CN104745661A - 一种游动放线菌基因组规模代谢网络模型构建及分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种游动放线菌基因组规模代谢网络模型构建方法及分析方法，属于系统生物学领域。基于此方法对构建所得的游动放线菌基因组规模代谢网络模型进行系统层次的细胞生长模拟、生长必需基因、反应鉴定，并对模拟提高阿卡波糖产量提供了策略，为全面理解游动放线菌的代谢特征和提高阿卡波糖发酵水平提供了重要的平台。本发明提供了多种提高阿卡波糖产量的方法，添加烟酸能使阿卡波糖产量提高53.5％，添加谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺使阿卡波糖产量分别提高了29.6％、26.5％、26.3％、11.8％和9.2％。

Description

一种游动放线菌基因组规模代谢网络模型构建及分析方法

技术领域

本发明涉及一种游动放线菌基因组规模代谢网络模型构建方法及分析方法，属于系统生物学领域。

背景技术

II型糖尿病是一种世界性的疾病，目前全世界有320百万II型糖尿病患者，并且患者人数在持续不断增加中。临床常用抗II型糖尿病药物主要有双胍类、磺酰脲类、α-葡糖苷酶抑制剂、噻唑烷双酮类和绿茴苯酸类，阿卡波糖由于其作用温和持久性和无毒作用的特点得到广泛应用。

作为发酵生产阿卡波糖的常用菌株，游动放线菌应用广泛。1977年，德国Bayer从土壤中筛得阿卡波糖工业生产菌Actinoplanes sp.SE50(ATCC 31042)。随后，工业生产的菌种通过菌株选育和发酵优化得到不断的改善。Byoung通过诱变菌株Actinoplanes sp.SE50/110筛得菌株CKD485-16，发酵优化后阿卡波糖产量达到3200mg/L。Wang YJ利用离子注入诱变得到菌株Actinoplanes sp.ZJB-08196，采用培养基优化、控制渗透压、添加腺苷蛋氨酸和有效霉素A等技术手段，阿卡波糖的浓度达到6.6g/L。张琴等通过紫外、NTG、DES和亚硝酸诱变，筛得突变株SIPI-AK，发酵水平比出发菌株提高了35％，优化后阿卡波糖产量达3130mg/L。随着糖尿病患者人数的不断增加，阿卡波糖需求量也在不断增加，但是传统的发酵优化存在着一些问题：(1)传统的菌株选育和发酵优化盲目、耗时长而且似乎达到了极限；(2)菌种Actinoplanes生产阿卡波糖过程中一些代谢机制不清楚，代谢瓶颈未知。因此我们需要系统地了解微生物的生理代谢特性，并且为发酵条件优化提供一定的基础。

随着基因组测序技术的完善和菌株基因组序列的积累，生化数据库的建立，基因组规模代谢网络模型(Genome-Scale Metabolic Model)成为研究的热点。常规的基因组规模代谢网络模型构建是根据公布的基因组测序结果提取具有代谢功能的基因，再整合生化数据库和文献信息，进而组合成代表目的微生物细胞内已知生化反应的反应列表，但是此方法工作量大耗时长。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提出一种半自动化的整合微生物基因组规模代谢网络模型构建方法。运用此方法进行代谢网络模型构建的优点是更加省时、方便，且所得模型更为全面、准确。同时，本发明提出了一种理性设计发酵优化的方法，具有结合微生物生理特点，降低工作强度，减少盲目摸索等优点，为相关发酵产品的发酵条件优化提供一定的指导作用。

本发明的第一个目的是一种提高阿卡波糖产量的方法，所述方法是在游动放线菌的发酵过程中，通过以下任意一种方式或者两种以上方式的结合来提高阿卡波糖产量：(1)添加烟酸；(2)添加氨基酸；(3)控制pH为中性；(4)控制溶氧。

所述氨基酸，在本发明的一种实施方式中为以下任意一种或者多种的组合：谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺。

所述烟酸，在本发明的一种实施方式中，其添加量为2mg/L-10mg/L。

所述控制溶氧，在本发明的一种实施方式中是指控制通气速率0.4vvm-1.0vvm。

所述氨基酸，在本发明的一种实施方式，其添加量为0mmol/L-2.0mmol/L。

所述游动放线菌，在本发明的一种实施方式中为Actinoplanes sp.SE50/110(ATCC 31044)。

所述游动放线菌的发酵，在本发明的一种实施方式中，使用的培养基为全合成培养基。

所述游动放线菌的发酵，在本发明的一种实施方式中，发酵温度为26-30℃，当使用摇瓶发酵(50mL/500mL)时转速为200rpm，当使用发酵罐发酵(4.5L/7.5L)时转速为400rpm。

所述游动放线菌的发酵，在本发明的一种实施方式中，具体是：取对数生长中后期的种子液，离心得到菌体并用生理盐水洗涤后重悬，最后以8-12％(V/V)的接种量接种到含有全合成培养基的发酵罐中培养，培养温度为26-30℃。还可以在全合成培养基中添加烟酸或者氨基酸以提高阿卡波糖的产量。还可以同时控制中性pH或者通气速率0.4vvm-1.0vvm以促进阿卡波糖合成。结果显示，在上述条件下都可以提高阿卡波糖的产量。

所述提高阿卡波糖产量的方式，在本发明的一种实施方式中，是通过构建游动放线菌基因组规模代谢网络模型并对模型进行分析而得到的；所述模型的构建是：根据公布的目的微生物的基因组测序结果，采用多种基因组注释技术进行全基因注释，同时根据生化数据库和文献数据进行补充，构建具有基因一蛋白质一反应关联关系的基因组规模代谢网络模型，随后在Matlab平台上使用Cobra工具箱对模型进行模拟验证分析。

本发明的第二个目的是提供一种游动放线菌基因组规模代谢网络模型的构建与分析方法，所述方法包括：全基因组注释与初模型的构建、模型的精炼、数学模型的建立、模型的验证与分析四个步骤。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：根据公布的目的微生物的基因组测序结果，采用多种基因组注释技术进行全基因注释，同时根据生化数据库和文献数据进行补充，构建具有基因一蛋白质一反应关联关系的基因组规模代谢网络模型，随后在Matlab平台上使用Cobra工具箱对模型进行模拟验证分析、并对其提高阿卡波糖产量提供策略。

所述目的微生物为Actinoplanes sp.SE50/110，其构建的最终模型为iYLW1028。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体包括：

(1)全基因组注释与初模型的构建：首先从NCBI数据库平台上下载最新的Fasta格式的目的微生物基因组序列，然后采用全自动化的基因组注释方法和同源比对方法(Blastp)，对目的微生物基因组序列注释进行整合，从而得到目的微生物的基因信息，得到初始反应列表，构建出以基因一蛋白质一反应关联为核心的代谢网络初模型。

(2)模型的精炼：模型精炼的主要目标是通过整合生化数据库和文献数据来修补初模型不完善的方面并建立物种特异的详细反应列表，具体工作包括统一代谢物格式、删除重复和不恰当反应、添加阿卡波糖合成反应、添加转运反应、填补代谢漏洞、平衡反应质量电荷、确定亚细胞定位、建立生物量方程。

(3)数学模型的建立：将上述反应列表转换成数学模型，其核心内容是计量系数矩阵，通常用S表示。在Matlab平台上安装COBRA工具箱，通过xls2model.m程序可将精细代谢模型转换成系统生物学语言格式的文件(SBML)后可在计算机上模拟。

(4)模型的验证与分析：基于约束条件的模拟优化方法是基因组规模代谢网络模型常用的模拟算法，其中最常用的是流量平衡分析(Flux Balance Analysis，FBA)。通过Cobra工具箱的使用，模拟微生物在特定条件下的代谢状况，包括必需基因和必需反应分析、模型的定性和定量验证分析，模型的定性和定量验证分析要和文献数据和实验数据进行比较。

所述同源比对，在本发明的一种实施方式中，是将Streptomyces coelicolor A3(2)和Bacillusmegaterium WSH002的基因组序列与目的菌进行同源比对。

所述补充信息来源于KEGG、MetacyC、BioPath.Explore生化数据库及PubMed文献数据。

所述模型的验证采用流量平衡分析(Flux balance analysis，FBA)定性验证四十种碳源和二十三种氮源对生长的影响，和不同底物吸收速率对细胞生长的影响，并与文献和湿实验数据进行比较。

根据所述方法构建出游动放线菌基因组规模代谢网络模型iYLW1028，注释出的具有代谢功能的1028个基因占游动放线菌总基因的12.5％。采用流量平衡分析方法证实模型的准确性后，运用Cobra工具箱中的singlegenedeletion.m和singlerxndeletion.m程序鉴定出游动放线菌细胞生长必需基因和必需反应分别为122和213个。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，还包括提高阿卡波糖发酵水平策略研究的步骤：在模型中添加烟酸和20种常见的氨基酸，分析其添加对阿卡波糖发酵的影响。采用鲁棒性分析方法分析质子排出速率和溶氧水平对阿卡波糖发酵的影响。

采用流量平衡分析方法证实烟酸使阿卡波糖产生速率提高8.2％；20种氨基酸对阿卡波糖积累有积极作用，组氨酸使其提高58.7％；质子排放鲁棒性分析表明阿卡波糖的产生比细胞生长对pH值更敏感，中性pH利于阿卡波糖产生；氧气鲁棒性分析表明相对低的溶氧水平(0.1917mmol/gDCW/h)利于阿卡波糖积累。

本发明的第三个目的是提供以上任一方法得到的阿卡波糖。

本发明还要求保护所述阿卡波糖在制备抗II型糖尿病药物方面的应用。

本发明的有益效果：(1)构建了游动放线菌基因组规模代谢网络模型，得到的模型准确性高、可靠性强，为全面理解游动放线菌的代谢特征和提高阿卡波糖发酵水平提供了重要的平台；(2)提供了多种提高阿卡波糖产量的方法，添加烟酸能使阿卡波糖产量提高53.5％，添加谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺使阿卡波糖产量分别提高了29.6％、26.5％、26.3％、11.8％和9.2％，控制中性pH有利于提高阿卡波糖产量。此外，氧气吸收速率为0.1917mmol/gDCW/h时，阿卡波糖合成速率达到最高值(0.0842mmol/gDCW/h)。

附图说明

图1：游动放线菌的基因组规模代谢网络模型构建示意流程图；

图2：20种氨基酸对菌体生长和阿卡波糖发酵的影响；

图3：质子排出速率对阿卡波糖发酵的影响；

图4：氧气吸收速率对阿卡波糖发酵的影响。

具体实施方式

培养基：

平板培养基(CPC培养基，g/L)：蔗糖10-30，蛋白胨1.0-2.0，酪蛋白水解物0.5-1.0，K₂HPO₄·3H₂O0.5-1.0，KCl 0-0.5，MgSO₄·7H₂O 0.25-0.5，FeSO₄·7H₂O 0.05-0.1，pH自然，121℃灭菌15min。

种子培养基(g/L)：葡萄糖5-10，蛋白胨2-4，酵母粉2-4，MgSO₄·7H₂O 0.5-1.0，KH₂PO₄ 1.0-2.0，K₂HPO₄·3H₂O 4-5.2，pH自然，115℃灭菌15min。

全合成培养基(g/L)：麦芽糖50-80，(NH₄)₂SO₄3-5，K₂HPO₄·3H₂O 3-6.55，KH₂PO₄ 3-5，柠檬酸三钠4-5.7，MgCl₂·6H₂O 0-1.0，CaCl₂·2H₂O 1.0-2.0，微量元素液0.1-0.2mL(15.75mmol/LFeCl₂，25.00mmol/L MnCl₂,，3.75mmol/L CaCl₂，3.75mmol/L ZnCl₂，0.50mmol/L CuCl₂，0.05mmol/L NiCl₂，0.02mmol/L[Co(NH₃)₆]Cl₃，过滤后加入到培养基中)，pH 7.0。

实施例1 烟酸添加对阿卡波糖发酵的影响

烟酸浓度(2mg/L、5mg/L、10mg/L)对细胞生长和阿卡波糖合成的影响如表1所示。随着烟酸浓度的增加(0～5mg/L)，细胞生长和阿卡波糖的产量逐渐增加，在5mg/L时细胞干重和阿卡波糖产量达到最大值(10.62g/L和0.697g/L)，比对照组分别提高了13.1％和53.5％，随后随着烟酸浓度的增加(≥5mg/L)，细胞生长和阿卡波糖浓度逐渐降低。

表1烟酸添加对阿卡波糖发酵的影响

实施例2 氨基酸添加对阿卡波糖发酵的影响

在摇瓶中分别添加0mmol/L-2.0mmol/L的精氨酸、组氨酸和谷氨酰胺对细胞生长的影响如表2所示。发现，当添加组氨酸时，细胞干重增加了9.4％，而添加精氨酸和谷氨酰胺则对细胞生长无明显地促进作用。

而在全合成培养基中添加氨基酸对阿卡波糖产量的影响如表2所示。在全合成培养基中添加2.0mmol/L谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺使阿卡波糖产量分别提高了29.6％、26.5％、26.3％、11.8％和9.2％。进一步研究发现，单独添加大于0mmol/L至.2mmol/L的上述5种氨基酸或者两种以上氨基酸混合添加，都能提高阿卡波糖的产量。除此之外，联合添加2mg/L-10mg/L的烟酸，阿卡波糖的产量比单独添加氨基酸或者烟酸要提高得更多。

表2氨基酸添加对菌体生长和阿卡波糖的影响

实施例3 pH对阿卡波糖发酵的影响

比较了不同pH条件下(不控制pH、pH 7.0、pH 5.5)细胞生长和阿卡波糖生产的影响。结果表明，在pH7.0时细胞干重和阿卡波糖产量达到最高值(9.53g/L和0.875g/L)，分别提高了21％和7％(不控制pH)、31％和15％(pH 5.5)。这一结果表明，细胞生能耐受一定的酸性条件(pH5.5)，但中性条件(pH 7.0)更利于细胞的生长；对于阿卡波糖合成来说，中性条件(pH 7.0)更为有利。

实施例4 溶氧对阿卡波糖发酵的影响

比较了不同通气速率(0.4vvm～1.0vvm)对细胞生长和阿卡波糖合成的影响。取对数生长中后期的种子液，离心得到菌体并用生理盐水洗涤洗涤并且重悬，最后以10％(V/V)的接种量接种到发酵罐中(4.5/7.5L)培养，培养温度28℃，转速为400r/min。

结果显示随着通气量的增大，菌体生长和阿卡波糖产量均呈现出现增大后减小的趋势。菌体干重在0.8vvm时达到最大值8.83g/L。阿卡波糖产量在0.5vvm达到最高值(1.11g/L)，比在0.4vvm、0.6vvm、0.8vvm和1.0vvm条件下分别提高了25.1％、17.7％、23.7％和100.1％。上述结果表明，控制通气速率(0.4vvm～0.8vvm)有利于阿卡波糖的生产，而过高的溶氧水平有利于菌体的生长而不利于阿卡波糖的积累。

实施例5 游动放线菌基因组规模代谢网络模型构建过程

游动放线菌基因组规模代谢网络模型构建流程如图1所示，具体如下：

(1)从NCBI数据库中下载最新的Actinoplanes sp.SE50/110的基因组序列，采用以下两种方法对其进行基因组注释。①将基因组序列(fasta格式)上传到RAST服务器，按照要求输入菌株的相关信息将会得到其注释结果。将此注释结果上传到Model SEED服务器，将会得到系统自动构建的基因组规模代谢网络模型，即一个初始的反应列表(命名为列表1)。②将Streptomyces coelicolor A3(2)和Bacillus megaterium WSH002的基因组序列与目的菌进行同源比对，得到反应列表2。整合两种自动化基因组注释结果，得到游动放线菌的初模型。模型构建过程中用到的数据库和软件如表3所示。

(2)模型的精炼包括了①代谢物格式的统一，②272个重复和不恰当反应的删除，③根据文献数据对38个阿卡波糖代谢反应的添加，④根据转运蛋白鉴定结果对33个转运反应的添加⑤填补代谢漏洞的92个反应的添加⑥质量电荷的平衡⑦亚细胞定位的确定：细胞膜和细胞外的蛋白质数目分别为4693，2093和1456⑧细胞生物量组分的确定。最终得到精确的游动放线菌的基因组规模代谢网络模型。

(3)将上述精细模型加载到Matlab平台上，以麦芽糖糖吸收速率0.269mmol/gDCW/h铵盐吸收速率0.330mmol/gDCW/h为限制(其它条件不限制)对模型进行流量平衡分析。

表3数据库及软件

实施例6 游动放线菌基因组规模代谢网络模型特点

采用实施例1的模型构建方法，得到一个游动放线菌基因组规模代谢网络模型(模型特点如表4所示)，包括1028个基因，1219个反应和1128个代谢物，命名为iYLW1028。模型iYLW1028基因覆盖率为12.5％，1219个反应共位于两个区间(分别是细胞内和细胞外)，分布在10个代谢亚系统(65个代谢途径)。在10个代谢亚系统中，氨基酸代谢中所包含的反应(249个)最多，其次分别为脂代谢(237个)和碳水化合物代谢(190个)，这三个代谢亚系统中的反应占总反应数目的50％以上。并且，有90％的反应(1162反应)有明确的基因关联。

表4模型特点

实施例7 游动放线菌基因组规模代谢网络模型验证与分析

游动放线菌基因组规模代谢网络模型验证与分析

(1)基于Matlab采用流量平衡分析方法，设置一定的底物吸收速率(如氮源、硫源)以细胞生长为目标方程考察不同碳源/氮源条件下细胞生长结果，并与实验数据和文献数据相比较(结果如表5、表6所示，其中“+”代表能够生长，“-”代表无法生长)，发现模拟与实验值的吻合率达到92％，证实了模型iYLW1028的准确性。

(2)基于Matlab采用流量平衡分析方法，设置特定的底物吸收速率和产物产生速率，以细胞生长为目标方程考察底物吸收速率对细胞生长的结果，并与实验数据相比较(结果如表7所示)，模拟值与实验值想接近，说明了模型可靠性。

(3)基于Cobra工具箱的Singlegenedeletion.m和Singlerxndeletion.m程序鉴定出在分别以麦芽糖和铵盐为碳源和氮源的培养基上，游动放线菌的生长必需基因和必需反应分别为122个和213个。

表5不同碳源模拟与实验值

表6不同氮源模拟与实验值

表7不同底物吸收速率的定量模拟

实施例8 提高阿卡波糖发酵水平策略研究

1)基于Matlab采用流量平衡分析方法，添加0.001mmol/gDCW/h的烟酸，考察烟酸添加对阿卡波糖发酵的影响，发现阿卡波糖的产生速率增加了8.2％。

2)基于Matlab采用流量平衡分析方法，考察氨基酸添加对菌体生长和阿卡波糖发酵的影响，如图2所示，发现氨基酸对细胞生长和阿卡波糖生产有一定促进作用。其中精氨酸、组氨酸和谷氨酰胺使细胞生长速率提高13.2％、9.9％和6.6％；而组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸和赖氨酸使阿卡波糖生产速率提高58.7％、39.2％、39.2％、39.2％和19.6％。

3)基于Matlab采用鲁棒性分析质子排出速率对菌体生长和阿卡波糖发酵的影响，如图3所示，结果发现，细胞生长和阿卡波糖合成能耐受一定的酸性环境，但与细胞生长相比较，阿卡波糖合成更易受到pH值影响。

4)基于Matlab采用鲁棒性分析溶氧水平对阿卡波糖发酵的影响，结果发现，阿卡波糖合成速率随着氧气吸收速率先升高后降低，如图4所示，当氧气吸收速率为0.1917mmol/gDCW/h时，阿卡波糖合成速率达到最高值(0.0842mmol/gDCW/h)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提高阿卡波糖产量的方法，其特征在于，所述方法是在游动放线菌的发酵过程中，通过以下任意一种方式或者两种以上方式的结合来提高阿卡波糖产量：(1)添加烟酸；(2)添加氨基酸；(3)控制pH为中性；(4)控制溶氧。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸为以下任意一种或者多种的组合：谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述烟酸的添加量为2mg/L-10mg/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述控制溶氧是指控制通气速率0.4vvm-1.0vvm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基酸的添加量为0mmol/L-2.0mmol/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述游动放线菌为Actinoplanes sp.SE50/110(ATCC 31044)。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提高阿卡波糖产量的方式是通过构建游动放线菌基因组规模代谢网络模型并对模型进行分析而得到的；所述模型的构建是：根据公布的目的微生物的基因组测序结果，采用多种基因组注释技术进行全基因注释，同时根据生化数据库和文献数据进行补充，构建具有基因一蛋白质一反应关联关系的基因组规模代谢网络模型，随后在Matlab平台上使用Cobra工具箱对模型进行模拟验证分析。

8.一种游动放线菌基因组规模代谢网络模型的构建与分析方法，其特征在于，所述方法包括：全基因组注释与初模型的构建、模型的精炼、数学模型的建立、模型的验证与分析四个步骤。

9.根据权利要求1-7任一所述方法得到的阿卡波糖。

10.权利要求9所述阿卡波糖在制备抗II型糖尿病药物方面的应用。