SI22056A - Visoko-produkcijski rekombinantni sevi kvasovk s spremenjeno galaktozno regulacijo transkripcije - Google Patents

Visoko-produkcijski rekombinantni sevi kvasovk s spremenjeno galaktozno regulacijo transkripcije Download PDF

Info

Publication number
SI22056A
SI22056A SI200500131A SI200500131A SI22056A SI 22056 A SI22056 A SI 22056A SI 200500131 A SI200500131 A SI 200500131A SI 200500131 A SI200500131 A SI 200500131A SI 22056 A SI22056 A SI 22056A
Authority
SI
Slovenia
Prior art keywords
strains
galactose
gene
gali
inducible promoter
Prior art date
Application number
SI200500131A
Other languages
English (en)
Inventor
Stagoj Mateja Novak
Sasa Comino
Radovan Komel
Original Assignee
Kemijski Institut
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kemijski Institut filed Critical Kemijski Institut
Priority to SI200500131A priority Critical patent/SI22056A/sl
Priority to PCT/SI2006/000011 priority patent/WO2006118550A2/en
Priority to US11/913,028 priority patent/US20090047708A1/en
Priority to EP06733568A priority patent/EP1880009B1/en
Priority to DK06733568.7T priority patent/DK1880009T3/da
Priority to AT06733568T priority patent/ATE513047T1/de
Publication of SI22056A publication Critical patent/SI22056A/sl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Predmet izuma so visoko-produkcijski rekombinantni organizmi, ki imajo galaktozno regulacijo, pri katerih je bila na kromosomih izvedena zamenjava gena, ki kodira encim, ki metabolno pretvarja transkripcijski induktor v neaktiven metabolit, z genom,ki kodira transkripcijski faktor za galaktoza-inducibilne promotorje. Izhodni sev je prednostno iz druzine Saccharomycetaceae ali Cryptococcaceae, sebolj prednostno iz vrste rodu Saccharomyces. Gen GAL1, kodira encim za pretvorbo galaktoze, gen GAL4, kodira transkripcijski faktor. Galaktoza-inducibilni promotor je reguliran s transkripcijskim faktorjem Gal4 in prednostno uravnava transkripcijo GAL1, GAL2, GAL7, GAL10 ali MEL1. Sevi, ki so predmet izuma, so gostitelji plazmidov za heterologno ekspresijo genov iz galaktoza-inducibilnega promotorja in se uporabljajo za pridobivanje biolosko aktivnih snovi in ostalih biotehnoloskih produktov. Predmet izuma je proizvodnja biolosko aktivnih snovi in ostalih biotehnoloskih produktov iz zgoraj opisanih sevov.

Description

Visoko-produkcijski rekombinantni sevi kvasovk s spremenjeno galaktozno regulacijo transkripcije
Področje tehnike
Predloženi izum se nanaša na visoko-produkcijske rekombinantne seve kvasovk s spremenjeno galaktozno regulacijo transkripcije, postopek priprave biološko aktivnih snovi in njihovo uporabo ter sodi na področje biotehnologije. Temeljni namen biotehnologije je industrijsko izkoriščanje biokultur (mikroorganizmov, tkivnih in celičnih kultur) za pridobivanje različnih biotehnoloških produktov, ki se uporabljajo v prehrambeni in farmacevtski industriji. Kvasovka Saccharomyces cerevisiae je pomemben gostitelj za pridobivanje različnih heterolognih proteinov, ki jih uporabljamo za pripravo zdravilnih in diagnostičnih pripravkov ter cepiv. S. cerevisiae uvrščamo v t.i. GRAS (Generally Regarded as Safe, splošno priznani kot vami) organizme. Kvasovka S. cerevisiae je poleg vame uporabe tudi najbolj proučen evkariontski mikroorganizem.
Povzetek izuma
Predmet izuma je mikrobiološki postopek, pri katerem je bil na mikrobiološkem materialu opravljen poseg. Bistvo predloženega izuma je zamenjava gena GALI z genom GAL4 v kromosomu kvasovke S. cerevisiae. Lokus gena GALI, ki kodira encim galaktokinazo, smo s homologno rekombinacijo zamenjali z genom za transkripcij ski aktivator Gal4. Načrtovana zamenjava genov je v mutiranem sevu S. cerevisiae povzročila bistveno izboljšanje sinteze rekombinantnih proteinov, ki se izražajo pod kontrolo promotoija GALI.
Celoten postopek zamenjave genov GAL v genomu, kije predmet izuma, omogoča pripravo visoko-produkcijskih rekombinantnih sevov S. cerevisiae, ki so primerni za ekspresijo industrijsko (farmacevtsko) zanimivih proteinov. Pri uporabi rekombinantnega seva, ki je predmet izuma, se bistveno zmanjšajo vhodni stroški produkcije (galaktoza je relativno drag induktor) in obenem se doseže visoka produkcija želenega rekombinantnega proteina.
Znano stanje
Kvasovka S. cerevisiae je pomembno orodje za pridobivanje rekombinantnih proteinov. V letu 1981 so prvič uporabili rekombinantne kvasovke za pripravo človeškega interferona. Že leto kasneje so s pomočjo kvasovk prvič izdelali rekombinantno cepivo za hepatitis B. Inzulin, pridobljen iz rekombinantnih S. cerevisiae, pa danes pokriva kar polovico vseh svetovnih potreb.
Izražanje genov je kompleksen večstopenjski proces. Med najpomembnejšimi dejavniki, ki vplivajo na specifično produktivnost, so jakost promotorja, število kopij plazmida v celici in prisotnost 5'-nekodirajočega vodilnega zaporedja. Spoznanja in raziskave o regulaciji genov pri kvasovkah so v veliki meri prispevale k razumevanju mehanizmov ekspresije genov pri višjih evkariontih. Med najboj proučene mehanizme pri kvasovkah prav gotovo sodi mehanizem uravnavanja genov GAL. Poglavitne značilnosti GAL modela sta že v 70. letih postavila Douglas in Hawthome.
Geni GALI, GAL7 in GAL10 so nakopičeni v bližini centromere na kromosomu II, medtem ko regulatomi geni GAL4, GAL80 in GAL3 ležijo na ločenih kromosomih. Gen GAL4 se nahaja na kromosomu XVI. Protein Gal4 zavzema osrednjo vlogo v regulaciji genov GAL. Nujno je potreben za transkripcijo genov GALI, -2, -7 in -10. Posledica mutacije v GAL4 je nezmožnost prepisovanja teh genov. Tesno regulirani geni GALI, GAL7 in GAL10 kodirajo proteine (galaktokinaza, transferaza in epimeraza), ki so ključni v metabolizmu galaktoze. Pomemben encim v metabolni poti je galaktokinaza (EC 2.7.1.6), ki pretvaija induktor galaktozo v galaktoza-1 -fosfat. Galaktoza prehaja v kvasno celico s pomočjo posebnega prenašalca, permeaze, ki ga kodira gen GAL2. Izražanje genov GAL je natančno regulirano: v prisotnosti galaktoze se izražanje teh genov močno poveča, tudi do 1000-krat, medtem ko glukoza močno zavira izražanje le-teh. Rast v gojišču z glukozo prepreči (tudi v prisotnosti galaktoze) izražanje genov GAL. Ta pojav imenujemo katabolna represija.
Promotorske sekvence genov GALI, GAL7 in GAL10, ki uravnavajo visoko ekspresijo teh genov, sodijo med najbolj preučene v S. cerevisiae. Pomembne so za načrtovanje in konstrukcijo vektoijev. Znani sta dve ključni prednosti uporabe promotoijev GAL. Prvič, možnost gojenja celic v gojišču, kjer je aktivnost teh promotorjev skoraj popolnoma zavrta, kar omogoča gojenje do primerne gostote celic (biomase) in sosledno indukcijo. S tem je omogočena tudi produkcija proteinov, ki so potencialno toksični za kvasno celico. Ter drugič, ti promotorji spadajo med najmočnejše v S. cerevisiae.
Pozitivni regulator je transkripcijski dejavnik Gal4, ki se veže na promotorska zaporedja teh genov. Negativni regulator Gal80 v prisotnosti glukoze, z vezavo na Gal4, preprečuje indukcijo. GAL4 se v celici izraža v zelo nizki količini (le ena do dve molekuli). Za optimalno indukcijo promotorjev GAL pa je nujno potrebna zadostna raven proteina Gal4 v celici. To je posebej pomembno za produkcijo heterolognih proteinov, ki se izražajo iz plazmidov, ki so prisotni v več kopijah (multi-copy plazmidi).
Raven izražanja tarčnega proteina v veliki meri določajo lastnosti, ki so lastne izraženemu proteinu. Vendar pa lahko izkoristek precej izboljšamo z upoštevanjem različnih dejavnikov, ki vplivajo na gensko ekspresijo ter stabilnost produkta. V strokovni literaturi zasledimo več poskusov genetskega inženiringa sistema GAL z namenom optimizacije fermentacij skih procesov.
Ker je transkripcij ski dejavnik Gal4 prisoten v celici v zelo nizki koncentraciji in zato omejuje indukcijo genov GAL, so raziskovalci poskusili premostiti to težavo. Rešitev vsekakor ni v konstitutivni prekomerni ekspresiji GAL4, kajti posledica tega je izguba regulacije. Da bi se izognili tej težavi, je nujno potrebna kontrolirana ekspresija. Leta 1984 je Laughon s sodelavci v reviji Molecular and Celular Biology 4, 268-275 opisal transformirane kvasne seve, ki vsebujejo multi-copy plazmide s strukturnim genom GAL4 pod kontrolo promotorja GALI. V literaturi in v patentnih spisih so opisani primeri integracije GAL4 s promotorjem GAL10 v genom kvasovke S. cerevisiae. V patentu US5068185 je opisana integracija ekspresijske kasete GAL10-GAL4 v kromosomalni lokus HIS3. N prisotnosti galaktoze so opazili 3-kratno povečanje produkcije tarčnega proteina (US5068185), (Schultz in sod., 1987).
Uporabo produkcijskih sevov, ki imajo mutiran gen GALI, je utemeljil že Hovland s sodelavci leta 1989 v reviji Gene 15, 57-64 ter kasneje še številni drugi. Ugotovili so, da se pri mutiranih sevih (gall), ki niso sposobni induktoija metabolno pretvarjati, ekspresija tarčnih genov, ki so pod kontrolo promotoijev GAL, signifikantno poveča. V sevih gall ostaja raven galaktoze v fermentacij skih gojiščih nespremenjena, kar omogoča in zagotavlja stalno ter konstantno indukcijo promotorjev GAL.
Problem stanja tehnike, ki za produkcijo biološko aktivnih substanc zahteva visoko raven galaktoze v gojišču, smo rešili z zamenjavo genov GAL na način, ki omogoča višjo produkcijo biološko aktivnih substanc v gojišču z nižjo koncentracijo induktoija. V stanju tehnike ne zasledimo opisa zamenjave gena GALI z genom GAL4, kar je predmet tega izuma. Da bi preučili in določili ali opisana zamenjava vpliva na ekspresijo heterolognih genov, smo v mutiranem sevu, ki je tudi predmet izuma, v sevu gall ter v izogenem sevu, spremljali raven zeleno-flurescirajočega proteina (GFP) in hepatitis B antigena (HBsAg).
GFP so uspešno izrazili v številnih heterolognih organizmih (Yang in sod., 1996, Nature Biotechnology 14, 1246-1251). Gen za GFP so izolirali iz meduze Aequorea victoria. Protein je zgrajen iz 238 aminokislin in ima molekulsko maso 26,9 kDa (Prasher in sod., 1992, Gene 111, 229-233). Zgradba proteina in zaščita fluorofora v notranjosti lete sta razlog za stabilnost proteina in odpornost na različne fizikalne in kemijske dejavnike. Glavna prednost GFP-ja, v primeijavi z drugimi poročevalskimi molekulami, je prisotnost fluorofora znotraj primarne strukture proteina. Fluorescenca je vrstno nespecifična in stabilna, za fluorescenco niso potrebni kofaktoiji ali eksogeni substrati, detektiramo jo enostavno z UV lučjo ter jo lahko sledimo neinvazivno v živih celicah (Kain in sod., 1995, Biotechniques 19, 650-655). GFP ima vrh absorbance pri 395 nm ter nižji vrh pri 475 nm, emisijski (flurescentni) vrh pa pri 509 nm.
Uporaba GFP se je razširila na številna področja biotehnologije. Enostavno spremljanje celotnega bioprocesa; od selekcije klonov, spremljanje pogojev produkcije ter izolacije proteinov, omogoča optimizacijo vseh stopenj produkcije rekombinantnega proteina (Albano in sod., 1998, Biotechnology Progress 14, 351-354; Misteli in Spector, 1997, Nature Biotecnology 15, 961-964; Poppenborg in sod., 1997, Journal of Biotechnology 58, 79-88).
Kljub velikemu številu novih ekspresijskih sistemov, kvasovka S. cerevisiae ostaja pomemben gostitelj za pridobivanje različnih heterolognih proteinov, kijih uporabljamo za pripravo zdravilnih in diagnostičnih pripravkov ter cepiv.
Očitna pomanjkljivost, opisana v znanem stanju je, da znane rešitve za produkcijo biološko aktivnih substanc s sevi z galaktozno regulacijo, zahtevajo višjo raven galaktoze v gojišču in obenem dajejo manj rekombinantnega produkta.
Naloga izuma je torej konstrukcija visoko-produkcijskega rekombinantnega seva, ki omogoča visoko produkcijo želenega rekombinantnega proteina z nizko koncentracijo galaktoze v gojišču. Rekombinantni sev po izumu naj omogoča bistveno povišanje izkoristka celotnega bioprocesa in s tem zmanjšanje stroškov.
Naloga je po izumu rešena z zamenjavo gena, ki kodira encim za pretvorbo transkripcij skega induktorja - galaktoze v neaktiven produkt, z genom, ki kodira transkripcij ski faktor za galaktoza-inducibilni promotor po neodvisnih patentnih zahtevkih.
Opis slik
Slika 1: Produkcija GFP iz vektorja YCpGALl-GFP v 1 mL kulture z gostoto celic 2x10 /mL, pri opisanih pogojih gojenja, v mutiranem sevu, v gall ter v izogenem sevu.
Slika 2: Produkcija GFP iz vektoija YEpl81GALl-GFP v 1 mL kulture z gostoto celic 2xlO7/mL, pri opisanih pogojih gojenja, v mutiranem sevu, v gall ter v izogenem sevu.
Definicije
Izraz 'galaktozna regulacija' se nanaša na uravnavanje transkripcije določenih genov z efektorskimi molekulami ali transkripcij skimi induktorji, v tem primeru z galaktozo.
Izraz 'kromosom' se nanaša na nitaste tvorbe iz kromatina v evkariontskem celičnem jedru, ki so nosilci genetskih informacij - zapisanih v linearno razporejenih genih.
Izraz 'transkripcij ski induktor' se nanaša na organsko molekulo, ki v celici povzroči aktivacijo transkripcije strukturnih genov.
Izraz 'transkripcijski faktor' se nanaša na gen oziroma genski produkt, ki ureja predvsem obseg in hitrost transkripcije drugih, oddaljenih genov. V tem primeru je to Gal4, ki uravnava transkripcijo genov GAL regulona.
Izraz 'promotor' se nanaša na specifično zaporedje DNA molekule - DNA vezavno mesto za RNA polimerazo II in druge proteine ter molekule, ki so potrebni za začetek (iniciacijo) transkripcije.
Izraz 'galaktoza - inducibilni promotor' se nanaša na specifično zaporedje DNA molekule - DNA vezavno mesto za: RNA polimerazo II in druge proteine ter induktor galaktozo, ki so potrebni za začetek (iniciacijo) transkripcije.
Izraz 'homologna ekspresija' se nanaša na izražanje lastne - izvorne genetske snovi ali genskega zapisa v nekem organizmu. Produkt je enak in lasten organizmu tako po zgradbi kot po delovanju.
Izraz 'heterologna ekspresija' se nanaša na izražanje genetske snovi ali genskega zapisa, ki izhaja iz druge vrste v nekem drugem organizmu - gostitelju.
Izraz 'gostitelj ski plazmid' se nanaša na nekromosomski genetski element, ki ima funkcionalno replikacijsko mesto, genetski označevalec (marker), ki omogoča njegovo razpoznavo in strukturni gen pod kontrolo močnega promotoija, ki omogoča ekspresijo tarčnega proteina v določenem organizmu - gostitelju.
Opis izuma
Po izumu je gen GALI zamenjen z genom GAL4 v kromosomu kvasovke S. cerevisiae. Lokus gena GALI, ki kodira encim galaktokinazo, je s homologno rekombinacijo zamenjan z genom za transkripcij ski aktivator Gal4, kar presenetljivo izboljša sintezo rekombinantnih proteinov, ki se izražajo pod kontrolo promotoija GALI.
Navedena zamenjava se nanaša na seve z galaktozno regulacijo, pri katerih je na kromosomu zamenjan gen, ki kodira encim za pretvorbo transkripcij skega induktorja v neaktiven produkt, z genom, ki kodira transkripcij ski faktor za galaktoza - inducibilni promotor. Prednostno so sevi iz družine Saccharomycetaceae ali Cryptococcaceae, prednostno iz vrst rodu Saccharomyces, prednostno vrste Saccharomyces cerevisiae.
Navedeni sevi so tisti sevi, katerih gen, ki kodira encim za pretvorbo transkripcij skega induktorja v neaktiven produkt, je gen GALI.
Navedeni sevi so tisti sevi, katerih gen, ki kodira transkripcij ski faktorje gen GAL4, prednostno je sinteza transkripcij skega faktoija GAL4 pod kontrolo galaktoza 7 inducibilnega promotorja, prednostno promotorja GALI, GAL2, GAL7, GAL10 ali MEL1, prednostno promotorja GALI.
Navedeni sevi so tisti sevi, za katere je značilno, da galaktoza - inducibilni promotor sproži izražanje proteinov v prisotnosti transkripcijskega induktorja, prednostno so to promotorji genov GALI, GAL2, GAL7, GAL 10 ali MEL1.
Navedeni sevi so tisti sevi, za katere je značilno, da so gostitelji plazmidov za heterologno ali homologno ekspresijo genov in/ali se uporabljajo za sintezo biološko aktivnih snovi in ostalih biotehnoloških produktov, prednostno so plazmidi za heterologno ali homologno ekspresijo genov pod kontrolo galaktoza - inducibilnega promotorja, prednostno pod kontrolo promotorjev genov GALI, GAL2, GAL7, GAL10 ali MEL1.
Navedene seve se po izumu uporablja za sintezo biološko aktivnih snovi in ostalih biotehnoloških produktov.
V okviru izuma je uporaba navedenih sevov za pripravo biološko aktivnih snovi in ostalih biotehnoloških produktov iz sevov z galaktozno regulacijo, pri katerih je na kromosomu zamenjan gen, ki kodira encim za pretvorbo transkripcij skega induktorja v neaktiven produkt, z genom, ki kodira transkripcij ski faktor za galaktoza - inducibilne promotorje, ki so opisani zgoraj.
Uporaba navedenih sevov za pridobivanje biološko aktivnih snovi in ostalih biotehnoloških produktov s pomočjo navedenih sevov z galaktozno regulacijo, prednostno iz družine Saccharomycetaceae ali Cryptococcaceae, prednostno iz rodu Saccharomyces, prednostno iz Saccharomyces cerevisiae.
Uporaba navedenih sevov za pridobivanje biološko aktivnih snovi in ostalih biotehnoloških produktov s pomočjo navedenih sevov, katerih značilnost je, da je gen, ki kodira encim za pretvorbo transkripcij skega induktorja v neaktiven produkt, gen GALI zamenjan z genom, ki kodira transkripcij ski faktor, gen GAL4.
Uporaba navedenih sevov za pridobivanje biološko aktivnih snovi in ostalih biotehnoloških produktov s pomočjo navedenih sevov, pri katerih je sinteza transkripcij skega faktorja GAL4 pod kontrolo galaktoza - inducibilnega promotorja, prednostno pod kontrolo promotorja GALI.
Uporaba navedenih sevov za pridobivanje biološko aktivnih snovi in ostalih biotehnoloških produktov s pomočjo navedenih sevov, pri katerih galaktoza - inducibilni promotor sproži izražanje proteinov v prisotnosti transkripcij skega induktoga, ki je prednostno izbran med promotorji genov GALI, GAL2, GAL7, GAL10 ali MEL1.
Uporaba navedenih sevov za pridobivanje biološko aktivnih snovi in ostalih biotehnoloških produktov s pomočjo navedenih sevov, ki so gostitelji plazmidov za heterologno ali homologno ekspresijo genov, prednostno so plazmidi pod kontrolo galaktoza - inducibilnega promotorja, prednostno izbrani med promotorji genov GALI, GAL2, GAL7, GAL10 ali MELE
Izum so produkti, pridobljeni z uporabo visoko-produkcijskih rekombinantnih sevov kvasovk s spremenjeno galaktozno regulacijo transkripcije; prednostno so produkti polipeptidi, prednostno homologni in /ali heterologni proteini.
Opisi materialov in metod v nadaljevanju so zgolj informativne narave in služijo pojasnjevanju izuma. V postopkih se lahko uporablja tudi druge ustrezne materiale in metode, ki so poznani strokovnjakom s področja.
Predloženi primeri izum prikazujejo in pojasnjujejo, vendar v ničemer ne omejujejo.
Primeri
Primer 1: KONSTRUKCIJA VISOKO-PRODUKCIJSKEGA REKOMBINANTNEGA SEVA Z ZAMENJAVO GENA GALI L GENOM GAL4 NA KROMOSOMU KVASOVKE S. CEREVISIAE
Predmet priloženega izuma je zamenjava genov GAL na kromosomu II kvasovke S. cerevisiae, ki smo jo izvedli po metodi 'delitto perfetto' (Storici in sod., 2001, Nature Biotechnology 19, 773-776). Zamenjavo omenjenih genov lahko izvedemo tudi na kakšen drug način.
Inaktivacija gena GALI ter vstavitev GAL4 vključuje več stopenj:
Z oligonukleotidi GAL 1 -core-S 1 (GTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACTATAATGgagctcgtttt cgacactgg) in GALl-core-S2 (GAAAAAAATGAGAAGTTGTTCTGAACAAAGTAAAAAAAAGAAGTATACtccttac cattaagttgatc) smo z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) iz plazmida pCORE (dar F. Storici) namnožili poročevalsko kaseto CORE, dolgo 3,2 kb. Kaseta CORE je sestavljena iz genskega zapisa £a«MX4 in omogoča selekcijo pozitivnih transformant na gojišču z geneticinom (G418), ter iz A7URA3 za selekcijo na gojišču s 5-fluoroorotično kislino (5-FOA). Himemi 67 bazni oligonukleotid GALl-core-Sl je sestavljen iz 47 baz, ki so homologne tarčnemu mestu integracije, to je 5' GALI mestu, ter iz preostalih 20 baz homolognih kaseti AzznMX4. GALl-core-S2 je prav tako sestavljen iz 48 baz homolognih 3' GALI mestu in 20 homolognih baz A7URA3. Poročevalsko kaseto CORE smo očistili s pomočjo kolon QIAquick PCR Purification Kit. Očiščeno selekcijsko kaseto CORE smo transformirali v kompetentne kvasne celice, tako kot je to opisal Wach s sodelavci leta 1994, Yeast 10, 1793-1804). Uporabili smo sev ΒΥ4741 z genotipom: MATa; his3Al; leu2A0; metl5A0; ura3A0. Transformiran sev smo razmazali na bogato gojišče YPD (1 % kvasni ekstrakt, 2 % pepton, 2 % glukoza) z geneticinom (200 mg/L). Transformante z vstavljeno kaseto CORE so neubčutljive na antibiotik G418. Pravilno vključitev kasete CORE na tarčno mesto smo iz posameznih kolonij kvasovk dokazali s PCR. Uporabili smo naslednje oligonukleotide:
K3 (AATATTGTTGATGCGCTGG),
GALI-Al (GGCCCCACAAACCTTCAA), dolžina fragmenta s K3 je pri pravilni vključitvi kasete 983 bp,
GAL1-A2 (AATAGCTAAAGGTAAAACCGAG) dolžina fragmenta z GALI-Al je v primeru nepravilne integracije oz. intaktnosti 500 bp.
Pozitivni klon smo ponovno transformirali z lokusom, ki nosi genski zapis za Gal4. S PCR smo predhodno lokus GAL4-long namnožili iz genomske DNA. Genomsko DNA smo s pomočjo steklenih kroglic izolirali iz seva S288c (MAT-α; SUC2; mal; mel; gal2; CUP1; flol; flo8-l). Iz produkta GAL4-long (3,3 kb) smo nato namnožili še GAL4 (2,6 kb). Fragment GAL4 smo očistili na kolonah in ga kot že rečeno transformirali v sev, ki ima na mestu GALI vstavljeno kaseto CORE.
Z vstavitvijo želenega gena GAL4 popolnoma odstranimo kaseto CORE, ki smo jo v prvi stopnji integrirali v tarčni lokus. Zaradi izgube selekcijskih markeijev /zz«MX4 in
A7URA3 so transformante občutljive na G418 in neobčutljive na 5-FO A. Transformirane kvasovke smo zato selekcionirali na gojišču s 5-FOA (1 g/L) in jih nato še replicirali na gojišče z G418.
Vstavitev gena GAL 4 smo iz posameznih kolonij kvasovk dokazali s PCR. Uporabili smo oligonukleotide:
K3 (AATATTGTTGATGCGCTGG)
GAL1-A1 (GGCCCCACAAACCTTCAA); dolžina fragmenta z K3 je v primeru intaktnosti 983 bp,
GAL4-as (ATGTCAAGGTCTTCTCGAGG); dolžina fragmenta z GAL1-A1 je v primeru vključitve gena GAL4 500 bp.
Vključitev gena GAL4 v mesto gena GALI v kromosomu Π smo dodatno preverili še s sekvenčno reakcijo. Rezultati sekvenčne reakcije dokazujejo uspešno in pravilno zamenjavo genov. Odprti čitalni okvir gena GALI smo v prvi fazi uspešno zamenjali s selekcijsko kaseto CORE, ki smo jo nato v drugi fazi popolnoma odstranili z odprtim čitalnim okviijem gena GAL4.
Predmet izuma so visoko-produkcijski rekombinantni sevi iz družine Saccharomycetaceae ali Cryptococcaceae, pri katerih je bila na kromosomih izvedena zamenjava gena, ki kodira encim, ki metabolno pretvarja induktor galaktozo v neaktiven metabolit, z genom, ki kodira transkripcij ski aktivator za galaktoza - inducibilni promotor. Izhodni sev je prednostno iz vrst rodu Saccharomyces, še bolj prednostno iz vrste Saccharomyces cerevisiae. Gen, ki kodira encim, je GALI, gen, ki kodira transkripcij ski faktor, pa je GAL4. Galaktoza - inducibilni promotor je GALI, GAL2, GAL7, GAL10 ali MEL1. Sevi, ki so predmet izuma, so gostitelji plazmidov za heterologno ekspresijo genov iz galaktoza - inducibilnega promotoqa in se uporabljajo za pridobivanje biološko aktivnih snovi in ostalih biotehnoloških produktov.
Predmet izuma je proizvodnja biološko aktivnih snovi in ostalih biotehnoloških produktov iz zgoraj opisanih sevov, prednostno iz sevov vrst rodu Saccharomyces, še bolj prednostno iz sevov vrste Saccharomyces cerevisiae. Pri tej proizvodnji je gen, ki kodira encim, GALI, gen, ki kodira transkripcij ski dejavnik, pa GAL4. Pri proizvodnji je galaktoza - inducibilni promotor GALI, GAL2, GAL7, GAL10 ali MEL1.
Da bi preučili in določili ali zamenjava genov GAL, kije predmet izuma, vpliva na izražanje heterolognih genov, ki so pod kontrolo promotorjev GAL, smo v mutiranem sevu, ki je tudi predmet izuma, v sevu gall ter v izogenem sevu, spremljali raven zelenoflurescirajočega proteina (GFP) in hepatitis B antigena (HBsAg).
Primer 2: IZRAŽANJE GFP
Promotorsko zaporedje GALI in terminatorsko zaporedje ADH1 smo vstavili v prenosljiva vektorja YCplll in YEpl81. Oba vektorja vsebujeta gen LEU2, ki omogoča selekcijo.
Prenosljivi vektor YCplll vsebuje avtonomno podvajajoče zaporedje ARS1 ter centromemo zaporedje CEN4. ARS/CEN vektor je relativno dobro mitotsko stabilen, vendar sta v kvasni celici prisotni le 1 do 2 kopiji. Gen divjega tipa GFP smo vstavili v 5' TtanjHI mesto, ki smo ga obdelali z Mung Bean nukleazo in v 3' EcoRA restrikcijsko mesto.
YEpl81 vsebuje kvasno 2μ DNA, kar omogoča stabilno razmnoževanje in prisotnost vektoija v več kopijah v kvasni celici. Kodirajoče zaporedje divjega tipa GFP smo vstavili v 5' Zta/nHI in 3' Smol restrikcijsko mesto.
Mutiran sev, ki je predmet izuma, sev gall ter izogeni sev ΒΥ4741 smo transformirali (Gietz in sod., 2002, v Methods in Enzymology (Fink in Gutrie, Ed.), Vol 350, 87-97) z ekspresijskima vektorjema YCpGALl-GFP in YEpl81GALl-GFP, ki nosita genski zapis za poročevalsko molekulo GFP. Transformante smo selekcionirali na minimalnem gojišču brez levcina.
Transformante kvasovk smo v bogatem tekočem gojišču z glukozo (2 %) gojili do (srednje) logaritemske faze. Nato smo odstranili gojišče in dodali gojišče z galaktozo (2 %). Kulture smo stresali na recipročnem stresalniku (180 obratov/minuto) 18 ur, pri temperaturi 30 °C. Gojišče smo nato odstranili, celice pa resususpendirali do koncentracije 2><107/mL v pufru TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA). Fluorescenco smo izmerili v živih celicah s fluorescentnim spektrofotometrom. Fluorescenco GFP smo vzbujali pri 395 nm ter jo izmerili pri 509 nm, s širino reže 5 nm. Količino rekombinantnega proteina GFP v mutiranem sevu, v sevu gall ter v izogenem sevu smo določili s pomočjo umeritvene premice standardov čistega rekombinantnega proteina GFP.
1. Izražanje GFP iz vektorja YCpGAL 1 -GFP
Količino rekombinantnega proteina smo določili v mutiranem sevu, ki je predmet izuma, v gall ter v izogenem sevu ΒΥ4741 iz treh zaporednih poskusov. Količino GFP smo izračunali posredno iz izmerjene fluorescence. Ugotovili smo, da se produkcija heterolognega proteina glede na izogen sev v sevu gall poveča za 96 % in še več, to je za 145 % v mutiranem sevu. Produkcija GFP v mL kulture z gostoto celic 2><107/mL, pri zgoraj opisanih pogojih gojenja, je v izogenem sevu 0,297 pg, v sevu gall 0,585 pg ter 0,729 pg v mutiranem sevu (Glej sliko 1).
2. Izražanj e GFP iz YEp 181 GAL 1 -GFP
Količino rekombinantnega proteina GFP, ki se izraža iz nosilnega vektorja prisotnega v nekaj desetih kopijah v kvasni celici, smo določili v posameznih sevih. Količino GFP smo izračunali posredno iz izmerjene fluorescence iz treh zaporednih poskusov. Ugotovili smo, da se sinteza heterolognega proteina glede na izogen sev v sevu gall poveča za 123 % in še več, to je za 218 % v mutiranem sevu. Produkcija GFP v mL kulture z gostoto celic 2x107/mL, pri zgoraj opisanih pogojih gojenja, je v izogenem sevu 4,05 pg, v sevu gall 9,03 pg ter 12,89 pg v mutiranem sevu (Glej sliko 2).
Primer 3: IZRAŽANJE HBsAg
Promotorsko zaporedje GALI in terminatorsko zaporedje ADH1 smo vstavili v prenosljivi vektor YEpl81. Vektor smo rezali z encimom 5a/wHI, ga obdelali z Klenowim fragmentom in nato še s Kpnl. Gen za HBsAg smo namnožili iz pRC/CMV-HBs(S) (darilo od Aldevron, ND, ZDA) in ga vklonirali v tarčni ekspresij ski vektor.
Mutiran sev, ki je predmet izuma, sev gall ter izogeni sev ΒΥ4741 smo transformirali z opisanim vektorjem, ki nosi genski zapis za HBsAg. Transformante smo selekcionirali na minimalnem gojišču brez levcina.
Transformante kvasovk smo v bogatem tekočem gojišču z glukozo (2 %) gojili do (srednje) logaritemske faze. Nato smo odstranili gojišče in dodali gojišče z galaktozo (2 %). Kulture smo stresali na recipročnem stresalniku (180 obratov/minuto) 18 ur, pri temperaturi 30 °C. Zbrali smo določeno količino celic, ki ustrezajo 50 OD enotam in jih dvakrat sprali z ledeno hladnim lizis pufrom (10 mM PBS pH 7.2, 5 mM EDTA, 0.5 M NaCI, 0.1 % (v/v) Triton Χ-100, 1 mM PMSF). Celice smo lizirali s pomočjo steklenih kroglic (0.45 pm). Količino celokupnih proteinov smo določili z metodo po Bradford-u.
Za oceno količine HBsAg v mutiranem sevu, ki je predmet izuma, v gall ter v izogenem sevu ΒΥ4741, smo uporabili metodo točkastega odtisa (Sambrook in sod., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. izdaja) Uporabili smo mišja protitelesa mAb Anti-Hepatitis B Surface Antigen (Aldevron). Količino rekombinantnega poteina smo primeijali s komercialnim standardom. Ugotovili smo, da se sinteza heterolognega proteina HBsAg glede na izogen sev v sevu gall poveča za približno 2-krat in še več, to je za 3-krat v mutiranem sevu, kije predmet tega izuma.

Claims (32)

1. Visoko-produkcijski rekombinantni sevi kvasovk s spremenjeno galaktozno regulacijo transkripcije, označeni s tem, da imajo na kromosomu zamenjan gen, ki kodira encim za pretvorbo transkripcij skega induktoija v neaktiven produkt, z genom, ki kodira transkripcij ski faktor za galaktoza - inducibilni promotor.
2. Sevi po zahtevku 1, označeni s tem, da so izhodni sevi iz družine Saccharomycetaceae ali Cryptococcaceae.
3. Sevi po katerem koli zahtevku od 1 do 2, označeni s tem, da so izhodni sevi iz vrst rodu Saccharomyces.
4. Sevi po katerem koli zahtevku od 1 do 3, označeni s tem, da so izhodni sevi iz vrste Saccharomyces cerevisiae.
5. Sevi po katerem koli zahtevku od 1 do 4, označeni s tem, daje gen, ki kodira encim za pretvorbo transkripcij skega induktoija v neaktiven produkt, gen GALI.
6. Sevi po katerem koli zahtevku od 1 do 5, označeni s tem, da je gen, ki kodira transkripcij ski faktor, gen GAL4.
7. Sevi po zahtevku 6, označeni s tem, daje sinteza transkripcij skega faktorja GAL4 pod kontrolo galaktoza - inducibilnega promotoija.
8. Sevi po katerem koli zahtevku od 6 do 8, označeni s tem, da je sinteza transkripcij skega faktoija GAL4 pod kontrolo promotorja GALI, GAL2, GAL7, GAL10 ali MEL1.
9. Sevi po katerem koli zahtevku od 6 do 8, označeni s tem, da je sinteza transkripcij skega faktoija GAL4 pod kontrolo promotorja GALI.
10. Sevi po katerem koli zahtevku od 1 do 5, označeni s tem, da galaktoza - inducibilni promotor sproži izražanje proteinov v prisotnosti transkripcij skega induktoija.
11. Sevi opisani v zahtevku 10 označeni s tem, daje galaktoza - inducibilni promotor izbran med promotoiji genov GALI, GAL2, GAL7, GAL10 ali MEL1.
12. Sevi po katerem koli zahtevku od 1 do 11, označeni s tem, da so gostitelji plazmidov za heterologno ali homologno ekspresijo genov in/ali se uporabljajo za sintezo biološko aktivnih snovi in ostalih biotehnoloških produktov.
13. Sevi po zahtevku 12, označeni s tem, da so gostitelji plazmidov za heterologno ali homologno ekspresijo genov pod kontrolo galaktoza - inducibilnega promotorja.
14. Sevi po katerem koli zahtevku od 12 do 13, označeni s tem, da so gostitelji plazmidov za heterologno ali homologno ekspresijo genov pod kontrolo galaktoza - inducibilnega promotorja izbranega med promotorji genov GALI, GAL2, GAL7, GAL10 ali MEL1.
15. Sevi po katerem koli zahtevku od 1 do 14, označeni s tem, da se jih uporablja za sintezo biološko aktivnih snovi in drugih biotehnoloških produktov.
16. Uporaba visoko-produkcijskih rekombinantnih sevov kvasovk s spremenjeno galaktozno regulacijo transkripcije za pripravo biološko aktivnih snovi in drugih biotehnoloških produktov, označena s tem, da imajo na kromosomu zamenjan gen, ki kodira encim za pretvorbo transkripcij skega induktorja v neaktiven produkt, z genom, ki kodira transkripcijski faktor za galaktoza - inducibilni promotor in so opisani v katerem koli zahtevku od 1 do 15.
17. Uporaba po zahtevku 16, označena s tem, da so uporabljeni sevi - sevi z galaktozno regulacijo.
18. Uporaba po katerem koli zahtevku od 16 do 17, označen s tem, da so sevi družine Saccharomycetaceae ali Cryptococcaceae.
19. Uporaba po katerem koli zahtevku od 16 do 18, označena s tem, da so sevi iz rodu Saccharomyces.
20. Uporaba po katerem koli zahtevku od 16 do 19, označen s tem, da so sevi Saccharomyces cerevisiae.
21. Uporaba po katerem koli zahtevku od 16 do 20, označena s tem, daje gen, ki kodira encim za pretvorbo transkripcij skega induktorja v neaktiven produkt, gen GALI.
22. Uporaba po katerem koli zahtevku od 16 do 21, označena s tem, daje gen, ki kodira transkripcijski faktor, gen GAL4.
23. Uporaba po zahtevku 22, označena s tem, daje sinteza transkripcij skega faktorja GAL4 pod kontrolo galaktoza - inducibilnega promotorja.
24. Uporaba po katerem koli zahtevku od 22 do 23, označena s tem, daje sinteza transkripcij skega faktorja GAL4 pod kontrolo promotorja GALI.
25. Uporaba po katerem koli zahtevku od 16 do 21, označena s tem, da galaktoza inducibilni promotor sproži izražanje proteinov v prisotnosti transkripcij skega induktorja.
26. Uporaba po zahtevku 25, označena s tem, daje galaktoza - inducibilni promotor izbran med promotorji genov GALI, GAL2, GAL7, GAL10 ali MEL1.
27. Uporaba po katerem koli zahtevku od 16 do 25, označena s tem, da so sevi po zahtevkih od 1 do 12 gostitelji plazmidov za heterologno ali homologno ekspresijo genov.
28. Uporaba po zahtevku 27, označena s tem, da so sevi po zahtevkih od 1 do 12 gostitelji plazmidov za heterologno ali homologno ekspresijo genov pod kontrolo galaktoza inducibilnega promotorja.
29. Uporaba po katerem koli zahtevku od 27 do 28, označena s tem, da so sevi po zahtevkih od 1 do 12 gostitelji plazmidov za heterologno ali homologno ekspresijo genov pod kontrolo galaktoza - inducibilnega promotorja izbranega med promotoiji genov GALI, GAL2, GAL 7, GALI 0 ali MEL1.
30. Produkti pridobljeni z uporabo visoko-produkcijskih rekombinantnih sevov kvasovk s spremenjeno galaktozno regulacijo transkripcije po zahtevkih od 16 do 29 .
31. Produkti po zahtevku 30 označeni s tem, da so produkti polipeptidi.
32. Produkti po zahtevku 30, označeni s tem, da so produkti heterologni in/ali homologni proteini.
SI200500131A 2005-05-05 2005-05-05 Visoko-produkcijski rekombinantni sevi kvasovk s spremenjeno galaktozno regulacijo transkripcije SI22056A (sl)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SI200500131A SI22056A (sl) 2005-05-05 2005-05-05 Visoko-produkcijski rekombinantni sevi kvasovk s spremenjeno galaktozno regulacijo transkripcije
PCT/SI2006/000011 WO2006118550A2 (en) 2005-05-05 2006-04-14 Highly productive recombinant yeast strains with modified galactose-regulated transcription
US11/913,028 US20090047708A1 (en) 2005-05-05 2006-04-14 Highly productive recombinant yeast strains with modified galactose-regulated transcription
EP06733568A EP1880009B1 (en) 2005-05-05 2006-04-14 Highly productive recombinant yeast strains with modified galactose-regulated transcription
DK06733568.7T DK1880009T3 (da) 2005-05-05 2006-04-14 Yderst produktive rekombinante gærstammer med modificeret galactose-reguleret transkription
AT06733568T ATE513047T1 (de) 2005-05-05 2006-04-14 Hochproduktive rekombinante hefestämme mit modifizierter galactose-regulierter transkription

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SI200500131A SI22056A (sl) 2005-05-05 2005-05-05 Visoko-produkcijski rekombinantni sevi kvasovk s spremenjeno galaktozno regulacijo transkripcije

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SI22056A true SI22056A (sl) 2006-12-31

Family

ID=37213555

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SI200500131A SI22056A (sl) 2005-05-05 2005-05-05 Visoko-produkcijski rekombinantni sevi kvasovk s spremenjeno galaktozno regulacijo transkripcije

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20090047708A1 (sl)
EP (1) EP1880009B1 (sl)
AT (1) ATE513047T1 (sl)
DK (1) DK1880009T3 (sl)
SI (1) SI22056A (sl)
WO (1) WO2006118550A2 (sl)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105820965B (zh) * 2015-01-08 2019-08-13 深圳华大基因研究院 一株人工合成ii号染色体的酿酒酵母菌株
EP3106520A1 (en) * 2015-06-17 2016-12-21 Institut National De La Recherche Agronomique Mutant yarrowia strain capable of degrading galactose
US20210269811A1 (en) * 2018-06-27 2021-09-02 Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg Means and methods for increased protein expression by use of transcription factors

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5068185A (en) * 1986-07-10 1991-11-26 Merck & Co., Inc. Trains of yeast for the expression of heterologous genes

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006118550A3 (en) 2007-02-01
DK1880009T3 (da) 2011-09-12
ATE513047T1 (de) 2011-07-15
EP1880009B1 (en) 2011-06-15
US20090047708A1 (en) 2009-02-19
WO2006118550A2 (en) 2006-11-09
EP1880009A2 (en) 2008-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Delneri et al. Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre–loxP system
Sugimoto et al. Schizosaccharomyces pombe ste11+ encodes a transcription factor with an HMG motif that is a critical regulator of sexual development.
Ma et al. Deletion analysis of GAL4 defines two transcriptional activating segments
Broach et al. Transformation in yeast: development of a hybrid cloning vector and isolation of the CAN1 gene
Andrianopoulos et al. Cloning and analysis of the positively acting regulatory gene amdR from Aspergillus nidulans
DK173186B1 (da) Gærpromotor, vektor indeholdende en sådan promotor, gær transformeret med en sådan vektor og fremgangsmåde til fremstilling
Jenkins et al. A DNA fragment containing the groE genes can suppress mutations in the Escherichia coli dnaA gene
Smith et al. Genetic evidence for transcriptional activation by the yeast IME1 gene product.
Siam et al. Choosing and using Schizosaccharomyces pombe plasmids
US4745057A (en) Method, vectors and transformants for high expression of heterologous polypeptides in yeast
US6190914B1 (en) Methods for modulating metabolic pathways of micro-organisms and micro-organisms obtainable by said methods
Tsalik et al. Curing Saccharomyces cerevisiae of the 2 micron plasmid by targeted DNA damage
JPH05508547A (ja) ライブラリースクリーニング法
Wright et al. A positive regulatory site and a negative regulatory site control the expression of the Saccharomyces cerevisiae CYC7 gene
SI22056A (sl) Visoko-produkcijski rekombinantni sevi kvasovk s spremenjeno galaktozno regulacijo transkripcije
Ni et al. Identification of the upstream activating sequence of MAL and the binding sites for the MAL63 activator of Saccharomyces cerevisiae
HU201116B (en) Process for producing plasmids having uncontrolled replication conduct under given circumstances
JP2003516149A (ja) 酵母における機能的遺伝子のアレイ
De Lucas et al. Analysis of the regulation of the Aspergillus nidulans acuD gene, encoding isocitrate lyase, by construction of a hybrid promoter
EP0399455B1 (en) Stably transformed yeast host cells and their use for the production of albumin
Taguchi et al. The cloning and mapping of ADR6, a gene required for sporulation and for expression of the alcohol dehydrogenase II isozyme from Saccharomyces cerevisiae
WO2006046694A1 (ja) 誘導可能に発現するエルゴステロール合成酵素を有する酵母を利用した遺伝子のスクリーニング法
US6365409B1 (en) Regulated gene expression in yeast
Wright et al. Point mutations implicate repeated sequences as essential elements of the CYC7 negative upstream site in Saccharomyces cerevisiae
Štagoj et al. A novel GAL recombinant yeast strain for enhanced protein production

Legal Events

Date Code Title Description
OO00 Grant of patent

Effective date: 20060213

KO00 Lapse of patent

Effective date: 20150506