CN103343098A

CN103343098A - 一株固氮芽孢乳杆菌及其用途

Info

Publication number: CN103343098A
Application number: CN2013102719912A
Authority: CN
Inventors: 孙建光; 张燕春; 杨慧
Original assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Priority date: 2013-07-01
Filing date: 2013-07-01
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2033-07-01
Also published as: CN103343098B

Abstract

本发明公开了一株固氮芽孢乳杆菌及其用途。该固氮芽孢乳杆菌是芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.7777。本发明所提供的芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777能够在作物根际定殖，具有很高的固氮潜能，在蔬菜工厂化育苗接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

Description

一株固氮芽孢乳杆菌及其用途

技术领域

本发明涉及一株固氮芽孢乳杆菌及其用途。

背景技术

氮肥是农业生产中最重要的生产资料之一。生产化学氮肥消耗大量能源，占生产总成本的70％～80％。近年来能源日趋紧张，化肥生产用煤价格飚升导致化学氮肥价格上涨，农民难以承受，反响强烈。化学氮肥在提高作物产量、保障我国粮食安全方面发挥了巨大作用，但是不合理施氮已经形成了严重的面源污染，造成一系列的严重危害，如太湖蓝藻事件令人触目惊心。城市地下水硝酸盐污染已经对饮用水安全造成了威胁。

大气中含有78%的氮素，但其存在形式是分子态氮气，动植物不能直接利用，自然界只有某些原核微生物具有直接利用大气中氮气的能力，将其还原成氨，这就是生物固氮作用。选用高效固氮微生物菌种工厂化生产制成菌剂，或进一步与其它富含植物营养的物料复合加工成生物制品，应用于农业生产，可以提供作物氮素营养，改善作物根际生态环境，提高土壤生物肥力性状，这就是通常所说的固氮微生物菌剂或固氮微生物肥料。生物氮肥具有多种优势：①生物氮肥由可再生的生化制剂和活体微生物组成，可以再生，不存在资源枯竭问题，是可持续发展农资产品。②生物氮肥是环境友好型肥料，其生产和使用过程均不产生三废等污染性物质，而且能改善土壤理化性质，提高土壤肥力，是生态农业农资产品。③生物氮肥生产耗能少、成本低，其成本仅为等效化学氮肥的20％～40％，可以为国家节省大量的煤炭和石油等能源战略物资。④使用生物氮肥可以显著降低农业生产成本，提高农产品品质，提升土壤肥力，使农民受益，促进社会和谐发展。

菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前，限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈就是高效菌种，农业生产迫切需要能够高效固氮的生产用菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有固氮作用的细菌。

本发明提供的细菌是芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)GD412，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7777。

本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777。

该菌剂除包含作为活性成分的芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777外，还可包括辅料，如草炭、动物的粪便、各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生皮等。所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

该菌剂可用于固氮、促进植物生长、提高植物抗逆性、产生固氮酶等。

所述芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777在制备下述1）-5）中任一的菌剂中的应用也属于本发明的保护范围：

1）用于固氮的菌剂；

2）产生固氮酶的菌剂；

3）促进植物生长的菌剂；

4）改良培肥土壤的菌剂；

5）提高植物抗逆性的菌剂。

上述应用中，所述抗逆性为对逆境的抗性，所述逆境为干旱、淹水、高温、机械损伤、病虫害侵袭或重金属污染等。

所述的芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777或以芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777为活性成分的菌剂在生产固氮酶中应用以及在制备生物有机肥中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种含有所述的芽孢乳杆菌(Sporolactobacillussp.)GD412CGMCC No.7777或以所述的芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777为活性成分的菌剂的生物有机肥。

本发明的又一目的是提供一种培养芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777的方法，包括将芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCCNo.7777在用于培养芽孢乳杆菌的培养基中培养的步骤。

本发明的又一目的是提供一种制备所述菌剂的方法，该方法包括如下步骤：将所述的芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777作为活性成分，得到所述菌剂。

本发明是从农田作物根际土壤中分离固氮菌，进一步筛选较高固氮酶活性的菌株，最终筛选到高效固氮菌芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777，该菌株固氮酶活性达到70.417nmol C₂H₄/h·mg蛋白，统计分析极显著高于微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103，在蔬菜工厂化育苗接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

保藏说明

菌种名称：芽孢乳杆菌

拉丁名：(Sporolactobacillus sp.)

菌株编号：GD412

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2013年6月20日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7777

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的培养基如下：

固氮菌富集培养液ACCC55：蔗糖10g、K₂HPO₄·3H₂O0.5g、NaCl0.2g、CaCO₃1g、MgSO₄·7H₂O0.2g、用蒸馏水定容至1000ml、pH7.0～7.2。

改良的ACCC55固氮菌固体培养基：蔗糖10g、K₂HPO₄·3H₂O0.5g、NaCl0.2g、CaCO₃1g、MgSO₄·7H₂O0.2g、酵母膏0.5g、琼脂15-20g，用蒸馏水定容至1000ml，pH7.0～7.2。

无氮培养基：蔗糖10g，NaCl0.12g，K₂HPO₄·3H₂O0.5g，CaCO₃1g，MgSO₄·7H₂O0.2g，用蒸馏水定容至1000ml，pH7.2。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15-20g，用蒸馏水定容至1000ml，pH7.2。

改良固氮培养基：蔗糖10g、K₂HPO₄·3H₂O0.5g、NaCl0.2g、CaCO₃1g、MgSO₄·7H₂O0.2g、酵母膏0.5g、蒸馏水1000ml、琼脂15-20g，pH7.0～7.2。

下述实施例中所用的圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）ACCC11103（参见“孙建光等.高效固氮芽孢杆菌筛选及其生物学特性.中国农业科学，2009,42(6):2043-2051”）。公众可从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所获得该菌株，以重复本申请的实验。

实施例1、芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777的分离与鉴定

一、作物根际固氮菌GD412的富集与分离

取10g土样（采自中国辽宁省）放入90ml无菌水中摇床振荡20min制成混浊液，吸取5ml放入30ml固氮菌富集培养液ACCC55中，100rpm，28℃进行摇床振荡培养，72h后换新鲜培养液继续培养。重复培养3次后进行固氮芽孢菌分离。吸取1ml上述固氮菌富集培养物放到9ml无菌水中制成10^-1稀释度，继续稀释制成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释度的菌悬液，在100℃沸水中加热10min，冷却后每个稀释度取0.1ml涂布在无氮培养基平板上，29℃静置培养。2～3d待菌落形成后，在改良的ACCC55固氮菌固体培养基平板上用平板划线法进行菌种纯化。将分离纯化所得的其中一个菌株命名为作物根际固氮菌GD412。

二、作物根际固氮菌GD412的鉴定

从以下几个方面鉴定步骤一分离纯化并筛选得到的作物根际固氮菌GD412：

1、形态学鉴定

将处于对数生长期且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的作物根际固氮菌GD412进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态（是否平坦、突起、褶皱、凹陷等）、菌落边缘状态（是否整齐、不规则、放射状等）。

对于处于对数生长期的所述作物根际固氮菌GD412，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。

结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的作物根际固氮菌GD412菌落圆形平铺，浅乳白色，有光泽，表面光滑湿润，边缘整齐；菌体杆状，1.0×4.0-5.0μm；革兰氏阳性；有芽孢。

2、生理生化特征分析

参考《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.）和《微生物学实验》（沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社,1999.）测定上述作物根际固氮菌GD412的生理生化特征。

所述作物根际固氮菌GD412的生理生化特征测定结果如下：

接触酶反应：阳性；

氧化酶反应：阴性；

生长温度：4℃不生长，28℃生长，37℃不生长，60℃不生长；

耐盐性试验：2%NaCl生长，5%NaCl不生长，7%NaCl不生长，10%NaCl不生长；

苯丙氨酸脱氨酶试验：阴性；

利用柠檬酸盐：阴性；

水解淀粉：阴性；

卵黄卵磷脂酶：阴性；

甲基红试验：阳性；

V．P试验：阳性；

PH5.7生长：阳性；

糖醇发酵产酸：葡萄糖阴性，甘露醇阳性，乳糖阳性，蔗糖阴性。

3、16s rDNA序列同源性分析

常规方法培养上述步骤一分离纯化得到的作物根际固氮菌GD412，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16s rDNA通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR反应。反应体系采用上海生物工程有限公司PCR扩增试剂盒。反应程序为：95℃变性30s、55℃退火1min、72℃延伸2min，共30个循环。DNA测序由北京三博远志生物技术公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar软件完成，基因比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）和EzTaxon在线完成。

PCR基因扩增得到作物根际固氮菌GD412的16S rDNA基因片段约1.4kb，测定序列后与NCBI和EzTaxon数据库中已公开的16S rDNA序列进行在线同源性比对，结果显示GD412与芽孢乳杆菌Sporolactobacillus laevolacticus IAM12321^T（GenBank登录号D16270）的同源性最高，达到99.228%。

作物根际固氮菌GD412的16s rDNA序列详见序列表中序列1。

4、生长特性分析

进行了作物根际固氮菌GD412的最适温度和最适pH生长实验。采用无氮培养基，分别在4℃、28℃、37℃、60℃培养、观察、记录菌株的温度适应性，每个处理3次重复。调整pH分别为4、5、6、7、8、9、10，每个处理3次重复，培养、观察、记录菌株生长的最适pH。

结果表明，所述作物根际固氮菌GD412的最适生长温度为28℃，最适生长pH为pH7～8。

鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤一分离纯化得到的作物根际固氮菌GD412鉴定为细菌域芽孢杆菌亚群芽孢乳杆菌科（Sporolactobacillaceae）芽孢乳杆菌属（Sporolactobacillus sp.)。该芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412已于2013年6月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.7777。

实施例2、芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777固氮酶活性测定

对实施例1所得到的芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777进行固氮酶活性测定，具体方法如下所述：在15×150mm螺口玻璃管中加入5mL改良固氮培养基制成斜面，接种芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCCNo.7777，28℃培养。以微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌（Azotobacterchroococcum）ACCC11103为阳性对照，不接种空白斜面为阴性对照，每个处理设3个重复。培养72h后，换橡胶塞，注入乙炔气体使终浓度为10%，用医用胶布密封，继续培养72h，取100μL反应气体，用气相色谱仪测定乙烯生成量，根据以下公式计算菌株的固氮酶活性。固氮酶活性（nmol/mg·h）=C₂H₄nmol/[菌体蛋白量（mg）×反应时间（h）]，其中C₂H₄nmol=1000×C₂H₄体积（μl）×273×P/[22.4×(273+t℃)×760]，其中P为气压（mm汞柱），t为反应温度。

其中，菌体蛋白含量测定方法如下所述：用5mL生理盐水将试管斜面上的菌苔洗入离心管中，收集菌体，向菌体中加入3mL0.5M的NaOH沸水煮沸5min，加入3mL0.5M的HCl混合，离心后取上清1.0mL，加入5mL考马斯亮蓝溶液，在漩涡混合器上混合，显色3min，测定595nm处的吸光值A₅₉₅，根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含量。

结果显示，筛选到的芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777的固氮酶活性为70.417nmol C₂H₄/h·mg蛋白，统计分析极显著高于微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性为25.100nmol C₂H₄/h·mg蛋白。这一结果表明，本发明的芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777具有很高的固氮潜能，在蔬菜工厂化育苗接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。

Claims

1.芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.7777。

2.一种菌剂，它的活性成分为权利要求1所述的芽孢乳杆菌（Sporolactobacillussp.)GD412CGMCC No.7777。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为下述1）-5）中任一的菌剂：

1）用于固氮的菌剂；

2）产生固氮酶的菌剂；

3）促进植物生长的菌剂；

4）改良培肥土壤的菌剂；

5）提高植物抗逆性的菌剂。

4.权利要求1所述的芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777在制备下述1）-5）中任一的菌剂中的应用：

1）用于固氮的菌剂；

2）产生固氮酶的菌剂；

3）促进植物生长的菌剂；

4）改良培肥土壤的菌剂；

5）提高植物抗逆性的菌剂。

5.根据权利要求3所述的菌剂或权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为对逆境的抗性，所述逆境为干旱、淹水、高温、机械损伤、病虫害侵袭或重金属污染。

6.权利要求1所述的芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777或权利要求2、3或5所述的菌剂在生产固氮酶中应用。

7.权利要求1所述的芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777或权利要求2、3或5所述的菌剂在蔬菜工厂化育苗或在制备生物有机肥中的应用。

8.含有权利要求1所述芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCCNo.7777或权利要求2、3或5所述的菌剂的生物有机肥。

9.培养权利要求1所述芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCCNo.7777的方法，包括将芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777在用于培养芽孢乳杆菌的培养基中培养的步骤。

10.权利要求2、3或5所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.)GD412CGMCC No.7777作为活性成分，得到所述菌剂。