CN102965308A - 一种分离高盐环境放线菌的培养基及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离高盐环境放线菌的培养基及其应用。培养基由甘露醇1%、丙氨酸0.1%、K2HPO4 0.1%、MgSO4•7H2O 0.1%、CaCO3 0.02%、FeSO4•7H2O 0.001%、Agar 1.8%、微量盐0.0003%、复合维生素0.0004%、生物素0.000025%、重铬酸钾0.005%组成；微量盐由FeSO4•7H2O、MnCl2•4H2O和ZnSO4•7H2O各0.0001%组成；复合维生素由B1、B2、B6、烟酸、肌醇、泛酸、对氨基苯甲酸、叶酸各0.00005%组成；该培养基适合高盐、寡营养的高盐环境放线菌的分离，具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域，具体的说，本发明具体涉及一种分离高盐环境放线菌的培养基及其应用的技术领域。
背景技术
现有技术认为，用一般的分离方法从环境样品中获得的微生物纯培养物重复性非常高，也很难再分离到新物种。尤其是放线菌，由于其产生多种具有生物活性的次级代谢产物而受到微生物学家的广泛关注，但是目前用普通的分离方法筛选到的菌株大部分都是已知菌和常见菌，这给当前活性物质的筛选带来了极大的困难。因此，探索有效的微生物分离方法，从不同角度、不同层次建立分离微生物的新方法就成了微生物领域长期的研究任务和难点。目前国内外对放线菌分离方法的研究主要集中在样品的预处理，抑制剂的选择和培养基成分的改变等方面。对土壤样品进行预处理和加入抑制剂的主要目的是增加目的菌的数量，减少或抑制非目的菌的生长。司美茹等研究发现，将土样在120℃处理1h有利于放线菌孢子萌发，增加放线菌的种类和数量；75μg/ml的重铬酸钾和2μg/ml的青霉素配合使用可以使细菌的数量明显减少而不影响放线菌的种类和数量。薛清等研究发现将土样在120 W功率模式下微波辐照3min对提高放线菌的出菌率有促进作用。姜怡等研究发现使用100 mg/L的放线菌酮和100 mg/L制霉菌素能有效抑制真菌而不影响放线菌的生长。Li等使用极高频辐射(extremely high frequency radiation，EHF)与连续照射联合使用的方法分离出了较多种类的稀有放线菌；Nonomura等使用6%的酵母提取物溶液处理样品能分离到新的放线菌物种。Esther使用噬菌体作为指示物定向分离稀有放线菌；Hayakawa等以腐殖酸维生素培养基为基础，加入不同种类的抗生素，再结合不同的样品前处理方法，分离出了小双孢菌(Micromonospora)、野野村氏菌(Nonomuraea)、链孢囊菌(Streptosporangium)、螺旋游动菌(Spirilliplanes)、草孢菌属(Herbidospora) 、马杜拉放线菌(Actinomadura)、指孢囊菌(Dactylosporangium)、小四孢菌(Microtetraspora)、地嗜皮菌(Geodermatophilus)、游鱼孢菌(Sporichthya)等大量稀有放线菌。迄今为止，没有那一种培养基能同时分离所有的微生物。
由于放线菌是一类具有巨大应用价值的微生物，所以开发放线菌资源就显得尤为重要。一直以来，分离方法一直是限制人们开发利用这类微生物资源的“瓶颈”，尤其是高盐环境下放线菌的纯培养技术一直没有突破，特别是针对高盐环境下放线菌，没有报道一种适合多种放线菌的培养基。
发明内容
针对现有技术中未见报道一种适合多种放线菌的培养基的技术现状，本发明目的在于提供一种分离高盐环境放线菌的培养基及其应用，填补了国内外针对高盐、寡营养的特殊环境和高盐环境没有一种培养基适合多种高盐环境放线菌的培养分离问题，为放线菌资源的开发提供菌种支撑具有广泛的应用价值。
本发明采用的主要技术方案：
本发明结合嗜盐放线菌对不同盐离子类型的选择和适应性生理学特点，设计分离培养基，全面挖掘盐湖沉积物放线菌资源，客观认识盐湖沉积环境中放线菌的物种多样性，结合沉积物样品离子类型如阳离子Na+、K+、Mg2+、Ca2+等、阴离子Cl-、CO3 2-、SO4 2-、HCO3的多样性，设计分离培养基，从而获得更多的放线菌资源。
本发明提供的一种分离高盐环境放线菌的培养基，按照重量百分比计，培养基由甘露醇1%、丙氨酸0.1%、K2HPO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.1%、CaCO3 0.02%、FeSO4·7H2O 0.001%、Agar 1.8%、微量盐0.0003 %、复合维生素0.0004%、生物素0.000025%、重铬酸钾0.005%组成；其中，微量盐由FeSO4·7H2O、 MnCl2·4H2O 和 ZnSO4·7H2O各 0.0001 %组成；复合维生素由B1、 B2、 B6、烟酸、肌醇、泛酸、对氨基苯甲酸、叶酸各0.00005%组成； pH 7.2-7.4。该分离高盐环境放线菌的培养基以下简称Z5分离培养基。
本发明中提供的重铬酸钾为培养基的非目的菌抑制剂。
通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果：
本发明提供的分离高盐环境放线菌的培养基与现有技术相比，现有技术中报道的经典培养基，分离放线菌种类都比较单一，最多也只能分离到3个属5个不同种的放线菌；而本发明提供的培养基分离放线菌结果为11个属22个种，适合高盐、寡营养的特殊环境和高盐环境放线菌的分离。
本发明站在营养生理学的角度，考虑到盐湖是一个高盐、寡营养的特殊环境和高盐环境放线菌生长缓慢等因素，以微生物对渗透压的反应为指导，设计了以不同碳源和氮源为基础的培养基，适合高盐、寡营养的特殊环境中分离多种放线菌，是目前报道能够分离高盐环境放线菌最多的一种培养基。
具体实施方式
下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指质量百分比。
主要仪器：PCR仪为德国SensoQuest Labcycler；高速冷冻离心机为BeckMan公司Allegra 64R Centrifuge；凝胶成像分析系统为Bio-Rad公司Gel Doc 2000；电泳仪为北京六一DYY-6C。
试剂：用于PCR扩增的全套试剂均购自广州东盛生物科技有限公司；限制性内切酶HaeIII及连接试剂盒PMD18-T购自TaKaRa公司；其他生化试剂均为国产分析纯。
本实验所有培养基中均添加1.5%、5%、10%、15%、20%、25% 6个浓度梯度的NaCl，分离高盐环境放线菌的培养基以下简称Z5分离培养基。
本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
实施例一：分离高盐环境放线菌的培养基的制备
按照重量百分比计，培养基由甘露醇1%、丙氨酸0.1%、K2HPO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.1%、CaCO3 0.02%、FeSO4·7H2O 0.001%、Agar 1.8%、微量盐0.0003 %、复合维生素0.0004% 、生物素0.000025%、重铬酸钾0.005%组成；其中，微量盐由FeSO4·7H2O、 MnCl2·4H2O 和 ZnSO4·7H2O各 0.0001 %组成；复合维生素由B1、 B2、 B6、烟酸、肌醇、泛酸、对氨基苯甲酸、叶酸各0.00005%组成； pH 7.2-7.4。
实施例二：分离高盐环境放线菌的培养基的供试土样
盐湖样品采自位于新疆阿图什市境内的硝尔库勒湖。该湖呈东北-西南向分布, 湖长18-20 km, 宽2-4 km, 面积 45 km2, 海拔为1585 m ( 76°53' E，40°10' N )。样品采集后立即装入无菌的封口袋并置于车载冰箱。运抵实验室后于-20℃保存备用。实验选取其中一份沉积物样品进行分离模型的研究。
1.样品离子成分的测定
主要测定样品中的CO3 2-、Cl-、SO4 2-、Ca2+、Mg2+、Na+、K+ 的含量以及可溶性总盐含量，由新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地综合测试中心完成，样品离子成分的测定方法为常规所见。
2.样品离子成分测定结果
根据采样点的不同植被将样品混合成3份(A、B、C)，由表2.2可以看出，硝尔库勒湖样品的可溶性总盐含量很高，主要的阳离子为Na+，阴离子为Cl-，因此推测该盐湖的盐成分以NaCl为主。可见本发明选用以硝尔库勒湖土样为高盐环境土样的典型代表。
表1 硝尔库勒湖样品离子成分测定结果
以上表１实验表明，本发明选用的盐湖硝尔库勒湖土样为高盐环境土样的典型代表，本发明是基于一个高盐、寡营养的特殊环境和高盐环境，现有技术清楚放线菌生长缓慢，以此决定了本发明设计的培养基具有广泛而适用于高盐、寡营养的特殊环境。
实施例三：经典培养基对放线菌分离的影响
选取6种现有技术中已报道的分离放线菌较好的经典培养基，经典培养基能够代表放线菌领域常见的有代表性的培养基，结果见表2可以看出，共获得6个属16个不同种的放线菌。TP培养基和F6培养基分离效果最好，均能获得3个属5个不同种的放线菌。GW1培养基、HV培养基和SCK培养基分离效果次之，GW1培养基能获得3个属4个不同种的放线菌，HV培养基和SCK培养基均能获得3个属3个不同种的放线菌。从培养基组成来看，TP培养基使用的碳源是海藻糖，氮源是脯氨酸；F6培养基的碳源是壳聚糖，氮源是酸水解酪蛋白并补充了一定量的天冬酰胺；GW1培养基的碳源是甘露醇，氮源是酸水解酪蛋白；HV培养基的碳源是腐殖酸，培养基中补充了一定量的复合维生素；SCK培养基使用的淀粉是一种迟效碳源。海藻糖、脯氨酸和甘露醇都是比较重要的渗透调节物，壳聚糖是一种氨基葡萄糖，腐殖酸是一种高交联度的复合物，只能被放线菌利用；由于高盐环境放线菌生长缓慢，所以淀粉可以持久的为放线菌提供营养物质。因此认为，分离盐湖放线菌时渗透调节物是比较理想的碳源，同时放线菌专一性的碳源和迟效碳源有利于放线菌的分离，复合维生素可能会促进放线菌孢子的萌发。因此尝试从不同碳源和不同氮源的角度设计新的培养基。
表2 经典培养基对硝尔库勒湖沉积物中放线菌的分离结果
现有技术中已报道的分离放线菌较好的6种经典培养基，经典培养基能够代表放线菌领域常见的有代表性的培养基配方如下：
F6培养基：壳聚糖0.4%，酸水解酪素0.2%，天冬酰胺0.1%，K2HPO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，微量盐采用FeSO4·7H2O，ZnSO4·7H2O，MnCl2·4H2O各0.001 %，维生素采用VB1 、VB2 、VB6 各 0. 00005%、VE 0.0001 %、VC 0.0005 %，琼脂粉 1.8%，pH 8.0-8.5。
TP培养基：海藻糖0.5%；脯氨酸0.1% ; K2HPO4 0.1%；MgSO4·7H2O 0.1%；(NH4)2SO4 0.1%；CaCl2 0.2%；NaCl 0.1%；复合维生素（B1 、 B2 、 B6、烟酸、肌醇、泛酸钙、对氨基苯甲酸、叶酸各0.00005%，生物素0.000025%）；琼脂2%； pH 7.2。
TA培养基： L -天门冬酰胺0.1%；海藻糖1%；K2HPO4 0.131%；微量盐( FeSO4 ·7H2O 0.0002%；MnCl2·2H2O和ZnSO4 ·7H2O各 0.0001% )；琼脂2%；pH7. 2-7. 4。
HV培养基：腐植酸0.1%；Na2HPO4 0.05%；KCl 0.17%；FeSO4 0.001%；MgSO4·7H2O 2%；CaCO3 0.002%；放线菌酮 0.005%；维生素B 0.00005%；琼脂 1.8%；pH 7. 2。
GW1培养基：干酪素 0.03%；甘露醇 0.1%；NaHCO3 0.2%；CaCO3 0.02%, (NH4)2 SO4 0.2%；KNO3 0.2%；K2HPO4 0.1%；MgSO4 ·7H2O 0.2%；FeSO4 0.001%；Trace-salt 0.001%；Agar 2%。
SCK培养基：淀粉 1%，水解酪素 0.03%，KNO3 0.2%，MgSO4·7H2O 0.005%， K2HPO4 0.2%，CaCO3 0.002%，FeSO4 0.001%，NaC1 15%，琼脂 2%。
实施例四：分离高盐环境放线菌的培养基对放线菌分离的影响
采用本发明提供的培养基和常见的培养基进行放线菌分离试验，分离试验为常见技术方案，经验证结果见下表3。
表3 Z5培养基对硝尔库勒湖沉积物中放线菌的分离结果
从表3中可以看出，本发明提供的Z5培养基，即分离高盐环境放线菌的培养基的分离效果要明显优于经典培养基，分离到了11个属22个不同种的放线菌。说明在分离盐湖放线菌时以渗透调节物作为碳源，以微生物在渗透胁迫时表达的小分子前体代谢物，如丙氨酸等作为氮源可以获得较好的分离结果，故认为甘露醇-丙氨酸培养基(Z5)可作为盐湖放线菌分离的最佳培养基。如要想分离Zhihengliuella、Actinomycete、Saccharopolyspora菌属的放线菌可以选择Z5培养基。
分析以上研究结果发现表明，现有技术报道的经典培养基，分离放线菌种类都比较单一，最多也只能分离到3个属5个不同种的放线菌。Z5培养基分离放线菌结果：11个属22个种。
实施例五：Z5分离培养基的优选
分离方法：稀释平板涂布法稀释。
分离时添加NaCl的浓度：1.5%、5%、10%、15%、20%、25%。
通过不同Z5分离培养基的选择，参见表4.
表4：Z5分离培养基的选择
| Z5 | 1.5% | Streptomonospora sp. | 链单孢菌属 |
| Z5 | 1.5% | Saccharopolyspora hordei | 糖多孢菌属 |
| Z5 | 1.5% | Micromonospora chaiyaphumensis | 小单孢菌属 |
| Z5 | 1.5% | Micromonospora chaiyaphumensis | 小单孢菌属 |
| Z5 | 1.5% | Saccharomonospora viridis | 糖单孢菌属 |
| Z5 | 1.5% | Streptomyces chungwhensis | 链霉菌属 |
| Z5 | 1.5% | Streptomyces vellosus | 链霉菌属 |
| Z5 | 1.5% | Nocardiopsis dassonvillei | 拟诺卡氏菌属 |
| Z5 | 1.5% | Verrucosispora gifhornensis | 疣孢菌属 |
| Z5 | 1.5% | Actinomycete | 放线菌属 |
| Z5 | 5% | Streptomyces candidus | 链霉菌属 |
| Z5 | 5% | Actinobacterium ZXY018 | 放线杆菌属 |
| Z5 | 5% | Streptomyces radiopugnans | 链霉菌属 |
| Z5 | 5% | Actinopolyspora xinjiangensis | 放线多孢菌属 |
| Z5 | 5% | Actinobacterium | 放线杆菌属 |
| Z5 | 5% | Nocardiopsis tangguensis | 拟诺卡氏菌属 |
| Z5 | 10% | Saccharomonospora halophila | 糖单孢菌属 |
| Z5 | 10% | Zhihengliuella sp. | 志恒菌属 |
| Z5 | 15% | Streptomonospora alba | 链单孢菌属 |
| Z5 | 15% | Actinopolyspora mortivallis | 放线多孢菌属 |
通过实验证明本发明的Z5分离培养基优选结果为可分离放线菌11个属22个种，为现有技术中能够分离最多的培养基。
实施例六：分离所得放线菌菌株的初步鉴定
选用放线菌菌株的鉴定方法在现有技术中常见，通过挑取适量纯化好的放线菌菌体，提取基因组DNA，PCR扩增其16S rRNA 并送样测序（详细过程如下）。将测序所得序列在GenBank上进行相似性比对，将菌株鉴定到属或种。
菌株DNA的提取
(1) 挑取适量的放线菌菌体，放入预先准备好的已灭菌的1.5ml的离心管中，加入480 ul提前配好的1×TE缓冲液，将菌体充分研碎后加入20 μl溶菌酶(50 mg/ml)，放于摇床，37℃，200 r/min振荡8-10 h。
(2) 每管加入5 μl 20 mg/ml的蛋白酶K，再加入50 μl 20%的SDS，放于55℃的水浴中1-2 h，期间来回晃动离心管2-3次。
(3) 每管加入550 μl的酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)，12000 r/min离心10 min后将上清液转移到另一离心管中，再加入550 μl的酚-氯仿-异戊醇，如此反复抽提2-3次。
(4) 取上清，加入800 ul无水乙醇，再加入80 ul的乙酸钠(3 mol/L)，放入4℃冰箱中沉淀DNA约0.5-1 h。
(5) 将沉淀后的DNA在12000 r/min离心10 min，充分弃上清。加入200 μl的70%乙醇清洗离心产物1-2次，12000 r/min离心10 min，弃上清，尽量使乙醇挥发完全。加入50 μl无菌超纯水或1×TE缓冲液溶解DNA后放入-20℃冰箱中保存备用。可用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的质量。
菌株16S rRNA基因序列PCR扩增
采用放线菌特异性引物PA(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')和PB(5'-AGGAGGTGATCCAGCCGC A-3')进行PCR扩增。反应体系(50 ul)为：Taq酶0.2 ul(5 U)；10×buffer 5 μl；dNTPs 1 μl(10 mM)；正向引物PA：1 ul (10 uM/L)；反向引物PB：1 ul (10 uM/L)；BSA：5 ul (25 mg/ml)；ddH2O：35.8 ul；模板1 ul。扩增条件为：94℃预变性4 min；94℃变性1 min；56℃退火1 min；72℃延伸2 min；35个循环；72℃总延伸8 min。
产物的纯化和测序
采用Novasy琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化菌株16S rRNA扩增产物，由上海生物工程有限公司进行测序。
菌株系统进化分析
将测序结果通过Blast程序提交到GenBank数据库中进行相似性比对搜索，下载相关属、种近缘菌株的16S rRNA基因序列，构建系统进化树。用MEGA4.1软件中的Clustal程序进行多序列比对，将生成的文件用邻接法(neighbor-joining )构建系统进化树。采用bootstrap法，重复1000次取样，分析进化树拓扑结构稳定性。
Claims (2)
1.一种分离高盐环境放线菌的培养基，其特征在于，按照重量百分比计，所述的培养基由甘露醇1%、丙氨酸0.1%、K2HPO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.1%、CaCO3 0.02%、FeSO4·7H2O 0.001%、Agar 1.8%、微量盐0.0003 %、复合维生素0.0004%、生物素0.000025%、重铬酸钾0.005%组成；其中，微量盐由FeSO4·7H2O、 MnCl2·4H2O 和 ZnSO4·7H2O各 0.0001 %组成；复合维生素由B1、 B2、 B6、烟酸、肌醇、泛酸、对氨基苯甲酸、叶酸各0.00005%组成； pH 7.2-7.4。
2.如权利要求1所述分离高盐环境放线菌的培养基在放线菌分离中的应用。
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| CN104745661A (zh) * | 2015-04-10 | 2015-07-01 | 江南大学 | 一种游动放线菌基因组规模代谢网络模型构建及分析方法 |
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