HBV-DNA-Polymeraseaktivität (Hirschmann, S. Z. et al. (19781. J. Med. Virol 2,61) wurde ein geeignetes Serum mit einem HBV(adw)-Gehalt > 108 Partikpl/ml ausgewählt. lOOml Serum wurden mit 200ml PBS verdünnt und für 4Std. bei 100000g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1OmJ Tris. HCI (pH 7,4) suspendiert, auf einen diskontinuierlichen Sucrosegradienten (10,20 und 30% Sucrose) aufgetragen undfür4Std. bei 200000g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml 1OmM Trie. HCI (pH7,4) aufgenommen. 0,5ml der Virussuspension wurden verwendet, um mittels der enogenen DNA-Polymerasereaktion den inkompletten Plusstrang des Genoms zu vervollständigen (Hirschmann, S.Z. et al. (1978)).After immunodiffusion using specific antibodies against HB 3 Ag of subtype adw (WHO reference panel) and after measurement of HBV DNA polymerase activity (Hirschmann, SZ et al. (19781. J. Med. Virol 2,61)) suitable serum with HBV (adw) content selected> 10 8 Partikpl / ml. lOOml serum were diluted with 200 ml of PBS and centrifuged for 4h. at 100,000g. The pellet was suspended in 1OmJ Tris. HCl (pH 7.4) to A discontinuous sucrose gradient (10.20 and 30% sucrose) was applied and centrifuged for 4 hrs at 200000g The pellet was taken up in 1 ml of 10 mM Trie HCl (pH 7.4) 0.5 ml of the virus suspension was used to digest by means of the enogenous DNA Polymerase reaction to complete the incomplete plus strand of the genome (Hirschmann, SZ et al., (1978)).
Anschließend wurde das Material in Gegenwart von 5OmM EDTA und 0,4% SDS mit 1 mg/ml Protoinase K für 3,5Std. bei 37"C inkubiert. Die DNA wurde mit Phenol, Phenol/Chloroform und Chloroform ausgeschüttelt, mit Ethanol gefällt und ϊη25μΙΤΕ ge'jst. Nach Reinigung über Sephadex G-50 wurde die DNA nochmals mit Ethanol gefällt und dann mit Eco Rl gespalten. Der Klonierungsvektor pUC 19 wurde ebenfalls mit Eco Rl gespalten und um die Ausbeute an rekombinanter DNA zu erhöhen, mit alkalischer Phosphatase behandelt.Subsequently, the material was incubated in the presence of 50 mM EDTA and 0.4% SDS with 1 mg / ml protoinase K for 3.5 h. incubated at 37 ° C. The DNA was extracted by shaking with phenol, phenol / chloroform and chloroform, precipitated with ethanol and precipitated with ηημμΙΤΕ After purification on Sephadex G-50, the DNA was again precipitated with ethanol and then cleaved with Eco RI Cloning vector pUC 19 was also cleaved with Eco RI and to increase the yield of recombinant DNA, treated with alkaline phosphatase.
Vektor und HBV-DNA wurden mit T4-DNA-Ligase verknüpft. E.coli TG-1 wurde dann mit der Rekombinanten-DNA transformiert und auf X-gal-Agar ausplattiert. 52 farblose Baktorienkolonien mit rekombinantem pUC 19 wurden erhalten.Vector and HBV DNA were linked to T4 DNA ligase. E. coli TG-1 was then transformed with the recombinant DNA and plated on X-gal agar. 52 colorless bacterial colonies with recombinant pUC 19 were obtained.
Aus 12 dieser Klone wurde Plasmid-DNA präpariert und nach Eco Rl-Spaltung und Agarosegelelektrophorese auf Anwesenheit von 3,2kb HBV-DNA geprüft. 4 Klone enthielan ein 3,2-kb-lnsert (pAE2, pAE3, pAE6, pAE 10), ein Klon enthielt ein unvollständiges, ein anderer ein nichtherausspaltbares Insert, 4 weitere Klone besaßen kein Insert. Mit den Klonen pAE 2 und pAE 10 wurde eine Restriktionsanalyse durchgeführt (Tab. 1) und mit den Daten anderer HBV-(adw)-DNA-Klone verglichen.From 12 of these clones plasmid DNA was prepared and tested for Eco RI cleavage and agarose gel electrophoresis for the presence of 3,2kb HBV DNA. Four clones contained a 3.2 kb insert (pAE2, pAE3, pAE6, pAE10), one clone contained an incomplete, another a non-cleavable insert, four other clones had no insert. Restriction analysis was performed with clones pAE 2 and pAE 10 (Table 1) and compared with data from other HBV (adw) DNA clones.
Danach sind die Klone pAE2 und pAE 10 identisch und unterscheiden sich von allen anderen Klonen durch das Fehlen eines Schnittortes für Xba I und den Besitz eines Sna Bl-Schnittortes.Thereafter, the clones pAE2 and pAE 10 are identical and differ from all other clones in the absence of a cut site for Xba I and possession of a Sna Bl cut site.
Der HBV-DNA-Rekombinantenklon pAE 2 wurde in der IMET-Hinterlegungsstelle unter der Nummer IMET 11355 hinterlegt.The HBV DNA recombinant clone pAE 2 has been deposited in the IMET depository under the number IMET 11355.
Tab. 1: Anzahl der Schnittorte verschiedener HBV-(adw)-DNA-Klone für einige ausgewählte RestriktionsendonukleasenTable 1: Number of cut sites of different HBV (adw) DNA clones for some selected restriction endonucleases
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD32573389A DD280119A1 (en) | 1989-02-13 | 1989-02-13 | METHOD FOR PRODUCING HBV DNA RECOMBINANT CLONES |
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| DD32573389A DD280119A1 (en) | 1989-02-13 | 1989-02-13 | METHOD FOR PRODUCING HBV DNA RECOMBINANT CLONES |
Publications (1)
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|---|---|
| DD280119A1 true DD280119A1 (en) | 1990-06-27 |
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Family Applications (1)
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| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD280119A1 (en) |
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1989
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