CN110917240A - 一种从青钱柳中分离多种有效成分的连续化方法 - Google Patents
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/30—Extraction of the material
- A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
- A61K2236/331—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using water, e.g. cold water, infusion, tea, steam distillation, decoction
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- A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
- A61K2236/55—Liquid-liquid separation; Phase separation
Abstract
本发明提供了一种从青钱柳中分离多种有效成分的连续化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在碱性条件下渗漉提取；(2)离心；(3)三萜皂苷的分离；(4)青钱柳黄酮的分离；(5)青钱柳多糖的分离；所述大孔吸附树脂柱I为非极性大孔树脂柱，所述大孔吸附树脂柱II为中极性或极性大孔树脂。本发明提供了一种从青钱柳中分离天然甜味剂和多种活性成分的方法，可以通过连续化的操作同时得到高质量的青钱柳三萜皂苷、青钱柳黄酮和青钱柳多糖，是对天然资源青钱柳的一种综合利用方法。本发明方法工艺过程可操作性强，不使用有毒有害、易燃易爆的化工溶剂，无污染，成本低，含量和收率高，实现了青钱柳资源的高效综合利用，适宜于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及青钱柳天然有效成分的分离方法，具体涉及一种同步从青钱柳中分离有效成分的方法
背景技术
青钱柳，胡桃科青钱柳属，是一种高大速生乔木，为我国特产。广泛分布于江西、浙江、江苏、安徽、福建、湖南、湖北、四川、贵州、云南等地。据《中国中药资源志要》记载，其树叶、树皮、树根可入药，性温，味辛微苦，具有清热消肿、解毒止痛的功能。长期以来，民间有传统取其叶制茶做饮料，有清热降暑、降血压、治疗高血压和糖尿病，以致延年益寿等功效，故又称其为甜茶树、神茶树、摇钱树。
对青钱柳的活性成分及保健药用功效的研究，直到近代才有深入。
青钱柳中的三萜皂苷，如青钱柳苷I(cyclocarioside I)、青钱柳苷II(cyclocarioside II)、青钱柳苷III(cyclocarioside III)等，属于新型的天然甜味剂，能够满足高血糖患者对甜味的需求，而不加重病情，同时在降糖、降脂、降压方面具有很好的作用。其中青钱柳苷I的甜度约是蔗糖的250倍。青钱柳黄酮，能有效清除体内的氧自由基，改善血液循环，降低胆固醇，扩张冠状血管、预防心脑血管疾病。青钱柳多糖具有良好的降血糖作用，能够有效提高高血糖患者糖耐受量。
CN108567142A公开了一种青钱柳总黄酮的制备方法，是以青钱柳干叶为原料，经粉碎、低温酶提取、活性炭脱色、大孔树脂纯化等步骤，获得含量约为80％的青钱柳总黄酮。该方法获得的总黄酮含量偏低，而且只能得到了一种青钱柳活性成分。
CN107753552A公开了一种青钱柳叶提取物的制备方法，是以青钱柳叶为原料，经高温水提法或低温逆流水提法、蝶式分离、UHT杀菌过滤、冷冻干燥等步骤，等到青钱柳叶提取物。该方法得到的是青钱柳叶水溶性成分的混合物，并未将青钱柳中的不同活性成分分离。
CN109364119A公开了从青钱柳叶中制备具有降血糖作用的总三萜的方法及应用，是以青钱柳叶为原料，经乙醇水混合溶剂提取、有机溶剂液液萃取后、聚酰胺柱色谱有机溶剂洗脱、大孔树脂柱色谱乙醇水洗脱等步骤，得到青钱柳总三萜。该方法得到青钱柳总三萜的含量偏低，同样只能得到了一种青钱柳活性成分，且大量使用了易燃易爆的有机溶剂，不适合工业化生产。
CN110183545A公开了一种青钱柳多糖的提取及脱色方法，是以青钱柳叶为原料，经水浸泡、复合溶壁酶酶解、超声辅助三级逆流提取、醇沉、水溶解、超声辅助树脂脱色等步骤，得到青钱柳多糖。该方法同样只能得到了一种青钱柳活性成分，未实现青钱柳资源的综合利用，且工艺复杂，设备要求高，不适合工业化生产。
上述现有技术中往往都是对青钱柳资源中单一组分的提取利用，造成资源的浪费。
CN 103694364 A公开了一种青钱柳多糖和黄酮同步提取分离与纯化的方法，是将青钱柳叶预处理后，通过用30％乙醇提取，经过调节浓缩液预处理，稀醇上样、AB-8号大孔树脂及D301强酸型阳离子交换树脂的组合串联分离、浓乙醇、0.5mol/L氨水溶液洗脱，经浓缩、冷冻干燥分别得到纯度较高的黄酮、多糖两种生物活性物质。一方面，改专利虽然提取了两种有效成分，但还是未能有效提取三萜皂苷类物质，对青钱柳资源利用不够充分；而且所得到产的纯度和收率都不高，不能满足工业化的实际需求。
现有技术中少有涉及总三萜、总黄酮和总多糖的同步提取制备工艺。
CN 110051726 A公开了一种青钱柳叶中总黄酮和总多糖的制备方法及应用，具体是以青钱柳叶为原料，经乙醇水溶剂提取，有机溶剂萃取，通过聚酰胺材料吸附，洗脱浓缩液获得粗三萜浸膏，在用醇溶液洗脱，得到总黄酮；水提后的青钱柳叶药渣再经热水提取，沉淀，除蛋白，大孔树脂吸附杂质，得到总多糖。首先，该方法中最终得到的产品纯度和收率都不高，工业化生产时成本并不具备优势；其次，该方法中实际是醇提青钱柳叶后分别以液相的有机溶剂和萃取后的药渣作为处理对象，也就是说该方法实际上仍是分别进行的提取分离处理，并不是一种连续化的生产方法。
因此，亟需开发一种能有效综合利用青钱柳原料的方法，能同时对其中有效的，有经济价值的成分高效、高质地提取出来，并且最终所得产品纯度高，经济价值高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种对青钱柳为原料，可同时分离多种活性成分的适于工业化的联系化生产方法，且所得的各种活性成分产品的含量及收率高，工艺过程可操作性强，成本低，不使用易燃易爆有机溶剂、无污染，可以将青钱柳资源高效综合利用，适宜于工业化生产的从青钱柳中分离天然甜味剂和活性成分的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种从青钱柳中分离多种有效成分的连续化方法，包括以下步骤：
(2)在碱性条件下渗漉提取；(2)离心；(3)三萜皂苷的分离；使用大孔吸附树脂柱I对步骤(2)得到的离心滤液进行三萜皂苷的吸附，流出液I收集待用，大孔吸附树脂柱I先用水洗至中性，再用醇水溶液洗脱，洗脱液依次经过阴离子交换树脂柱和阳离子交换树脂柱，流出液经过浓缩、干燥得三萜皂苷；(4)青钱柳黄酮的分离：调节步骤(3)的流出液I的pH值至中性，通过大孔吸附树脂柱II吸附青钱柳黄酮，收集流出液II待用；用醇水溶液对大孔吸附树脂柱II洗脱，洗脱液减压浓缩干燥，冷却析晶，干燥得青钱柳黄酮；(5)青钱柳多糖的分离：将步骤(4)的流出液II纳滤、脱色、减压浓缩，干燥得青钱柳多糖；
所述大孔吸附树脂柱I为非极性大孔树脂柱，所述大孔吸附树脂柱II为中极性或极性大孔树脂。
在本发明优选的技术方案中，所述包括如下步骤：
(1)在碱性条件下渗漉提取：将青钱柳干叶粉碎，投入渗漉器中，压紧，加入碱水，室温渗漉提取，得渗漉液；
(2)离心：完成固液分离，得离心滤液；
(3)三萜皂苷的分离是将步骤(2)的离心滤液通过大孔吸附树脂柱I，收集大孔吸附树脂柱流出液I待用；用水将大孔吸附树脂柱I洗至中性，再用醇水溶液对大孔吸附树脂柱I洗脱，得洗脱液I；将洗脱液I减压浓缩至无醇，再依次通过阴、阳离子交换树脂柱脱色，得脱色液I；将脱色液I减压浓缩，干燥，得三萜皂苷。
(4)青钱柳黄酮的分离：将步骤(3)大孔吸附树脂柱流出液I用酸调节pH值至中性，再通过大孔吸附树脂柱II，收集大孔吸附树脂柱流出液II待用；用醇水溶液对大孔吸附树脂柱II洗脱，得洗脱液II；将洗脱液II减压浓缩，冷却析晶，抽滤，滤饼干燥，得青钱柳黄酮。
(5)青钱柳多糖的分离：将步骤(4)大孔吸附树脂柱流出液II先用纳滤膜过滤，收集纳滤截留液；将截留液通过活性炭柱脱色，得脱色液II；将脱色液II减压浓缩，干燥，得青钱柳多糖。
进一步优选地，步骤(4)中用酸调节pH值至中性是调节pH为6.5-8，优选为7-7.5。发明人发现，将pH调控在上述范围内，能够在青钱柳黄酮和青钱柳多糖的含量和收率之间取得较好的平衡。
进一步优选地，步骤(1)中，所述的碱水是金属氢氧化物的水溶液，具体可以选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠和碳酸氢钠中的至少一种的水溶液，碱水溶液的质量百分比浓度为1.0-5.0wt％，更优选为1.0-2.0wt％，所述碱水的用量为青钱柳干叶重量的8～15倍，所述渗漉的流速为0.1～0.5BV/h。碱水渗漉的目的是，用较少的水量，将青钱柳干叶中的三萜皂苷和活性成分青钱柳黄酮和青钱柳多糖充分浸出，同时确保杂质较少的浸出，以减少污水的排放和分离纯化的难度。若碱水溶液的质量百分比浓度过小、碱水的用量过少或渗漉的流速过快，都无法达到上述目的；若碱水溶液的质量百分比浓度过大、碱水的用量过多或渗漉的流速过慢，都将造成物料和能源的浪费。
步骤(2)中，所述卧螺离心机的工作条件没有特别的限定，保证能够固液分离即可，一般转速为3000～5000r/min，分离因数为2500～4000。
步骤(3)中，所述大孔吸附树脂柱I选自D101B、D101C、LX-11或LX-60。
再进一步优选地，大孔吸附树脂I和青钱柳干叶的体积质量比为0.3～0.5(L/kg)，所述大孔吸附树脂柱I的高径比为5～8:1，上柱的流速为0.5～1.0BV/h。使用大孔吸附树脂柱I的目的，是吸附碱性离心滤液中的青钱柳三萜皂苷，而不吸附其中的青钱柳黄酮。若大孔吸附树脂I的用量过少、大孔吸附树脂柱I的高径比过小或上柱的流速过快，都将导致三萜皂苷的吸附不充分，造成三萜皂苷的收率偏低；若大孔吸附树脂I的用量过多、大孔吸附树脂柱I的高径比过大或上柱的流速过慢，都将造成物料和能源的浪费。
更进一步优选地，步骤(3)中，所述的阴离子交换树脂为强碱性大孔型阴离子交换树脂，可以举出的例子包括但不限于D945、D941、LSA-700，阴离子交换树脂和青钱柳干叶的体积质量比为0.1～0.2(L/kg)，所述阴离子交换树脂柱的高径比为5～8:1，上柱的流速为0.5～2.0BV/h；所述的阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，可以举出的例子包括但不限于001×7、001×8、001×16，阳离子交换树脂和青钱柳干叶的体积质量比为0.1～0.2(L/kg)，所述阳离子交换树脂柱的高径比为6～10:1，上柱的流速为0.5～1.0BV/h。使用阴、阳离子交换树脂的目的是脱色、脱盐。若离子交换树脂的用量过少、高径比过小或上柱流速过快，都将导致脱色和脱盐不充分，造成三萜皂苷的含量偏低；若离子交换树脂的用量过多、高径比过大或上柱流速过慢，都将造成物料和能源的浪费。
步骤(2)和步骤(3)中洗脱用到的醇水溶液是低碳醇和水的混合溶液，所述低碳醇是指碳原子数为1-4的醇，比如甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、丙二醇、甘油、丁醇、丁二醇中的至少一种，优选为乙醇。所述纯水溶液的浓度为50-80wt％，用量1.5—3.0BV。
步骤(4)中，所述的调节pH的酸为稀盐酸或稀硫酸，用酸调节pH值至中性的目的是将大孔吸附树脂柱碱性流出液I中已成盐的青钱柳黄酮转化为游离的分子状态，从而使其可以被大孔吸附树脂柱II吸附。
所述大孔吸附树脂柱II选自LX-17、LX-28、LX-38或LSA-10。
再进一步优选地，大孔吸附树脂II的体积和青钱柳干叶的体积质量比为0.3～0.5(L/kg)，所述大孔吸附树脂柱II的高径比为5～8:1，上柱的流速为0.5～1.0BV/h。使用大孔吸附树脂柱II的目的，是吸附青钱柳黄酮。若大孔吸附树脂II的用量过少、高径比过小或上柱的流速过快，都将导致青钱柳黄酮的吸附不充分，造成青钱柳黄酮的收率偏低；若大孔吸附树脂II的用量过多、大孔吸附树脂柱II的高径比过大或上柱的流速过慢，都将造成物料和能源的浪费。
更进一步优选地，步骤(4)中，所述冷却析晶的条件为，检验浓缩至结晶溶液固形物浓度为15～25wt％，结晶温度为0～10℃，结晶时间为12～24小时。若结晶溶液固形物浓度过低、结晶温度过高或结晶时间过短，都将造成青钱柳黄酮析出不充分，导致青钱柳黄酮的收率偏低；若结晶溶液固形物浓度过高、结晶温度过低或结晶时间过长，都将造成杂质大量析出，导致青钱柳黄酮的含量偏低。
步骤(5)中，所述纳滤膜的截留分子量为500～1000Da，过滤的压力为1.0～2.0Mpa。使用纳滤膜过滤的目的，是除去大孔吸附树脂柱流出液II中的小分子糖类和盐。若纳滤膜的截留分子量过大或者过滤的压力过大，都有可能导致部分多糖分子透过纳滤膜，造成青钱柳多糖的损失；若纳滤膜的截留分子量过小或者过滤的压力过小，都将造成小分子糖类和盐无法完全透过纳滤膜。
优选地，步骤(5)中，所述活性炭目数为100-200目，用量和青钱柳干叶的体积质量比为的0.05～0.12(L/kg)倍，所述活性炭柱的高径比为1～3:1，上柱的流速为1.0～1.5BV/h。使用活性炭柱的目的，是除去纳滤截留液中的色素，以进一步提高青钱柳多糖的含量。若活性炭的用量过少、活性炭柱的高径比过小或上柱的流速过快，都将无法达到充分除去色素的目的；若活性炭的用量过多、活性炭柱的高径比过大或上柱的流速过慢，不但会造成物料和能源的浪费，还将造成青钱柳多糖的损耗。
本发明方法中，1BV＝1个柱体积。
本发明方法的原理是：
通过碱水渗漉，可以将青钱柳中的三萜皂苷、黄酮和多糖提取出。通常，三萜皂苷和黄酮类化合物可以被大孔树脂吸附，而多糖不会被大孔吸附树脂吸附，因此，可以通过大孔树脂的吸附，将三萜皂苷和黄酮类化合物与多糖类化合物分离。但无法有效分离三萜皂苷和黄酮类化合物，利用碱性条件下黄酮类化合物与碱反应生成盐，在溶液中呈离子状态，因而不会被大孔吸附树脂吸附，所以，在碱性条件下，大孔树脂只会吸附三萜皂苷(常温下，与酸、碱都不发生反应)，而不会吸附成盐的黄酮类化合物。黄酮类化合物与碱反应生成盐是可逆反应，用酸可以使成盐的黄酮类化合物转变为分子状态，恢复其可被大孔树脂吸附的特性。于是，实现了三者的分离。
本发明方法的有益效果如下：
一、本发明方法所得产品，三种主要成分的含量和收率都很高，具体而言，青钱柳三萜皂苷的含量在88％以上，收率在90％；青钱柳黄酮的含量在94％以上，收率在85％以上；青钱柳多糖的含量高达89％，收率90％以上。
二、本发明方法提供了一种从青钱柳中分离天然甜味剂和多种活性成分的方法，可以通过连续化的操作同时得到高质量的青钱柳三萜皂苷、青钱柳黄酮和青钱柳多糖，是对天然资源青钱柳的一种综合利用方法。
三、本发明的方法是一种适合工业化大规模推广的连续化生产方法，全部工艺依次进行。工艺过程可操作性强，不使用有毒有害、易燃易爆的化工溶剂，无污染，成本低，含量和收率高，还实现了青钱柳资源的高效综合利用，适宜于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的从青钱柳中分离多种有效成分的连续化方法作进一步说明。
本发明实施例所使用的青钱柳(干叶)购于江西修水，其中，总三萜皂苷、总黄酮、总多糖的质量含量分别为3.17％、4.36％和3.29％；本发明实施例所使用的离子交换树脂、大孔吸附树脂均购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司；本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
本发明实施例中，采用香草醛-高氯酸比色法检测青钱柳三萜皂苷的含量、采用三氯化铝比色法测定青钱柳黄酮的含量，采用苯酚-硫酸比色法测定青钱柳多糖的含量。
实施例1
(1)渗漉提取：取青钱柳干叶200kg，粉碎，投入渗漉器中，压紧，加入质量百分比浓度为1.5％的氢氧化钠水溶液2000L，室温渗漉提取，渗漉提取的流速为0.5BV/h，得渗漉液；
(2)离心：将步骤(1)渗漉液用转速为4000r/min、分离因数为3000的卧螺离心机离心，得离心滤液；
(3)青钱柳天然甜味剂的分离：将步骤(2)中离心滤液通过大孔吸附树脂柱D101B，大孔吸附树脂的用量为80L，高径比为7:1，上柱的流速为1.0BV/h，收集碱性的大孔吸附树脂柱流出液I待用；用水将大孔吸附树脂柱I冲洗至中性，再用乙醇对大孔吸附树脂柱洗脱，得洗脱液I；将洗脱液I减压浓缩至无醇，通过阴离子交换树脂柱D941，用量为30L，阴离子交换树脂柱的高径比为9:1，上柱的流速为1BV/h；在通过阳离子交换树脂柱001×7，用量为30L，高径比为9:1，流速为1BV/h，最后得脱色液I；将脱色液I减压浓缩，干燥，得青钱柳三萜皂苷6.68kg；
(4)青钱柳黄酮的分离：将步骤(3)大孔吸附树脂柱碱性流出液I用盐酸调节pH值至7.5，再通过大孔吸附树脂柱LX-17，用量为100L，高径比为7:1，上柱的流速为1BV/h，收集大孔吸附树脂柱流出液II待用；用乙醇对大孔吸附树脂柱II洗脱，得洗脱液II；将洗脱液II减压浓缩至固形物浓度为20％，在温度为5℃条件下，冷却析晶18小时，抽滤，滤饼干燥，得青钱柳黄酮8.34kg；
(5)青钱柳多糖的分离：将步骤(4)大孔吸附树脂柱流出液II先用截留分子量为800Da的纳滤膜过滤，过滤的压力为1.5Mpa，收集纳滤截留液；将截留液通过活性炭柱脱色(活性炭用量为24L，活性炭柱的高径比为3:1，上柱的流速为1.5BV/h，得脱色液II；将脱色液II减压浓缩，干燥，得青钱柳多糖6.73kg；
经香草醛-高氯酸比色法检测，本实施例所得青钱柳三萜皂苷的含量为90.20％，青钱柳三萜皂苷的收率为95.03％；经三氯化铝比色法检测，所得青钱柳黄酮的含量为96.39％，青钱柳黄酮的收率为92.19％；经苯酚-硫酸比色法测定，所得青钱柳多糖的含量91.17％，青钱柳多糖的收率为93.25％。
实施例2
(1)渗漉提取：取青钱柳干叶300kg，粉碎，投入渗漉器中，压紧，加入质量百分比浓度为2.0％的氢氧化钾水溶液2400L，室温渗漉提取，渗漉提取的流速为0.3BV/h，得渗漉液；
(2)离心：将步骤(1)渗漉液用转速为3500r/min、分离因数为3000的卧螺离心机离心，得离心滤液；
(3)青钱柳天然甜味剂的分离：将步骤(2)离心滤液通过大孔吸附树脂柱LX-11，大孔吸附树脂的用量为90L，高径比为5:1，上柱的流速为0.6BV/h，收集大孔吸附树脂柱碱性的流出液I待用；用水将大孔吸附树脂柱冲洗至中性，再用乙醇对大孔吸附树脂柱洗脱，得洗脱液I；将洗脱液I减压浓缩至无醇，再依次通过阴、阳离子交换树脂柱脱色(阴离子交换树脂的型号为D945，用量为60L，高径比为6:1，上柱的流速为0.5BV/h；阳离子交换树脂的型号为001×8，用量为60L，高径比为6:1，上柱的流速为0.5BV/h)，得脱色液I；将脱色液I减压浓缩，干燥，得青钱柳三萜皂苷10.03kg；
(4)青钱柳黄酮的分离：将步骤(3)大孔吸附树脂柱碱性的流出液I用硫酸调节PH值至7，再通过大孔吸附树脂柱LX-28，大孔吸附树脂的用量为150L，高径比为6:1，上柱的流速为0.8BV/h，收集大孔吸附树脂柱流出液II待用；用乙醇对大孔吸附树脂柱II洗脱，得洗脱液II；将洗脱液II减压浓缩至固形物浓度为25％，在温度为6℃条件下，冷却析晶16小时，抽滤，滤饼干燥，得青钱柳黄酮12.78kg；
(5)青钱柳多糖的分离：将步骤(4)大孔吸附树脂柱流出液II先用截留分子量为500Da的纳滤膜过滤，过滤的压力为2.0Mpa，收集纳滤截留液；将截留液通过活性炭柱脱色，活性炭用量为30L，活性炭柱的高径比为2:1，上柱的流速为0.5BV/h，得脱色液II；将脱色液II减压浓缩，干燥，得青钱柳多糖10.00kg；
经香草醛-高氯酸比色法检测，本实施例所得青钱柳三萜皂苷的含量为88.34％，青钱柳三萜皂苷的收率为93.17％；经三氯化铝比色法检测，所得青钱柳黄酮的含量为94.09％，青钱柳黄酮的收率为91.93％；经苯酚-硫酸比色法测定，例所得青钱柳多糖的含量89.52％，青钱柳多糖的收率为90.70％。
实施例3
(1)渗漉提取：取青钱柳干叶100kg，粉碎，投入渗漉器中，压紧，加入质量百分比浓度为0.1％的氢氧化钙水溶液1500L，室温渗漉提取，渗漉提取的流速为0.1BV/h，得渗漉液；
(2)离心：将步骤(1)渗漉液用转速为3000r/min、分离因数为2500的卧螺离心机离心，得离心滤液；
(3)青钱柳天然甜味剂的分离：将步骤(2)得到的碱性离心滤液通过大孔吸附树脂柱LX-60，大孔吸附树脂的用量为50L，高径比为6:1，上柱的流速为0.8BV/h，收集大孔吸附树脂柱流出液I待用；用水将大孔吸附树脂柱冲洗至中性，再用乙醇对大孔吸附树脂柱I洗脱，得洗脱液I；将洗脱液I减压浓缩至无醇，再依次通过阴、阳离子交换树脂柱脱色(阴离子交换树脂的型号为LSA-700，用量为20L，高径比为8:1，上柱的流速为0.8BV/h；阳离子交换树脂的型号为001×16，用量为20L，高径比为8:1，上柱的流速为0.8BV/h，得脱色液I；将脱色液I减压浓缩，干燥，得青钱柳三萜皂苷3.12kg；
(4)青钱柳黄酮的分离：将步骤(3)大孔吸附树脂柱碱性的流出液I用盐酸调节pH值至7.5，再通过大孔吸附树脂柱LSA-10，大孔吸附树脂的用量为30L，高径比为8:1，上柱的流速为0.5BV/h，收集大孔吸附树脂柱流出液II待用；用乙醇对大孔吸附树脂柱II洗脱，得洗脱液II；将洗脱液II减压浓缩至固形物浓度为15％，在温度为2℃条件下，冷却析晶24小时，抽滤，滤饼干燥，得青钱柳黄酮4.08kg。
(5)青钱柳多糖的分离：将步骤(4)大孔吸附树脂柱流出液II先用截留分子量为1000Da的纳滤膜过滤，过滤的压力为1.0Mpa，收集纳滤截留液；将截留液通过活性炭柱脱色，活性炭用量为8L，高径比为2.5:1，上柱的流速为1BV/h，得脱色液II；将脱色液II减压浓缩，干燥，得青钱柳多糖3.37kg。
经香草醛-高氯酸比色法检测，本实施例所得青钱柳三萜皂苷的含量为91.89％，青钱柳三萜皂苷的收率为90.44％；经三氯化铝比色法检测，所得青钱柳黄酮的含量为94.27％，青钱柳黄酮的收率为88.21％；经苯酚-硫酸比色法测定，所得青钱柳多糖的含量93.83％，青钱柳多糖的收率为96.11％。
实施例4
其他操作和实施例1相同，区别在于步骤(4)大孔吸附树脂柱碱性的流出液I用盐酸调节pH值至6.5，最终得到产品，经香草醛-高氯酸比色法检测，本实施例所得青钱柳三萜皂苷的含量为90.15％，青钱柳三萜皂苷的收率为94.98％；经三氯化铝比色法检测，所得青钱柳黄酮的含量为94.26％，青钱柳黄酮的收率为90.47％；经苯酚-硫酸比色法测定，所得青钱柳多糖的含量91.19％，青钱柳多糖的收率为93.26％。
实施例5
其他操作和实施例1相同，区别在于步骤(4)大孔吸附树脂柱碱性的流出液I用盐酸调节pH值至8，最终得到产品，经香草醛-高氯酸比色法检测，本实施例所得青钱柳三萜皂苷的含量为90.24％，青钱柳三萜皂苷的收率为95.13％；经三氯化铝比色法检测，所得青钱柳黄酮的含量为94.61％，青钱柳黄酮的收率为91.85％；经苯酚-硫酸比色法测定，所得青钱柳多糖的含量91.13％，青钱柳多糖的收率为91.57％。
实施例6
其他操作和实施例1相同，区别在于步骤(1)中NaOH溶液浓度为3wt％，流速为0.8BV/h，最终得到产品，经香草醛-高氯酸比色法检测，本实施例所得青钱柳三萜皂苷的含量为90.41％，青钱柳三萜皂苷的收率为86.27％；经三氯化铝比色法检测，所得青钱柳黄酮的含量为95.75％，青钱柳黄酮的收率为85.61％；经苯酚-硫酸比色法测定，所得青钱柳多糖的含量91.26％，青钱柳多糖的收率为88.60％。
实施例7
其他操作和实施例1相同，区别在于步骤(3)中大孔吸附树脂柱D101B用量改为50L，高径改为4:1。最终得到产品，经香草醛-高氯酸比色法检测，本实施例所得青钱柳三萜皂苷的含量为90.13％，青钱柳三萜皂苷的收率为84.85％；经三氯化铝比色法检测，所得青钱柳黄酮的含量为95.27％，青钱柳黄酮的收率为91.47％；经苯酚-硫酸比色法测定，所得青钱柳多糖的含量91.05％，青钱柳多糖的收率为92.47％。
实施例8
其他操作和实施例1相同，区别在于步骤(3)中通过阴离子交换树脂柱D941用量改为15L，流速为0.6BV/h；阳离子交换树脂柱001×7用量改为15L，流速改为0.6BV/h。最终得到产品，经香草醛-高氯酸比色法检测，本实施例所得青钱柳三萜皂苷的含量为85.62％，青钱柳三萜皂苷的收率为91.67％；经三氯化铝比色法检测，所得青钱柳黄酮的含量为95.55％，青钱柳黄酮的收率为91.83％；经苯酚-硫酸比色法测定，所得青钱柳多糖的含量91.21％，青钱柳多糖的收率为93.31％。
实施例9
其他操作和实施例1相同，区别在于步骤(4)中打孔吸附树脂柱LX-17用量改为120L，流速改为0.8BV/h。最终得到产品，经香草醛-高氯酸比色法检测，本实施例所得青钱柳三萜皂苷的含量为90.22％，青钱柳三萜皂苷的收率为95.14％；经三氯化铝比色法检测，所得青钱柳黄酮的含量为96.36％，青钱柳黄酮的收率为92.08％；经苯酚-硫酸比色法测定，所得青钱柳多糖的含量91.06％，青钱柳多糖的收率为93.27％。
对比例1
其他操作和实施例1相同，区别在于步骤(1)改为醇提，具体是以1500L的50％乙醇水溶液为提取溶剂，先浸泡4h，微沸状态下保温2h，再用0.5mol/L氨水调节pH为9左右。最终得到产品，经香草醛-高氯酸比色法检测，本实施例所得青钱柳三萜皂苷的含量为89.83％，青钱柳三萜皂苷的收率为87.37％；经三氯化铝比色法检测，所得青钱柳黄酮的含量为94.51％，青钱柳黄酮的收率为85.72％；经苯酚-硫酸比色法测定，所得青钱柳多糖的含量91.03％，青钱柳多糖的收率为87.64％。
对比例2
其他操作和实施例1相同，区别在于步骤(3)中大孔吸附树脂柱D101B吸附洗脱后，取消阴离子交换树脂和阳离子交换树脂的步骤，洗脱液直接进行减压浓缩，干燥。最终得到产品，经香草醛-高氯酸比色法检测，本实施例所得青钱柳三萜皂苷的含量为82.51％，青钱柳三萜皂苷的收率为85.38％；经三氯化铝比色法检测，所得青钱柳黄酮的含量为96.27％，青钱柳黄酮的收率为92.12％；经苯酚-硫酸比色法测定，所得青钱柳多糖的含量91.13％，青钱柳多糖的收率为93.14％。
对比例3
其他操作和实施例1相同，区别在于步骤(4)中得到洗脱液II后；将洗脱液II减压浓缩至固形物浓度为20％，再冷冻真空干燥得到青钱柳黄酮产品。最终得到产品，经香草醛-高氯酸比色法检测，本实施例所得青钱柳三萜皂苷的含量为90.18％，青钱柳三萜皂苷的收率为94.97％；经三氯化铝比色法检测，所得青钱柳黄酮的含量为92.53％，青钱柳黄酮的收率为86.35％；经苯酚-硫酸比色法测定，所得青钱柳多糖的含量91.13％，青钱柳多糖的收率为93.25％。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种从青钱柳中分离多种有效成分的连续化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在碱性条件下渗漉提取；(2)离心；(3)三萜皂苷的分离；使用大孔吸附树脂柱I对步骤(2)得到的离心滤液进行三萜皂苷的吸附，流出液I收集待用，大孔吸附树脂柱I先用水洗至中性，再用醇水溶液洗脱，洗脱液依次经过阴离子交换树脂柱和阳离子交换树脂柱，流出液经过浓缩、干燥得三萜皂苷；(4)青钱柳黄酮的分离：调节步骤(3)的流出液I的pH值至中性，通过大孔吸附树脂柱II吸附青钱柳黄酮，收集流出液II待用；用醇水溶液对大孔吸附树脂柱II洗脱，洗脱液减压浓缩干燥，冷却析晶，干燥得青钱柳黄酮；(5)青钱柳多糖的分离：将步骤(4)的流出液II纳滤、脱色、减压浓缩，干燥得青钱柳多糖；
所述大孔吸附树脂柱I为非极性大孔树脂柱，所述大孔吸附树脂柱II为中极性或极性大孔树脂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在碱性条件下渗漉提取：将青钱柳干叶粉碎，投入渗漉器中，压紧，加入碱水，室温渗漉提取，得渗漉液；
(2)离心：完成固液分离，得离心滤液；
(3)三萜皂苷的分离：是将步骤(2)的离心滤液通过大孔吸附树脂柱I，收集大孔吸附树脂柱流出液I待用；用水将大孔吸附树脂柱I洗至中性，再用醇水溶液对大孔吸附树脂柱I洗脱，得洗脱液I；将洗脱液I减压浓缩至无醇，再依次通过阴、阳离子交换树脂柱脱色，得脱色液I；将脱色液I减压浓缩，干燥，得三萜皂苷；
(4)青钱柳黄酮的分离：将步骤(3)大孔吸附树脂柱流出液I用酸调节pH值至中性，再通过大孔吸附树脂柱II，收集大孔吸附树脂柱流出液II待用；用醇水溶液对大孔吸附树脂柱II洗脱，得洗脱液II；将洗脱液II减压浓缩，冷却析晶，抽滤，滤饼干燥，得青钱柳黄酮；
(5)青钱柳多糖的分离：将步骤(4)大孔吸附树脂柱流出液II先用纳滤膜过滤，收集纳滤截留液；将截留液通过活性炭柱脱色，得脱色液II；将脱色液II减压浓缩，干燥，得青钱柳多糖。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中用酸调节pH值至中性是调节pH为6.5-8。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述碱水溶液的质量百分比浓度为1.0-5.0wt％，所述碱水的用量为青钱柳干叶重量的8～15倍，所述渗漉的流速为0.1～0.5BV/h。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述大孔吸附树脂柱I选自D101B、D101C、LX-11或LX-60；步骤(4)中所述大孔吸附树脂柱II选自LX-17、LX-28、LX-38或LSA-10。
6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，大孔吸附树脂I和青钱柳干叶的体积质量比为0.3～0.5(L/kg)，所述大孔吸附树脂柱I的高径比为5～8:1，上柱的流速为0.5～1.0BV/h。
7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的阴离子交换树脂为强碱性大孔型阴离子交换树脂，阴离子交换树脂和青钱柳干叶的体积质量比为0.1～0.2(L/kg)，所述阴离子交换树脂柱的高径比为5～8:1，上柱的流速为0.5～2.0BV/h；和/或
阳离子交换树脂为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，阳离子交换树脂和青钱柳干叶的体积质量比为0.1～0.2(L/kg)，所述阳离子交换树脂柱的高径比为6～10:1，上柱的流速为0.5～1.0BV/h。
8.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，大孔吸附树脂II的体积和青钱柳干叶的体积质量比为0.3～0.5(L/kg)，所述大孔吸附树脂柱II的高径比为5～8:1，上柱的流速为0.5～1.0BV/h。
9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述冷却析晶的条件为，检验浓缩至结晶溶液固形物浓度为15～25wt％，结晶温度为0～10℃，结晶时间为12～24小时。
10.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述纳滤膜的截留分子量为500～1000Da，过滤的压力为1.0～2.0Mpa；和/或
所述活性炭目数为100-200目，用量和青钱柳干叶的体积质量比为的0.05～0.12(L/kg)倍，所述活性炭柱的高径比为1～3:1，上柱的流速为1.0～1.5BV/h。
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