CN115137762A - 一种青钱柳提取物及其在制备抗冠状病毒的药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种青钱柳提取物及其在制备抗冠状病毒的药物中的用途。该青钱柳提取物中，多糖的含量为8wt.％～15wt.％，黄酮的含量为0.5wt.％～5wt.％，且多糖与黄酮的含量比值≥5：1。实验结果表明，本发明特定黄酮和多糖含量的青钱柳提取物具有SARS‑CoV‑2病毒中和活性，能够有效抑制SARS‑CoV‑2病毒引起的细胞病变，保护细胞不被SARS‑CoV‑2病毒感染。本发明提供的青钱柳提取物在制备安全性好、制备成本低的抗冠状病毒(特别是SARS‑CoV‑2病毒)的药物中具有广阔的应用前景。

Description

一种青钱柳提取物及其在制备抗冠状病毒的药物中的用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种青钱柳提取物及其在制备抗冠状病毒的药物中的用途。
背景技术
目前发现的可感染人类的冠状病毒共有7种：HcoV-229E、HcoV-NL63、HcoV-HKU1、HcoV-OC43、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)、新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。其中，SARS-CoV-2是一种新型β属冠状病毒，属于单链RNA病毒，其感染性极强，人群普遍易感。目前虽对SARS-CoV-2引起的新型冠状病毒肺炎的流行病学、临床特点、诊断治疗及其预防转归等方面有了一定的认识，但治疗仍不能满足临床需求，缺乏特效药物，形式仍相当严峻。
已有的抗病毒药物对SARS-CoV-2大部分无效，例如抗HIV药物克力芝(洛匹那韦和利托那韦)在治疗新型冠状病毒肺炎的临床试验中效果差并且副作用大。靶向刺突S蛋白的抗体、小蛋白、脂多肽虽然能有效阻断冠状病毒侵入细胞，但是价格昂贵。因此，亟需开发出安全性好、制备成本低、抗SARS-CoV-2病毒作用优异的新药。
中药提取物由于具有安全性好、制备成本低的优点受到了广泛的关注。青钱柳，Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja，又名青钱李、摇钱树、甜茶树等，系胡桃科青钱柳属植物特有单种属，为我国所特有，广泛分布于江西、广西等地。青钱柳是一种高大速生阔叶乔木，因其树形似柳，果实圆形似铜钱，色青而下垂，故名“青钱柳”。近年来，国内外学者对青钱柳的理化成分及保健功能在动物水平及临床试验初步研究，表明青钱柳及相关保健产品具有多种有益的药理作用和保健效果，包括降压、降血糖、减肥、抗肿瘤、抗过敏、增强机体免疫等作用。但是，还未见将青钱柳提取物用来制备抗SARS-CoV-2病毒的药物的报道。
发明内容
为了解决安全性好、制备成本低、抗SARS-CoV-2病毒作用优异的药物匮乏的问题，本发明的目的在于提供一种青钱柳提取物及其在制备抗冠状病毒(特别是SARS-CoV-2病毒)的药物中的用途。
本发明提供了一种青钱柳提取物，所述青钱柳提取物中，多糖的含量为8wt.％～15wt.％，黄酮的含量为0.5wt.％～5wt.％，且多糖与黄酮的含量比值≥5：1。
进一步地，所述多糖与黄酮的含量比值为(8～9)：1。
进一步地，所述青钱柳提取物中，多糖的含量为10wt.％～11wt.％，黄酮的含量为1wt.％～2wt.％。
本发明还提供了上述青钱柳提取物的制备方法，所述制备方法为：称取青钱柳叶，加水提取，然后过滤，取滤液浓缩并干燥，得青钱柳提取物。
进一步地，所述青钱柳叶与水的重量比为1:(5～15)；所述提取的次数为1～3次，提取的温度为60～100℃，提取的时间为每次1～3小时；所述青钱柳叶为青钱柳Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja的干燥叶或新鲜叶。
进一步地，所述提取的次数为2次，提取的温度为80℃，提取的时间为每次2小时；所述青钱柳叶与水的重量比为1:(6～8)，优选为第1次1:8，第2次1:6；所述青钱柳叶是粉碎后的青钱柳叶。
本发明还提供了上述青钱柳提取物在制备抗冠状病毒的药物中的用途。
进一步地，所述药物具有冠状病毒中和活性；和/或，所述药物能够抑制冠状病毒引起的细胞病变。
进一步地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HcoV-229E、HcoV-NL63、HcoV-HKU1或HcoV-OC43，优选为SARS-CoV-2。
本发明还提供了一种抗冠状病毒的药物，所述药物是以上述的青钱柳提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制得的制剂。
“常温”指25±2℃。
“具有冠状病毒中和活性”的药物指能够保护50％以上的细胞不被病毒感染的药物。
实验结果表明，本发明黄酮和多糖含量的青钱柳提取物具有SARS-CoV-2病毒中和活性，能够有效抑制SARS-CoV-2病毒引起的细胞病变，保护细胞不被SARS-CoV-2病毒感染。本发明提供的青钱柳提取物在制备安全性好、制备成本低的抗冠状病毒的药物中具有广阔的应用前景。
本发明的青钱柳提取物制备方法简单、成本低廉、适合工业化生产。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1：本发明青钱柳叶提取物的制备
称取室温阴干的青钱柳叶500g，粉碎后加8倍重量的水浸泡12h，然后在80℃下搅拌提取2h，收集提取液；在剩余的药渣中再加入6倍重量的水，再次以前述相同温度下(80℃)搅拌提取2h，收集提取液。合并提取液，过滤，滤液在温度不超过60℃的条件下进行减压浓缩，得到相对密度为1.10的青钱柳浸膏。
然后将青钱柳浸膏放进冻库进行预冻，预冻温度和时间为：零下40℃、6h。将预冻好的青钱柳浸膏转入冻干机中进行冷冻干燥，得到80℃青钱柳叶提取物48.8g，4℃保存。
采用紫外-可见分光光度法(《中国药典》2015年版通则0401)，以芦丁为对照，测得上述80℃青钱柳叶提取物中黄酮的含量为1.25wt.％；以D-葡萄糖为对照，测得上述80℃青钱柳叶提取物中多糖的含量为10.64wt.％。
实施例2：本发明青钱柳叶提取物的制备
参照实施例1的提取方法，区别仅在于将搅拌提取的温度由80℃修改为60℃，得到60℃青钱柳叶提取物。
实施例3：本发明青钱柳叶提取物的制备
参照实施例1的提取方法，区别仅在于将搅拌提取的温度由80℃修改为70℃，得到70℃青钱柳叶提取物。
实施例4：本发明青钱柳叶提取物的制备
参照实施例1的提取方法，区别仅在于将搅拌提取的温度由80℃修改为90℃，得到90℃青钱柳叶提取物。
实施例5：本发明青钱柳叶提取物的制备
参照实施例1的提取方法，区别仅在于将搅拌提取的温度由80℃修改为100℃，得到100℃青钱柳叶提取物。
对照例1：对照青钱柳叶提取物的制备
(1)称取室温阴干的青钱柳叶100kg，粉碎后加入料液比为1:5(w/w)的80％乙醇，常温浸泡4h，4800r/min离心10min，取上清。此步骤重复2次。
(2)将步骤(1)所得上清浓缩，加入5倍体积的80℃热水，搅拌均匀，常温静置24h。4800r/min离心10min，取上清浓缩后50℃真空干燥24h，得到粉末状固体9kg(命名为对照物)，4℃保存备用。
采用紫外-可见分光光度法(《中国药典》2015年版通则0401)，以芦丁为对照，测得上述对照物中黄酮的含量为26.615wt.％；以D-葡萄糖为对照，测得上述对照物中多糖的含量为22.782wt.％。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1：实施例中各青钱柳叶提取物对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的抑制作用测试
1.实验方法
实验用病毒和靶细胞：实验室构建的表达新型冠状病毒(Sars-CoV-2)刺突蛋白(spikprotein)的荧光标记假病毒(pseudovirus)和病毒受体(ACE2)转染的293T细胞(293T-ACE2)。
实验方法：利用上述构建细胞体系，评估实施例1～5制得的青钱柳叶提取物对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的抑制作用，以配制青钱柳叶提取物溶液所用的溶剂(DMEM细胞培养液，不含提取物)作为空白对照。实验步骤为：1)用带荧光标记的包装质粒pLenti-GFP-luciferase和psPAX2，以及编码SARS-CoV-2刺突蛋白质粒共转染293T细胞，构建能组装假病毒的细胞；2)培养假病毒组装细胞，收集培养上清，制得假病毒；3)将假病毒与不同的提取物及其在不同的浓度下共孵育1小时；4)将共孵育后的假病毒加入ACE2转染的293T细胞(293T-ACE2)，孵育72小时；5)流式细胞仪检测带有荧光标记细胞的比例，计算假病毒的感染效率及提取物处理后对病毒感染能力的影响。
2.实验结果
结果显示，空白对照组细胞的病毒感染率为82.7％；经1mg/mL实施例1制得的80℃青钱柳叶提取物处理后，细胞的病毒感染率为26.1％；经1mg/mL实施例2制得的60℃青钱柳叶提取物处理后，细胞的病毒感染率为52.3％；经1mg/mL实施例3制得的70℃青钱柳叶提取物处理后，细胞的病毒感染率为41.2％；经1mg/mL实施例4制得的90℃青钱柳叶提取物处理后，细胞的病毒感染率为38.6％；经1mg/mL实施例5制得的100℃青钱柳叶提取物处理后，细胞的病毒感染率为65.8％。
上述结果表明，本发明实施例1～5制得的青钱柳叶提取物能够有效抑制新型冠状病毒(Sars-CoV-2)对细胞的感染；而且，80℃青钱柳叶提取物抑制对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的抑制作用最佳。
实验例2：青钱柳叶提取物抑制新型冠状病毒(SARS-CoV-2)导致细胞病变作用的测试
1.病毒株和药物
试验病毒株：SARS-CoV-2病毒(BetaCoV/JS02/human/2020，江苏省新型冠状肺炎临床病例分离病毒株)。
病毒的培养：在VeroE6细胞株中培养分离到SARS-CoV-2病毒。VeroE6细胞接种于24孔细胞培养板中，在含10％胎牛血清和抗生素的Dulbecco minimal essential medium(DMEM)培养基中37℃，5％CO2培养3-4天，直到80％的孔底铺满单层细胞。将50ul病毒原液接种到24孔板中，继续培养3天，到细胞出现病变。用0.5％木瓜酶消化贴壁的单层VeroE6细胞，经超声破碎后，离心去沉淀，将上清分装后置-80℃储存。病毒量按标准的空斑计数法检定。
受试药物：分别精确称取实施例1制得的青钱柳叶提取物和对照例1制得的青钱柳叶提取物各10mg溶于10ml DMEM培养基(不含血清)中，用0.22μm滤器过滤除菌，得浓度各为1mg/ml的提取物原液，4℃保存备用。
2.测试步骤
1)将Vero E6细胞(非洲绿猴肾细胞)按照5×104个细胞/孔接种于96孔板中培养过夜。
2)将上述两种1mg/ml的提取物原液分别按照不稀释，1:1稀释，1:2稀释，1:4稀释，1：8稀释的梯度稀释法配制成应用液，各取100μL与100TCID50 SARS-CoV-2病毒进行孵育，孵育条件为37℃，5％CO2，1小时；分别记为实施例1提取物组、对照例1提取物组。
3)将步骤2)孵育后不同稀释浓度的混合物100uL加入到Vero E6细胞中培养3天。培养条件为37℃,5％CO2。每个稀释度设置复孔；
4)3天后，通过光学显微镜观察病毒致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，0-25％细胞CPE变化记为“+”，26-50％细胞CPE变化记为“++”，51-75％细胞CPE变化记为“+++”，76-100％细胞CPE变化记为“++++”，正常细胞形态记为“-”，记录实验结果。
5)实验同时设置正常细胞对照组(不加病毒，不加提取物)、病毒对照组(加100TCID50 SARS-CoV-2病毒，不加提取物)和中和性抗体对照组(加100TCID50 SARS-CoV-2病毒，加中和性抗体)；另外，为确保实验的准确性，设置病毒滴度回滴组，病毒滴度回滴1TCID50/0.1mL为10e-5.0。
中和性抗体是当SARS-CoV-2病毒侵入机体时产生的相应抗体，中和性抗体能保护细胞不被SARS-CoV-2病毒感染，作为有效抗病毒制剂对照。
3.结果判断与分析
以能够保护50％以上的细胞不被病毒感染的药物浓度，判断为具有病毒中和活性的浓度，即有效浓度。
统计学分析:使用IBM SPSS statistics 25软件，采用卡方检验进行统计学分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
4.实验结果
表1病毒致细胞病变效应测试结果
Figure BDA0003000033220000061
注：P值表示与相应浓度提取物保护效应的显著性差异。a指与与相同浓度的实施例1提取物组进行比较，*指与实施例1提取物组0.125mg/ml浓度进行比较。
表2病毒中和活性测试结果
Figure BDA0003000033220000062
实验结果如表1和表2所示。正常细胞对照组的细胞生长良好；中和性抗体对照组无细胞病变；病毒对照组出现+++～++++的细胞病变。
各浓度下的实施例1制得的青钱柳叶提取物均能抑制病毒导致的细胞病变，能保护50％以上的细胞不被SARS-CoV-2病毒感染；但是各浓度下的对照例1制得的青钱柳叶提取物均不能抑制病毒导致的细胞病变，不能保护细胞免受SARS-CoV-2病毒感染。与对照例1制得的青钱柳叶提取物相比，实施例1制得的青钱柳叶提取物抑制细胞病变的效应具有统计学意义上的显著性差异(P<0.05)。
上述实验结果表明，只有本发明实施例1的青钱柳叶提取物才具有显著抑制SARS-CoV-2病毒引起的细胞病变的能力，保护细胞不被SARS-CoV-2病毒感染。
综上所述，本发明提供了一种青钱柳提取物及其在制备抗冠状病毒的药物中的用途。实验结果表明，本发明特定黄酮和多糖含量的青钱柳提取物具有SARS-CoV-2病毒中和活性，能够有效抑制SARS-CoV-2病毒引起的细胞病变，保护细胞不被SARS-CoV-2病毒感染。本发明提供的青钱柳提取物在制备安全性好、制备成本低的抗冠状病毒的药物中具有广阔的应用前景。

Claims (10)

1.一种青钱柳提取物，其特征在于：所述青钱柳提取物中，多糖的含量为8wt.％～15wt.％，黄酮的含量为0.5wt.％～5wt.％，且多糖与黄酮的含量比值≥5：1。
2.根据权利要求1所述的青钱柳提取物，其特征在于：所述多糖与黄酮的含量比值为(8～9)：1。
3.根据权利要求2所述的青钱柳提取物，其特征在于：所述青钱柳提取物中，多糖的含量为10wt.％～11wt.％，黄酮的含量为1wt.％～2wt.％。
4.权利要求1～3任一项所述的青钱柳提取物的制备方法，其特征在于：所述制备方法为：称取青钱柳叶，加水提取，然后过滤，取滤液浓缩并干燥，得青钱柳提取物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述青钱柳叶与水的重量比为1:(5～15)；所述提取的次数为1～3次，提取的温度为60～100℃，提取的时间为每次1～3小时；所述青钱柳叶为青钱柳Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja的干燥叶或新鲜叶。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述提取的次数为2次，提取的温度为80℃，提取的时间为每次2小时；所述青钱柳叶与水的重量比为1:(6～8)，优选为第1次1:8，第2次1:6；所述青钱柳叶是粉碎后的青钱柳叶。
7.权利要求1～3任一项所述的青钱柳提取物在制备抗冠状病毒的药物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述药物具有冠状病毒中和活性；和/或，所述药物能够抑制冠状病毒引起的细胞病变。
9.根据权利要求7或8所述的用途，其特征在于：所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HcoV-229E、HcoV-NL63、HcoV-HKU1或HcoV-OC43，优选为SARS-CoV-2。
10.一种抗冠状病毒的药物，其特征在于：所述药物是以权利要求1～3任一项所述的青钱柳提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制得的制剂。
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