CN103360359B

CN103360359B - 一种从落叶松中精制二氢槲皮素的方法

Info

Publication number: CN103360359B
Application number: CN201210134146.6A
Authority: CN
Inventors: 叶敏; 苗文娟; 刘春芳; 乔雪; 程晓伟
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2012-03-31
Filing date: 2012-05-02
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2032-05-02
Also published as: CN103360359A

Abstract

本发明公开了一种采用小孔树脂从落叶松中精制二氢槲皮素的方法。该方法包括下述步骤：1)将原料落叶松木材粉碎后，加入乙醇水溶液进行提取，收集提取液并浓缩，得到浸膏；2)将所述浸膏采用小孔树脂MCI进行液相吸附分离，以体积分数为0％-30％的乙醇水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集合并体积分数为20-25％的洗脱组分，浓缩、干燥得到二氢槲皮素粗品；3)对所述二氢槲皮素粗品进行重结晶，得到精制的二氢槲皮素。本发明采用水、乙醇等绿色溶剂，无污染，可回收利用；所采用的吸附剂小孔树脂引入杂质少，可多次循环使用；获得的产品纯度高于99％，无毒性成分残留，可直接得到药物级原料。该方法路线简单、经济、环保、产率高，适合于工业化生产。

Description

一种从落叶松中精制二氢槲皮素的方法

技术领域

本发明涉及一种从落叶松中精制二氢槲皮素的方法。

背景技术

二氢槲皮素(taxifolin，dihydroquercetin)，又名紫杉叶素，黄杉素，花旗松素，分子式C₁₅H₁₂O₇，分子量：304.25，结构式：见式I。它是一种二氢黄酮醇化合物，化学名为5，7，3’，4’-四羟基二氢黄酮醇。二氢槲皮素广泛存在于松科植物中，如海岸松、落叶松、花旗松，并且是落叶松中含量最大的黄酮类化合物，含量约为0.3-5.7％。

(式I)

二氢槲皮素具有很强的抗氧化能力，能从人体内有效地消除过量的自由基，促进毛细血管的渗透性。其抗氧化特性优于许多现有的抗氧化剂，且未见毒性报道，因此作为抗氧添加剂广泛用于植物油、动物油、奶粉及含脂糕点等食品。此外，二氢槲皮素在美国和俄罗斯药典都有收载，它因具有保护心血管、抗癌、保肝、抗菌、抗病毒、促进胶原纤维形成等一系列药理活性而备受关注。

自天然产物获取二氢槲皮素的方法主要分为两类：以黄杞叶等为原料，首先提取二氢槲皮素的糖苷类衍生物，再通过酸水解得到二氢槲皮素苷元；或以松科植物的树皮或木材为原料，直接提取二氢槲皮素单体。

首先提取糖苷的方法由于增加了水解步骤，工艺复杂。公开号为CN101054369的专利介绍了一种从黄杞叶中提取分离二氢槲皮素的方法，通过提取、浓缩、柱层析、结晶、水解，自黄杞叶中得到针状结晶的二氢槲皮素。此法延长了生产周期，且所得产物纯度较低。

直接提取二氢槲皮素单体的工艺主要以落叶松木粉或木屑为原料，提取溶剂多为水或极性较大的醇，此后通过低极性溶剂萃取、热水重结晶等操作得到粗品。这种方法有如下缺陷：溶剂消耗量大，需引入醚、酮等有毒溶剂；粗品纯度低，常需进一步脱色或增加结晶次数，降低产率。公开号CA532804A，US2744919A，CN101333203A，CN101333204A，CN 101157733A的专利均属于此类。

公开号为CN101863869A的中国专利介绍了一种从落叶松木片中提取二氢槲皮素的方法，用乙醇回流提取落叶松木片，向所得提取液中加入酸和含氯溶液，使二氢槲皮素糖苷转化为苷元，并随含氯溶剂萃取提出，继而经大孔吸附树脂纯化。该工艺引入强酸与含氯溶剂完成酸水解，毒性大，费用高，所得产物纯度不理想。公开号为CN101851221A的中国专利根据类似原理，使用强酸性离子交换树脂进行酸水解步骤，同样引入了大量含氯溶剂，不利于大规模生产。公开号为CN101830881A的中国专利采用酶水解来破坏细胞壁，使活性成分易溶出。该方法得率不高，且纯度低。

公开号为CN101993429A的中国专利介绍了一种从落叶松木屑中提取二氢槲皮素的方法，采用水提取，经乙醇沉淀除去阿拉伯半聚乳糖，再经大孔树脂进行液相吸附分离，使用50％，70％和95％的乙醇梯度洗脱，自洗脱流分中检识并纯化二氢槲皮素。此法有机溶剂消耗量大，同时高比例的乙醇易从吸附剂大孔树脂中洗脱交联剂及其他杂质，将其引入二氢槲皮素产物中。

公开号为CN1844095A和CN1858046A的中国专利介绍了从落叶松中提取二氢槲皮素的方法，该方法以水为提取剂，后以甲基叔丁基醚为萃取剂进行液液萃取，采用活性炭或活性白土对甲基叔丁基醚萃取液进行吸附脱色。其中专利CN1858046A在脱色后进一步使用聚酰胺粉末吸附法进行富集。此二种工艺使用甲基叔丁基醚，价格昂贵且毒性较大，而活性碳或活性白土的脱色过程为非封闭式操作过程，不便于连续性生产。公开号为CN1858046A的专利经两次吸附操作，生产周期长，成本增加。

综上所述，现有方法多数在提取及重结晶操作的基础上，引入萃取或吸附方法制备二氢槲皮素。其中萃取操作多引入醚、酮或含氯的溶剂，毒性大，成本高；部分吸附方法采用的吸附剂不便于连续性生产，或容易向终产物引入吸附剂自身的杂质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种精制二氢槲皮素的方法。

本发明所提供的精制二氢槲皮素的方法，包括下述步骤：

1)将原料落叶松木材粉碎后，加入乙醇水溶液进行提取，收集提取液并浓缩，得到浸膏；

2)将所述浸膏采用小孔树脂MCI进行液相吸附分离，以体积分数为0％-30％的乙醇水溶液为洗脱剂进行梯度洗脱，收集合并体积分数为20-25％的洗脱组分，浓缩、干燥得到二氢槲皮素粗品；

3)对所述二氢槲皮素粗品进行重结晶，得到精制的二氢槲皮素。

其中，步骤1)中所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数可为50％-95％。

所述提取为回流提取，所述提取至少进行2次。

每次回流提取时，所述落叶松木材与所述乙醇水溶液的料液比为1kg∶5-20L，每次提取的温度为75-90℃，提取的时间为1-2小时。

步骤1)中在进行提取前还需对粉碎后的落叶松木材浸泡。具体方法如下：将落叶松木材粉碎后加入体积分数为50％-95％的乙醇溶液浸泡2-8小时；所述落叶松木材与体积分数为50％-95％的乙醇溶液的的配比为1kg∶5-20L。

步骤1)中对提取液进行浓缩可在35-50℃减压条件下进行，浓缩至无醇味。

上述步骤2)中所采用的小孔树脂MCI(聚苯乙烯型反相微孔树脂填料)可以是F型，也可以是R型，优选F型。具体可为：1)SBC MCI GEL，75-150μM，F型，或2)SBC MCI GEL，50-70μM，F型。

步骤2)中所述梯度洗脱的具体方法如下：依次用体积分数为10％、20％、25％的乙醇水溶液进行洗脱，每个梯度洗脱3-5个柱体积。

上述步骤3)中所述重结晶中使用的溶剂为体积分数30％-100％的乙醇水溶液；所述重结晶中二氢槲皮素粗品与溶剂的配比为1kg∶20-40L。所述重结晶可在4℃冰箱内进行，也可在较低室温(2-15℃)进行。

本发明方法的优点在于：

1.精制方法路线简单，所使用材料经济环保，生产规模可扩大，适合工业化生产。

2.吸附剂小孔树脂可多次循环使用，大大简化生产步骤；吸附剂自身残留低，引入杂质少，所用解吸附溶剂安全无毒，并可回收利用。

3.所有精制工艺仅使用水和乙醇为溶剂，无任何毒性溶剂的引入，无需脱色处理，可直接制备得到药物级原料。

4.精制工艺在较低温度下完成，所得到的二氢槲皮素具有天然的结构。所得产品纯度高，产率高，重结晶精制品纯度可达99％，产率大于1.1％。

附图说明

图1为本发明精制二氢槲皮素的工艺流程图。

图2为本发明二氢槲皮素精制品的HPLC纯度检测图。

图3为本发明二氢槲皮素精制品的¹H-NMR图谱。

图4为本发明二氢槲皮素精制品的¹³C-NMR图谱。

图5为本发明二氢槲皮素精制品的ESI-MS图谱。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：精制二氢槲皮素

(1)提取：落叶松木材粉末100g，加入1.5L体积分数为95％的乙醇水溶液，浸泡4h，加热回流2h(80℃)，提取液过滤；再加入1.0L体积分数为95％的乙醇水溶液，加热回流2h(80℃)，提取液过滤后与前次合并，在50℃条件下减压浓缩至无醇味，得到10g浸膏。

(2)纯化：将步骤(1)获得的浸膏用小孔树脂MCI(SBC MCI GEL，75-150μM，F型)进行液相吸附分离。依次用体积分数为10％、20％、25％、30％的乙醇水溶液洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，将流出液分段收集浓缩，经TLC检测，将含有二氢槲皮素较高的部分(20-25％洗脱组分)合并，得二氢槲皮素粗品1.57g。经HPLC检测纯度为90.7％。HPLC色谱条件如下：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C₁₈色谱柱(250mm×9.4mm，5μm)及Agilent ZORBAX SB-C₁₈保护柱(12.5mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(A)-0.1％甲酸溶液(B)，梯度洗脱：0-5min：20-25％A；5-15min：25-40％A；15-30min：40-90％A；30-35min：90％A；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；检测波长：290nm；进样体积：10μL。

(3)重结晶：将步骤(2)所得的二氢槲皮素1.57g，加入20倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液溶解，置于4℃冰箱内重结晶，过滤干燥得到纯度为98.5％的二氢槲皮素；再向纯度为98.5％的二氢槲皮素中加入20倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液，同法重结晶，得纯度为99.5％的二氢槲皮素精制品1.12g。

所得白色粉末经HPLC纯度检测(图2所示)纯度为99.5％，经¹H-NMR(图3所示)、¹³C-NMR(图4所示)及质谱(图5所示)测试，所得结果与二氢槲皮素数据相符。以原落叶松粉末折算，得率为1.12％。

实施例2：精制二氢槲皮素

(1)提取：落叶松木材粉末1000g，加入5L体积分数为95％的乙醇水溶液，浸泡4h，加热回流2h(80℃)，提取液过滤；再加入5L体积分数为95％的乙醇水溶液，加热回流2h(80℃)，提取液过滤后与前次合并，在35℃条件下减压浓缩至无醇味，得到100g浸膏。

(2)纯化：将步骤(1)获得的浸膏用小孔树脂MCI(SBC MCI GEL，75-150μM，F型)进行液相吸附分离。依次用体积分数为10％、20％、25％、30％的乙醇水溶液洗脱，每个梯度洗脱5个柱体积，将流出液分段收集浓缩，经TLC检测，将含有二氢槲皮素较高的部分(20-25％洗脱组分)合并，得二氢槲皮素粗品15.6g。经HPLC检测纯度为91.8％。

(3)重结晶：将步骤(2)所得的二氢槲皮素15.6g粗品加入30倍量、体积分数为50％的乙醇水溶液溶解，置于4℃冰箱内重结晶，过滤干燥得到纯度为98.6％的二氢槲皮素；再向纯度为98.6％的二氢槲皮素中加入40倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液，同法重结晶，得纯度为99.6％的二氢槲皮素精制品11g。

所得白色粉末经HPLC纯度检测纯度为99.6％，经¹H-NMR、¹³C-NMR及质谱测试，所得结果与二氢槲皮素数据相符。以原落叶松粉末折算，得率为1.1％。

实施例3：精制二氢槲皮素

(1)提取：落叶松木材粉末10000g，加入80L体积分数为95％的乙醇水溶液，浸泡4h，加热回流2h(90℃)，提取液过滤；再加入60L体积分数为95％的乙醇水溶液，加热回流2h(90℃)，提取液过滤后与前次合并，在40℃条件下减压浓缩至无醇味，得到1000g浸膏。

(2)纯化：将步骤(1)获得的浸膏用小孔树脂MCI(SBC MCI GEL，75-150μM，F型)进行液相吸附分离。依次用体积分数为10％、20％、25％、30％的乙醇水溶液洗脱，每个梯度洗脱5个柱体积，将流出液分段收集浓缩，经TLC检测，将含有二氢槲皮素较高的部分(20-25％洗脱组分)合并，得二氢槲皮素粗品160g。经HPLC检测纯度为91.8％。

(3)重结晶：将步骤(2)所得的二氢槲皮素160g粗品中加入30倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液溶解，置于4℃冰箱内重结晶，过滤干燥得到纯度为98.8％的二氢槲皮素；再向纯度为98.8％的二氢槲皮素中加入40倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液，同法重结晶，得纯度为99.7％的二氢槲皮素精制品113g。

所得白色粉末经HPLC纯度检测纯度为99.7％，经¹H-NMR、¹³C-NMR及质谱测试，所得结果与二氢槲皮素数据相符。以原落叶松粉末折算，得率为1.13％。

实施例4：精制二氢槲皮素

(1)提取：落叶松木材粉末100000g，加入1000L体积分数为95％的乙醇水溶液，浸泡4h，加热回流2h(90℃)，提取液过滤。再加入800L体积分数为95％的乙醇水溶液，加热回流2h(90℃)，提取液过滤后与前次合并，在45℃条件下减压浓缩至无醇味，得到10000g浸膏。

(2)纯化：将步骤(1)获得的浸膏用小孔树脂MCI(SBC MCI GEL，75-150μM，F型)进行液相吸附分离。依次用体积分数为10％、20％、25％、30％的乙醇水溶液洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，将流出液分段收集浓缩，经TLC检测，将含有二氢槲皮素较高的部分(20-25％洗脱组分)合并，得二氢槲皮素粗品1580g。经HPLC检测纯度为91.8％。

(3)重结晶：将步骤(2)所得的二氢槲皮素1580g，加入30倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液溶解，置于4℃冰箱内重结晶，过滤干燥得到纯度为98.5％的二氢槲皮素；再向纯度为98.5％的二氢槲皮素中加入40倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液，同法重结晶，得纯度为99.5％的二氢槲皮素精制品1140g。

所得白色粉末经HPLC纯度检测纯度为99.5％，经¹H-NMR、¹³C-NMR及质谱测试，所得结果与二氢槲皮素数据相符。以原落叶松粉末折算，得率为1.14％。

实施例5：精制二氢槲皮素

(1)提取：落叶松木材粉末500g，加入7.5L体积分数为95％的乙醇水溶液，浸泡4h，加热回流2h(85℃)，提取液过滤；再加入5L体积分数为95％的乙醇水溶液，加热回流2h(85℃)，提取液过滤后与前次合并，在45C条件下减压浓缩至无醇味，得到45g浸膏。

(2)纯化：将步骤(1)获得的浸膏用小孔树脂MCI(SBC MCI GEL，50-70μM，F型)进行液相吸附分离。依次用体积分数为10％、20％、25％、30％的乙醇水溶液洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，将流出液分段收集浓缩，经TLC检测，将含有二氢槲皮素较高的部分(20-25％洗脱组分)合并，得二氢槲皮素粗品7.8g。经HPLC检测纯度为92％。

(3)重结晶：将步骤(2)所得的二氢槲皮素7.8g，加入30倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液溶解，置于4℃冰箱内重结晶，过滤干燥得到纯度为98％的二氢槲皮素。再向纯度为98％的二氢槲皮素中加入40倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液，同法重结晶，得纯度为99.1％的二氢槲皮素精制品5.6g。

所得白色粉末经HPLC纯度检测纯度为99.1％，经¹H-NMR、¹³C-NMR及质谱测试，所得结果与二氢槲皮素数据相符。以原落叶松粉末折算，得率为1.13％。

实施例6：精制二氢槲皮素

(1)提取：落叶松木材粉末1500g，加入22.5L体积分数为95％的乙醇水溶液，浸泡4h，加热回流2h(85℃)，提取液过滤；再加入15L体积分数为95％的乙醇水溶液，加热回流2h(85℃)，提取液过滤后与前次合并，在45℃条件下减压浓缩至无醇味，得到150g浸膏。

(2)纯化：将步骤(1)获得的浸膏用小孔树脂MCI(SBC MCI GEL，75-150μM，R型)进行液相吸附分离。依次用体积分数为10％、20％、25％、30％的乙醇水溶液洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，将流出液分段收集浓缩，经TLC检测，将含有二氢槲皮素较高的部分(20-25％洗脱组分)合并，得二氢槲皮素粗品23.5g。经HPLC检测纯度为94％。

(3)重结晶：将步骤(2)所得的二氢槲皮素23.5g，加入30倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液溶解，置于4℃冰箱内重结晶，过滤干燥得到纯度为98％的二氢槲皮素；再向纯度为98％的二氢槲皮素中加入40倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液，同法重结晶，得纯度为99.3％的二氢槲皮素精制品16.8g。

所得白色粉末经HPLC纯度检测纯度为99.3％，经¹H-NMR、¹³C-NMR及质谱测试，所得结果与二氢槲皮素数据相符。以原落叶松粉末折算，得率为1.13％。

实施例7：精制二氢槲皮素

(1)提取：落叶松木材粉末5000g，加入75L积分数为95％的乙醇水溶液，浸泡4h，加热回流2h(85℃)，提取液过滤；再加入50L体积分数为95％的乙醇水溶液，加热回流2h(85℃)，提取液过滤后与前次合并，在45℃条件下减压浓缩至无醇味，得到500g浸膏。

(2)纯化：将步骤(1)获得的浸膏用小孔树脂MCI(SBC MCI GEL，75-150μM，F型)进行液相吸附分离。依次用体积分数为10％、20％、25％、30％的乙醇水溶液洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，将流出液分段收集浓缩，经TLC检测，将含有二氢槲皮素较高的部分(20-25％洗脱组分)合并，得二氢槲皮素粗品78.5g。经HPLC检测纯度为92％。

(3)重结晶：将步骤(2)所得的二氢槲皮素78.5g，加入30倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液溶解，置于4℃冰箱内重结晶，过滤干燥得到纯度为98％的二氢槲皮素；再向纯度为98％的二氢槲皮素中加入40倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液，同法重结晶，得纯度为99.1％的二氢槲皮素精制品56g。

所得白色粉末经HPLC纯度检测纯度为99.1％，经¹H-NMR、¹³C-NMR及质谱测试，所得结果与二氢槲皮素数据相符。以原落叶松粉末折算，得率为1.12％。

实施例8：精制二氢槲皮素

(1)提取：落叶松木材粉末8000g，加入120L体积分数为95％的乙醇水溶液，浸泡4h，加热回流2h(80℃)，提取液过滤。再加入80L体积分数为95％的乙醇水溶液，加热回流2h(80℃)，提取液过滤后与前次合并，在45℃条件下减压浓缩至无醇味，得到700g浸膏。

(2)纯化：将步骤(1)获得的浸膏用小孔树脂MCI(SBC MCI GEL，75-150μM，F型)进行液相吸附分离。依次用体积分数为10％、20％、25％、30％的乙醇水溶液洗脱，每个梯度洗脱4个柱体积，将流出液分段收集浓缩，经TLC检测，将含有二氢槲皮素较高的部分(20-25％洗脱组分)合并，得二氢槲皮素粗品126g。经HPLC检测纯度为94％。

(3)重结晶：将步骤(2)所得的二氢槲皮素126g，加入30倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液溶解，置于4℃冰箱内重结晶，过滤干燥得到纯度为94％的二氢槲皮素；再向纯度为94％的二氢槲皮素中加入40倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液，同法重结晶，得纯度为99％的二氢槲皮素精制品90g。

所得白色粉末经HPLC纯度检测纯度为99％，经¹H-NMR、¹³C-NMR及质谱测试，所得结果与二氢槲皮素数据相符。以原落叶松粉末折算，得率为1.13％。

实施例9：精制二氢槲皮素

(1)提取：落叶松木材粉末30000g，加入450L体积分数为95％的乙醇水溶液，浸泡4h，加热回流2h(80℃)，提取液过滤；再加入300L体积分数为95％的乙醇水溶液，加热回流2h(80℃)，提取液过滤后与前次合并，在45℃条件下减压浓缩至无醇味，得到3000g浸膏。

(2)纯化：将步骤(1)获得的浸膏用小孔树脂MCI(SBC MCI GEL，75-150μM，F型)进行液相吸附分离。依次用体积分数为10％、20％、25％、30％的乙醇水溶液洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，将流出液分段收集浓缩，经TLC检测，将含有二氢槲皮素较高的部分合并，得二氢槲皮素粗品570g。经HPLC检测纯度为92％。

(3)重结晶：将步骤(2)所得的二氢槲皮素570g，加入30倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液溶解，置于4℃冰箱内重结晶，过滤干燥得到纯度为98％的二氢槲皮素；再向纯度为98％的二氢槲皮素中加入40倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液，同法重结晶，得纯度为99％的二氢槲皮素精制品336g。

实施例10：精制二氢槲皮素

(1)提取：落叶松木材粉末60000g，加入900L体积分数为95％的乙醇水溶液，浸泡4h，加热回流2h(90℃)，提取液过滤。再加入600L体积分数为95％的乙醇水溶液，加热回流2h(90℃)，提取液过滤后与前次合并，在45℃条件下减压浓缩至无醇味，得到6000g浸膏。

(2)纯化：将步骤(1)获得的浸膏用小孔树脂MCI(SBC MCI GEL，75-150μM，F型)进行液相吸附分离。依次用体积分数为10％、20％、25％、30％的乙醇水溶液洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，将流出液分段收集浓缩，经TLC检测，将含有二氢槲皮素较高的部分合并，得二氢槲皮素粗品942g。经HPLC检测纯度为92％。

(3)重结晶：将步骤(2)所得的二氢槲皮素942g，加入30倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液溶解，置于4℃冰箱内重结晶，过滤干燥得到纯度为98％的二氢槲皮素。再向纯度为98％的二氢槲皮素中加入40倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液，同法重结晶，得纯度为99％的二氢槲皮素精制品672g。

所得白色粉末经HPLC纯度检测纯度为99％，经¹H-NMR、¹³C-NMR及质谱测试，所得结果与二氢槲皮素数据相符。以原落叶松粉末折算，得率为1.12％。

实施例11：精制二氢槲皮素

(1)提取：落叶松木材粉末200g，加入3.0L体积分数为50％的乙醇水溶液，浸泡4h，加热回流2h(90℃)，提取液过滤；再加入2.0L体积分数为50％的乙醇水溶液，加热回流2h(90℃)，提取液过滤后与前次合并，在50℃条件下减压浓缩至无醇味，得到18g浸膏。

(2)纯化：将步骤(1)获得的浸膏用小孔树脂MCI(SBC MCI GEL，75-150μM，F型)进行液相吸附分离。依次用体积分数为10％、20％、25％、30％的乙醇水溶液洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，将流出液分段收集浓缩，经TLC检测，将含有二氢槲皮素较高的部分合并，得二氢槲皮素粗品2.99g。经HPLC检测纯度为90％。

(3)重结晶：将步骤(2)所得的二氢槲皮素2.99g，加入20倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液溶解，置于4℃冰箱内重结晶，过滤干燥得到纯度为98％的二氢槲皮素；再向纯度为98％的二氢槲皮素中加入20倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液，同法重结晶，得纯度为99.5％的二氢槲皮素精制品2.20g。

所得白色粉末经HPLC纯度检测纯度为99.5％，经¹H-NMR、¹³C-NMR及质谱测试，所得结果与二氢槲皮素数据相符。以原落叶松粉末折算，得率为1.10％。

实施例12：精制二氢槲皮素

(1)提取：落叶松木材粉末800g，加入12L体积分数为85％的乙醇水溶液，浸泡4h，加热回流2h(90℃)，提取液过滤；再加入8L体积分数为85％的乙醇水溶液，加热回流2h(90℃)，提取液过滤后与前次合并，在50℃条件下减压浓缩至无醇味，得到80g浸膏。

(2)纯化：将步骤(1)获得的浸膏用小孔树脂MCI(SBC MCI GEL，75-150μM，F型)进行液相吸附分离。依次用体积分数为10％、20％、25％、30％的乙醇水溶液洗脱，每个梯度洗脱3个柱体积，将流出液分段收集浓缩，经TLC检测，将含有二氢槲皮素较高的部分合并，得二氢槲皮素粗品12.5g。经HPLC检测纯度为91％。

(3)重结晶：将步骤(2)所得的二氢槲皮素12.5g，加入20倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液溶解，置于4℃冰箱内重结晶，过滤干燥得到纯度为96％的二氢槲皮素；再向纯度为96％的二氢槲皮素中加入20倍量、体积分数为30％的乙醇水溶液，同法重结晶，得纯度为99.1％的二氢槲皮素精制品8.9g。

所得白色粉末经HPLC纯度检测纯度为99.1％，经¹H-NMR、¹³C-NMR及质谱测试，所得结果与二氢槲皮素数据相符。以原落叶松粉末折算，得率为1.11％。

Claims

1.一种精制二氢槲皮素的方法，包括下述步骤：

3)对所述二氢槲皮素粗品进行重结晶，得到精制的二氢槲皮素；

步骤1)中所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为50％-95％；

步骤2)中所述小孔树脂MCI为F型或R型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中所述梯度洗脱的具体方法如下：依次用体积分数为10％、20％、25％、30％的乙醇水溶液进行洗脱，每个梯度洗脱3-5个柱体积。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述提取为回流提取，所述提取至少进行2次；

每次提取时，所述落叶松木材与所述乙醇水溶液的配比为1kg:5-20L，每次提取的温度为75-90℃，提取的时间为1-2小时。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤1)中在进行提取前还包括对粉碎后的落叶松木材浸泡的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述浸泡的方法如下：将落叶松木材粉碎后加入体积分数为50％-95％的乙醇溶液浸泡2-8小时；所述落叶松木材与体积分数为50％-95％的乙醇溶液的的配比为1kg:5-20L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述浓缩的条件为：35-50℃减压浓缩至无醇味。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述重结晶中使用的溶剂为体积分数30％-100％的乙醇水溶液；所述重结晶中二氢槲皮素粗品与溶剂的配比为1kg:20-40L；所述重结晶的温度为2-15℃。