JPS5974986A - 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 - Google Patents
酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵母ザツカロマイセスの解糖系酵素の１つであ
るグリセロアルデヒド−３−ホスフェイトデヒドロゲナ
ーゼ（以下ＧＡＰ −ＤＩ と略称する）を支配してい
るｊｙＪ伝子転子ペロン）のプロモーターと有用な目的
ペプチド遺伝子とを結合した酵母菌のベクターに閂する
。更に、本発明は上記ＱＡＰ−ＤＨを支配しているオペ
ロンのプロモーターを利用１７て、有用な目的ペプチド
を高収率で酵母から生産する方法に関する。
るグリセロアルデヒド−３−ホスフェイトデヒドロゲナ
ーゼ（以下ＧＡＰ −ＤＩ と略称する）を支配してい
るｊｙＪ伝子転子ペロン）のプロモーターと有用な目的
ペプチド遺伝子とを結合した酵母菌のベクターに閂する
。更に、本発明は上記ＱＡＰ−ＤＨを支配しているオペ
ロンのプロモーターを利用１７て、有用な目的ペプチド
を高収率で酵母から生産する方法に関する。
これ寸で遺伝子操作技術を用いて医薬上有用なペプチド
類、例えばソマトスタチン、インスリン、成長ホルモン
、各種インターフェロン、インフルエンザウィルス並び
に肝炎Ｂウィルス蛋白、ザイモシンα１、β−エンドル
フィン、α−ネオエンドルフィン、セクレチン、ウロキ
ナーゼ、プラスミノーゲン活性化物質など多くの物質が
微生向又は動物イ（ｌ胞で作られるようになっている。
類、例えばソマトスタチン、インスリン、成長ホルモン
、各種インターフェロン、インフルエンザウィルス並び
に肝炎Ｂウィルス蛋白、ザイモシンα１、β−エンドル
フィン、α−ネオエンドルフィン、セクレチン、ウロキ
ナーゼ、プラスミノーゲン活性化物質など多くの物質が
微生向又は動物イ（ｌ胞で作られるようになっている。
これらの多くは宿主として原核細胞（ｐｒｏｋａｒｙｎ
ｔＯ）である大腸菌を用いているが、近年有核細胞（４
＋ｕｌｃａｒｙｏｔ ｅ ）である酵母を宿主とじ−Ｃ
利用することが注目されている。これは、酵ｎの培養条
件が簡単でちり、分裂速度が速いこと、安全性が高いこ
と、！［Ｈにサツカロマイセス酸［Ｊ″′ｃは遺伝生化
学的解析がより多くなされていることなどの理由による
。しかし、酵Ｒ１における外来異種ペプチド産生に関す
る例は少く、α−インターフェロン、ＨＢ肝炎表面抗原
蛋白、α−ネオエンドルフィンにみられる程度である。
ｔＯ）である大腸菌を用いているが、近年有核細胞（４
＋ｕｌｃａｒｙｏｔ ｅ ）である酵母を宿主とじ−Ｃ
利用することが注目されている。これは、酵ｎの培養条
件が簡単でちり、分裂速度が速いこと、安全性が高いこ
と、！［Ｈにサツカロマイセス酸［Ｊ″′ｃは遺伝生化
学的解析がより多くなされていることなどの理由による
。しかし、酵Ｒ１における外来異種ペプチド産生に関す
る例は少く、α−インターフェロン、ＨＢ肝炎表面抗原
蛋白、α−ネオエンドルフィンにみられる程度である。
一方、外来異種遺伝子、例えば化学的に合成した遺伝子
、ｍ Ｆ Ｎ Ａ から逆転写酊床によって得られる相
補的１） Ｎ Ａ （ｃｌｌ Ｎ Ａ ）遺伝子、ある
いは染色体から１商当な処理によって得られる遺伝そな
どを発現させようと」−るに＆Ｕ： 、用いる宿主に適
したプロモーター領域の存在が必須である。プロモータ
ーの良し悪しが［］的とするペプチドｉｌ’ｊ転子発現
に太きく影響するため、これ才で種々のプロモーターを
用いた発」プラスミドベクターの開発が行われてきた。
、ｍ Ｆ Ｎ Ａ から逆転写酊床によって得られる相
補的１） Ｎ Ａ （ｃｌｌ Ｎ Ａ ）遺伝子、ある
いは染色体から１商当な処理によって得られる遺伝そな
どを発現させようと」−るに＆Ｕ： 、用いる宿主に適
したプロモーター領域の存在が必須である。プロモータ
ーの良し悪しが［］的とするペプチドｉｌ’ｊ転子発現
に太きく影響するため、これ才で種々のプロモーターを
用いた発」プラスミドベクターの開発が行われてきた。
しかしながら、報告されている酵母？宿主とする夕１来
遺伝子の発現ベクターは大腸菌を宿主とするベクターに
比べ、目的と１−る外来遺伝子の発現効率は十分と＆、
ｌ君乏−ない。発明者らは、酵Ｉひサツカロマイ−４，
スの解糖糸を支配している酵素であるグリセロアルデヒ
ド−３−ホスフェイトデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ −Ｄ
Ｈ）が酵母菌体で多量に生産されているのに着目し、こ
の酵素をコード［７ているオペロンのプロモーｊ′−ｊ
ｌ’ｊ伝子の転子用を考ρ−１研究をｉｆ：めた。この
結果、このプロモーター・がｒ１γ母での界種せたは同
種のペプチドの生産に非常に有用であることを、り出し
、このフロモーターの下流に異種機たは同種ベフチドノ
１″（伊予とを結合し７たβ′ｆ母閑のベクターを作成
し、これを用いて醇ｆｌｊの形質転Ｉ桑を１１い、形・
乃転換の行われた酵母を分與１解析することにより本発
明を完成した。
遺伝子の発現ベクターは大腸菌を宿主とするベクターに
比べ、目的と１−る外来遺伝子の発現効率は十分と＆、
ｌ君乏−ない。発明者らは、酵Ｉひサツカロマイ−４，
スの解糖糸を支配している酵素であるグリセロアルデヒ
ド−３−ホスフェイトデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ −Ｄ
Ｈ）が酵母菌体で多量に生産されているのに着目し、こ
の酵素をコード［７ているオペロンのプロモーｊ′−ｊ
ｌ’ｊ伝子の転子用を考ρ−１研究をｉｆ：めた。この
結果、このプロモーター・がｒ１γ母での界種せたは同
種のペプチドの生産に非常に有用であることを、り出し
、このフロモーターの下流に異種機たは同種ベフチドノ
１″（伊予とを結合し７たβ′ｆ母閑のベクターを作成
し、これを用いて醇ｆｌｊの形質転Ｉ桑を１１い、形・
乃転換の行われた酵母を分與１解析することにより本発
明を完成した。
本発明の酵母ベクターは次のようにしてイ′「１戊され
る。
る。
ザツカロマイセス酬母Ｘ５Ｉ６−５Ｃ！株［ｃｊｒ’ｌ
の核Ｔ））Ｊ Ａを制限酵素Ｈ１ｎｄ ｌｌで切断して
イ！ｉ ｆｃｌ、９ｋｂから２．２ｋｂに相当するＤ↑
ＩＡ ｊ断片を適当なプラスミドベクター、例えばプラ
スミドＰＢＲ３２２のＪ（ｊ、ｎｄ、 Ｉザイトにクロ
ーニングして、酵母の遺伝子ライブラリーを得た。その
遺伝子ライブラリーから２１ｋｂの長さの酵母ＤＮＡ断
片を持ち、かつそのＤ Ｉ：ｌ Ａ断片が制限＾１で素
ｆＥ ａ、 Ｉ Ｉで１ケ所、制限酵素Ｈｐａ Ｉで１
ケ所切断される断片を持つクローンを分離した。このプ
ラスミドは、挿入されたＩ）Ｎ Ａ断片についてＭａｘ
ａｍ Ｇ１１ｂｅｒｔ法（ＰＮＡＳ７４．５６０’−
５６４（１９７７））により塩基配列を決定し、この結
果をホランド（１１ｏ１．］、ａｎｄ、 ）らｒ Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２５４．９８３９（１９７９
）Ｊの報告と比較検討することにより、目的とするＧＡ
Ｐ −ＤＨ遺伝子が挿入されていることを確認できる。
の核Ｔ））Ｊ Ａを制限酵素Ｈ１ｎｄ ｌｌで切断して
イ！ｉ ｆｃｌ、９ｋｂから２．２ｋｂに相当するＤ↑
ＩＡ ｊ断片を適当なプラスミドベクター、例えばプラ
スミドＰＢＲ３２２のＪ（ｊ、ｎｄ、 Ｉザイトにクロ
ーニングして、酵母の遺伝子ライブラリーを得た。その
遺伝子ライブラリーから２１ｋｂの長さの酵母ＤＮＡ断
片を持ち、かつそのＤ Ｉ：ｌ Ａ断片が制限＾１で素
ｆＥ ａ、 Ｉ Ｉで１ケ所、制限酵素Ｈｐａ Ｉで１
ケ所切断される断片を持つクローンを分離した。このプ
ラスミドは、挿入されたＩ）Ｎ Ａ断片についてＭａｘ
ａｍ Ｇ１１ｂｅｒｔ法（ＰＮＡＳ７４．５６０’−
５６４（１９７７））により塩基配列を決定し、この結
果をホランド（１１ｏ１．］、ａｎｄ、 ）らｒ Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２５４．９８３９（１９７９
）Ｊの報告と比較検討することにより、目的とするＧＡ
Ｐ −ＤＨ遺伝子が挿入されていることを確認できる。
このようにしてＧ ＡＰ −ＤＨ遺伝子が挿入されたプ
ラスミドを！１を定の制限酵素で切断し、上記遺伝子を
沈むＩＮＩＡ断片を選択マーカーを持つ酵母菌ベクター
、好しくＱよ忰作の便宜上大腸菌−酵母シャトルベクタ
ーに挿入する。
ラスミドを！１を定の制限酵素で切断し、上記遺伝子を
沈むＩＮＩＡ断片を選択マーカーを持つ酵母菌ベクター
、好しくＱよ忰作の便宜上大腸菌−酵母シャトルベクタ
ーに挿入する。
次に、このベクター中のＧＡＰ−ＤＨ遺伝子のＣ末端近
くにある制限酵素５ａｌｌ切断部位に、読みわ（（ｒθ
ａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ） が合うように、予じめ得
ている目的ペプチド遺伝子を含む断片を挿入１−る。こ
の」：うにして得たＧＡＰ −ＤＩ遺伝子および目的ペ
プチド遺伝子を含むプラスミドにより酵イＵを形質転換
する。
くにある制限酵素５ａｌｌ切断部位に、読みわ（（ｒθ
ａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ） が合うように、予じめ得
ている目的ペプチド遺伝子を含む断片を挿入１−る。こ
の」：うにして得たＧＡＰ −ＤＩ遺伝子および目的ペ
プチド遺伝子を含むプラスミドにより酵イＵを形質転換
する。
目的ペプチド遺伝Ｐとしては外来性異種ペプチド遺伝子
および酵母内のＧＡＰ −１）Ｈ遺伝子以外のペプチド
遺伝子（同種ペプチド遺伝子）の両方を含むものとする
。
および酵母内のＧＡＰ −１）Ｈ遺伝子以外のペプチド
遺伝子（同種ペプチド遺伝子）の両方を含むものとする
。
このように形質転換された酵母において、ＧＡＰ−ＩＨ
Ｉ遺伝子プロモーターが目的ペプチドｊ１（伊予の発現
に非常に優れていることが認めらｉｌ、ｆｃ。
Ｉ遺伝子プロモーターが目的ペプチドｊ１（伊予の発現
に非常に優れていることが認めらｉｌ、ｆｃ。
又、目的ペプチドの酵母における生産性は、ＧＡＰ−Ｄ
■（遺伝子の３′末端非ｔｔｉＴ］訳領域をプラスミド
中の目的ペプチド遺伝子の下流にｆｆ ｔａｎすること
によって著しく上昇１″ることが認めらＪｔでいる。
■（遺伝子の３′末端非ｔｔｉＴ］訳領域をプラスミド
中の目的ペプチド遺伝子の下流にｆｆ ｔａｎすること
によって著しく上昇１″ることが認めらＪｔでいる。
この３′末端非翻訳領域の１τ」加による効果について
はノ持ｎ′［昭５６ １６７６１５号に詳イ［１１に説
明されている。
はノ持ｎ′［昭５６ １６７６１５号に詳イ［１１に説
明されている。
上記のような３′末端非翻訳領域をオリ用する方法およ
びこの領域も挿入されているプラスミドおよびその利用
も本発明の範囲に含むものとする。
びこの領域も挿入されているプラスミドおよびその利用
も本発明の範囲に含むものとする。
本発明を以下の実施例により更に詳細に説明する。
具体的実施例では、目的ペプチド遺伝子としてアルファ
ネオエンドルフィン（αＮＦ２）遺伝子を用い、Ｇ Ａ
Ｐ −１，）Ｈプロモーター−ＧＡＰ−ＤＨ構造遺伝
子−αＮＥ１遺伝子（ＰＧＡＩ’−ＧＡＰ−αＮ孔と略
）および、、（ＩＡＰ −０４Ｐ−αＮＦ −３’ＧＡ
Ｐ （ＧＡＰｊＤＨ遺伝Ｐの３′未非翻訳領域を附加し
たもの）のような配列から、ＧＡＰ−αｔ［！／’、ｆ
、に’ｌＥ白質として目的物質（αＮ孔）を生産する方
法を記しているが、ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの位置か
ら適当な塩基配列をおいて目的３１１１伝子、例えばイ
ンターフェロンのようなペプチドをコードする遺伝子を
附加し目的ペプチドを１１ｊ］房生産させることもでき
る。このように０Ｊ（Ｐ −１，）Ｈプロモーターは広
く外来遺伝子の発現並びにアル７アネオエンドルフーイ
ン以外のＪ％ ｆｆｆｉおよび間挿ペプブ°ドの生７竹
に活用されつるものである。
ネオエンドルフィン（αＮＦ２）遺伝子を用い、Ｇ Ａ
Ｐ −１，）Ｈプロモーター−ＧＡＰ−ＤＨ構造遺伝
子−αＮＥ１遺伝子（ＰＧＡＩ’−ＧＡＰ−αＮ孔と略
）および、、（ＩＡＰ −０４Ｐ−αＮＦ −３’ＧＡ
Ｐ （ＧＡＰｊＤＨ遺伝Ｐの３′未非翻訳領域を附加し
たもの）のような配列から、ＧＡＰ−αｔ［！／’、ｆ
、に’ｌＥ白質として目的物質（αＮ孔）を生産する方
法を記しているが、ＧＡＰ−ＤＨプロモーターの位置か
ら適当な塩基配列をおいて目的３１１１伝子、例えばイ
ンターフェロンのようなペプチドをコードする遺伝子を
附加し目的ペプチドを１１ｊ］房生産させることもでき
る。このように０Ｊ（Ｐ −１，）Ｈプロモーターは広
く外来遺伝子の発現並びにアル７アネオエンドルフーイ
ン以外のＪ％ ｆｆｆｉおよび間挿ペプブ°ドの生７竹
に活用されつるものである。
実施例
シツ力ロマイセス酵母Ｘ８１６−５０（ｃｉ、ｒＯ〕（
ＳａｃＣｈａｒｏｍｙｃｅｎ ｃｅｒｅｖｉｅｉａｅ
ＸＳ １６−５ ＣＭＡＴａ ｌｅｕ ２ ｈｉｓ ３
ｔｒｙｐ Ｉ Ｃｅ１ｒ ’ ］ ）をＩｌのＹＰＤ
培地（１チ酵母エキス、２％ポリペプトン、２係グルコ
ース）で３０℃、２４時間培養し、得られた菌体をクラ
イヤー（Ｃｒｙｅｒ ）らの方法（Ｃｒｙｅｒ ｅｔ
ａｌ−、■５ｏｌａ、ｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａａｔ
ＤＮＡ 。
ＳａｃＣｈａｒｏｍｙｃｅｎ ｃｅｒｅｖｉｅｉａｅ
ＸＳ １６−５ ＣＭＡＴａ ｌｅｕ ２ ｈｉｓ ３
ｔｒｙｐ Ｉ Ｃｅ１ｒ ’ ］ ）をＩｌのＹＰＤ
培地（１チ酵母エキス、２％ポリペプトン、２係グルコ
ース）で３０℃、２４時間培養し、得られた菌体をクラ
イヤー（Ｃｒｙｅｒ ）らの方法（Ｃｒｙｅｒ ｅｔ
ａｌ−、■５ｏｌａ、ｔｉｏｎ ｏｆ ｙｅａａｔ
ＤＮＡ 。
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅ１．］ Ｂｉｏ１．ｏｒＴ
、ｙ 、 ｖｏｗ、 、 １２ 。
、ｙ 、 ｖｏｗ、 、 １２ 。
八ｃａｄｅｍ：１．ｃ Ｐｒｅｅｅ 、 Ｎｅｗ
’１ｏｒｋ 、 １ ９７ ５ 。
’１ｏｒｋ 、 １ ９７ ５ 。
ｐｐ３９−４４）に従って総１）ＮＡを分離した。
５Ｃ１／ＩＦの酵母ＤＩ、ＴＡを１００ Ｑ’＋位のＴ
Ｈ，ｎ＋１ Ｉな用いて１３７℃で２時間加湿すること
により切断した。反応液を０８係アガロースゲル市気泳
動により公印（し、１．９ｋｂ〜２２ｋｂに相当−す−
るＪ（ｉ ｎ ｄ 璽によるＴＪＮＡ断片を公邸ｆ精製
した。一方、０５μｇのＰＢＲ３２２をＩ（ｉｎｄＩ
１単位を用いてＴＡ緩衝液中で３７℃で１時間反応させ
ることにより切断した。次にこれら両ＤＮＡをＴ、１Ｔ
ｎ、ＩＡ リガーゼ用緩衝液に溶解し、２単位のＴ４
ＤＩＪＡリガーゼを加え、１５℃で１８時間反シテ４、
させた。この反応液ｌｅｕ込をＱ、 ３ ｍｌのＣＰ、
Ｃ１，２で処理したｊｐ、、ｃｏｌ、ｉ、ＴＡ ２２１
に加えて形質転換し７、アンピシリン耐性クローンを１
１）り。このうちテトラザイクリンに対して感受性のあ
るクローンを４００個選び、そのプラスミドＤＮＡの解
析をアルカリ変性法により行った。
Ｈ，ｎ＋１ Ｉな用いて１３７℃で２時間加湿すること
により切断した。反応液を０８係アガロースゲル市気泳
動により公印（し、１．９ｋｂ〜２２ｋｂに相当−す−
るＪ（ｉ ｎ ｄ 璽によるＴＪＮＡ断片を公邸ｆ精製
した。一方、０５μｇのＰＢＲ３２２をＩ（ｉｎｄＩ
１単位を用いてＴＡ緩衝液中で３７℃で１時間反応させ
ることにより切断した。次にこれら両ＤＮＡをＴ、１Ｔ
ｎ、ＩＡ リガーゼ用緩衝液に溶解し、２単位のＴ４
ＤＩＪＡリガーゼを加え、１５℃で１８時間反シテ４、
させた。この反応液ｌｅｕ込をＱ、 ３ ｍｌのＣＰ、
Ｃ１，２で処理したｊｐ、、ｃｏｌ、ｉ、ＴＡ ２２１
に加えて形質転換し７、アンピシリン耐性クローンを１
１）り。このうちテトラザイクリンに対して感受性のあ
るクローンを４００個選び、そのプラスミドＤＮＡの解
析をアルカリ変性法により行った。
既に報告されているポランド等の解析結果によると、Ｇ
ＡＰ −１）■１遺伝子を含む２．１ｋｂの断片には
ＨｐａｌおよびＳｏ、］、 Ｉの切断部位がそれぞれ１
ケ所ちる。２．１ｋｂの１４ｉｎｄ Ｉ ｉ４片はＳａ
］、 Ｉにより０．１４ ｋＬ＋とＩｌ、 ！１６ ｋ
ｂとの２つの断片に切断され、！）： ｆｃ ＩＴｐａ
、 Ｉにより１．３９ ｋｂと０．７１ｋｂとの２つの
断片にそれぞれ切断されている。
ＡＰ −１）■１遺伝子を含む２．１ｋｂの断片には
ＨｐａｌおよびＳｏ、］、 Ｉの切断部位がそれぞれ１
ケ所ちる。２．１ｋｂの１４ｉｎｄ Ｉ ｉ４片はＳａ
］、 Ｉにより０．１４ ｋＬ＋とＩｌ、 ！１６ ｋ
ｂとの２つの断片に切断され、！）： ｆｃ ＩＴｐａ
、 Ｉにより１．３９ ｋｂと０．７１ｋｂとの２つの
断片にそれぞれ切断されている。
発明者らυ：」―記の４００個のクローンについて検討
した結果、上記ＧΔＰ −ＤＨ遺伝子を含む断片におけ
るのと同じ制限酵素切断部位を有するプラスミドを持つ
クローンが１つ得られたことが判った。このり「」−ン
のプラスミドをｐＹｇａ、ｐ ８７とした。
した結果、上記ＧΔＰ −ＤＨ遺伝子を含む断片におけ
るのと同じ制限酵素切断部位を有するプラスミドを持つ
クローンが１つ得られたことが判った。このり「」−ン
のプラスミドをｐＹｇａ、ｐ ８７とした。
この Ｙｇａｐ ８７の：ハ１１切断部位に近い方のＨ
ｌｎｄ Ｉ切断によつで得られる粘着末端にｒ−［”
ｐ ］ −ＧＡＰおよびボリヌクレ、十チドキナーゼを
用いて標識し、 Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法に従い
ＤＮＡの塩基配列を決定した。この結果を前記ホランド
らの報告と比較検討し、Ｐｙ ｇａ ｐ ８７ ｉｊ−
。
ｌｎｄ Ｉ切断によつで得られる粘着末端にｒ−［”
ｐ ］ −ＧＡＰおよびボリヌクレ、十チドキナーゼを
用いて標識し、 Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法に従い
ＤＮＡの塩基配列を決定した。この結果を前記ホランド
らの報告と比較検討し、Ｐｙ ｇａ ｐ ８７ ｉｊ−
。
ＧＡＰ−Ｔ））Ｔ遺伝子を持つことを確認した。このＰ
Ｙｇす８７によって形質転換された大腸菌に一１２株は
Ｅ、Ｃ０１ｉ ＳＢＭ １５１と命名し、工学技術院微
生物工粟研究所（機工１ｉ１） ）に寄託し、寄託番号
ＦＥ、ＲＭＰ−６７６２を和でいる。
Ｙｇす８７によって形質転換された大腸菌に一１２株は
Ｅ、Ｃ０１ｉ ＳＢＭ １５１と命名し、工学技術院微
生物工粟研究所（機工１ｉ１） ）に寄託し、寄託番号
ＦＥ、ＲＭＰ−６７６２を和でいる。
ＦＹＥ ２３７ベクターは！１〒願昭５６ １６７６１
．５号に開示されたＰＹＥ ２２７ベクターからその８
ａ、］Ｉ切断点を消失さ佑タブラスミドでちり、次のよ
うに作製された。
．５号に開示されたＰＹＥ ２２７ベクターからその８
ａ、］Ｉ切断点を消失さ佑タブラスミドでちり、次のよ
うに作製された。
５１（（ｙ、のＰＹＫ ２２’７を］ ｆ） ｒｐ−（
ｒ’ｌのＳａｌ ｌを用いＴＡ緩衝液中で３７℃１５時
間反応さぜＬＩＪ断した。
ｒ’ｌのＳａｌ ｌを用いＴＡ緩衝液中で３７℃１５時
間反応さぜＬＩＪ断した。
続いて６５℃で加熱１−ることによりＳａ、１１を失活
さ亡た後、４種のｄ、 Ｎ Ｔ Ｐを０．３ｍＭ；２−
メルカプトエタノールを３ Ｑ ｍＭ となる様に加え
１単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて３７℃３０分
間尺応さゼ、Ｓａｌ Ｉ切断で生じた粘着末端を消失さ
せた。反応終了後フェノール抽出を１回行った後、２容
のエタノールでＤＮＡを沈殿させた。Ｄ Ｎ Ａ沈殿物
を２０μＵのＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ緩衝液に溶解後、５
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用い１５℃１８時間反応さ
せることにより結合させた。
さ亡た後、４種のｄ、 Ｎ Ｔ Ｐを０．３ｍＭ；２−
メルカプトエタノールを３ Ｑ ｍＭ となる様に加え
１単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて３７℃３０分
間尺応さゼ、Ｓａｌ Ｉ切断で生じた粘着末端を消失さ
せた。反応終了後フェノール抽出を１回行った後、２容
のエタノールでＤＮＡを沈殿させた。Ｄ Ｎ Ａ沈殿物
を２０μＵのＴ４ＤＮＡＩＪガーゼ緩衝液に溶解後、５
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用い１５℃１８時間反応さ
せることにより結合させた。
反応液をｆＪ（与ＤＮＡとして常法に従いＥ、 ｃｏａ
ｌＪＡ ２２１に形質転換し、アンビミリン耐性クロー
ンを得た。これらのクローンよりＤＮＡを分＃＃し解析
１−１ＰＹＥ２２７よりＳａｌ−１の切断部位の消失し
た。ＹＥ２３７を得た。
ｌＪＡ ２２１に形質転換し、アンビミリン耐性クロー
ンを得た。これらのクローンよりＤＮＡを分＃＃し解析
１−１ＰＹＥ２２７よりＳａｌ−１の切断部位の消失し
た。ＹＥ２３７を得た。
５ ／Ｉｑの、３ＹＥ ２３７を２０弔位のＨｉｎｄ
Ｎを用い、’ｒＡ緩衝液（３３ｍＭ トリス酢酸＋ｐＨ
７，９，６６１μＭ ｉ”ｉ’ｌ’：酸カリ、１０ｍＭ
酢酸マグネシウム、０、５ ｍＭ ＤＴＴ ）中で３７
℃１時間反応させた。以後制限酵素の反応（ｌまＴＡ緩
衝液中で３７℃１時間反応させた。一方既に得られてい
友プラスミドＰＹｇａｐ ８７ ５７１ｇを２０単位の
Ｈｌｎｄ、 Ｉを用い切断後、寒天電気泳動法により２
．１ｋｂのＤＮＡフラグメン） （ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子
）を分離し寒天片よりＤＮＡを溶出、精製した。この２
．１ ｋｂ ＤＮＡ断片とＰＹＥ ＝ ３７のＨｌｎｄ
ＩＩ切断ＤＮＡを２０ｔｉＲＤＮＡリガーゼ・緩衝液
（２０ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ７，５，１０ｍＭ ＭｇＣ
！１．．１０ｍＭ ＤＴＴ％０．５ｍＭＡＴＰ ）に溶
解し、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え１５℃１６時
間反応させた。この反応液１０μ２を０．３ ｍｌの０
ａＯ１２処理したＥ、ｃｏｌｉＪＡ２２１に加え形質転
換を行った。
Ｎを用い、’ｒＡ緩衝液（３３ｍＭ トリス酢酸＋ｐＨ
７，９，６６１μＭ ｉ”ｉ’ｌ’：酸カリ、１０ｍＭ
酢酸マグネシウム、０、５ ｍＭ ＤＴＴ ）中で３７
℃１時間反応させた。以後制限酵素の反応（ｌまＴＡ緩
衝液中で３７℃１時間反応させた。一方既に得られてい
友プラスミドＰＹｇａｐ ８７ ５７１ｇを２０単位の
Ｈｌｎｄ、 Ｉを用い切断後、寒天電気泳動法により２
．１ｋｂのＤＮＡフラグメン） （ＧＡＰ−ＤＨ遺伝子
）を分離し寒天片よりＤＮＡを溶出、精製した。この２
．１ ｋｂ ＤＮＡ断片とＰＹＥ ＝ ３７のＨｌｎｄ
ＩＩ切断ＤＮＡを２０ｔｉＲＤＮＡリガーゼ・緩衝液
（２０ｍＭ）リス塩酸、ｐＨ７，５，１０ｍＭ ＭｇＣ
！１．．１０ｍＭ ＤＴＴ％０．５ｍＭＡＴＰ ）に溶
解し、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを加え１５℃１６時
間反応させた。この反応液１０μ２を０．３ ｍｌの０
ａＯ１２処理したＥ、ｃｏｌｉＪＡ２２１に加え形質転
換を行った。
アンピシリン耐性トランスホーマントから、常法に従い
プラスミドＤＮＡを’Ａ１’ｉｆＡ解析し、ＰＹＥ１２
０１を得たことを確認した。
プラスミドＤＮＡを’Ａ１’ｉｆＡ解析し、ＰＹＥ１２
０１を得たことを確認した。
このプラスミドによって形質転換され７ｊ Ｉ’ｌｆ母
（ＸＳ１６−５Ｃり株はＳａ、ｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｅｉａｅ Ｉ’ｌＢＭ ３２１と命名し
、機工研に寄託番号ＦＥＢＭ Ｐ−６７６６として寄託
した。
（ＸＳ１６−５Ｃり株はＳａ、ｃｃｂａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｅｉａｅ Ｉ’ｌＢＭ ３２１と命名し
、機工研に寄託番号ＦＥＢＭ Ｐ−６７６６として寄託
した。
Ｎｅｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
１０ １ ７４ １〜１７５４（１９８２）の方法に
従いαＮＫ遺伝子 ゛（Ｅｃｏ ＲＩ −Ｂａｍ ＨＩ
ＤＮＡ断片）を作製した。
１０ １ ７４ １〜１７５４（１９８２）の方法に
従いαＮＫ遺伝子 ゛（Ｅｃｏ ＲＩ −Ｂａｍ ＨＩ
ＤＮＡ断片）を作製した。
この様にして得られた４６塩基対より成るαＮＦｉ遺伝
子を ＢＲ３２２のＦｉｃｏＲ工・Ｂａｍ ＨＩ 両
制限酵素で切断した大きい方の断片（４ｋｂ ）に挿入
しＰＹαＮＥ５’を得た。次にＧＡＰ −ＯＨ遺伝子中
にあるＳａ、１１部位に読み枠を合せ、挿入する為に、
５’ −ＧＧＧＴＯＧＡＣＯＯ−３’よりなるＳａｌ
Ｉリンカ−を挿入したプラスミドＰＹαＮＥ５’（Ｓａ
ｌ Ｔ）−ｃを得た。５１１（ｘ、のｐｙ αＮ Ｅ
５ ’を１０単位のＳａｌ ｌを用いＴＡ緩衝液中で３
７℃１時間加温することにより切断した。６５℃で加熱
後、０．３ｍＭのｄＡＴ：Ｐ。
子を ＢＲ３２２のＦｉｃｏＲ工・Ｂａｍ ＨＩ 両
制限酵素で切断した大きい方の断片（４ｋｂ ）に挿入
しＰＹαＮＥ５’を得た。次にＧＡＰ −ＯＨ遺伝子中
にあるＳａ、１１部位に読み枠を合せ、挿入する為に、
５’ −ＧＧＧＴＯＧＡＣＯＯ−３’よりなるＳａｌ
Ｉリンカ−を挿入したプラスミドＰＹαＮＥ５’（Ｓａ
ｌ Ｔ）−ｃを得た。５１１（ｘ、のｐｙ αＮ Ｅ
５ ’を１０単位のＳａｌ ｌを用いＴＡ緩衝液中で３
７℃１時間加温することにより切断した。６５℃で加熱
後、０．３ｍＭのｄＡＴ：Ｐ。
ｄ、ＴＴＰ 、 ｄｃ！ＴＰ 、 ｄＧＴＰ及び８０
ｍＭの２−メルカプトエタノールとなる様にそれぞれ加
え、３７℃：’ｒ Ｏｍｊ、ｎ反応させＳａｌ Ｉの粘
着末端を満した。
ｍＭの２−メルカプトエタノールとなる様にそれぞれ加
え、３７℃：’ｒ Ｏｍｊ、ｎ反応させＳａｌ Ｉの粘
着末端を満した。
反応終了後フェノール抽出を１回行ってがらエタール沈
殿によりＤＮＡを回収した。一方、Ｓａｌ Ｉ ！Ｊノ
ンカー／＋ｇを５０ｍＭ）リス塩酸、Ｉ）Ｈ７，５，１
０ｍｌＫ １４ｇ Ｃ１２中で２５ ｎｍｏ功ＡＴＰ
、 １０中位のボリヌクレオチドギナーゼを用いて３７
℃。
殿によりＤＮＡを回収した。一方、Ｓａｌ Ｉ ！Ｊノ
ンカー／＋ｇを５０ｍＭ）リス塩酸、Ｉ）Ｈ７，５，１
０ｍｌＫ １４ｇ Ｃ１２中で２５ ｎｍｏ功ＡＴＰ
、 １０中位のボリヌクレオチドギナーゼを用いて３７
℃。
４５分間反応させ、５′末端をリン酸化した。これらの
ＤＮＡを混合し、Ｔ４ＤＮＡ リガーゼ緩衝液とし５単
位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを加え１５℃で１８時間反応
させた。この反応液１０ ｔｌｐ、を０．３ ｍｌのＣ
ｏＬ＃Ｃ１，処理したＥ、 Ｃ０１１ＪＡ ２２１ に
加え形質転換を行った。アンピシリン耐性形質転換体か
ら常法に従いプラスミドＤＮＡを５分離解析し、ピαＮ
Ｅ５’−８ａｌｌ−ｃを得た。
ＤＮＡを混合し、Ｔ４ＤＮＡ リガーゼ緩衝液とし５単
位のＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを加え１５℃で１８時間反応
させた。この反応液１０ ｔｌｐ、を０．３ ｍｌのＣ
ｏＬ＃Ｃ１，処理したＥ、 Ｃ０１１ＪＡ ２２１ に
加え形質転換を行った。アンピシリン耐性形質転換体か
ら常法に従いプラスミドＤＮＡを５分離解析し、ピαＮ
Ｅ５’−８ａｌｌ−ｃを得た。
５μｇのＰＹＥ１２０１を２０単位のＢａｍＨＩ 。
２０単位のＳａｌ ｌで２つの断ハに切断し寒天電気泳
動にて分離後、大きい断片を寒天より溶出させ精製した
。一方αＮＦｉ遺伝子を含む断片はアαＮＥ５’−８ａ
ｌｌ−ｃ ５０１μｇをｉｏｏ単（ｊＺのＢａｍ ＨＩ
゛。
動にて分離後、大きい断片を寒天より溶出させ精製した
。一方αＮＦｉ遺伝子を含む断片はアαＮＥ５’−８ａ
ｌｌ−ｃ ５０１μｇをｉｏｏ単（ｊＺのＢａｍ ＨＩ
゛。
１００単位のＳａＬ Ｉを用いて切断後、５チポリアク
リルアミドゲルによる電気泳動法により分離し５０塩基
対に相当するＤＮＡ断片を溶出・精製し７て得た。以−
ヒの２つのＤＮＡ断片を２０μＵのＤＮＡリガーゼ緩衝
液に溶解し２単位のＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼを加え、１５
℃１６時間反応させた。この反応液ｌＯノ１２を０．３
ｗｔｅの０ａＯ１，処理したＦｉ、 Ｃ０１１ＪＡ
２２ ］に加え形質転換を行い、アンピシリン耐性形質
転換体から常法に従いプラスミドＤＮＡを分離解析し１
．ＹαＮＦ、５３を得た。
リルアミドゲルによる電気泳動法により分離し５０塩基
対に相当するＤＮＡ断片を溶出・精製し７て得た。以−
ヒの２つのＤＮＡ断片を２０μＵのＤＮＡリガーゼ緩衝
液に溶解し２単位のＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼを加え、１５
℃１６時間反応させた。この反応液ｌＯノ１２を０．３
ｗｔｅの０ａＯ１，処理したＦｉ、 Ｃ０１１ＪＡ
２２ ］に加え形質転換を行い、アンピシリン耐性形質
転換体から常法に従いプラスミドＤＮＡを分離解析し１
．ＹαＮＦ、５３を得た。
−タ付加（第３図参照）
ＰＹαＩ往５３にＧＡＰ −ＤＨ遺伝子の３′末端領域
を絹込寸れた吋ＩＥ遺伝子の下流に伺加する具体例を以
下に示す。
を絹込寸れた吋ＩＥ遺伝子の下流に伺加する具体例を以
下に示す。
１０１１ｇ、のＰＹαＮＥ ５３を３０単位のＢａｍ
Ｈ工で切断後、１単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用い
、６７ｍ１口゛す７″塩酸（ｐＨ８，８）、６．７ ｍ
Ｍ Ｍ（７Ｃ！１．、．１０Ｍ２−メルカプトエタノー
ル１６．６ｍＭ硫酸アンモン、６．７７０４ ＥＤＴＡ
、 ０．３ ｍＭの４種の旧＋ １’ Ｐを含む緩衝
液（Ｔ ４ ＤＩ、ＩＡポリメラーゼ緩衝液）中：３７
℃３０分間反応させ、ＢａｍＨ工切断で生じた粘着末端
をうめた。一方ＧＡＰ −ＤＩ（遺伝子）：３′末）７
ｊＡｊ領域をＰＹＥ １２０ ］ 、こり得ｆｃ ］、
Ｏμｇの□ＪＴＩ２１２０ ］を３０単位のＳａｌ
ｌで切断後、１即位のＴ ４ ＤＮＡポリメラーゼを用
い同緩衝液中で３７℃３０分間反応させ、５ａ１Ｔ切断
で生じた粘着末端をうめた。次にそれぞれ３０単位のＰ
ｅｔｌで切断し、、 ＰＹαＮＥ５３からはαＮＦ遺
伝子を含む断片、ＰＹｍ ］、 ２ （１１からはＧＡ
Ｐ−ＤＪ（遺伝子の３′末端領域を含む断片を寒天電気
泳動で分離しイ゛〜？、°（した。次に両断片を２０１
Ｌｐ、のＴ４ＤＮＡ、ｌＪガーゼ緩衝液中５単位のＴ４
ＤＮＡＩＪガーゼを用いて１５℃１７時間反応させ結合
させた。この反応液１ｏｌｉρを用い上記の方法で形質
転換体を得、それよりプラスミドＤＮＡを分離・解析し
ＰＹαＮＥ１５５を得たことを確認した。
Ｈ工で切断後、１単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用い
、６７ｍ１口゛す７″塩酸（ｐＨ８，８）、６．７ ｍ
Ｍ Ｍ（７Ｃ！１．、．１０Ｍ２−メルカプトエタノー
ル１６．６ｍＭ硫酸アンモン、６．７７０４ ＥＤＴＡ
、 ０．３ ｍＭの４種の旧＋ １’ Ｐを含む緩衝
液（Ｔ ４ ＤＩ、ＩＡポリメラーゼ緩衝液）中：３７
℃３０分間反応させ、ＢａｍＨ工切断で生じた粘着末端
をうめた。一方ＧＡＰ −ＤＩ（遺伝子）：３′末）７
ｊＡｊ領域をＰＹＥ １２０ ］ 、こり得ｆｃ ］、
Ｏμｇの□ＪＴＩ２１２０ ］を３０単位のＳａｌ
ｌで切断後、１即位のＴ ４ ＤＮＡポリメラーゼを用
い同緩衝液中で３７℃３０分間反応させ、５ａ１Ｔ切断
で生じた粘着末端をうめた。次にそれぞれ３０単位のＰ
ｅｔｌで切断し、、 ＰＹαＮＥ５３からはαＮＦ遺
伝子を含む断片、ＰＹｍ ］、 ２ （１１からはＧＡ
Ｐ−ＤＪ（遺伝子の３′末端領域を含む断片を寒天電気
泳動で分離しイ゛〜？、°（した。次に両断片を２０１
Ｌｐ、のＴ４ＤＮＡ、ｌＪガーゼ緩衝液中５単位のＴ４
ＤＮＡＩＪガーゼを用いて１５℃１７時間反応させ結合
させた。この反応液１ｏｌｉρを用い上記の方法で形質
転換体を得、それよりプラスミドＤＮＡを分離・解析し
ＰＹαＮＥ１５５を得たことを確認した。
７、酵母の形γｊ転換および培養
上記のようにして得られたプラスミドｐＹＥ １２０１
ＰＹαＮ屈５３、ｐＹαＮＥ１５５をＢθｇｐｎ Ｊ、
１１゜。
ＰＹαＮ屈５３、ｐＹαＮＥ１５５をＢθｇｐｎ Ｊ、
１１゜。
Ｎａｔｕｒｅ、 ｖｏｌ ２７５１０４ （１９７８
）に記載の方法に従って酵刊（ザッヵロマイセス セレ
ビシェＸＳ １６−５Ｃりに形質転換した。イ；Ｉられ
た形質転換体をＹＰ、Ｄ （１％イーストエキス、２％
ポリペプトン、２係グルコース）培地で３０Ｃ１２４時
間振とう培養後、遠心分離により菌体を回収した。
）に記載の方法に従って酵刊（ザッヵロマイセス セレ
ビシェＸＳ １６−５Ｃりに形質転換した。イ；Ｉられ
た形質転換体をＹＰ、Ｄ （１％イーストエキス、２％
ポリペプトン、２係グルコース）培地で３０Ｃ１２４時
間振とう培養後、遠心分離により菌体を回収した。
１ ｍｌの培養液から得られた菌体に０．５ Ｎ／の冷
アセトンを加え、−２０℃で１〜２４時間放置した後、
凍結乾燥した。この乾燥菌体に５ ｒｎｙ ／ ｍｅの
臭化シアンを含む７０％ギ酸溶液に懸濁し２４時間暗所
で反応させた。この試料を凍結乾燥後０．１ ｙｎｌの
Ｑ、ｌＮ酢酸でαＮＫを溶出させ０．１ ｍｌの１．３
Ｍ）リス塩酸（ｐ” ８．０ ）で中和後ＲＩＡの試料
とした。
アセトンを加え、−２０℃で１〜２４時間放置した後、
凍結乾燥した。この乾燥菌体に５ ｒｎｙ ／ ｍｅの
臭化シアンを含む７０％ギ酸溶液に懸濁し２４時間暗所
で反応させた。この試料を凍結乾燥後０．１ ｙｎｌの
Ｑ、ｌＮ酢酸でαＮＫを溶出させ０．１ ｍｌの１．３
Ｍ）リス塩酸（ｐ” ８．０ ）で中和後ＲＩＡの試料
とした。
ＲＩＡ はＮ、Ｍｉ、ｎａｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ、Ｂ
ＢＲＣ！ ｖｏｌ １０２２２６（，１９８１）に
記さいの方法に準じて行った。その結果を表１に示した
。ＧＡＰ −ＤＨプロモーター１第１１用しそのト１末
端（３２３アミノ酸残基）の直後にαＮＥｉを結合した
雑種蛋白質として、ＰＹαＮＦｉ５３の場合（ＧＡＰ
−、ＩＨ（遺伝子の３′末端領域が無い）では１細胞当
り２００万分子発現していた。又、それに（）Ａ、Ｐ
−ＩＩＩ（遺伝子の３′末端領域を付加したもの（ＰＹ
σＮＥ１５５）ついては−ＰＹαＮＥ５３の約ｉｏ暗に
相当する１細胞当り２０００万分子発現していた。培養
液当りでは約２μｇ ／ ａｔの生産が認められた。プ
ラスミドの安定性につい−Ｃ検肘したところ１０世代非
選択条件（ＹＰＤ培地で培養）で培養したところ、完全
なＧＡＰ−ＤＨを持つプラスミドＰＹＥ１２０１の場合
は１０〜２０％とかなり不安定であった。しかしαＮＦ
２遺伝子をＣ末端付近に結合させたプラスミド（ＰＹα
ＮＥ５３、ＰＹαＮＥ１５５）の場合は多少安定性は良
くなっていた。
ＢＲＣ！ ｖｏｌ １０２２２６（，１９８１）に
記さいの方法に準じて行った。その結果を表１に示した
。ＧＡＰ −ＤＨプロモーター１第１１用しそのト１末
端（３２３アミノ酸残基）の直後にαＮＥｉを結合した
雑種蛋白質として、ＰＹαＮＦｉ５３の場合（ＧＡＰ
−、ＩＨ（遺伝子の３′末端領域が無い）では１細胞当
り２００万分子発現していた。又、それに（）Ａ、Ｐ
−ＩＩＩ（遺伝子の３′末端領域を付加したもの（ＰＹ
σＮＥ１５５）ついては−ＰＹαＮＥ５３の約ｉｏ暗に
相当する１細胞当り２０００万分子発現していた。培養
液当りでは約２μｇ ／ ａｔの生産が認められた。プ
ラスミドの安定性につい−Ｃ検肘したところ１０世代非
選択条件（ＹＰＤ培地で培養）で培養したところ、完全
なＧＡＰ−ＤＨを持つプラスミドＰＹＥ１２０１の場合
は１０〜２０％とかなり不安定であった。しかしαＮＦ
２遺伝子をＣ末端付近に結合させたプラスミド（ＰＹα
ＮＥ５３、ＰＹαＮＥ１５５）の場合は多少安定性は良
くなっていた。
表 １
ＧＡＰ−ＤＨプロモータによるαＮＥの生産性ＰＹＥ１
２０１ １．８３Ｘ１０” ＜０（月
１５．１％］、、２８Ｘ］、０８ ４４５ ＋、
７３Ｘ１０’ ４２．０チＰＹαＮＥ５３ （＋、
６ Ｘｌ０８３３７ ２．８ ｘｌＯ’ ７８．９％
１．１２Ｘ１０８３６８ ］、、６ Ｘｌ０６Ｎ、Ｉ
）、＊０．９９ｘｌＯｓ２０４９ １．０ ｘｌＯ’
４３．２％０．４２Ｘ１０８１７０６ ２．ＯＸＩＯ
’ Ｎ、Ｄ、＊＊測測定子
２０１ １．８３Ｘ１０” ＜０（月
１５．１％］、、２８Ｘ］、０８ ４４５ ＋、
７３Ｘ１０’ ４２．０チＰＹαＮＥ５３ （＋、
６ Ｘｌ０８３３７ ２．８ ｘｌＯ’ ７８．９％
１．１２Ｘ１０８３６８ ］、、６ Ｘｌ０６Ｎ、Ｉ
）、＊０．９９ｘｌＯｓ２０４９ １．０ ｘｌＯ’
４３．２％０．４２Ｘ１０８１７０６ ２．ＯＸＩＯ
’ Ｎ、Ｄ、＊＊測測定子
第１図〜第３図はＧＡＰ −ＤＨ遺伝子を含みαＮＥ遺
伝子を組込Ｘ７だプラスミドの構成法を示す。 第１図はＧＡＰ−ＤＨ遺伝子のクローニングを示す。 第２図はＧＡＰ−ＤＨ遺伝子を含みαＮＢ遺伝子を組込
んだシラスミドの構成法を示す。 第３図は第２図で得られたプラスミドアＹａＮＦ５３上
のαＮＫ遺伝子の下流に（）ＡＰ −ＤＨ遺伝子の３′
末端非翻訳部位が付加されたプラスミドの構成法を示す
。 特許出願人 サントリー株式会社 代！■１人 弁理士 湯 浅 恭 巨、１．：、
゛、・（１１’、、− （外４名） ：、ｊ′裕 １ しＩ ｊｎｄｍ 第２図 第３図 手 続 浦 正 書 １．事件の表示 昭和５７年特許願第１８４２９１ 号２発明の名称 酵ＣＪの高発現ベクターシラスミドおよびその利用方法
６、補正をする者 事件との関係 ｌ特許出願人 住所 名称（１９０）ザントリ−株式会社 ４、代理人 明細層の〔発明の詳細な説明〕の（光 図面 ６補正の内４ （１）明細書の記載を下記の通りｄ１正する。 頁 行 補正前 補正後１０
６ 工学波 下業技Ｆ ２ ８０ ｍ
、 Ｍ ８ｍ、 Ｍ１２ ５ リガー
−ビ・糸夛省トエ リガ−−ビ月ｆ糸ンシ埴１ｔ＋
７（！液 下６〜Ｊド５ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳＢＭ３２１
３８Ｍ３２］１３ ６
ＧＡＰ−ＯＨＧＡＰ−ＤＨｌ・ろ ｐＨ７５ｐ Ｈ
７，５ １４１１Ｂａｎ ＨＩ Ｂａ、ｍＨ１１
５ドア １０１ｖｌ １０ｍ、Ｍ
１６ ６ 寒天 アガロース１７
８ ｐＨ８，０ｐＨ８，０９Ｖｏｅ１０２２２６
Ｖｏ−ｇ、 １０２ ’）２６１０ （，１９
８１） （１９８１）（２） ］閃面な二もＮ１の
１山り汀１１ヒｉ−る。 以−］ニ ネｌ関 ノヲノｎｄｌｌ（ ｔ２（２） 藤３ 圀 手続順正書 昭和５８年１１月２日 ２、発明の名称 酵ＩＮＪの高発現Ｒフタ−プラスミドおよびその利用方
汐６、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名称（１９０）ヤントリー株式会社 ４、代理人 ） ：１ ６補正の内容 明細量の記載を下記の通り訂正する。 頁 行 補正前 補正後として 以 」二
伝子を組込Ｘ７だプラスミドの構成法を示す。 第１図はＧＡＰ−ＤＨ遺伝子のクローニングを示す。 第２図はＧＡＰ−ＤＨ遺伝子を含みαＮＢ遺伝子を組込
んだシラスミドの構成法を示す。 第３図は第２図で得られたプラスミドアＹａＮＦ５３上
のαＮＫ遺伝子の下流に（）ＡＰ −ＤＨ遺伝子の３′
末端非翻訳部位が付加されたプラスミドの構成法を示す
。 特許出願人 サントリー株式会社 代！■１人 弁理士 湯 浅 恭 巨、１．：、
゛、・（１１’、、− （外４名） ：、ｊ′裕 １ しＩ ｊｎｄｍ 第２図 第３図 手 続 浦 正 書 １．事件の表示 昭和５７年特許願第１８４２９１ 号２発明の名称 酵ＣＪの高発現ベクターシラスミドおよびその利用方法
６、補正をする者 事件との関係 ｌ特許出願人 住所 名称（１９０）ザントリ−株式会社 ４、代理人 明細層の〔発明の詳細な説明〕の（光 図面 ６補正の内４ （１）明細書の記載を下記の通りｄ１正する。 頁 行 補正前 補正後１０
６ 工学波 下業技Ｆ ２ ８０ ｍ
、 Ｍ ８ｍ、 Ｍ１２ ５ リガー
−ビ・糸夛省トエ リガ−−ビ月ｆ糸ンシ埴１ｔ＋
７（！液 下６〜Ｊド５ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＳＢＭ３２１
３８Ｍ３２］１３ ６
ＧＡＰ−ＯＨＧＡＰ−ＤＨｌ・ろ ｐＨ７５ｐ Ｈ
７，５ １４１１Ｂａｎ ＨＩ Ｂａ、ｍＨ１１
５ドア １０１ｖｌ １０ｍ、Ｍ
１６ ６ 寒天 アガロース１７
８ ｐＨ８，０ｐＨ８，０９Ｖｏｅ１０２２２６
Ｖｏ−ｇ、 １０２ ’）２６１０ （，１９
８１） （１９８１）（２） ］閃面な二もＮ１の
１山り汀１１ヒｉ−る。 以−］ニ ネｌ関 ノヲノｎｄｌｌ（ ｔ２（２） 藤３ 圀 手続順正書 昭和５８年１１月２日 ２、発明の名称 酵ＩＮＪの高発現Ｒフタ−プラスミドおよびその利用方
汐６、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名称（１９０）ヤントリー株式会社 ４、代理人 ） ：１ ６補正の内容 明細量の記載を下記の通り訂正する。 頁 行 補正前 補正後として 以 」二
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）グリセロアルデヒド−３−ホスフェイトデヒドロゲ
ナーゼを支配している遺伝子のプロモーターを含み、目
的ペプチド遺伝子を酵母中で発現させるプラスミド。 ２）グリセロアルデヒド−３−ホスフェイトデヒドロゲ
ナーゼを支配している遺伝子のプロモーターと目的ベグ
チド遺伝子とを含むプラスミドを作製し、このプラスミ
ドにより形質転換された酵母を培））；、するとどによ
り目的ペプチドを生産する方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57184291A JPH0716432B2 (ja) | 1982-10-20 | 1982-10-20 | 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 |
| EP83110471A EP0109559A1 (en) | 1982-10-20 | 1983-10-20 | High-efficiency yeast vector plasmid and method of its use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57184291A JPH0716432B2 (ja) | 1982-10-20 | 1982-10-20 | 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6092062A Division JP2625379B2 (ja) | 1994-04-28 | 1994-04-28 | 酵母の高発現ベクタープラスミド用ｄｎａ断片 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5974986A true JPS5974986A (ja) | 1984-04-27 |
| JPH0716432B2 JPH0716432B2 (ja) | 1995-03-01 |
Family
ID=16150753
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57184291A Expired - Lifetime JPH0716432B2 (ja) | 1982-10-20 | 1982-10-20 | 酵母の高発現ベクタープラスミドを用いたペプチドの生産方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0109559A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0716432B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60248181A (ja) * | 1984-05-23 | 1985-12-07 | Shiseido Co Ltd | 酵母発現ベクタ− |
Families Citing this family (4)
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|---|---|---|---|---|
| CA1341302C (en) * | 1983-02-22 | 2001-10-09 | Rae Lyn Burke | Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis of foreign protein |
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| JPS61141890A (ja) * | 1984-12-15 | 1986-06-28 | Suntory Ltd | アルコ−ルの製造法 |
| US5013652A (en) * | 1986-10-14 | 1991-05-07 | Genex Corporation | Composite yeast vectors |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| JPS57159489A (en) * | 1981-02-25 | 1982-10-01 | Genentech Inc | Developement of polypeptide in yeast |
Family Cites Families (3)
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|---|---|---|---|---|
| JPS58146281A (ja) * | 1981-10-19 | 1983-08-31 | Suntory Ltd | 酵母細胞の形質転換法 |
| US4446235A (en) * | 1982-03-22 | 1984-05-01 | Genentech, Inc. | Method for cloning human growth hormone varient genes |
| PT76727B (en) * | 1982-05-19 | 1985-12-27 | Gist Brocades Nv | Process for the preparation of clones for kluyveromyces species |
-
1982
- 1982-10-20 JP JP57184291A patent/JPH0716432B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1983
- 1983-10-20 EP EP83110471A patent/EP0109559A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57159489A (en) * | 1981-02-25 | 1982-10-01 | Genentech Inc | Developement of polypeptide in yeast |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60248181A (ja) * | 1984-05-23 | 1985-12-07 | Shiseido Co Ltd | 酵母発現ベクタ− |
| JPH0249715B2 (ja) * | 1984-05-23 | 1990-10-31 | Shiseido Co Ltd |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0109559A1 (en) | 1984-05-30 |
| JPH0716432B2 (ja) | 1995-03-01 |
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