CN107245113B

CN107245113B - 具有抗癌作用的玉米须多糖提取物及其制备方法

Info

Publication number: CN107245113B
Application number: CN201710555236.5A
Authority: CN
Inventors: 周鸿立; 李亚平; 张扬
Original assignee: Jilin Institute of Chemical Technology
Current assignee: Chengdu Feiyou Trading Co ltd; Lu'an Yipro Technology Co ltd; Shanghai Zhicha Technology Co ltd
Priority date: 2017-07-10
Filing date: 2017-07-10
Publication date: 2020-12-11
Anticipated expiration: 2037-07-10
Also published as: CN107245113A

Abstract

本发明涉及一种从玉米须中提取的具有抗癌作用的玉米须多糖提取物及其制备方法，其特征是含有α‑型糖苷键的多聚糖，是溶于水的乳白色粉末，含有L‑鼠李糖、D‑木糖、D‑甘露糖、D‑葡萄糖、D‑果糖，其摩尔比为2.34:3.96:1.83:1.00:7.50。玉米须多糖对人宫颈癌细胞Hela的生长有抑制作用。

Description

具有抗癌作用的玉米须多糖提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种从玉米须中提取的具有抗癌活性作用的玉米须多糖提取物及制备方法。提取的多糖对人宫颈癌细胞Hela的生长具有抑制作用。背景技术

玉米须，又称玉麦须，蜀黍须、包谷须、玉米黍蕊，是禾本科玉蜀属植物玉米的花柱和柱头。玉米须是传统的中草药，为《中华人民共和国卫生部药材标准》1985版（一部）和《中国药典》2010年版中药一部收载品种。许多中医药典籍中都有玉米须的记载，玉米须味甘、淡，性平，且药理作用有很多，玉米须中含有多种化学成分，如多糖、氨基酸、维生素、挥发油、皂苷、植物甾醇、肌醇、生物碱、黄酮、隐黄素、尿囊素、有机酸、脂肪油、树胶状物、苦味糖苷、矿物质等多种活性成分。

越来越多的研究证实，从植物中提取的多糖由于具有提高机体免疫力的作用，对于宫颈癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、骨癌等有一定的疗效，能明显提高癌症晚期病人的生活质量。在过去的几十年中，人们已经从蘑菇、海藻、苔藓和植物中分离出了多种多糖，并显这些多糖均显示出强大的免疫调节活性和抗肿瘤活性。例如，任丹丹等研究黄秋葵多糖对人体卵巢癌细胞(OVCAR-3)、乳腺癌细胞(MCF-7)、宫颈癌细胞(Hela)、胃腺癌细胞(MCG-803)增殖的抑制作用。通过水提醇沉提取黄秋葵粗多糖(raw polysaccharide，RPS)，经DEAE-纤维素阴离子交换层析柱分离得到3种多糖洗脱组分E1、E2和E3；不同质量浓度黄秋葵多糖作用于人体肿瘤细胞72h，采用MTT法对其抗癌活性进行分析。结果显示：RPS和E1组分可抑制OVCAR-3细胞的生长，随质量浓度的增加细胞存活率降低，呈剂量依赖关系，最低可分别降至72.30%和52.31%；E3组分可抑制MCF-7、Hela和MCG-803细胞的生长，抑制作用呈剂量依赖关系，细胞的存活率最低可分别降至63.90%、63.51%和67.71%。黄秋葵多糖组分可抑制多种肿瘤细胞生长。

汤小军等以So荷瘤小鼠为模型，六月青多糖灌胃后观察小鼠移植瘤抑制率，采用双抗体夹心ABC—ELISA法检测Slso荷瘤小鼠血清中IL-2和TNF-α作用水平。结果六月青多糖可抑制小鼠Slso移植瘤的生长，其中高剂量组(1.2g/kg)抑制率为37.81%；六月青多糖能提高荷瘤小鼠血清中IL-2和TNF-α含量。结论六月青多糖体内抗肿瘤活性较强，其机制可能与增强机体的免疫功能有关。

因此具有抗癌活性的植物多糖越来越受关注在制药领域。未见均一玉米须多糖对宫颈癌细胞（Hela）的体外生长有抑制作用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新型的抗癌多糖-玉米须多糖，预防和治疗肿瘤；另一个目的是提供一种操作简单、效率高、耗能低、无污染的玉米须多糖制备工艺。

本发明的技术解决方案是：一种抑制人子宫颈癌细胞生长的多糖提取物，其特征是含有α-型糖苷键多聚糖，溶于水的乳白色粉末。

一种如权利要求1所述具有抗癌活性的玉米须多糖提取物的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）郊外采集的玉米须除去杂质、清洗后低温烘干、粉碎过60~80目筛备用；

（2）准确称取制得的玉米须粉末放入大圆底烧瓶中，加入料液比为1:35~1:45的水，浸泡过夜；

（3）上述浸泡过夜的玉米须80~100℃水浴提取0.5~1.5h，用尼龙布粗滤得滤液，滤渣继续加入料液比为1:35~1:45的水，80~100℃水浴再提取0.5~1.5h，用尼龙布粗滤得滤液合并滤液；

（4）上述所得的滤液60~65℃水浴浓缩至1/4~1/5体积，加入约90%的乙醇至酒精计显示为80%，静置过夜；

（5）上述静置过夜后的提取液用4000转/分的转速离心，滤渣50℃真空干燥即得玉米须水溶性多糖；

（6）将上述得到的粗多糖用水溶解，过AB-8大孔树脂层析柱，进行脱色处理；

（7）将步骤（6）脱色处理后的粗多糖溶液调pH到4.5~5.5，加入木瓜蛋白酶适量（酶底比为2.0~2.5mg/L），45~50℃恒温水浴1~1.2h，然后沸水浴4~6min灭酶，冷却至室温后4000r/min离心，取上清液用sevag溶液（氯仿：正丁醇（v:v）=5:1样液与试剂=2:1）除蛋白；

（8）将步骤（7）除蛋白处理后的多糖溶液用无水乙醇、乙醚、丙酮三次洗涤除杂；

（9）将步骤（8）洗涤后的溶液透析处理，用分子截留量为8000～14000的透析袋，透析液与缓冲液（蒸馏水）体积比为1:40~1:60，透析时间为6~8h、透析温度为25~30℃、更换缓冲液次数为3次；最后用真空干燥箱50℃干燥至粉末，得精制玉米须多糖；

（10）将步骤（9）所得总多糖用约1~2mL的初始洗脱剂完全溶解，微孔滤膜过滤后，加入DEAE-52的层析柱中，依次用不同浓度的NaCl溶液梯度洗脱，分管收集，并用α-萘酚-硫酸跟踪，将洗脱出来的样合并，旋蒸浓缩，真空干燥后即得玉米须多糖；

（11）将步骤（10）分离得到的多糖用蒸馏水溶解，上Sephadex LH-20层析柱，用甲醇洗脱，流速控制在0.5~0.8mL/min,分瓶收集，用苯酚硫酸法测其吸光度，绘制洗脱曲线，验证DEAE洗脱出来的多糖为单一多糖，多糖纯度达到90%以上；

（12）将分离纯化的多糖对人子宫颈癌细胞Hela做抗癌活性试验，结果证明玉米须多糖对人子宫颈癌细胞的生长有抑制作用。

本发明的优点：

（1）本发明涉及的玉米须多糖，具有抑制肿瘤细胞活性的作用，能够很好的预防和治疗肿瘤。

（2）本发明提供玉米须多糖提取工艺，是通过单因素试验和正交试验优化的最佳提取工艺，提取率高。水提醇沉法提取玉米须多糖操作简单，能耗低，所使用的水和乙醇都能够回收利用，无污染，能够进行大规模生产。

附图说明：

图1是玉米须多糖对人宫颈癌细胞Hela生长的抑制图，其中系列1为多糖对人宫颈癌细胞作用48h，系列2为多糖对人宫颈癌细胞作用72h。

具体实施方式：

实施例1：

（1）标准曲线的绘制和样品液的测定

精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖50 mg，加水溶解并定容至50ml容量瓶中，即得葡萄糖贮备液（1mg/ ml）。精密吸取贮备液3mL，4mL，5mL，6mL，7mL分别置50mL容量瓶中，加蒸馏水定容，摇匀。分别吸取上述溶液0.5 mL(含糖60～140μg/mL)，置于10 mL具塞试管中，加入5%苯酚溶液1mL，迅速加入3.5 mL浓硫酸，迅速摇匀,于40℃水浴放置30 min后，冷却至室温，在490 nm波长处测定吸收度值。

得到回归方程为:y=5.91x+0.0038，相关系数r=0.9999。在糖含量60～140μg/mL范围内，吸收度和糖浓度呈良好的线性关系。

（2）单因素探索实验

分别就加水量（15、20、30、40、50倍），提取时间（0.5、1、1.5、2、3.0小时），提取次数（1、2、3、4、5次），提取温度（80、85、90、95、100℃）4个因素试验。

实验方法：玉米须粉碎，过60~80目筛，干燥至恒重，精密称取玉米须放入圆底烧瓶中，加入一定量的水，浸泡过夜。恒温水浴锅加热，计时，离心，上清液抽滤，取滤液，再提取2次，水减半，合并3次滤液，浓缩，定容于250mL容量瓶。每个因素为一组做含量测定，即每组5个样。分别从250mL容量瓶中移液5mL至25mL容量瓶，定容，摇匀。从1-5号中个移液0.5mL至具塞试管，加1mL苯酚，3.5mL浓硫酸，40℃恒温水浴30min，自然冷却至室温，在490nm处测吸光度，在标准曲线上计算出浓度，最后计算出得率。用旋转蒸发仪浓缩多糖，90%的乙醇低温静置，醇沉24h，离心得沉淀物，真空干燥（温度为50℃，时间为4小时），得粗多糖。

单因素试验结果表明：最佳加水量为30倍，最佳提取时间为1h，最佳提取次数为3次，最佳提取温度为90℃。

实施例2：

正交实验设计：

Table 2.1 Fators and levels of orthogonal experiment

正交实验结果：

按照上述正交实验设计表中的实验方案进行正交实验操作，实验方法与单因素探索性实验方法一样。所得多糖吸光度A如下:

Table 2.2 The data processing of orthogonal experiment

实验结束后所得多糖产率见下表：

Table 2.3 The results of orthogonal experiment

实验结果：

最佳工艺曲线为90℃状态下料液比1:40，提取时间为30min，提取次数为3次，产率为11.38%。

实施例3：

（2）准确称取制得的玉米须粉末放入大圆底烧瓶中，加入料液比为1:25~1:35的水，浸泡过夜；

（3）上述浸泡过夜的玉米须80~100℃水浴提取0.5~1.5h，用尼龙布粗滤得滤液，滤渣继续加入料液比为1:25~1:35的水，80~100℃水浴再提取0.5~1.5h，用尼龙布粗滤得滤液合并滤液；

（5）上述静置过夜后的提取液用4000转/分的转速离心，滤渣50℃真空干燥即得玉米须粗多糖；

（6）将上述所得粗多糖用水溶解，过AB-8大孔树脂层析柱，进行脱色处理；

（7）上述脱色处理后的多糖溶液脱色处理后的粗多糖溶液调pH到4.5~5.5，加入木瓜蛋白酶适量（酶底比为2.0~2.5mg/L），45~50℃恒温水浴1~1.2h，然后沸水浴4~6min灭酶，冷却至室温后4000r/min离心用sevag（氯仿：正丁醇（v:v）=5:1样液与试剂=2:1）除蛋白；

（8）将上述除蛋白处理后的多糖溶液用无水乙醇、乙醚、丙酮3次洗涤除杂；

（9）将上述洗涤后的溶液透析处理，透析液与缓冲液（蒸馏水）体积比为1:40~1:60，透析时间为6~8h、透析温度为25~30℃、更换缓冲液次数为3次；，最后用真空干燥箱50℃干燥至粉末，得精制玉米须多糖；

（10）纯化后的多糖经过DEAE-52柱层析，分离纯化出均一的多糖；

（11）将上述分离得到的多糖用蒸馏水溶解，上Sephadex LH-20层析柱，用甲醇洗脱，流速控制在0.5~0.8mL/min,分瓶收集，用苯酚-硫酸法测其吸光度，绘制洗脱曲线，验证DEAE洗脱出来的多糖为单一多糖，多糖纯度达到90%以上。

实施例4：

将纯化分离出来的多糖做抗癌活性试验：

选用人子宫颈癌细胞Hela细胞株，DMEM培养基，CO₂培养箱，MTT法检测。

F₁₂/DMEM完全培养基的配置：量取44 mL F₁₂/DMEM培养基，加入5mL胎牛血清，500μL双抗与500 μL谷氨酰胺，0.22 μm滤器过滤除菌，4℃保存。

多糖培养基的配制：称取8mg玉米须多糖，溶于10mL细胞完全培养基中，震荡至多糖溶解，配制成800mg/L的多糖培养基，0.22 μm滤器过滤除菌，4℃保存。使用时用完全培养基将溶液稀释为浓度为 400 mg/L、200 mg/L与100 mg/L的多糖培养基。

MTT配置：称取0.5gMTT粉末，溶于100ML PBS溶液中，0.22μm滤器过滤除菌，避光-20℃保存。

将细胞丰度为80~90%的Hela细胞消化，制成细胞浓度为1×10⁴个/mL的细胞悬液。向96孔板每孔加入200μL上述细胞悬液（96孔板最外周孔加PBS溶液），待细胞贴壁后弃去培养基。实验设试验组（细胞、多糖、培养基，多糖浓度分别为800mg/L、400mg/L、200mg/L、100mg/L）、细胞对照组（细胞、培养基）、空白对照组（培养基），培养72h、48h后弃去培养基，加入MTT溶液，培养4h，弃去MTT溶液，每孔150μL DMSO，水平震荡10min后，酶标仪570nm处测吸光度OD值。

分别在800mg/L、400mg/L、200mg/L、100mg/L、细胞对照组组作用48h后，计算多糖对人子宫颈癌细胞的抑制率为37.77%、24.92%、15.9%、14.54%。说明玉米须多糖能够直接抑制Hela细胞活性，具有明显的抗肿瘤活性，且100mg/L时作用效果较好。

在玉米须多糖对癌细胞作用72h后再进行检测，计算玉米须多糖对Hela细胞体的抑制分别为32.56%、21.82%、21.90%、14.59%，试验结果同上，玉米须多糖具有明显的抗肿瘤活性，且100mg/L时作用效果较好。

作用48h或作用72h的实验结果相差不多，但都显示多糖浓度为800mg/L时，抗癌活性最强，如说明书附图1所示。

Claims

1.一种具有抑制人子宫颈癌细胞生长作用的玉米须多糖的制备方法，所述的玉米须多糖，通过如下步骤制备：

(1)郊外采集的玉米须除去杂质，清洗后晒干、粉碎过60～80目筛备用；

(2)准确称取步骤(1)制得的玉米须放入大圆底烧瓶中，加入料液比为1:35～1:45的水，浸泡过夜；

(3)将步骤(2)浸泡过夜的玉米须80～100℃水浴提取0.5～1.5h，用尼龙布粗滤得滤液，滤渣继续加入料液比为1:35～1:45的水，80-100℃水浴再提取0.5～1.5h，用尼龙布粗滤得滤液合并滤液；

(4)将步骤(3)所得的滤液60～65℃水浴浓缩至1/4～1/5体积，加入约90％的乙醇至酒精计显示为80％，静置过夜；

(5)将步骤(4)静置过夜后的提取液离心，滤渣干燥即得玉米须粗多糖，存留备用；

(6)将步骤(5)所得粗多糖用水溶解，过AB-8大孔树脂层析柱，进行脱色处理；

(7)将步骤(6)脱色处理后的粗多糖溶液调PH到4.5～5.5，加入木瓜蛋白酶适量酶底比为2.0～2.5mg/L，45～50℃恒温水浴1～1.2h，然后沸水浴4～6min灭酶，冷却至室温后3500～4000r/min离心，取上清液用sevag溶液氯仿：正丁醇v:v＝5:1样液与试剂＝2:1除蛋白；

(8)将步骤(7)除蛋白处理后的多糖溶液用无水乙醇、乙醚、丙酮三次洗涤除杂；

(9)将步骤(8)洗涤后的溶液透析处理，用分子截留量为8000～14000的透析袋，透析液与缓冲液蒸馏水体积比为1:40～1:60，透析时间为6～8h、透析温度为25～30℃、更换缓冲液次数为3次；最后用真空干燥箱50℃干燥至粉末，得精制玉米须多糖；

(10)将上述精制多糖用约1～2mL的初始洗脱剂完全溶解，微孔滤膜过滤后，加入DEAE-52的层析柱中，依次用不同浓度的NaCl溶液梯度洗脱，流速控制在1.0～1.5mL/min，分管收集，并用α-萘酚-硫酸跟踪，将洗脱出来的样合并，旋蒸浓缩，真空干燥后即得玉米须多糖；

(11)将上述分离得到的多糖用蒸馏水溶解，上Sephadex LH-20层析柱，用甲醇洗脱，流速控制在0.5～0.8mL/min,分瓶收集，用苯酚-硫酸法测其吸光度，绘制洗脱曲线，验证DEAE洗脱出来的多糖为单一多糖。

2.如权利要求1所述的玉米须多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中醇沉的乙醇浓度为80％，(5)中离心的转速为4000转/分，时间为10min。

3.如权利要求1所述的玉米须多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(10)中所用的层析柱为DEAE-52层析柱，分别用蒸馏水、0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.3、2.5、2.7、3.0、3.3M NaCl溶液各125mL相继洗脱，流速控制在1.0～1.5mL/min，分瓶收集，每5～6min收集一瓶。

4.如权利要求1所述的玉米须多糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(11)所用的层析柱为SephadexLH-20葡聚糖凝胶柱，用甲醇洗脱，流速控制在0.5～0.8mL/min，每5～6min收集一瓶。