KR20070119641A - 생체 물질로부터 갈란타민을 단리하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 주제는 다수의 식물에 의해 생산되는 갈란타민 및 그 유도체의 단리 및 정제 방법에 관한 것이다.

Description

생체 물질로부터 갈란타민을 단리하는 방법{ISOLATION OF GALANTHAMINE FROM BIOLOGICAL MATERIAL}

본 발명은 공지된 방법의 단점을 해소하는, 갈란타민 및 그 유도체를 실질적으로 순수한 형태로 단리하는 방법에 관한 것이다.

갈란타민, 즉, 4a,5,9,10,11,12-헥사히드로-3-메톡시-11-메틸-6H-벤조푸로[3a,3,2-ef]-(2)-벤자제핀-6-올은 아마릴리다세아(Amaryllidacea)과, 예를 들면, 갈란투스(Galanthus)속, 나르시수스(Narcissus)속, 류코줌(Leucojum)속 및 리코리스(Lycoris)속의 식물에 의해 생산되는 천연 알칼로이드이다. 그 구조는 도 1에 도시되어 있다. 이것은 제일 먼저 Proskurnina와 Jakovleva에 의해 스노우드랍(Galanthus woronowi)으로부터 단리되었다(문헌 [J. Gen. Chem. USSR, 1952, 22, 1899 - 1902] 참조).

약리학적으로, 갈란타민은 피조스티그민과 같은 가역적인 콜린에스테라제 억제제이나, 실질적으로 독성이 없다. 또한 이것은 진통제 및 항산화제 특성을 가진다. 이러한 특성들의 특유의 조합은 알츠하이머병(예를 들면, 문헌 [L. J. Scott 및 K. L. Goa, Drugs 2000, 60, 1095 - 1122] 참조) 및 또한 알코올, 약물 및 니코틴 중독 및 몇몇 다른 질병(미국 특허 제5,643,905호)을 치료하는 데 사용할 수 있 게 한다.

다수의 갈란타민 합성 방법이 기술되어 있지만(예를 들면, Kametani et al., J. Chem. Soc. C, 1971, 6, 1043 - 1047, 또는 Shimizu et al., Heterocycles, 1977, 8, 277 - 282, 및 다수 특허), 식물 물질로부터 갈란타민 단리는 여전히 대규모 제조의 유용한 대안이다. 식물 물질로부터 갈란타민을 단리하는 공지된 방법의 일반적인 단점은 대규모로 단리하는 경우 유효성 및 확장성(scalability)이 결핍된다는 점이다. 이들 방법은 대체로 1종의 한정된 식물 물질 공급원을 가공하기 위한 맞춤형 공정이었다. 또 다른 식물 물질을 가공하는 데 사용되는 경우, 이들 방법은 실질적으로 순수한 갈란타민을 충분히 생산할 수 없다. 디클로로에탄 및 다른 염소화 탄화수소 및 디에틸 에테르와 같은 독성이 있고 및/또는 환경적으로 유해한 용매의 사용은 또한 대규모 생산시 이들 방법을 저지한다. 또한, 이들 공지된 방법에 사용되는 몇몇 작업, 예를 들면, 1차 추출물의 농축 건조 및 잔류물을 다른 용매에 용해시키는 작업의 규모를 확대시키는 것이 어렵다.

독일 특허 제1,193,061호는 암모니아 수용액으로 알칼리화된 식물 물질을 디클로로에탄 또는 다른 염소화 탄화수소(디클로로메탄, 클로로포름)로 추출하여 아마릴리다세아 식물로부터 갈란타민을 단리하는 방법에 대해 기술하고 있다. 얻어진 1차 추출물은 묽은 황산으로 추가 처리되며, 수반되는 알칼로이드는 암모니아 수용액으로 침전된다. 상기 용액에 잔류하는 갈란타민은 디에틸에테르 또는 디클로로메탄으로 추출되고 추가 정제된다. 이러한 방법의 실질적인 개선은 미국 특허 제5,877,172호에서 제시하고 있다. 분쇄된 식물 물질(나르시수스 슈도나르시수 스(Narcissus pseudonarcissus) "칼턴(Carlton)")은 추출에 앞서 분말 탄산나트륨으로 혼합된 후 디클로로에탄으로 추출된다. 1차 추출물의 추가 가공은 전술한 바와 유사하나 에멀션의 형성은 최소화된다. 그럼에도 불구하고, 사용된 용매, 디클로로에탄 및 디에틸 에테르는 산업적 규모로 단리하는 데에는 적절하지 않다.

또한 미국 특허 제5,877,172호는 추출에 앞서 1차 추출물을 얻기 위해 분말 탄산나트륨을 가솔린과 함께 첨가하여 알칼리화된 식물 물질을 추출하는 방법에 대해 기술하고 있다. 1차 추출물은 증발 건조시키고, 건조 잔류물은 pH가 약 4로 조정된 묽은 황산 용액에 용해시키며, 비알칼로이드성의 동반 성분들은 디에틸 에테르로 추출한다. 얻어진 정제 수용액은 pH 9로 알칼리화하고 알칼로이드는 디에틸 에테르로 추출한다. 디에틸 에테르 추출물은 농축 건조된 후 2-프로판올로부터 결정화하여 갈란타민을 수득한다. 독성 디클로로에탄의 사용의 사용이 제거되었지만, 상기 방법은 여전히 디에틸 에테르를 사용한다. 또한 가솔린으로의 추출은 비효율적이며 고부피의 용매를 필요로 한다. 또한, 1차 추출물을 증발시켜 건조 잔류물을 얻는 것은 용이하지 않다. 상기 방법은 비알칼로이드 성분인 밸러스트(ballast)로부터 알칼로이드를 분리하기 위한 몇몇 작업을 포함하나, 다른 알칼로이드로부터 갈란타민의 분리를 확보하는 유일한 작업은 2-프로판올로부터 알칼로이드 농축물을 결정화하는 것이다. 이러한 사실은 상기 방법이 후술하는 바와 같은 복합 물질로부터 순수한 갈란타민의 단리를 확보하기에 충분히 효율적이지 않음을 의미한다.

식물 물질로부터의 갈란타민 추출에 대한 선행 기술의 개요는 다른 식물 물질로부터 고순도의 생성물을 산출하는, 갈란타민의 효율적인 대규모 추출 및 정제 방법이 여전히 요구된다는 증거를 제시한다.

도 1. 갈란타민의 구조식

도 2. 실시예 1에서 얻은 1차 추출물의 HPLC 분석

도 3. 실시예 1에서 얻은 미정제 알칼로이드 농축물의 HPLC 분석

도 4. 실시예 1에서 얻은 정제 갈란타민의 HPLC 분석

도 5. 실시예 1에서 얻은 갈란타민 염산염의 HPLC 분석

도 6. 실시예 1에서 얻은 갈란타민 염기의 HPLC 분석

도 7. 실시예 2에서 얻은 갈란타민 염기의 HPLC 분석

도 8. 실시예 3에서 얻은 1차 추출물의 HPLC 분석

도 9. 실시예 3에서 얻은 갈란타민 염기의 HPLC 분석

발명의 요약

일 양상에서, 본 발명은 갈란타민을 생산하는 공지된 모든 식물, 즉, 아마릴리다세아과, 예를 들면, 갈란투스속, 나르시수스속, 류코줌속 및 리코리스속의 식물로부터 견고하고 효율적인 갈란타민을 대규모로 단리하는 방법을 제공한다. 사용되는 식물 물질은 건조된 것, 예를 들면, 식물의 건조된 잎 또는 전기생 부분, 또는 신선한 그대로의 것, 예를 들면, 분쇄된 구근 및/또는 기생 부분일 수 있다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 식물 물질을 무기산 또는 유기산 수용액으로 추출하여, 1차 추출물을 얻는 단계 및 흡착제 상에 1차 추출물로부터 유기 화합물을 흡착시키고, 물로 흡착제를 세척하며 흡착제로부터 유기 화합물을 수혼화성 유 기 용매로 용리하여, 알칼로이드 농축물을 얻는 단계를 포함하는 갈란타민을 단리하는 방법을 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 양이온 교환 중합체 수지 상에 알칼로이드 농축물로부터 알칼로이드를 흡착시키는 단계 및 수지로부터의 알칼로이드를 무기 염기 수용액으로 용리하여, 수성 알칼로이드 농축물을 얻는 단계를 포함하는 알칼로이드 농축물을 추가 정제하는 방법을 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 수성 알칼로이드 농축물로부터 알칼로이드를 수불혼화성 유기 용매 내로 추출하는 단계 및 추출물을 농축시켜 미정제 알칼로이드 농축물을 얻는 단계를 포함하는 수성 알칼로이드 농축물을 추가 정제하는 방법을 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 알루미나 상에 미정제 알칼로이드 농축물을 크로마토그래피로 정제하여 이동상으로서 수불혼화성 유기 용매를 사용하여 갈란타민 분획을 얻고, 정제된 갈란타민을 얻는 단계를 포함하는 미정제 알칼로이드 농축물을 추가 정제하는 방법을 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 적절한 용매로부터 정제된 갈란타민을 결정화하여, 정제된 결정질 갈란타민을 얻는 단계를 포함하는 갈란타민을 추가 정제하는 방법을 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 메틸 이소부틸 케톤 또는 tert-부틸 메틸 에테르로부터 결정질 갈란타민을 재결정화하는 단계를 포함하는 갈란타민을 추가 정제하는 방법을 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 갈란타민 염산염으로부터 갈란타민 염기를 유리하는 단계 및 메틸 이소부틸 케톤 또는 tert-부틸 메틸 에테르로부터 갈란타민을 결정화하는 단계를 포함하는 갈란타민을 추가 정제하는 방법을 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 나르웨딘의 카르보닐기를 2차 알코올기로 환원시킬 수 있는 적절한 환원제로 나르웨딘의 카르보닐기를 환원시켜 나르웨딘을 제거하는 수단을 제공한다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 전술한 유형의 모든 식물 물질로부터 고순도의 갈란타민을 단리하는 방법을 제공한다. 단리된 갈란타민의 순도는 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과 및 더욱 더 바람직하게는 99% 초과이다.

또 다른 양상에서, 본 발명은 매우 독성이 높은 용매 또는 환경에 유해한 용매, 예를 들면, 염소화 탄화수소를 사용하지 않고 실질적으로 순수한 갈란타민을 단리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 생체 물질로부터 고순도의 갈란타민을 단리하는 방법을 제공한다. 용어 생체 물질은 갈란타민을 생산하는 식물, 즉, 아마릴리다세아과, 예를 들면, 갈란투스속, 나르시수스속, 류코줌속 및 리코리스속 식물의 건조된 부분 또는 신선한 그대로의 부분을 의미한다. 본 방법은 단리 방법의 효율성 및 식물 물질에 존재하고 갈란타민의 유력한 불순물로 여겨짐이 틀림없는 원치 않는 알칼로이드를 제거하는 능력을 최적화하도록 설계된 다수의 연속 단계로 구성된다. 개별 단계는 독성이 있는 용매 또는 염소화 탄화수소와 같은 환경에 유해한 용매 및 디에틸 에테르, 아세톤 및 석유 에테르와 같은 저비등 용매의 사용을 피하기 위해 설계되었다. 개별 단계의 순서는 전체 공정이 효율적으로 되도록 설계되었다.

단리 방법의 제1 단계는 생체 물질의 추출이다. 무기산 또는 유기산의 묽은 수용액은 식물 물질의 추출에 있어 우수한 수단임은 실험에 의해 확인되었다. 유기 용매를 사용하는 공지된 절차와는 대조적으로, 수성 추출은 다수의 이점이 있다: 1) 추출에 앞서 식물 물질을 알칼리화하는 것이 필요하지 않으므로 본 방법으로부터 하나의 기계적 작업이 생략된다(미국 특허 제5,877,172호에 기재된 바와 같이 식물 물질을 분말 탄산나트륨과 혼합하는 작업); 2) 추출 용매가 물인 경우 환경에 대한 영향이 최소화된다; 3) 추출 물질로부터 용매를 제거하는 것이 필요하지 않으므로 본 방법으로부터 또 다른 작업이 생략된다(소모된 생체 물질을 건조하는 작업); 4) 또한 사용된 용매의 회수 공정이 생략된다. 사용된 산의 선택은 추출 효율성 및 선택성 측면에 있어서는 중요하지 않다. 산의 선택은 그 비용, 취급성 및 필요한 경우 사용된 장치의 부식에 대한 영향에 의해 결정된다. 농도가 약 0.1%(w/w)인 인산의 사용은 유익하다. 생체 물질의 수성 추출을 이용하는 또 다른 이점은 신선한 그대로의 식물 물질, 예를 들면, 구근이 추출되는 경우에 명백하다. 이러한 물질은 다량의 수분을 함유하기 때문에, 더욱이 수불혼화성인 유기 용매로 그것을 추출하는 것은 비생산적일 것이다.

생체 물질의 추출은 다양한 방법에 의해 이루어질 수 있으나, 역시, 배터리식 퍼콜레이터(a battery of percolators)의 사용이 매우 편리하다. 배터리식 퍼콜레이터의 사용은 1차 추출물의 부피를 최소화할 수 있다. 실시예 1은 구근 1 kg으로부터 1차 추출물의 약 1.5 ℓ만이 얻어졌음을 기재하고 있다. 그럼에도 불구하고, 건조된 생체 물질이 배터리식 퍼콜레이터에서 추출되는 경우, 1차 추출물의 부피는 퍼콜레이터에서의 큰 사장 부피와 추출된 물질의 낮은 가밀도로 인하여 실질적으로 더 크다. 반면, 건조된 물질을 실시예 3에서 기재되어 있는 바와 같이 배터리식 퍼콜레이터로 추출하는 경우 건조된 물질은 분쇄할 필요가 없으며, 1차 추출물과 건조된 식물 물질 간의 추출비를 15:1(v/w)로 이용하였을 때 정량적 추출이 이루어졌다.

단리 방법의 다음 작업은 1차 추출물에 존재하는 유기 화합물의 흡착제 상으로의 흡착이다. 비이온성 중합체 수지가 본 발명의 목적에 있어서 매우 적절한 흡착제임이 실험에 의해 확인되었다. 또한 염의 형태로 1차 추출물에 존재하는 알칼로이드가 몇몇 무기 염기, 예를 들면, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 첨가함으로써 염기 형태로 전환됨이 틀림없음도 실험에 의해 확인되었다. 그 후 알칼로이드는 1차 추출물에 존재하는 매질 극성의 몇몇 다른 유기 화합물과 함께 수지 상에 매우 효율적으로 흡착된다. 당류와 같은 극성 유기 화합물과 무기 화합물은 흡착되지 않으므로 이 작업은 중요한 정제 단계에 해당된다. 흡착에 적절한 중합체 수지는 임의의 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 공중합체이다. 수지의 세공 크기 및 입자 크기 분포는 흡착의 선택성에 있어서 또는 효율성에 있어서 중요한 파라미터가 아니다. 흡착은, 예를 들면, 수지를 알칼리화된 1차 추출물과 혼합함으로써 이루어질 수 있으나, 역시, 가장 편리한 방법은 칼럼에 충전된 수지 상으로의 흡착이다. 그 후 알칼리화된 1차 추출물은 칼럼 상에 간단히 로딩할 수 있으며, 그 후 칼럼을 물로 세척하고, 알칼로이드 및 다른 유기 화합물을 수혼화성 유기 용매 또는 이러한 용매와 물의 혼합물, 편리하게는 60%(v/v)의 에탄올 수용액으로 용리하여, 알칼로이드 농축물을 얻는다. 상기 농축물은 1차 추출물 및 몇몇 다른 유기 화합물에 존재하는 모든 알칼로이드를 함유한다.

알칼로이드 농축물은 양이온 교환 중합체 수지 상에 알칼로이드를 추가 흡착시킨다. 비이온성 중합체 수지로부터의 용리에 의해 얻어진 알칼로이드 농축물은 양이온 교환 수지로 충전된 칼럼 상에 바로 로딩할 수 있음을 발견하였다. 다수 유형의 양이온 교환 수지를 성공적으로 사용하였으나, 4% 이하의 디비닐벤젠으로 가교된 폴리술포네이트화된 (스티렌-디비닐벤젠) 공중합체인 겔형의 강산성 양이온 교환 수지를 사용하여 최적의 결과를 얻었다. 이러한 유형의 양이온 교환 수지를 사용하여, 농축물에 존재하는 다른 유기 화합물이 제거되는 동안 알칼로이드를 정량적으로 보유한다. 그 후 적절한 무기 염기 수용액으로 용리하여, 편리하게는, 묽은 암모니아 수용액에 의해, 칼럼으로부터 알칼로이드를 탈착시킴으로써 수성 알칼로이드 농축물을 얻는다.

양이온 교환 수지 상으로의 알칼로이드의 흡착은 유기 화합물의 농축물에서 알칼로이드를 제외한 유기 화합물의 함량이 낮은 경우에 생략될 수 있다. 이러한 경우는 실시예 3에서 증명하고 있다. 그 후 비이온성 중합체 수지로부터 용리에 의해 얻어진 알칼로이드 농축물을 농축시켜 유기 용매를 제거할 수 있고 잔류 수용액은 암모니아 수용액을 첨가하여 알칼리화할 수 있으며 이러한 방법에 의해 얻어진 수성 알칼로이드 농축물은 양이온 교환 수지로부터 용리에 의해 얻어진 수성 농축물과 같이, 유사한 방법으로 다음 정제 단계에 이용될 수 있다.

갈란타민 및 다른 지방 친화성 알칼로이드는 수용액으로부터 유기 용매 내로 추가 추출된다. 그 후 추출물을 농축시키고 얻어진 미정제 알칼로이드 농축물을 알루미나 상에서 크로마토그래피로 추가 정제한다. 지방족 탄화수소를 제외하고 임의의 수불혼화성 용매는 수성 농축물로부터 알칼로이드를 추출하는 데 사용될 수 있으나, 바람직한 용매는 톨루엔, 메틸 이소부틸 케톤 및/또는 몇몇 아세트산 에스테르, 예를 들면, 아세트산 프로필, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸 및 아세트산 이소부틸이다. 이들을 사용하는 이점은 동일한 용매가 알루미나 상에 미정제 알칼로이드 농축물을 크로마토그래피에 의한 정제에 사용하여 상이한 용매의 혼합이 최소화되고 용매 회수가 매우 간단하다는 사실을 기초로 한다.

미정제 알칼로이드 농축물의 크로마토그래피에 의한 정제는 개별 알칼로이드를 분리할 수 있는 제1 작업이다. 특히, 주로 나르시수스속 식물로부터 얻어진 농축물에 존재하는 해마타민(haemathamine)은 실시예 1(도 3 및 4 비교)에서 증명된 바와 같이 이러한 작업에 의해 효율적으로 분리된다. 전술한 용매는 대규모 제조시 매우 편리한 등용매 모드로 해마타민 및 몇몇 다른 알칼로이드로부터 갈란타민의 크로마토그래피에 의한 분리를 수행할 수 있게 한다. 갈란타민이 주 분획(정제된 갈란타민)으로서 크로마토그래피 칼럼으로부터 용리되는 동안, 몇몇 다른 알칼로이드, 주로 해마타민은 칼럼 상에 포획된다. 정제된 갈란타민의 조성물은 비교적 순수한 갈란타민이 그것의 결정화에 의해 예외적으로 고수율로 얻어질 수 있도록 수행된다. 정제된 갈란타민으로부터 갈란타민의 결정화는 2가지 방법으로, 즉 염산과의 염으로서, 또는 염기로서 이루어질 수 있다. 갈란타민 염의 결정화는 매우 고수율로 결정질 생성물을 생성하지만, 생성물 순도에 대한 그 영향은 단지 중간 정도이다. 본 발명자들은 놀랍게도 갈란타민 염기가 상기 문헌에 기재되지 않은 몇몇 용매, 예를 들면, 메틸 이소부틸 케톤 또는 tert-부틸 메틸 에테르로부터 결정화함을 발견하였다. 이러한 용매로부터의 결정화는 대부분의 유력한 불순물을 매우 효과적으로 제거한다. 양 가능성의 조합, 즉 실시예 1에 기재된 바와 같이 갈란타민 염산염의 결정화 후 갈란타민 염기의 유리 및 결정화가 매우 효과적이다. 본 방법에서 2가지 결정화 단계가 포함되지만, 누적 수율이 놀랍게도 높고 2가지 상이한 결정화 단계의 조합은 갈란타민을 순도 99% 초과로 제공한다.

알루미나 상으로의 크로마토그래피 및 결정화의 조합은 실시예 1 및 3에서 증명되는 바와 같이 N-데메틸갈란타민과 나르웨딘을 제외하고는 대부분의 유력한 불순물 제거를 가능하게 한다. 갈란타민의 생합성 전구체인 나르웨딘은 갈란타민을 단리하는 데 사용되는 식물 물질에 항상 존재한다. 그것은 실질적으로 전술한 바와 같은 알루미나 상에 매우 간단한 크로마토그래피에 의해서는 제거되지 않으며, 단지 결정화에 의해서 부분적으로 제거된다. 본 발명의 또 다른 개시는 갈란타민으로부터 나르웨딘의 제거를 가능하게 한다. 약 0.5% 초과의 나르웨딘을 함유하는 결정질 갈란타민은 나르웨딘의 카르보닐기를 환원시킬 수 있는 환원제를 사용함으로써 갈란타민 또는 에피갈란타민의 2차 알코올기를 제공하는 나르웨딘의 환원에 의해 정제될 수 있음을 발견하였다. 이러한 환원은 다수의 환원제에 의해 실현될 수 있으나, 예외적으로 수소화붕소나트륨을 사용하는 것이 편리하다. 나르웨딘을 함유하는 갈란타민 염산염은 물에 용해되며 소량의 수소화붕소나트륨이 첨가된다. 이러한 반응 혼합물로부터 단리된 갈란타민은 실질적으로 실시예 2에서 증명되는 바와 같이 임의의 나르웨딘을 함유하지 않는다.

본 발명에 따른 방법은 전술한 모든 식물 물질로부터 고순도의 갈란타민을 단리할 수 있다. 생성물의 순도는 사용되는 식물 물질에 의존하나, 결코 99% 미만은 아니며, 몇몇 경우에서, 단리된 갈란타민의 순도는 심지어 99.5% 초과였다. 또한 본 방법의 수율은 매우 높았으며, 대체로 실시예 1 및 3에서 증명되는 바와 같이 계산된 양의 80% 초과였다.

하기 실시예에서 본 발명에 대해 기술한다.

하기 실시예를 설명하지만 본 발명을 제한하지는 않는다.

실시예 1

나르시수스 슈도나르시수스 "칼턴"의 구근으로부터 갈란타민의 단리:

(HPLC로 측정시) 갈란타민을 0.12%로 함유하는 나르시수스(나르시수스 슈도나르시수스 "칼턴")의 구근을 분쇄하고 파일럿 플랜트 퍼콜레이터 배터리(4×100 ℓ) 내로 충전하였다(분쇄된 구근 75 kg을 한 추출기 내로 충전하였다). 충전된 개별 추출기를 배터리에 연결하고 역류법에 의해 0.1%(w/w)의 인산 수용액으로 추출하였다. 한 추출기로부터 1차 추출물 125 ℓ를 얻었다. 1차 추출물의 HPLC 분석 기재치는 도 2에 나타내었다. 한 추출기로부터의 1차 추출물을 pH가 9 ~ 10이 되도록 10%의 수산화칼륨 수용액으로 알칼리화하고 상기 용액을 비이온성 수지 SP-825L로 충전된 60 ℓ 칼럼 상에 로딩하였다. 상기 칼럼을 물 100 ℓ로 추가 세척하고 유기 화합물을 60%(v/v)의 에탄올 수용액으로 용리하여 수지로부터 탈착하여 알칼로이드 농축물 220 ℓ를 얻었다. 상기 농축물을 모든 알칼로이드가 흡착된 양이온 교환 수지 SK 104를 함유하는 3 ℓ 칼럼 상에 추가 로딩하였다. 상기 칼럼을 물로 세척하고 알칼로이드를 0.5%(w/w)의 암모니아 수용액으로 칼럼으로부터 용리하여, 수성 알칼로이드 농축물 30 ℓ를 얻었다.

수성 알칼로이드 농축물을 메틸 이소부틸 케톤 30 ℓ로 추출하고 추출물을 증발시켜 약 1 ℓ의 미정제 알칼로이드 농축물을 얻었다. HPLC 분석에 따르면, 상기 농축물은 건조 상태로 갈란타민을 45.8%를 함유하였다(HPLC 기재치는 도 3에 나타내었다). 상기 농축물을 이동상으로서 메틸 이소부틸 케톤을 사용하여 2 kg의 염기성 알루미나를 함유하는 칼럼 상에서 크로마토그래피하였다. 갈란타민을 함유하는 분획(TLC 모니터링)을 풀링(pooling)하고 농축시켜, 건조 잔류물(정제된 갈란타민) 134 g을 얻었다. HPLC 분석은 도 4에 나타내었다. 정제된 갈란타민을 에탄올 450 ㎖에 용해시키고 용액의 pH를 진한 염산을 첨가하여 약 4로 조정하였다. 결정질 갈란타민 염산염의 현탁액을 냉장고에서 냉각시킨 후 결정질 생성물을 여과 제거하였으며, 에탄올 100 ㎖로 세척하고 건조하여, 갈란타민 염산염 106 g을 얻었다. HPLC 분석은 도 5에 나타내었다.

상기 제조된 갈란타민 염산염 30 g을 고온수 50 ㎖에 용해시키고 암모니아 수용액 12 ㎖를 상기 용액에 첨가하였다. 갈란타민의 결정질 염기를 여과하여 분리하였고 건조하였다. 갈란타민의 무수 염기를 100 ㎖의 메틸 이소부틸 케톤으로부터 재결정화하여, 순도가 HPLC로 측정시 99.4%인 갈란타민 21.9 g을 얻었다(HPLC 기재치는 도 6에 나타내었다). 본 방법의 수율은, 모액으로부터 2차 수확물을 회수함이 없이, 갈란타민의 이러한 염기가 이론치의 최대 85.0%였다.

실시예 2

갈란타민 염산염의 정제

실시예 1에서 제조되고 HPLC 분석에 따라 1.1%의 나르웨딘을 함유하는 갈란타민 염산염 30 g을 물 120 ㎖에 용해시키고 교반 하에 수소화붕소나트륨 1.2 g을 약 30분 이내에 6 등분하여 첨가하였다. 용액을 실험실 온도로 추가 30분 동안 교반한 후 25%(w/w)의 암모니아 수용액 12 ㎖와 메틸 이소부틸 케톤 200 ㎖를 상기 용액에 첨가하였다. 유기상을 분리하고, 부피를 약 100 ㎖로 농축시켰으며 냉장고에서 24시간 동안 결정화되도록 하였다. 갈란타민의 결정질 염기를 여과하여 분리하고 건조하여, 순도가 HPLC로 측정시 99.7%이고 나르웨딘 함량이 0.04%인 갈란타민 19.3 g을 얻었다(HPLC 기재치는 도 7에 나타내었다).

실시예 3

류코줌 아에스티붐(Leucojum aestivum, L)의 건조된 잎으로부터 갈란타민(염기)의 단리:

(HPLC로 측정시) 갈란타민을 0.26% 함유하는 스노플레이크(Leucojum aestivum, L)의 건조된 잎 40 kg을 분쇄하고 파일럿 플랜트 퍼콜레이터 배터리(4×100 ℓ) 내로 충전하였다(분쇄된 잎 10 kg을 한 추출기 내로 충전하였다). 충전된 개별 추출기를 배터리에 연결하고 역류법에 의해 0.1%(w/w)의 인산 수용액으로 추 출하였다. 한 추출기로부터 1차 추출물 150 ℓ를 얻었다. 1차 추출물의 HPLC 분석 기재치는 도 8에 나타내었다. 한 추출기로부터 1차 추출물을 칼럼 내 충전된 비이온성 수지 SP-825L의 60 ℓ 칼럼 상에 바로 흡착시키고, 물 100 ℓ로 세척하였으며 90%(v/v)의 에탄올 수용액(200 ℓ)으로 탈착한 후 물 50 ℓ로 세척하여 알칼로이드 농축물을 얻었다.

전체 4종의 추출기로부터 얻어진 알칼로이드 농축물을 배합하고 부피가 75 ℓ가 될 때까지 증발시켰으며, 물을 첨가하여 최종 부피가 300 ℓ가 될 때까지 희석하고 암모니아 수용액을 첨가하여 용액의 pH를 약 10으로 조정하여, 수성 알칼로이드 농축물을 얻었다. 상기 농축물을 연속적인 역류 추출기에서 메틸 이소부틸 케톤 200 ℓ로 추출하였다. 그 결과 생성된 추출물을 부피가 약 1,000 ㎖가 될 때까지 증발시키고, 1,000 g의 염기성 알루미나로 충전된 칼럼 상에 로딩하였다. 상기 칼럼을 메틸 이소부틸 케톤으로 용리하고 갈란타민을 함유하는 분획(TLC 모니터링)을 풀링(pooling)하고 증발 건조하여 잔류물(정제된 갈란타민) 112.5 g을 얻었다. 상기 잔류물을 tert-부틸 메틸 에테르 340 ㎖로부터 결정화하여, HPLC로 측정시 순도가 99.0%인 갈란타민 83.6 g을 얻었다(HPLC 기재치는 도 9에 나타내었다). 본 방법의 수율은, 모액으로부터 2차 수확물을 회수함이 없이, 이론치의 최대 80.0%였다.

본 발명의 방법은 또한 갈란타민 유도체의 경우에도 적용시킬 수 있다. 지금까지 본 발명을 그 특정한 구체적 실시형태와 관련하여 기술하고 예시하였으나, 당업자라면 본 발명의 사상과 범위로부터 벗어남이 없이 절차 및 프로토콜에 다양한 개조, 변경, 변형, 치환, 삭제 또는 부가가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 특허 청구 범위에 의해 한정되며, 그러한 청구 범위는 타당한 범위 내에서 광범위하게 해석되어야 한다.

Claims (37)

1. 갈란타민을 함유하는 생체 물질로부터 갈란타민을 단리하는 방법으로서,

   a) 적절한 유기산 또는 무기산 수용액으로 생체 물질을 추출하여 1차 추출물을 얻는 단계;

   b) 흡착제 상에 상기 1차 추출물로부터 유기 화합물을 흡착시키고, 물로 상기 흡착제를 세척하며, 수혼화성 유기 용매를 사용하여 상기 흡착제로부터 유기 화합물을 용리하여, 알칼로이드 농축물을 얻는 단계

   를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 갈란타민을 함유하는 생체 물질은 아마릴리다세아(Amaryllidacea)과 식물의 건조된 부분 또는 신선한 그대로의 부분인 방법.
3. 제2항에 있어서, 아마릴리다세아과 식물은 갈란투스(Galanthus)속, 나르시수스(Narcissus)속, 류코줌(Leucojum)속 및/또는 리코리스(Lycoris)속의 식물인 방법.
4. 제2항에 있어서, 식물의 상기 신선한 그대로의 부분은 상기 식물의 구근 또는 전기생 부분인 방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 건조된 부분은 상기 식물의 잎 또는 전기생 부분인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 생체 물질을 추출하는 데 사용되는 유기산 또는 무기산은 아세트산, 타르타르산, 시트르산, 인산, 황산 및 염산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
7. 제6항에 있어서, 수 중 유기산 또는 무기산의 농도는 0.05% 내지 약 2%인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 생체 물질을 농도가 약 0.1%(w/w)인 인산 수용액으로 추출하는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 생체 물질의 추출은 배터리식 퍼콜레이터에서 역류법으로 수행하는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 1 중량부의 생체 물질로부터 1 내지 3 중량부의 1차 추출물이 얻어지는 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 1차 추출물로부터 알칼로이드를 흡착시키는 데 사용되 는 흡착제가 폴리(스티렌-디비닐벤젠) 공중합체인 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 흡착제 상으로의 알칼로이드의 흡착은 pH 약 8 내지 약 11에서 수행하는 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 흡착제로부터 알칼로이드를 용리하는 데 사용되는 극성 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 아세톤, 이들의 혼합물 또는 이들의 수성 혼합물인 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 알칼로이드의 농축물은 양이온 교환 수지 상에 농축물로부터 알칼로이드를 흡착시켜 추가 정제하고 적절한 염기의 수용액으로 상기 양이온 교환 수지로부터 상기 알칼로이드를 용리하여 수성 알칼로이드 농축물을 얻는 것인 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 양이온 교환 수지는 겔형의 강산성 양이온 교환 수지인 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 양이온 교환 수지는 4% 이하의 디비닐벤젠으로 가교된 폴리술포네이트화된 (스티렌-디비닐벤젠) 공중합체인 방법.
17. 제14항에 있어서, 상기 양이온 교환 수지로부터 알칼로이드를 용리하는 데 사용되는 염기는 암모니아 수용액인 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 알칼로이드 농축물을 농축시켜 상기 유기 용매를 제거함으로써, 수성 알칼로이드 농축물을 얻는 것인 방법.
19. 제14항 또는 제18항에 있어서, 상기 알칼로이드를 수불혼화성 유기 용매 내로 추출하여 상기 수성 알칼로이드 농축물을 추가 정제하고, 얻어진 추출물은 농축시켜 미정제 알칼로이드 혼합물을 얻는 것인 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 수불혼화성 유기 용매는 메틸 이소부틸 케톤, 아세트산 프로필, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸, 아세트산 이소부틸, 톨루엔 또는 이들의 혼합물인 방법.
21. 제19항에 있어서, 상기 미정제 알칼로이드 혼합물은 이동상으로서 수불혼화성 유기 용매를 사용하여 알루미나 상에서 크로마토그래피에 의해 추가 정제하여 정제된 갈란타민을 얻는 것인 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 수불혼화성 유기 용매는 메틸 이소부틸 케톤, 아세트산 프로필, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸, 아세트산 이소부틸, 톨루엔 또는 이들의 혼합물인 방법.
23. 제19항 또는 제21항에 있어서, 상기 수성 농축물로부터 알칼로이드를 추출하고 크로마토그래피로 정제를 하는 데 동일한 용매를 사용하는 것인 방법.
24. 제19항 또는 제21항에 있어서, 추출 및 크로마토그래피 둘 다에 메틸 이소부틸 케톤을 사용하는 것인 방법.
25. 제21항에 있어서, 상기 정제된 갈란타민을 농축시키고, 메틸 이소부틸 케톤, 아세톤, 또는 tert-부틸 메틸 에테르로부터 결정화하여 결정질 갈란타민을 얻는 것인 방법.
26. 제21항에 있어서, 상기 정제된 갈란타민을 농축시키고, 잔류물을 에탄올에 용해시키며, 염산 1 당량을 첨가하여 갈란타민 염산염 결정화를 촉진시키는 것인 방법.
27. 제25항에 있어서, 상기 결정질 갈란타민을 메틸 이소부틸 케톤, tert-부틸 메틸 에테르 또는 이들의 혼합물로부터 재결정화하여 추가 정제하는 것인 방법.
28. 제26항에 있어서, 상기 갈란타민 염산염을 염기로 전환시키고 상기 염기를 메틸 이소부틸 케톤, tert-부틸 메틸 에테르 또는 이들의 혼합물로부터 결정화하여 추가 정제하는 것인 방법.
29. 제26항에 있어서, 0.5%(w/w) 초과의 나르웨딘을 함유하는 상기 결정질 갈란타민 염산염을 적절한 용매에 용해시키고 나르웨딘의 카르보닐기를 알코올기로 환원시킬 수 있는 환원제를 첨가하여 정제하는 것인 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 적절한 용매는 물인 방법.
31. 제29항에 있어서, 상기 환원제는 수소화붕소나트륨인 방법.
32. 제29항에 있어서, 0.5%(w/w) 초과의 나르웨딘을 함유하는 갈란타민 1 mol에 0.1 mol 이하의 수소화붕소나트륨이 사용되는 것인 방법.
33. 제27항 또는 제28항에 있어서, 얻어진 상기 결정질 갈란타민의 순도는 99% 초과인 방법.
34. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 결정질 갈란타민은 갈란타민 브롬화수소산염을 제조하는 데 사용되는 것인 방법.
35. 갈란타민을 함유하는 생체 물질로부터 갈란타민을 단리하는 방법으로서,

    a) 적절한 유기산 또는 무기산 수용액으로 생체 물질을 추출하여 1차 추출물을 얻는 단계;

    b) 흡착제 상에 상기 1차 추출물로부터 유기 화합물을 흡착시키는 단계;

    c) 상기 흡착제로부터 유기 화합물을 용리하여, 알칼로이드 농축물을 얻는 단계

    를 포함하는 방법.
36. 제35항에 있어서, 얻어진 상기 갈란타민을 적절한 매질로부터 재결정화하는 것인 방법.
37. 제35항에 있어서, 얻어진 갈란타민은 약학 제형에 사용되는 것인 방법.

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