CN109897787A - 一株米曲霉za133及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株米曲霉ZA133菌株,其已于2018年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60477，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。该米曲霉ZA133具有高产琥珀酸和高产谷氨酸的特性，采用该菌株进行酱油原油发酵，原油中谷氨酸产量能够高达10.9克/升，琥珀酸产量能够达到3.1克/升，与出发菌株相比，氨基氮得率能够提高9％。此外，感官鉴评结果显示ZA133发酵获得的酱油原油的鲜味更突出、持久、口感更协调丰富。该菌株经过连续传代10代后所产的谷氨酸、琥珀酸及氨基氮含量在各代之间稳定，未显示出回复突变，表明该菌株具有很好的遗传稳定性。

Description

一株米曲霉ZA133及其应用

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，涉及一株适用于酱油酿造的米曲霉 ZA133(Aspergillus oryzae)，及涉及所述米曲霉ZA133在提高酱油原油琥珀酸 和谷氨酸含量中的应用。

背景技术

酿造酱油是以小麦和黄豆为原料，经过微生物发酵制成的一种液态调味品。 其中，米曲霉是酱油酿造的关键菌种，不仅能为后续发酵过程提供各种酶系， 如蛋白水解酶、淀粉水解酶、纤维素酶、植酸酶等，还能给酱油带来特有的风 味成分。目前，国内90％的酱油生产企业采用米曲霉As3.951(沪酿3.042)菌 株进行酱油生产，该菌株具有酶系种类丰富、生长旺盛、传代遗传稳定性好、 应用工艺成熟等特点。

生产菌株对酱油发酵产量和质量影响甚深。研究表示米曲霉制曲阶段所生 产的酶系与代谢产物种类、原料使用率、成品色泽及味道有着直接关联。其中， 米曲霉制曲阶段的三羧酸代谢途径(TCA循环)中所产生的α-酮戊二酸及琥珀 酸对天然发酵酱油成品有着巨大影响。α-酮戊二酸是谷氨酸的形成前体，α-酮戊 二酸含量的提升会直接促进谷氨酸含量的提升，谷氨酸含量的提高能够直接提 高酿造酱油的鲜美度。琥珀酸是一种风味增鲜剂，带有海鲜贝类的滋味，能与 其他呈味成分协同作用达到呈鲜增味的效果。因此，米曲霉中琥珀酸与谷氨酸 含量的共同提升，不仅可提升酱油鲜味的鲜美度，而且利用琥珀酸的协同增鲜 作用，可让鲜味更持久、协调。

中国发明专利申请CN 106222094A(发明名称为《富产琥珀酸的酱油酿造 用菌株及其诱变选育方法和应用》)中利用紫外对沪酿3.042米曲霉进行诱变， 选育获得了一株琥珀酸产量较出发菌株提高近2倍且含量达到1.72克/升的米曲 霉菌株。但此高产琥珀酸菌株所发酵的酱油，氨基氮含量只有1.08克/100毫升， 比出发菌种沪酿3.042低了0.02克/100毫升。

中国发明专利申请CN 104872616A(发明名称为《一种酱油酿造用曲的制 备方法》)中公开了利用一株高产琥珀酸总状毛霉发酵低质鱼虾粉制成高琥珀 酸含量的酱油。

中国发明专利申请CN 107746812A(发明名称为《一株米曲霉ZA156及其 应用》)中描述了一株高产中性蛋白酶、淀粉酶和谷氨酰胺酶活力菌株。此米 曲霉适合用于生产原酿高鲜酱油，使得原油中的谷氨酸提升了10％左右。

山东省烟台大学李宁等人以米曲霉As3.042为出发菌株,经过紫外诱变、亚 硝基胍诱变后获得一株高产琥珀酸米曲霉菌株ASC-5。该菌株在马铃薯液体培 养基中琥珀酸产量高达3.60g/L，为出发菌株的371倍(李宁、马莉岷等，“富 产琥珀酸米曲霉的诱变选育”，《中国酿造》2015年第34卷第1期，第72～ 75页)。

为了满足消费者对酱油鲜味的需求，各企业在酱油中添加了如谷氨酸钠， 肌苷酸，鸟苷酸等各种鲜味剂、呈味剂。但随着生活水平的提高，消费者对零 添食品更加倾心。所以，在保持现有酱油发酵体系基础上进行针对性的选育高 鲜菌株，对于提高天然酿造酱油品质至关重要。

发明内容

为了满足酱油天然呈鲜的需求，本发明选育一株高产琥珀酸和高产谷氨酸 的米曲霉ZA133，接种该菌株进行酱油酿造可同时提高呈鲜物质谷氨酸和琥珀 酸的含量，同时高含量琥珀酸与谷氨酸之间形成协同增味作用，使得发酵酱油 的鲜味口感更丰富持久。

为实现上述目的，所采取的技术方案为：本发明提供了一株米曲霉ZA133， 该菌株已于2018年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为 GDMCC NO：60477，分类命名为Aspergillus oryzae，保藏地址为广州市先烈中 路100号大院59号楼。

本发明提供的米曲霉ZA133是以沪酿3.042为原始菌株，通过公知诱变方 法之一紫外诱变方法进行诱变而获得。该米曲霉ZA133产谷氨酸和琥珀酸能力 高于出发菌株。

本发明的米曲霉ZA133的菌落特征如下：将米曲霉ZA133接种在豆汁平板 培养基上培养，并在30℃的条件下进行菌落形态观察，培养初期接种的孢子逐 渐萌发呈白色菌丝，培养到第三天左右菌落表面形成大量绿色孢子，培养到第 五天左右孢子转为成熟的黄绿色并且菌落背面有黄褐色色素沉淀，七天后菌落 直径可达34-39mm。

因此，本发明提供了一株米曲霉ZA133。

本发明提供了一种酱油，所述酱油是采用上述米曲霉ZA133对大豆、小麦 原料进行发酵获得。

本发明提供了上述米曲霉ZA133在食品发酵中的用途，在一个实施例中， 食品发酵为酱油和/或酱发酵。

本发明提供了上述米曲霉ZA133在制曲中的用途，在一个实施例中，制曲 获得的成曲用于制备酱油和/或酱发酵。

本发明提供了上述米曲霉ZA133在制备酱油和/或酱中的用途。

本发明提供了上述米曲霉ZA133在提高酱油鲜味方面的用途。

本发明提供了上述米曲霉ZA133在提高酱油琥珀酸和谷氨酸含量方面的用 途。

有益效果：

本发明提供的米曲霉ZA133菌株具有高产琥珀酸和高产谷氨酸的特性，采 用该菌株进行酱油原油发酵，谷氨酸含量能够高达10.9克/升，琥珀酸含量能够 达到3.1克/升，与出发菌株沪酿3.042相比，米曲霉ZA133的氨基氮得率能够 提高9％。此外，组织专业鉴评人员对此菌株发酵原油进行鉴评，鉴评结果显示 ZA133发酵获得原油较出发菌株在鲜味上更突出、持久，口感更协调丰富。该 菌株经过连续传代10代之后谷氨酸、琥珀酸及氨基氮含量在各代之间稳定，波 动范围在10％以内，未显示出回复突变，表明该菌株具有很好的遗传稳定性。

附图说明

图1为本发明米曲霉ZA133菌株的获得及应用流程图；

图2为本发明米曲霉ZA133菌株发酵酱油感官鉴评雷达图。

具体实施方式

为了促进对本发明的理解，以下将列举具体实施例进行进一步说明，并使 用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施例不意图限制 本发明的应用范围。所描述的实施例中的任何改变和进一步的修改，及本发明 的任何进一步应用，均为本领域技术人员显而易见。

除非特别说明，否则本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规 试剂、方法和设备。

除非特别说明，否则本发明实施例所用培养基和试验条件均为本领域常规 培养基和试验条件。除非特别说明，否则本发明实施例所用试剂均为市购。下 述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1米曲霉菌株的诱变筛选

本发明米曲霉ZA133菌株的获得及其应用流程如图1所示。

将培养成熟的沪酿3.042菌株的孢子制成孢子悬液，并对孢子悬液进行紫外 线诱变。经过紫外诱变后的孢子悬液按照10倍梯度稀释法，用无菌生理盐水将 孢子悬液稀释到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6浓度，制成孢子稀释液。选取 10^-6浓度梯度的孢子稀释液作为后续实验。

移取0.2ml孢子稀释液涂布于溴甲酚绿大豆蛋白平板培养基上，并在30℃ 条件下培养7天。在培养过程中观察并记录菌落的生长情况、颜色变化快慢情 况、颜色圈形成的快慢大小，并测量计算圈径比。该过程共观察并记录1200个 单菌落，挑选其中菌落生长速度快，颜色变色接近黄色，圈径比大的109株菌 株进行下一步筛选。

将上述109株菌株转接到不含有溴甲酚绿的大豆蛋白平板培养基上，并在 30℃培养箱中培养7天，在培养过程中观察并记录菌落的生长情况、透明圈形 成的快慢、透明圈大小、孢子着生情况。并挑选生长速度快、圈径比大、孢子 着生良好的菌株移种于豆汁斜面培养基中；在30℃培养箱培养至成熟后，置于 4℃冰箱保藏备用。

其中，溴甲酚绿大豆蛋白培养基的配制方法为：大豆蛋白1克，麦芽糖2 克，磷酸氢二钾1克，七水硫酸锌1克，氯化钠0.5克，七水硫酸镁0.5克，七 水硫酸亚铁0.1克，磷酸二氢钾0.1克，琼脂粉15克，蒸馏水1升，pH 5.5，并 在0.1Mpa、121℃条件下灭菌15分钟；为避免大豆蛋白与麦芽糖高温灭菌发生 美拉德反应，二者分开灭菌后再混匀。溴甲酚绿用0.22μm无菌滤膜过滤后，待 培养基冷却到50℃左右加入，溴甲酚绿在培养基中的最终浓度为100毫克/升。

实施例2米曲霉曲料制作与发酵

将小麦、脱脂大豆、水按一定比例混合拌匀，分装三角瓶后于121℃灭菌 30分钟，制成三角瓶发酵培养基。将实施例1中的米曲霉斜面菌种挑取1环孢 子接种于三角瓶发酵培养基中，32℃培养96小时至成熟，制得三角瓶曲料。三 角瓶发酵培养基的配方为：脱脂大豆：小麦＝1:1，润水1.2倍，拌匀后分装入三 角瓶，每瓶30克，0.1Mpa、121℃条件下灭菌20分钟。

待三角瓶曲料成熟后往三角瓶中加入2倍的盐水进行高盐稀态发酵，发酵 条件为在45℃培养箱中发酵30天。发酵结束后摇匀酱醪，过滤并获得滤液，用 HPLC法测定琥珀酸、谷氨酸含量，用滴定法测定氨基酸态氮含量、用凯氏定氮 法测定全氮含量。通过综合指标判定分析，获得4株综合性能较好的菌株，分 别命名为S1811F、S1811G、S1811H、S1811I。其琥珀酸、谷氨酸、氨基酸态氮、 全氮检测结果如表1所示。

表1优良筛选菌株发酵指标检测

如表1的结果所示，S1811H菌株的氨基氮达到1.13克/100毫升，全氮达到1.84 克/100毫升，谷氨酸达到11.1克/升，琥珀酸达到3.2克/升，在4株菌株中的综合性 能是最优的。上述发酵指标有利于改善发酵原油的鲜味，使口感更加丰富。

发明人对S1811H菌株进行生物材料样品保藏，命名为米曲霉ZA133，保藏 单位名称为广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59 号楼，保藏日期为2018年11月15日，保藏编号为GDMCC No.60477，因此， 表中菌株S1811H即本发明人进行专利保藏的米曲霉ZA133菌株。

实施例3米曲霉ZA133菌株的遗传稳定性

将实施例2所得米曲霉ZA133菌株在豆汁斜面培养基上连续传代10代，观察 并记录各代菌株的生长情况，并将第1代、第5代和第10代斜面种按照实施例2所 述的方法进行三角瓶培养与发酵。检测发酵酱油琥珀酸及谷氨酸含量，判断米 曲霉ZA133菌株的遗传稳定性，若十代测定琥珀酸及谷氨酸的含量间误差在10％ 误差范围内，则表明菌株遗传稳定性良好。检测结果如表2所示，表明本发明的 米曲霉ZA133菌株遗传稳定性良好。

表2米曲霉ZA133菌株遗传稳定性检测结果

如表2所示，通过10代传代实验分析了米曲霉ZA133菌株在谷氨酸和琥珀酸 方面表现出了良好的稳定性，符合生产使用需求。

实施例4米曲霉ZA133菌株在酱油酿造中的应用

将诱变筛选所得米曲霉ZA133菌株与出发菌株沪酿3.042同步展开酱油生产 使用，首先按常规方法采用普通曲池制曲，制曲结束后，将米曲霉ZA133菌株种 曲分为3批次制成成曲，所得成曲的检测结果见表3。

将上述三个批次的成曲加入2倍的盐水进行高盐稀态发酵，发酵温度及发酵 周期管理按照常规生产方法进行。发酵结束后，对压榨所得的酱油进行氨基氮、 全氮、琥珀酸和谷氨酸检测，检测结果见表3。

表3米曲霉ZA133菌株制曲成曲及发酵酱油指标检测

结果表明，米曲霉ZA133菌株发酵酱油的氨基氮达到1.08克/100毫升以上， 全氮达到1.78克/100毫升以上，琥珀酸达到3.1克/升以上，谷氨酸达到10.8克以 上，发酵理化指标稳定正常，具有产业化应用价值。

本实施例召集了10名有丰富经验的鉴评人员对上述发酵酱油进行感官鉴评， 感官鉴评的评价指标包括鲜味、甜味、酸味、咸味、苦涩味和浓厚感，分值为0～ 4分，分数越高，该项指标越好。感官鉴评结果如表4、图2。

表4米曲霉ZA133菌株发酵酱油感官鉴评结果

	鲜味	甜味	酸味	咸味	苦涩味	浓厚感
							沪酿3.042	3.0	2.9	2.7	2.8	2.8	3.1
ZA133	3.6	2.9	2.4	2.8	2.8	3.3.

表4和图2的感官鉴评结果显示，与对照菌株沪酿3.042相比米曲霉ZA133菌 株发酵获得的酱油，在鲜味、酸味及浓厚感上要明显好于生产对照菌株，达到 选育米曲霉ZA133菌株的目的。

本专利提供的任何和所有实施例或示例性语言的使用仅旨在更好地说明本 发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有要求。说明书中的语言不应被 解释为指示任何未要求保护的元素对于实施本发明是必要的。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单 独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本专利所 述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意 图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附 图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明 性的而不是限制性的。

Claims (9)

1.一株米曲霉ZA133，其特征在于，所述米曲霉ZA133已于2018年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60477，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。

2.一种酱油，其特征在于，所述酱油是采用如权利要求1所述的米曲霉ZA133对大豆、小麦原料进行发酵获得的。

3.权利要求1所述的米曲霉ZA133在食品发酵中的用途。

4.权利要求3所述的用途，其中食品发酵为酱油和/或酱发酵。

5.权利要求1所述的米曲霉ZA133在制曲中的用途。

6.权利要求5所述的用途，其中制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱发酵。

7.权利要求1所述的米曲霉ZA133在制备酱油和/或酱中的用途。

8.权利要求1所述的米曲霉ZA133在提高酱油鲜味方面的用途。

9.权利要求1所述的米曲霉ZA133在提高酱油琥珀酸和谷氨酸含量方面的用途。