CN109971780A - 一种在双降醇中分枝杆菌甾酮c1,2位脱氧酶基因敲除的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因敲除技术领域，具体公开了一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，该方法具体为首先对结核分枝杆菌、鸟结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌的甾酮C1,2位脱氢酶基因序列进行比对,根据保守区的同源序列设计引物，以分枝杆菌染色体DNA为模板，A1和B1为引物，通过聚合酶链式反应扩增目的基因，将聚合酶链式反应产物及质粒PUC‑18。该在双降醇中分枝杆菌甾酮C1，2位脱氧酶基因敲除的方法，能够充分对分支杆菌中的C1,2位脱氢酶进行敲除。
Description
技术领域
本发明涉及基因敲除技术领域，具体为一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法。
背景技术
分枝杆菌属是一类细长略弯曲的，有时有分枝或出现丝状体，目前在分类学上已将分枝杆菌属归纳于放线菌中，对人致病的放线菌可分含和不含分枝菌酸两类，分枝杆菌属于含分枝菌酸类，而基因敲除技术是近10余年发展起来的分子生物学技术,它克服了随机整合的的盲目性和偶然性,是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。
胆固醇、胆甾醇和植物甾醇等是甾体药物生产中的重要原料,一些微生物可以有效降解这类物质,生成甾体激素类药物合成的前体，如利用分枝杆菌降解植物甾醇可生成4-AD,4-AD是生产雄性激素、蛋白同化激素、螺内脂等的重要前体物，分枝杆菌体内存在C1,2位脱氢酶,4-AD将进一步脱氢生成ADD,4-AD和ADD化学结构极其相似,很难将这两种物质分离纯化。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，具备能够充分对分支杆菌中的C1,2位脱氢酶进行敲除，且有利于将4-AD从发酵液中分离纯化以提高其产量等优点，解决了胆固醇、胆甾醇和植物甾醇等是甾体药物生产中的重要原料,一些微生物可以有效降解这类物质,生成甾体激素类药物合成的前体，如利用分枝杆菌降解植物甾醇可生成4-AD,4-AD是生产雄性激素、蛋白同化激素、螺内脂等的重要前体物，分枝杆菌体内存在C1,2位脱氢酶,4-AD将进一步脱氢生成ADD,4-AD和ADD化学结构极其相似,很难将这两种物质分离纯化的问题。
(二)技术方案
为实现上述的目的，本发明提供如下技术方案：一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，包括如下步骤：
步骤1：首先对结核分枝杆菌、鸟结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌的甾酮C1,2位脱氢酶基因序列进行比对,根据保守区的同源序列设计引物，以分枝杆菌染色体DNA为模板，A1和B1为引物，通过聚合酶链式反应扩增目的基因，将聚合酶链式反应产物及质粒PUC-18，分别用HindIII和EcoRI双酶切,酶切产物经纯化回收后,用DNA链上切口酶于20℃连接过夜，电转化大肠杆菌中,用蓝白筛选平板筛选转化子，并对转化子的重组质粒进行双酶切鉴定和序列分析，用序列分析软件将测序结果与其它分枝杆菌属的C1，2位脱氢酶基因进行比对；
步骤2：在连入PUC-18的DNA基因中间设计引物A2和B2，扩增出上下游各含部分DNA基因，中间为PUC-18的线性化重组质粒PUC18-DAN，另外在上下游引物上分别设计KpnI和BamHI的酶切位点，以便连入卡那抗性基因，根据PJUG5的卡那霉素抗性基因序列，同时参照乳酸克鲁维酵母、大肠杆菌载体、PET-28a中的卡那霉素抗性基因序列设计引物A3和C3扩增卡那霉素抗性基因，将线性化的pUC18-DNA和卡那抗性基因双酶切后连接,电转化大肠杆菌JM109,卡那霉素抗性平板筛选转化子,双酶切法进行鉴定,阳性转化子的质粒即为线性载体PUC18-MK；
步骤3：培育LB琼脂培养基：选取葡萄糖10g、柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.05g、磷酸氢二铵35gMgSO4、7H2O0.5g、KHPO0.5g、Iween803ml和豆甾醇5g，用蒸馏水定客至1000ml,并用20％NaOH调LB琼脂培养基的PH为7.0~7.6，在LB琼脂培养基中加入卡那霉素，终浓度分别为0.1-2μg/ml，取0.5ml分枝杆菌的菌液涂布于以上平板，29℃培养48h,观察结果；
步骤4：将分枝杆菌用含有0.3mol/L山梨醇和1mmol/LDTT的10％甘油洗2次，4000r/min离心，最终重悬于10％甘油中，分装，利用电转化法将线性载体导入分枝杆菌中，从而实现对基因的敲除。
优选的，以所述HindIII和EcoRI双酶切为酶切位点，以所述A1、A2和A3和B1、B2和B3作为引物载体，将所述分支杆菌染色体作为DNA模板。
优选的，所述分支杆菌染色体的电转化条件为:电压2.5kv,电阻200Ω,电容25mF,利用卡那霉素抗性平板筛选转化子。
优选的，所述KpnI和BamHI的酶切位点为所述HindIII和EcoRI双酶切的辅助切位点。
优选的，所述卡那霉素的终浓度为0.1-2μg/ml。
优选的，所述酶切产物经纯化回收后,用DNA链上切口酶于20℃连接过夜。
优选的，所述A1、A2和A3均为上游引物，所述B1、B2和B3均为下游引物。
(三)有益效果
与现有技术相比，本发明提供了一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，具备以下有益效果：
该在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，通过同源重组敲除掉了分枝杆菌染色体上正常的DNA基因,使C1,2位脱氢酶失活，通过初筛筛选出了5株转化子,并对它们进行甾体转化分析,表明了4-AD的摩尔生成率大幅度提高,而ADD明显降低,在发酵144h后,生成4-AD占4-AD和ADD总和的74％,比出发菌株提高了7倍,达到了4-AD大量积累而ADD大量减少的目的,能够充分对分支杆菌中的C1,2位脱氢酶进行敲除，且有利于将4-AD从发酵液中分离纯化以提高其产量。
具体实施方式
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，包括如下步骤：
步骤1：首先对结核分枝杆菌、鸟结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌的甾酮C1,2位脱氢酶基因序列进行比对,根据保守区的同源序列设计引物，以分枝杆菌染色体DNA为模板,A1和B1为引物,通过聚合酶链式反应扩增目的基因,将聚合酶链式反应产物及质粒PUC-18,分别用HindIII和EcoRI双酶切,酶切产物经纯化回收后,用DNA链上切口酶于20℃连接过夜,电转化大肠杆菌中,用蓝白筛选平板筛选转化子,并对转化子的重组质粒进行双酶切鉴定和序列分析，用序列分析软件将测序结果与其它分枝杆菌属的C1,2位脱氢酶基因进行比对；
步骤2：在连入PUC-18的DNA基因中间设计引物A2和B2,扩增出上下游各含部分DNA基因,中间为PUC-18的线性化重组质粒PUC18-DAN，另外在上下游引物上分别设计KpnI和BamHI的酶切位点,以便连入卡那抗性基因，根据PJUG5的卡那霉素抗性基因序列,同时参照乳酸克鲁维酵母、大肠杆菌载体、PET-28a中的卡那霉素抗性基因序列设计引物A3和C3扩增卡那霉素抗性基因，将线性化的pUC18-DNA和卡那抗性基因双酶切后连接，电转化大肠杆菌JM109,卡那霉素抗性平板筛选转化子,双酶切法进行鉴定,阳性转化子的质粒即为线性载体PUC18-MK；
步骤3：培育LB琼脂培养基，选取葡萄糖10g、柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.05g、磷酸氢二铵35gMgSO4、7H2O0.5g、KHPO0.5g、Iween803ml和豆甾醇5g，用蒸馏水定客至1000ml，并用20％NaOH调LB琼脂培养基的PH为7.0，在LB琼脂培养基中加入卡那霉素，终浓度分别为0.1μg/ml，取0.5ml分枝杆菌的菌液涂布于以上平板，29℃培养48h，观察结果；
步骤4：将分枝杆菌用含有0.3mol/L山梨醇和1mmol/LDTT的10％甘油洗2次，4000r/min离心,最终重悬于10％甘油中,分装，利用电转化法将线性载体导入分枝杆菌中,从而实现对基因的敲除。
以HindIII和EcoRI双酶切为酶切位点，以A1、A2和A3和B1、B2和B3作为引物载体，将分支杆菌染色体作为DNA模板。
分支杆菌染色体的电转化条件为:电压2.5kv,电阻200Ω,电容25mF,利用卡那霉素抗性平板筛选转化子。
KpnI和BamHI的酶切位点为HindIII和EcoRI双酶切的辅助切位点。
卡那霉素的终浓度为0.1μg/ml。
酶切产物经纯化回收后,用DNA链上切口酶于20℃连接过夜。
A1、A2和A3均为上游引物，B1、B2和B3均为下游引物。
通过对分支杆菌染色体进行电转化，转化条件为:电压2.5kv,电阻200Ω,电容25mF，以及用DNA链上切口酶于20℃连接过夜，能够对分支杆菌中的C1,2位脱氢酶进行敲除。
实施例2
一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，包括如下步骤：
步骤1：首先对结核分枝杆菌、鸟结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌的甾酮C1,2位脱氢酶基因序列进行比对,根据保守区的同源序列设计引物，以分枝杆菌染色体DNA为模板,A1和B1为引物,通过聚合酶链式反应扩增目的基因,将聚合酶链式反应产物及质粒PUC-18,分别用HindIII和EcoRI双酶切，酶切产物经纯化回收后，用DNA链上切口酶于20℃连接过夜，电转化大肠杆菌中，用蓝白筛选平板筛选转化子，并对转化子的重组质粒进行双酶切鉴定和序列分析，用序列分析软件将测序结果与其它分枝杆菌属的C1，2位脱氢酶基因进行比对；
步骤2：在连入PUC-18的DNA基因中间设计引物A2和B2,扩增出上下游各含部分DNA基因，中间为PUC-18的线性化重组质粒PUC18-DAN，另外在上下游引物上分别设计KpnI和BamHI的酶切位点，以便连入卡那抗性基因，根据PJUG5的卡那霉素抗性基因序列,同时参照乳酸克鲁维酵母、大肠杆菌载体、PET-28a中的卡那霉素抗性基因序列设计引物A3和C3扩增卡那霉素抗性基因，将线性化的pUC18-DNA和卡那抗性基因双酶切后连接，电转化大肠杆菌JM109，卡那霉素抗性平板筛选转化子，双酶切法进行鉴定，阳性转化子的质粒即为线性载体PUC18-MK；
步骤3：培育LB琼脂培养基，选取葡萄糖10g、柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.05g、磷酸氢二铵35gMgSO4、7H2O0.5g、KHPO0.5g、Iween803ml和豆甾醇5g，用蒸馏水定客至1000ml,并用20％NaOH调LB琼脂培养基的PH为7.6，在LB琼脂培养基中加入卡那霉素，终浓度分别为2μg/ml，取0.5ml分枝杆菌的菌液涂布于以上平板，29℃培养48h,观察结果；
步骤4：将分枝杆菌用含有0.3mol/L山梨醇和1mmol/LDTT的10％甘油洗2次,4000r/min离心,最终重悬于10％甘油中,分装，利用电转化法将线性载体导入分枝杆菌中,从而实现对基因的敲除。
以HindIII和EcoRI双酶切为酶切位点，以A1、A2和A3和B1、B2和B3作为引物载体，将分支杆菌染色体作为DNA模板。
分支杆菌染色体的电转化条件为:电压3kv,电阻230Ω,电容30mF,利用卡那霉素抗性平板筛选转化子。
KpnI和BamHI的酶切位点为HindIII和EcoRI双酶切的辅助切位点。
卡那霉素的终浓度为2μg/ml。
酶切产物经纯化回收后,用DNA链上切口酶于30℃连接过夜。
A1、A2和A3均为上游引物，B1、B2和B3均为下游引物。
通过对分支杆菌染色体进行电转化，转化条件为:电压3kv,电阻230Ω,电容30mF，以及用DNA链上切口酶于30℃连接过夜，能够提高对分支杆菌中的C1,2位脱氢酶的敲除率。
实施例3
一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，包括如下步骤：
步骤1：首先对结核分枝杆菌、鸟结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌的甾酮C1,2位脱氢酶基因序列进行比对,根据保守区的同源序列设计引物，以分枝杆菌染色体DNA为模板,A1和B1为引物,通过聚合酶链式反应扩增目的基因,将聚合酶链式反应产物及质粒PUC-18,分别用HindIII和EcoRI双酶切，酶切产物经纯化回收后,用DNA链上切口酶于20℃连接过夜,电转化大肠杆菌中,用蓝白筛选平板筛选转化子,并对转化子的重组质粒进行双酶切鉴定和序列分析，用序列分析软件将测序结果与其它分枝杆菌属的C1，2位脱氢酶基因进行比对；
步骤2：在连入PUC-18的DNA基因中间设计引物A2和B2,扩增出上下游各含部分DNA基因，中间为PUC-18的线性化重组质粒PUC18-DAN，另外在上下游引物上分别设计KpnI和BamHI的酶切位点，以便连入卡那抗性基因，根据PJUG5的卡那霉素抗性基因序列,同时参照乳酸克鲁维酵母、大肠杆菌载体、PET-28a中的卡那霉素抗性基因序列设计引物A3和C3扩增卡那霉素抗性基因，将线性化的pUC18-DNA和卡那抗性基因双酶切后连接,电转化大肠杆菌JM109,卡那霉素抗性平板筛选转化子,双酶切法进行鉴定,阳性转化子的质粒即为线性载体PUC18-MK；
步骤3：培育LB琼脂培养基，选取葡萄糖10g、柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.05g、磷酸氢二铵35gMgSO4、7H2O0.5g、KHPO0.5g、Iween803ml和豆甾醇5g，用蒸馏水定客至1000ml,并用20％NaOH调LB琼脂培养基的PH为7.2，在LB琼脂培养基中加入卡那霉素,终浓度分别为1.2μg/ml，取0.5ml分枝杆菌的菌液涂布于以上平板,29℃培养48h,观察结果；
步骤4：将分枝杆菌用含有0.3mol/L山梨醇和1mmol/LDTT的10％甘油洗2次,4000r/min离心,最终重悬于10％甘油中,分装，利用电转化法将线性载体导入分枝杆菌中,从而实现对基因的敲除。
以HindIII和EcoRI双酶切为酶切位点，以A1、A2和A3和B1、B2和B3作为引物载体，将分支杆菌染色体作为DNA模板。
分支杆菌染色体的电转化条件为:电压2.5kv,电阻200Ω,电容25mF，利用卡那霉素抗性平板筛选转化子。
KpnI和BamHI的酶切位点为HindIII和EcoRI双酶切的辅助切位点。
卡那霉素的终浓度为1.2μg/ml。
酶切产物经纯化回收后,用DNA链上切口酶于20℃连接过夜。
A1、A2和A3均为上游引物，B1、B2和B3均为下游引物。
通过对分支杆菌染色体进行电转化，转化条件为:电压2kv,电阻180Ω,电容20mF，以及用DNA链上切口酶于25℃连接过夜，能够减少对分支杆菌中的C1,2位脱氢酶的敲除率。
综上所述，该在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，通过同源重组敲除掉了分枝杆菌染色体上正常的DNA基因,使C1,2位脱氢酶失活，通过初筛筛选出了5株转化子,并对它们进行甾体转化分析,表明了4-AD的摩尔生成率大幅度提高,而ADD明显降低,在发酵144h后,生成4-AD占4-AD和ADD总和的74％,比出发菌株提高了7倍,完全达到了4-AD大量积累而ADD大量减少的目的，能够充分对分支杆菌中的C1,2位脱氢酶进行敲除，且有利于将4-AD从发酵液中分离纯化以提高其产量。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，包括如下步骤：
步骤1：首先对结核分枝杆菌、鸟结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌的甾酮C1,2位脱氢酶基因序列进行比对，根据保守区的同源序列设计引物，以分枝杆菌染色体DNA为模板，A1和B1为引物，通过聚合酶链式反应扩增目的基因，将聚合酶链式反应产物及质粒PUC-18，分别用HindIII和EcoRI双酶切，酶切产物经纯化回收后，用DNA链上切口酶于20℃连接过夜，电转化大肠杆菌中,用蓝白筛选平板筛选转化子,并对转化子的重组质粒进行双酶切鉴定和序列分析，用序列分析软件将测序结果与其它分枝杆菌属的C1,2位脱氢酶基因进行比对；
步骤2：在连入PUC-18的DNA基因中间设计引物A2和B2,扩增出上下游各含部分DNA基因,中间为PUC-18的线性化重组质粒PUC18-DAN，另外在上下游引物上分别设计KpnI和BamHI的酶切位点，以便连入卡那抗性基因，根据PJUG5的卡那霉素抗性基因序列，同时参照乳酸克鲁维酵母、大肠杆菌载体、PET-28a中的卡那霉素抗性基因序列设计引物A3和C3扩增卡那霉素抗性基因，将线性化的pUC18-DNA和卡那抗性基因双酶切后连接,电转化大肠杆菌JM109,卡那霉素抗性平板筛选转化子,双酶切法进行鉴定,阳性转化子的质粒即为线性载体PUC18-MK；
步骤3：培育LB琼脂培养基：选取葡萄糖10g、柠檬酸2g、柠檬酸铁铵0.05g、磷酸氢二铵35gMgSO4、7H2O0.5g、KHPO0.5g、Iween803ml和豆甾醇5g，用蒸馏水定客至1000ml,并用20％NaOH调LB琼脂培养基的PH为7.0~7.6，在LB琼脂培养基中加入卡那霉素,终浓度分别为0.1-2μg/ml，取0.5ml分枝杆菌的菌液涂布于以上平板,29℃培养48h,观察结果；
步骤4：将分枝杆菌用含有0.3mol/L山梨醇和1mmol/LDTT的10％甘油洗2次,4000r/min离心,最终重悬于10％甘油中,分装，利用电转化法将线性载体导入分枝杆菌中,从而实现对基因的敲除。
2.根据权利要求1所述的一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，其特征在于：以所述HindIII和EcoRI双酶切为酶切位点，以所述A1、A2和A3和B1、B2和B3作为引物载体，将所述分支杆菌染色体作为DNA模板。
3.根据权利要求1所述的一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，其特征在于：所述分支杆菌染色体的电转化条件为:电压2.5kv,电阻200Ω,电容25mF,利用卡那霉素抗性平板筛选转化子。
4.根据权利要求1所述的一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，其特征在于：所述KpnI和BamHI的酶切位点为所述HindIII和EcoRI双酶切的辅助切位点。
5.根据权利要求1所述的一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，其特征在于：所述卡那霉素的终浓度为0.1-2μg/ml。
6.根据权利要求1所述的一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，其特征在于：所述酶切产物经纯化回收后,用DNA链上切口酶于20℃连接过夜。
7.根据权利要求1所述的一种在双降醇中分枝杆菌甾酮C1,2位脱氧酶基因敲除的方法，其特征在于：所述A1、A2和A3均为上游引物，所述B1、B2和B3均为下游引物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190705 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |