CN113755341A - 一种羊肚菌液体发酵培养方法 - Google Patents

一种羊肚菌液体发酵培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种羊肚菌液体发酵培养方法，包括以下步骤：(1)制备母种；(2)制备原种；(3)制备栽培种；(4)液体发酵培养：取栽培种平板培养基上的菌丝体放入锥形瓶中，之后放入摇床培养箱中在23‑33℃，160‑260r/min培养1‑5d；液体发酵培养基包括下列组分：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏5g/L、MgSO41g/L、KH2PO41g/L、VB11g/L，蒸馏水定容，pH自然。本发明通过对液体发酵条件的优化，以及培养基的合理搭配，达到了羊肚菌菌丝生长快、品质好的目的。

Description

一种羊肚菌液体发酵培养方法
技术领域
本发明涉及羊肚菌栽培技术领域，更具体的说是涉及一种羊肚菌液体发酵培养方法。
背景技术
羊肚菌是一种盘菌纲盘菌目羊肚菌属的大型珍稀食用真菌，因它的表面含有许多小小的沟壑凹坑而得名，又由于含有蛋白质、多糖、甘露醇以及稀有氨基酸等，有极高的药用价值。我国中医中一致认为羊肚菌有补脑提神、抵抗疲劳、增强免疫力、促进消化、补肾壮阳、化痰理气、抑制肿瘤、增强机体免疫力和减轻毒副作用等功能，正是因为这些保健功能，使得羊肚菌深受人们喜爱。
野生羊肚菌在我国许多省份均有生长，尤其喜欢生长于大火烧过之处，周围环境潮湿阴凉背风，多生长于阔叶林，如生长在杨树林、槐树林及榆树林等地，也有一些生活在河边、路边等处，但是经过火烧后的地方羊肚菌往往会长的更多更好。
由于野生的羊肚菌对生活环境要求高，导致野生羊肚菌资源不足，无法满足人们的需求，市场供不应求，价格一直居高不下，所以对其进行人工栽培符合人们的的期望与要求。虽然近些年我国相关方面一直致力于羊肚菌人工栽培的问题，但是由于羊肚菌对其繁衍与生长环境的要求非常严苛，所以人工栽培产量极不稳定，成功栽培羊肚菌的案例还处于研究阶段。研究显示，羊肚菌菌丝体中所含营养物质的种类及含量都与子实体相似，而且液体发酵可以进行工业化生产，并且液体发酵培养还具有生产规模大、发酵周期短、菌丝体产量高以及生产效益高等特点。所以，利用发酵技术得到羊肚菌菌丝体及其他产物不仅填补了对羊肚菌子实体市场需求的空缺，还为羊肚菌的深层次开发奠定了基础。因此，如何提供一种利用液体发酵培养羊肚菌的方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种羊肚菌液体发酵培养方法，通过对液体发酵条件的优化，以及培养基的合理搭配，达到了羊肚菌菌丝生长快、品质好的目的。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种羊肚菌液体发酵培养方法，包括以下步骤：
(1)制备母种：用接种针将羊肚菌接种到PDA斜面培养基上进行恒温培避光培养，斜面培养基中长满菌丝后备用；
(2)制备原种：用接种针取出斜面培养基上的菌丝放入原种平板培养基中进行恒温培避光培养，原种平板培养基中长满菌丝后备用；
(3)制备栽培种：取原种平板培养基上的菌丝体放入栽培种平板培养基中进行恒温培避光培养，栽培种平板培养基中长满菌丝后备用；
(5)(4)液体发酵培养：取栽培种平板培养基上的菌丝体放入锥形瓶中，之后放入摇床培养箱中在23-33℃，160-260r/min培养1-5d；液体发酵培养基包括下列组分：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏5g/L、MgSO41g/L、KH2PO41g/L、VB11g/L，蒸馏水定容，pH自然。
优选的，所述PDA斜面培养基包括下列质量份配比的组分：去皮马铃薯200份，葡萄糖20份，琼脂18份，拌水量为上述组分总质量的，pH自然。
优选的，所述原种平板培养基包括下列质量份配比的组分：去皮马铃薯200份，葡萄糖20份，蛋白胨3份，琼脂18份，拌水量为上述组分总质量的，pH自然。
优选的，所述栽培种平板培养基包括下列质量份配比的组分：去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨3g/L，琼脂18g/L，MgSO41g/L、KH2PO41g/L，蒸馏水定容，pH自然。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果为：
野生真菌由于生长在野外环境中，周围的环境不受控制，时而潮湿，时而干旱，时而有风，时而有阳，时而黑暗，时而有光，所以虽然产量极低，但是品质极好。但是在人工种植中虽然能模仿羊肚菌生长的环境，以及其他需要摄取的营养与配方，但是往往存在难以发现的因素或者两种甚至几种相关联的因素，这是影响羊肚菌生长的重要问题。本发明中采用的碳源和氮源利于羊肚菌的生长与吸收，而温度与转速等则影响着生物体中酶的活性，酶活时刻影响着菌丝体的生长与分裂，只有达到最适温度，酶的活性才能达到最大，从而使菌丝生长最快，营养才能最快的积累下来。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为不同碳源对羊肚菌菌丝体产量和胞外粗多糖含量的影响；
图2为不同氮源对羊肚菌菌丝体产量和胞外粗多糖含量的影响；
图3为不同液体发酵培养温度对羊肚菌菌丝体产量和胞外粗多糖含量的影响；
图4为不同液体发酵培养转速对羊肚菌菌丝体产量和胞外粗多糖含量的影响。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中所用设备如下：立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；超净工作台：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；光照培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；恒温培养振荡器：天津市欧诺仪器仪表有限公司；离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；电热恒温干燥箱：康恒仪器有限公司；Scientz-10N冷冻干燥机：宁波新芝科技股份有限公司，752N紫外可见分光光度计：上海精科。
实施例1
实验材料
羊肚菌取自河南三门峡
斜面PDA培养基(母种)：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然。
原种培养基：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然。
栽培种培养基：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，琼脂18g，MgSO41g，KH2PO41g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然。
液体发酵培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏5g，MgSO41g，KH2PO41g，VB11g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然。
实验方法
1制备母种
称取200g去皮后的马铃薯煮汁，用8层纱布过滤，之后倒入锅中，边加热边加入葡萄糖，琼脂，用蒸馏水定容至1000mL,搅匀后倒入试管中，塞好棉塞，放入灭菌锅121℃灭菌20分钟后放入超净台斜面放凉。在超净工作台上，将羊肚菌子实体用灭菌过得手术刀切开，将菌伞与菌柄交接处切下，弃去表面皮层，用接种针将其接种到PDA斜面培养基上，放在25℃恒温培养箱中进行避光培养，斜面培养基中长满菌丝后备用。
2制备原种
称取200g去皮后的马铃薯煮汁，用8层纱布过滤，之后倒入锅中，边加热边加入葡萄糖，琼脂，蛋白胨，用蒸馏水定容至1000mL，搅匀后倒入锥形瓶中，塞好棉塞，连同培养皿，用报纸包裹扎紧之后放入灭菌锅，在121℃下进行灭菌，20分钟后放入超净台，稍凉后倒入培养皿中，放凉。在超净台上，用接种针取出斜面培养基上的菌丝放入平板培养基中，接种后的培养基用封口膜封好，放入25℃恒温培养箱中避光培养，直到长满菌丝。
3制备栽培种
称取200g去皮后的马铃薯煮汁，用8层纱布过滤，之后倒入锅中，边加热边加入葡萄糖，琼脂，蛋白胨，MgSO4，KH2PO4，用蒸馏水定容至1000mL,搅匀后倒入锥形瓶中，塞好棉塞，连同培养皿，用报纸包裹扎紧之后放入灭菌锅，在121℃下进行灭菌，20分钟后放入超净台，稍凉后倒入培养皿中，放凉。在超净台上，在原种培养基上取1mL枪头大小的菌丝体，放入平板培养基中，接种后的培养基用封口膜封好，放入25℃恒温培养箱中避光培养，直到长满菌丝。
4制备液体发酵培养基
葡萄糖20g，蛋白胨20g，每次加入，pH自然。搅拌均匀后取50mL放入250mL锥形瓶中，塞好棉塞，放入灭菌锅121℃灭菌20分钟后放入超净台放凉。在平板培养基上取1mL枪头大小的菌丝体，放入锥形瓶中，之后放入摇床培养箱中在23℃，210r/min培养3d。
对比例1-3
对比例1-3分别用蔗糖、麦芽糖和玉米粉代替实施例1中液体发酵培养基中的葡萄糖，其余同实施例1。
对比例4-6
对比例4-6分别用牛肉膏、硝酸钾和麦麸代替实施例1中液体发酵培养基中的蛋白胨，其余同实施例1。
对比例7-9
对比例7-9分别用18℃，28℃，33℃替换实施例1中液体发酵培养条件中的温度23℃，其余同实施例1。
对比例10-12
对比例10-12分别用160r/min，260r/min，310r/min替换实施例1中液体发酵培养条件中的转速210r/min，其余同实施例1。
试验例
对实施例1和对比例1-12提供的羊肚菌液体培养方法对羊肚菌液体发酵培养的影响进行测定
测定方法
1胞外粗多糖的测定
液体发酵培养后的发酵液用四层纱布过滤，过滤后的滤液用于胞外多糖的提取，将发酵液在60℃的水浴锅中蒸发浓缩至10mL后，加入30mL95％乙醇定容到40mL，放入冰箱-20℃处沉淀24h。将滤液4000r/min离心10min,弃上清液，沉淀物加入其三倍体积的95％乙醇洗涤三次，干燥，最终提取出羊肚菌的胞外粗多糖，称质量后计算其胞外粗多糖得率。
2菌丝体干重的测定
液体发酵培养后的发酵液用四层纱布过滤，过滤到纱布上的菌丝体用蒸馏水清洗三次，用冷冻干燥机冷冻干燥至其质量不变后，称其质量并计算其菌丝体干重。
结果与分析
碳源：由图1可以看出，羊肚菌菌丝体在几种碳源因素中都能很好的生长，菌丝体产量为葡萄糖>蔗糖>麦芽糖>玉米粉，胞外粗多糖含量为玉米粉>蔗糖>葡萄糖>麦芽糖，其中在葡萄糖和蔗糖中菌丝体产量最多，而碳源为玉米粉时菌丝体产量明显少于其他三种碳源，所以选择葡萄糖、蔗糖、麦芽糖为正交实验的碳源。
氮源：由图2可以看出羊肚菌菌丝体在几种氮源因素中都能很好的生长，菌丝体产量为硝酸钾>牛肉膏>蛋白胨>麦麸，胞外粗多糖含量为麦麸>蛋白胨>硝酸钾>牛肉膏，其中氮源为麦麸时尽管胞外粗多糖含量明显高于其他因素，但菌丝体产量明显少于其他三种氮源，所以选择硝酸钾、牛肉膏和蛋白胨为正交实验的氮源。
温度：由图3可以看出羊肚菌菌丝体在几种温度因素中都能很好的生长，菌丝体产量为28℃>23℃>18℃>33℃，胞外粗多糖含量为28℃>23℃>18℃>33℃，尽管18℃时菌丝体含量和胞外粗多糖含量都略高于33℃时，但是28℃时菌丝体含量达到最大，与23℃和33℃接近，于是所以选择23℃，28℃，33℃为正交实验的温度。
转速：由图4可以看出羊肚菌菌丝体在几种转速因素中都能很好的生长，菌丝体产量为210r/min>260r/min>160r/min>310r/min，胞外粗多糖含量为210r/min>160r/min>260r/min>310r/min，其中当转速为160r/min时菌丝体含量高于330r/min时菌丝体的含量，所以选择210r/min、260r/min、160r/min为正交实验的转速。
采用单因素正交实验对羊肚菌发酵培养条件进行优化，选取温度、转速和碳源、氮源四个因素，从中分别取三个水平，使用L9(34)进行四因素三水平实验设计。
表1正 交实验因素水平表
Figure BDA0003257359460000081
表2 正交实验分析表
Figure BDA0003257359460000082
Figure BDA0003257359460000091
从表2可以看出，以菌丝体干重为指标的最佳培养条件为A3B2C2D2；以胞外粗多糖为指标的最佳培养条件为A1B2C3D1；两者结合最佳培养的条件为A3B2C2D2，然而该方案不在正交表中，需要进行验证，即培养基为蔗糖2％，蛋白胨2％，培养条件为28℃，转速为210r/min，然而碳源为葡萄糖时更为经济实惠，且从表中可以得出此时菌丝体干重最大，培养条件为A3B2C2D2时最终得到菌丝体干重为5.247g/L，胞外粗多糖含量为0.587g/L。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.一种羊肚菌液体发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备母种：用接种针将羊肚菌接种到PDA斜面培养基上进行恒温培避光培养，斜面培养基中长满菌丝后备用；
(2)制备原种：用接种针取出斜面培养基上的菌丝放入原种平板培养基中进行恒温培避光培养，原种平板培养基中长满菌丝后备用；
(3)制备栽培种：取原种平板培养基上的菌丝体放入栽培种平板培养基中进行恒温培避光培养，栽培种平板培养基中长满菌丝后备用；
(4)液体发酵培养：取栽培种平板培养基上的菌丝体放入锥形瓶中，之后放入摇床培养箱中在23-33℃，160-260r/min培养1-5d；液体发酵培养基包括下列组分：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏5g/L、MgSO4 1g/L、KH2PO4 1g/L、VB1 1g/L，蒸馏水定容，pH自然。
2.根据权利要求1所述的一种羊肚菌液体发酵培养方法，其特征在于，所述PDA斜面培养基包括下列质量份配比的组分：去皮马铃薯200份，葡萄糖20份，琼脂18份，拌水量为上述组分总质量的_，pH自然。
3.根据权利要求1所述的一种羊肚菌液体发酵培养方法，其特征在于，所述原种平板培养基包括下列质量份配比的组分：去皮马铃薯200份，葡萄糖20份，蛋白胨3份，琼脂18份，拌水量为上述组分总质量的_，pH自然。
4.根据权利要求1所述的一种羊肚菌液体发酵培养方法，其特征在于，所述栽培种平板培养基包括下列组分：去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨3g/L，琼脂18g/L，MgSO41g/L、KH2PO4 1g/L，蒸馏水定容，pH自然。
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