CN105079074B - 甘薯提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甘薯提取物及其制备方法与应用。所述甘薯提取物的制备方法如下：1)将甘薯洗净、沥干、切片、干燥后粉碎，得甘薯粉；2)以氯仿和甲醇的混合溶液为提取剂对甘薯粉浸提，得甘薯粗提物；3)将甘薯粗提物溶于氯仿和甲醇混合液中，然后对得到的甘薯粗提物溶液进行以氯仿、丙酮为洗脱剂的固相萃取分离，收集丙酮洗脱组分；4)将丙酮洗脱组分通过以大孔吸附树脂为吸附剂的层析柱进行吸附层析，依次采用水、体积分数为20％‑40％、50％‑60％和70％‑80％的乙醇溶液洗脱，收集体积分数为70％‑80％的乙醇溶液的洗脱组分，即得。药效试验表明，该甘薯提取物对结肠癌细胞、乳腺癌细胞等均具有较强的增殖抑制能力。

Description

甘薯提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种甘薯提取物及其制备方法与应用。

背景技术

目前，癌症是导致人类死亡的主要疾病之一，世界卫生组织发布的最新数据显示，预计全球80-100目癌症发病率将从2012年的1400万急剧上升到2032年的2200万。而在同一期间，癌症死亡人数也将由每年820万人升高到每年1300万人。而我国的癌症在2012年的发病个案几乎占了全球一半，高居第一位。传统的癌症治疗方法(如放疗和化疗)在一定程度上可有效杀伤癌细胞，但是也会损伤及破坏正常细胞。与传统的癌症治疗相比，天然抗癌活性成分的优点就在于高活性、以及无或低不良反应。

甘薯(Ipomoea batatas)是旋花科甘薯属的一个重要栽培品种，原产于南美洲，由于其高产稳产并具有抗干旱、耐瘠薄、适应性强、营养丰富等特点，在我国被大量种植，年产量约0.8亿吨，仅次于水稻、小麦和玉米，占世界甘薯总产量的80％以上。经研究发现，甘薯不仅营养丰富，同时具有很高的药用价值。已有研究报道指出，从海藻、菠菜和灵芝孢子中分离出的活性物质对乳腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺腺癌和胃癌细胞等均有一定的抑制作用。然而，有关甘薯抗癌提取物的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种甘薯提取物及其制备方法。

本发明所提供的甘薯提取物是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

1)原料预处理：将收获的新鲜甘薯洗净、沥干、切片、干燥后粉碎，得甘薯粉；

2)甘薯粗提物的提取：以氯仿和甲醇的混合溶液为提取剂对所述甘薯粉进行提取，收集提取液，并除去所述提取液中的提取剂得到甘薯粗提物；

3)甘薯粗提物的初步分离：对步骤2)中所制得的甘薯粗提物进行固相萃取分离，得到初步纯化的甘薯粗提物；

所述固相萃取分离的步骤为：将所述甘薯粗提物加入固相萃取柱中，依次以氯仿和丙酮为洗脱剂进行洗脱，收集丙酮洗脱组分，并除去其中所含的溶剂，得到所述初步纯化的甘薯粗提物；

4)甘薯提取物的制备：将步骤3)中所制得的初步纯化的甘薯粗提物溶于甲醇中，得到甲醇溶液，将所述甲醇溶液通过以大孔吸附树脂为吸附剂的层析柱进行吸附层析，得到甘薯提取物；

所述吸附层析中依次采用水、体积分数为20％-40％的乙醇溶液、体积分数为50％-60％的乙醇溶液、体积分数为70％-80％的乙醇溶液对层析柱进行洗脱，收集体积分数为70％-80％的乙醇溶液的洗脱组分，并除去其中所含的溶剂，得到所述甘薯提取物。

其中，上述方法步骤1)中，所述新鲜甘薯可为任一甘薯品种，优选徐薯18。

步骤1)中，所述干燥的方式具体可为热风干燥或冷冻干燥，优选冷冻干燥。

所述冷冻干燥在真空冷冻干燥机中进行。所述冷冻干燥的条件如下：真空度为50-100Pa，温度为-60—-70℃，时间为36-60小时，优选48小时。

所述冷冻干燥前还包括在-20℃—-40℃冰箱里预冻24h-36h的步骤。

所述粉碎是在万能粉碎机中进行的，粉碎后所得甘薯粉的粒径为80-100目。

上述方法步骤2)中，所述提取剂中氯仿和甲醇的体积比可为1:1-3:1，具体可为1:1、2:1或3:1。

所述提取的方法具体可为浸提法。

所述浸提至少进行一次，具体可进行2-5次，优选进行3次。每次浸提的温度为-4—-20℃，时间为12-48小时，优选24小时。每次浸提时，所述甘薯粉与提取剂的配比为1g:(2-5)mL，具体可为1g:2mL、1g:3mL或1g:5mL。

当所述浸提进行两次或两次以上时，所述步骤2)中还包括合并提取液的步骤。

步骤2)中所述提取液中所含的提取剂可通过旋转蒸发的方法去除，旋转蒸发的条件为：温度为35-40℃，转速为50-70rpm，真空度为0.05-0.09MPa。。

上述方法步骤3)中，所述固相萃取分离之前，还包括：将所述甘薯粗提物溶于氯仿和甲醇混合液中，制备甘薯粗提物溶液的步骤。所述氯仿和甲醇混合液中，氯仿和甲醇的体积比为1:1-3:1，具体可为1:1、2:1或3:1；所述甘薯粗提物与氯仿和甲醇混合液的配比可为1g:(1-3)mL。

所述固相萃取柱具体可为反相萃取柱、键合柱或硅胶柱，优选硅胶柱；所述固相萃取柱的规格为：(3-5)mg/20mL。

步骤3)中每种洗脱剂的用量均为3-5倍柱体积，优选3倍柱体积。

上述方法步骤4)中，所述甲醇溶液中初步纯化的甘薯粗提物与甲醇的配比为1g：10mL。所述大孔树脂的型号可为D4020、D101和HP-20，优选D4020。

所述大孔树脂在使用前需进行活化，具体活化步骤如下：称取大孔树脂，用体积分数为95％乙醇溶液浸泡24-48h，蒸馏水反复清洗至无醇味，加入2mol/L NaOH溶液浸泡4-6h，用蒸馏水洗至中性，加入2mol/L HCl溶液浸泡4-6h，用蒸馏水洗至中性，抽滤去除水分，即得；

其中，所述大孔树脂与体积分数为95％的乙醇溶液、2mol/L NaOH溶液和2mol/LHCl溶液的配比为分别为1g：(5-10)mL。

步骤4)中，所述吸附层析中，所述水的用量为所述层析柱柱体积的2-5倍，具体可为5倍或4倍柱体积。

所述体积分数为20％-40％的乙醇溶液、体积分数为50％-60％的乙醇溶液和体积分数为70％-80％的乙醇溶液的用量均为所述层析柱柱体积的3-5倍，具体可为4倍或5倍柱体积。

所述吸附层析的洗脱条件可具体选自下述任意一种：

1)依次采用水、体积分数为20％的乙醇溶液、体积分数为50％的乙醇溶液、体积分数为70％的乙醇溶液对层析柱进行洗脱，收集体积分数为70％的乙醇溶液的洗脱组分；

2)依次采用水、体积分数为40％的乙醇溶液、体积分数为60％的乙醇溶液、体积分数为80％的乙醇溶液对层析柱进行洗脱，收集体积分数为80％的乙醇溶液的洗脱组分；

3)依次采用水、体积分数为30％的乙醇溶液、体积分数为50％的乙醇溶液、体积分数为75％的乙醇溶液对层析柱进行洗脱，收集体积分数为75％的乙醇溶液的洗脱组分。

所述洗脱的流速为0.5-2.0mL/min，具体可为1.0mL/min或2.0mL/min。

步骤4)中，所述吸附层析中上样的方式具体采用干法上样。

具体方法如下：将所述甲醇溶液加入到活化的大孔吸附树脂中，减压浓缩至干，使所述初步纯化的甘薯粗提物完全吸附于大孔吸附树脂上，得到样品大孔吸附树脂混合物；然后将所述样品大孔吸附树脂混合物加于大孔吸附树脂层析柱上层，完成上样操作。

上述方法中，所述甲醇溶液与活化的大孔吸附树脂的配比为(10-20)mL：1g；所述大孔吸附树脂层析柱的规格(内径×长度)为：(15-35)×(300-500)mm，具体为15×400mm、20×500mm、30×500mm。所述大孔吸附树脂层析柱中空白大孔吸附树脂(即未与样品混合的大孔吸附树脂)与样品大孔吸附树脂混合物的体积比可为3：1-5：1，优选5：1。

本发明的再一个目的是提供所述甘薯提取物的应用。

本发明所提供的甘薯提取物的应用是其在下述方面的应用：

1)制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂中的应用；2)制备真核生物肿瘤细胞粘附抑制剂中的应用；3)制备真核生物肿瘤细胞迁移抑制剂中的应用；4)在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。

所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为乳腺癌细胞或结肠癌细胞；所述乳腺癌细胞具体为人乳腺癌细胞Bcap-37，所述结肠癌细胞具体为人结肠癌细胞HT-29。

所述肿瘤为癌；所述癌为乳腺癌或结肠癌。

以本发明提供的甘薯提取物为活性成分制备的预防和/或治疗肿瘤药物或真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂或真核生物肿瘤细胞粘附抑制剂或真核生物肿瘤细胞迁移抑制剂也属于本发明的保护范围。

所述预防和/或治疗肿瘤药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

以甘薯提取物为活性成分制备的预防和/或治疗肿瘤药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明提供的甘薯提取物及其制备方法具有以下优点：

(1)该方法操作简单，可实现规模化批量生产；

(2)该方法所用到的试剂、材料、仪器设备均是常见规格，生产成本低，且无毒环保；

(3)该方法所制得的抗癌活性物质，对结肠癌细胞、乳腺癌细胞等均具有较强的增殖抑制能力，具有较高的商业应用开发价值。

附图说明

图1为甘薯粗提物与甘薯提取物对结肠癌细胞HT-29的增殖抑制作用；图中：大写字母代表不同浓度对抑制细胞增殖效果差异性，小写字母代表不同处理时间对抑制细胞增殖效果差异性。

图2为甘薯粗提物与甘薯提取物对乳腺癌细胞Bcap-37的增殖抑制作用；图中：大写字母代表不同浓度对抑制细胞增殖效果差异性，小写字母代表不同处理时间对抑制细胞增殖效果差异性。

图3为甘薯提取物对HT-29细胞增殖的影响(结晶紫法)。

图4为甘薯提取物对Bcap-37细胞增殖的影响(结晶紫法)。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

结肠癌细胞HT-29、乳腺癌细胞Bcap-37均购自中国医学科学院基础医学研究所。产品编号分别为3111C0001CCC000109和3131C0001000700009。

实施例1：甘薯粉的制备

将新鲜的甘薯1000g洗净、沥干、切片后，放入托盘中于-40℃冰箱里预冻24h后，取出放入真空冷冻干燥机，在50Pa真空度，-66℃下干燥处理48小时后，采用万能粉碎机粉碎，制得80-100目的甘薯粉。

实施例2：甘薯粉的制备

将新鲜的甘薯1500g洗净、沥干、切片后，放入托盘中于-20℃冰箱里预冻36小时，取出放入真空冷冻干燥机，在100Pa真空度，-70℃干燥处理48小时后，采用万能粉碎机粉碎，制得80-100目甘薯粉。

实施例3：甘薯粗提物的制备

取实施例1得到的甘薯粉100g，加入3倍体积(300mL)的氯仿和甲醇混合液(2:1，v/v)，在-4℃条件下浸提24小时，浸提后过滤，收集上清液，残渣加入3倍体积(300mL)的氯仿和甲醇混合液，在-4℃条件下浸提2小时后，重复提取2次，合并上清液，在温度为35℃，真空度为0.09MPa的条件下，以转速为70rpm旋转蒸发去除有机试剂(氯仿和甲醇)后即得2g甘薯粗提物。

实施例4：甘薯粗提物的制备

取实施例2得到的甘薯粉200g，加入2倍体积(400mL)的氯仿和甲醇混合液(3:1，v/v)，在-4℃条件下浸提12小时，浸提后过滤，收集上清液，残渣加入2倍体积(400mL)的氯仿和甲醇混合液，在-4℃条件下浸提3小时后，重复提取2次，合并上清液，在温度为40℃，真空度为0.08MPa的条件下，以转速为50rpm旋转蒸发去除有机试剂(氯仿和甲醇)后即得4g甘薯粗提物。

实施例5：甘薯粗提物的制备

取实施例1得到的甘薯粉100g，加入5倍体积(500mL)的氯仿和甲醇混合液(1:1，v/v)，在-4℃条件下浸提36小时，浸提后过滤，收集上清液，残渣加入2倍体积(200mL)的氯仿和甲醇混合液，在-20℃条件下浸提3小时后，重复提取2次，合并上清液，在温度为35℃，真空度为0.06MPa的条件下，以转速为60rpm旋转蒸发去除有机试剂(氯仿和甲醇)后即得3g甘薯粗提物。

实施例6：甘薯粗提物的初步分离

取实施例3得到的甘薯粗提物15g，溶于150mL氯仿和甲醇混合液(2:1，v/v)，得到甘薯粗提物溶液；然后将该甘薯粗提物溶液加入到硅胶柱(硅胶柱规格为5mg/20mL，填料为100目的硅胶)中，利用3倍柱体积的氯仿、丙酮依次进行洗脱，收集丙酮洗脱组分，在温度为35℃，真空度为0.07MPa的条件下，以转速为70rpm旋转蒸发去除丙酮，得到5g初步纯化的甘薯粗提物。

实施例7：甘薯粗提物的初步分离

取实施例4得到的甘薯粗提物10g，溶于100mL氯仿和甲醇混合液(1:1，v/v)中，得到甘薯粗提物溶液；然后将该甘薯粗提物溶液加入到硅胶柱(硅胶柱规格为3mg/20mL，填料为100目的硅胶)中，利用5倍柱体积的氯仿、丙酮和依次进行洗脱，收集丙酮洗脱组分，在温度为35℃，真空度为0.03MPa的条件下，以转速为60rpm旋转蒸发去除丙酮，得到3g初步纯化的甘薯粗提物。

实施例8：甘薯粗提物的初步分离

取实施例5得到的甘薯粗提物10g，溶于50mL氯仿和甲醇混合液(3:1，v/v)，中，得到甘薯粗提物溶液；然后将该甘薯粗提物溶液加入到硅胶柱(硅胶柱规格为4mg/20mL，填料为100目的硅胶)中，利用4倍柱体积的氯仿、丙酮和依次进行洗脱，收集丙酮洗脱组分，在温度为40℃，真空度为0.05MPa的条件下，以转速为50rpm旋转蒸发去除丙酮，得到3g初步纯化的甘薯粗提物。

实施例9：甘薯提取物的制备

取实施例6得到的初步纯化的甘薯粗提物10g，溶于100mL甲醇中，加入100gD4020大孔吸附树脂，减压浓缩至干，使所述初步纯化的甘薯粗提物完全吸附于大孔吸附树脂上，得到样品大孔吸附树脂混合物，将所述样品大孔吸附树脂混合物加于大孔吸附树脂层析柱(规格(内径×长度)15×400mm)上层，其中空白大孔吸附树脂(即未与样品混合的大孔吸附树脂)与样品大孔吸附树脂混合物体积比为5:1，分别以5倍柱体积的蒸馏水、体积分数为40％的乙醇溶液、体积分数为60％的乙醇溶液、体积分数为80％的乙醇溶液依次进行洗脱，采用数显恒流泵控制流速为1.0mL/min，收集体积分数为80％的乙醇溶液的洗脱组分，浓缩除去有机试剂后，-66℃冻干36小时，得到2g甘薯提取物。

实施例10：甘薯提取物的制备

取实施例7得到的初步纯化的甘薯粗提物5g，溶于50mL甲醇中，加入50g D4020大孔吸附树脂，减压浓缩至干，使所述初步纯化的甘薯粗提物完全吸附于大孔吸附树脂上，得到样品大孔吸附树脂混合物，将所述样品大孔吸附树脂混合物加于大孔吸附树脂层析柱(规格(内径×长度)(20×500mm))上层，其中空白大孔吸附树脂(即未与样品混合的大孔吸附树脂)与样品大孔吸附树脂混合物体积比为3:1，分别以4倍柱体积的蒸馏水、体积分数为20％的乙醇溶液、体积分数为50％的乙醇溶液、体积分数为70％的乙醇溶液依次进行洗脱，采用数显恒流泵控制流速为2.0mL/min，收集体积分数为70％的乙醇溶液的洗脱组分，浓缩除去有机试剂后，-60℃冻干24小时，得到1g甘薯提取物。

实施例11：甘薯提取物的制备

取实施例8得到的初步纯化的甘薯粗提物5g，溶于50mL甲醇中，加入80g D4020大孔吸附树脂，减压浓缩至干，使所述初步纯化的甘薯粗提物完全吸附于大孔吸附树脂上，得到样品大孔吸附树脂混合物，将所述样品大孔吸附树脂混合物加于大孔吸附树脂层析柱(规格(内径×长度)(30×500mm))上层，其中空白大孔吸附树脂(即未与样品混合的大孔吸附树脂)与样品大孔吸附树脂混合物体积比为4:1，分别以3倍柱体积的蒸馏水、体积分数为30％的乙醇溶液、体积分数为50％的乙醇溶液、体积分数为75％的乙醇溶液依次进行洗脱，采用数显恒流泵控制流速为0.5mL/min，收集体积分数为75％的乙醇溶液的洗脱组分，浓缩除去有机试剂后，-70℃冻干24小时，得到1g甘薯提取物。

实施例12：癌细胞存活率测定

为观察甘薯提取物对癌细胞的毒性，添加1.00mg/mL实施例9制备的甘薯提取物的溶液(溶剂为添加千分之一DMSO的培养基)于培养基中作用48h后，用PBS(磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗液清洗两次，胰酶消化后，加入一定量的McCoy’s5A培养基终止消化。取100μL细胞悬液，加入100μL用PBS配制的0.40％台盼蓝染液，混合后于血球计数板上分别计算细胞总数和被染蓝的细胞个数，用下列公式计算存活细胞比率：

存活细胞比率＝[(细胞总数-蓝色细胞数)/细胞总数]×100％

结果如表1所示

表1甘薯提取物对结肠癌细胞HT-29和乳腺癌细胞Bcap-37存活率的影响(％)

表1中，小写字母表示甘薯提取物与空白组之间细胞毒性的差异性。

由表1可知：添加1000μg·mL^-1甘薯提取物于培养基中分别作用48h后，癌细胞HT-29和Bcap-37的存活率与未添加甘薯提取物的对照组相比无显著变化(P＜0.05)。说明在甘薯提取物浓度低于1000μg·mL^-1及作用时间少于48h时，对上述两种癌细胞均无毒性。

实施例13：采用MTT法测定所述甘薯粗提物与甘薯提取物对癌细胞的增殖抑制作用比较

以每孔5×10⁴个浓度的细胞(结肠癌细胞HT-29或乳腺癌细胞Bcap-37)接种于96孔板，用培养基调节每孔为200μL，在37℃和5％的CO₂浓度的恒温培养箱中培养24h。形成的单层细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗以除去未贴壁细胞。然后分别添加不同浓度(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL和1000μg/mL)的实施例3制备的甘薯粗提物溶液和实施例9制备的甘薯提取物溶液(溶剂均为添加千分之一DMSO的培养基)，继续培养48h。培养完成后，用100μL新鲜的培养基更新，每孔加20μL的5.0mg/mL的MTT溶液后继续孵育4h，吸管吸弃孔内培养基，每孔加150μL的DMSO，轻微振荡约10min使产生的紫色结晶物充分融解。再用酶标仪于492nm下测定吸光值。甘薯粗提物及甘薯提取物对癌细胞的增殖抑制率均采用下列公式进行计算：

细胞增殖抑制率(％)＝(1-实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100。

结果如图1、表2和图2、表3所示。

图1为甘薯粗提物与甘薯提取物对结肠癌细胞HT-29的增殖抑制作用对比图。

表2甘薯粗提物与甘薯提取物对HT-29细胞的增殖抑制作用对比(％)

注：大写字母代表不同浓度对抑制细胞增殖效果差异性，小写字母代表不同物质对抑制细胞增殖效果差异性。

由图1和表2可知：所述甘薯粗提物和甘薯提取物对结肠癌细胞HT-29增殖均具有抑制作用，且甘薯提取物对结肠癌细胞HT-29的增殖抑制作用显著高于甘薯粗提物。

图2为甘薯粗提物与甘薯提取物对乳腺癌细胞Bcap-37的增殖抑制作用对比图。

表3甘薯粗提物与甘薯提取物对Bcap-37细胞的增殖抑制作用对比(％)

注：大写字母代表不同浓度对抑制细胞增殖效果差异性，小写字母代表不同物质对抑制细胞增殖效果差异性。

由图2和表3可知：所述甘薯粗提物和甘薯提取物对乳腺癌细胞Bcap-37增殖均具有抑制作用，且甘薯提取物对乳腺癌细胞Bcap-37的增殖抑制作用显著高于甘薯粗提物。

实施例14：采用MTT法测定所述甘薯提取物对癌细胞的增殖抑制作用

以每孔5×10⁴个浓度的细胞(乳腺癌细胞Bcap-37或结肠癌细胞HT-29)接种于96孔板，用培养基调节每孔为200μL，在37℃和5％的CO₂浓度的恒温培养箱中培养24h。形成的单层细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗以除去未贴壁细胞。然后添加不同浓度(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL和1000μg/mL)的实施例9制备的甘薯提取物溶液(溶剂为添加千分之一DMSO的培养基)，继续培养24h、36h和48h。培养完成后，用100μL新鲜的培养基更新，每孔加20μL的5.0mg/mL的MTT溶液后继续孵育4h，吸管吸弃孔内培养基，每孔加150μL的DMSO，轻微振荡约10min使产生的紫色结晶物充分融解。再用酶标仪于492nm下测定吸光值。甘薯提取物对癌细胞的增殖抑制率采用下列公式进行计算：

细胞增殖抑制率(％)＝(1-实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100。

结果如表4和表5所示。

表4MTT法测定甘薯提取物对HT-29癌细胞增殖的抑制作用(％)

注：大写字母代表不同浓度对抑制细胞增殖效果差异性，小写字母代表不同处理时间对抑制细胞增殖效果差异性。

由表4可知：所述甘薯提取物对结肠癌细胞HT-29的增殖抑制作用呈浓度及时间依赖性，在分别采用不同浓度提取物对HT-29细胞进行处理时，甘薯提取物对HT-29的抑制增殖作用均显著增强(P＜0.05)。提取物浓度为1000μg·mL^-1、处理时间48h时，甘薯提取物对HT-29细胞增殖的抑制率为92.66％；与甘薯粗提物相比，甘薯提取物对细胞增殖抑制率提高了23.42％。不同浓度(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL和1000μg/mL)下，甘薯提取物对HT-29的抑制增殖作用均显著高于甘薯粗提物(P＜0.05)。对于甘薯提取物而言，随着处理时间的延长，抑制率增大，当以1000μg·mL^-1处理48h时，抑制率达到92.66％。

表5MTT法测定甘薯提取物对乳腺癌细胞Bcap-37增殖的抑制作用(％)

注：大写字母代表不同浓度对抑制细胞增殖效果差异性，小写字母代表不同处理时间对抑制细胞增殖效果差异性。

由表5可知：所述甘薯提取物对乳腺癌细胞Bcap-37的增殖抑制作用呈浓度及时间依赖性，在分别采用不同浓度甘薯提取物(50-1000μg·mL^-1)对Bcap-37细胞进行处理时，与甘薯粗提物相比，甘薯提取物对Bcap-37的抑制增殖作用均显著增强(P＜0.05)。甘薯提取物浓度为1000μg·mL^-1，处理时间48h时，其对Bcap-37细胞增殖抑制率为90.37％；与甘薯粗提物相比，甘薯提取物对细胞增殖抑制率提高了35.71％。对于甘薯提取物，随着处理时间的延长，抑制率增大，处理时间48h时抑制率均达到最大，当以1000μg·mL^-1处理48h时，抑制率达到最高达到90.37％。

实施例15：结晶紫染色法测定所述甘薯提取物对癌细胞的增殖抑制作用

用6孔板培养细胞，调节细胞(乳腺癌细胞Bcap-37或结肠癌细胞HT-29)密度为每孔1×10⁶个，细胞培养方法与上述细胞增殖测定所述的方法相同。再加入1.0mL新鲜配制的样品(0.1mg/mL、0.4mg/mL、1mg/mL实施例9制备的甘薯提取物(溶剂为添加千分之一DMSO的培养基))和培养基，除空白对照外，其余都含有100ng/mL佛波酯(PMA)。对于用甘薯提取物处理24h或是对照实验的细胞，抽去培养基，并用冰温的PBS清洗细胞两次。加入1mL含0.2％的结晶紫(含10％甲醛的磷酸缓冲液)对细胞进行染色，室温下反应2min。然后将染色液除去，用冰温的PBS清洗细胞两次。粘附在孔上的细胞在显微镜测定并拍照。

结果如图3和图4所示。

图3为甘薯提取物对HT-29细胞增殖的影响(结晶紫法)。

由图3可知，甘薯提取物随着浓度增大，染色的活HT-29细胞数量明显减少，甘薯提取物对HT-29细胞的增殖抑制作用呈浓度依赖性；这与MTT的测定结果相一致。

图4为甘薯提取物对Bcap-37细胞增殖的影响(结晶紫法)。

由图4可知，甘薯提取物对Bcap-37的影响也呈现一定的浓度依赖性；这与MTT的测定结果相一致。

实施例16：甘薯提取物抗癌细胞粘附测定

将培养好的HT-29和Bcap-37细胞消化后，反复吹打使其分散均匀，用倒置显微镜计数后，调节细胞浓度。以密度为5×10⁵/孔的细胞悬液密度接入12孔细胞培养板，1.0mL/孔，于37℃、5％的CO₂培养箱中培养24h后，吸弃培养基，用PBS清洗。再加入1.0mL新鲜配制的样品(0.1mg/mL、0.4mg/mL、1mg/mL实施例9制备的甘薯提取物(溶剂为添加千分之一DMSO的培养基))和培养基，除空白对照外，其余都含有100ng/mL佛波酯(PMA)。于37℃及5％的CO₂培养箱中再培养24h，吸弃培养液，用PBS冲洗2次，每孔加入600uL的胰酶消化3min。然后把12孔板置于室温100rpm下摇动，计算癌细胞完全消化下来的时间(min)。

结果如表6所示。

表6甘薯提取物对HT-29和Bcap-37细胞粘附的抑制作用(min)

注：大写字母代表不同浓度对抑制细胞增殖效果差异性，小写字母代表对不同细胞增殖抑制效果差异性。

由表6可知：经所述甘薯提取物作用HT-29和Bcap-37细胞24h后，HT-29和Bcap-37细胞完全消化下来的时间均显著小于加入PMA而不加甘薯提取物处理的对照组；随着甘薯提取物浓度(100μg/mL、400μg/mL和1000μg/mL)的增大，癌细胞的粘附作用显著减弱(P＜0.05)；在提取物浓度小于400μg/mL时，细胞完全消化下来的时间仍显著小于对照组(P＜0.05)。对于HT-29细胞，甘薯提取物浓度为1000μg/mL时，甘薯提取物处理组细胞完全消化下来的时间为6.07min，与对照组相比缩短了49.5％；对于Bcap-37细胞，甘薯提取物浓度为1000μg/mL时，甘薯提取物处理组细胞完全消化下来的时间为5.53min，与对照组相比缩短了50.0％。

实施例17：划痕愈合试验测定甘薯提取物对癌细胞迁移的影响

分别将密度为5×10⁵/孔的HT-29和Bcap-37细胞悬液放入12孔细胞培养板中，1.0mL/孔，于37℃及5％的CO₂培养箱中培养24h。吸弃培养基，在单层平铺长满的细胞上用黄色枪头划痕。脱落下来的细胞用PBS溶液冲洗两次，吸净。再加入1.0mL新鲜配制的样品(0.1mg/mL、0.4mg/mL和1mg/mL实施例9制备的甘薯提取物(溶剂为添加千分之一DMSO的培养基)和培养基，除空白对照外，其余都含有100ng/mL佛波酯(PMA)。将细胞置于电子显微镜下放大100倍拍照。于37℃及5％的CO₂培养箱中再培养24h，用PBS冲洗2次，用4％的多聚甲醛固定，将细胞置于电子显微镜下放大100倍拍照。用NIH ImageJ软件处理0h和24h时的照片，测量划痕的宽度L₀和L₂₄，利用下列公式计算细胞迁移率：

细胞迁移率(％)＝(L₀-L₂₄)/L₀

结果如表6和表7所示。

表7甘薯提取物对HT-29细胞迁移的抑制作用(％)

注：小写字母表示不同浓度抑制细胞迁移的差异性。

由表7可知：经所述甘薯提取物作用的HT-29细胞，细胞的迁移率显著小于对照组(加入PMA而不加甘薯提取物)；甘薯提取物处理组中，随着浓度(100μg/mL、400μg/mL和1000μg/mL)的增大，癌细胞的迁移率显著减低(P＜0.05)；与对照组相比，癌细胞迁移率显著降低(P＜0.05)。对于HT-29细胞，对照组细胞迁移率为34.19％，而1000μg/mL的甘薯提取物处理组细胞迁移率为8.06％，由此表明甘薯提取物可以抑制HT-29癌细胞的迁移。

表8甘薯提取物对Bcap-37细胞迁移的抑制作用(％)

注：小写字母表示不同浓度抑制细胞迁移的差异性。

由表8可知：经所述甘薯提取物作用的Bcap-37细胞，细胞的迁移率显著小于对照组(加入PMA而不加甘薯提取物)；甘薯提取物处理组中，随着浓度(100μg/mL、400μg/mL和1000μg/mL)的增大，癌细胞的迁移率显著减低(P＜0.05)；与对照组相比，癌细胞迁移率显著降低(P＜0.05)。对于Bcap-37细胞，对照组细胞迁移率为54.19％，而1000μg/mL的甘薯提取物处理组细胞迁移率为20.04％，由此表明甘薯提取物可以抑制Bcap-37癌细胞的迁移。

实施例18：MTT法测定所述甘薯提取物对癌细胞的增殖抑制作用

以每孔5×10⁴个的浓度将细胞(人乳腺癌细胞Bcap-37或人结肠癌细胞HT-29)接种于96孔板，用培养基调节每孔为200μL，在37℃和5％的CO₂浓度的恒温培养箱中培养24h。形成的单层细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗以除去未贴壁细胞。然后分别添加1000μg/mL的实施例10和实施例11制备的甘薯提取物溶液(溶剂为添加千分之一DMSO的培养基)，继续培养48h。培养完成后，用100μL新鲜的培养基更新，每孔加20μL的5.0mg/mL的MTT溶液后继续孵育4h，吸管吸弃孔内培养基，每孔加150μL的DMSO，轻微振荡约10min使产生的紫色结晶物充分融解。再用酶标仪于492nm下测定吸光值。甘薯提取物对癌细胞的增殖抑制率采用下列公式进行计算：

细胞增殖抑制率(％)＝(1-实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100。

结果如表9所示。

表9甘薯提取物对HT-29和Bcap-37细胞增殖的抑制作用(％)

注：小写字母表示不同洗脱梯度得到的甘薯提取物抑制癌细胞的差异性；表9中的结果是加入1000μg/mL提取物的抑制率数据。

由表9可知，所述甘薯提取物对HT-29和Bcap-37癌细胞处理48小时，对这两种癌细胞均具有显著地抑制作用。

Claims (10)

1.一种制备甘薯提取物的方法，包括下述步骤：

1)原料预处理：将甘薯洗净、沥干、切片、干燥后粉碎，得甘薯粉；

2)甘薯粗提物的提取：以氯仿和甲醇的混合溶液为提取剂对所述甘薯粉进行提取，收集提取液，并除去所述提取液中的提取剂得到甘薯粗提物；

3)甘薯粗提物的初步分离：对步骤2)中所制得的甘薯粗提物进行固相萃取分离，得到初步纯化的甘薯粗提物；

所述固相萃取分离的步骤为：将所述甘薯粗提物加入固相萃取柱中，依次以氯仿、丙酮为洗脱剂进行洗脱，收集丙酮洗脱组分，并除去其中所含的溶剂，得到所述初步纯化的甘薯粗提物；

4)甘薯提取物的制备：将步骤3)中所得到的初步纯化的甘薯粗提物溶于甲醇中，得到甲醇溶液，将所述甲醇溶液通过以大孔吸附树脂为吸附剂的层析柱进行吸附层析，得到甘薯提取物；

所述吸附层析中依次采用水、体积分数为20％-40％的乙醇溶液、体积分数为50％-60％的乙醇溶液、体积分数为70％-80％的乙醇溶液对层析柱进行洗脱，收集体积分数为70％-80％的乙醇溶液的洗脱组分，并除去其中所含的溶剂，得到所述甘薯提取物；

所述步骤2)中，所述提取剂中氯仿和甲醇的体积比为1:1-3:1；

所述步骤2)中，所述提取的方法为浸提法；

所述浸提至少进行一次；每次浸提的温度为-4--20℃，时间为12-48小时；

所述步骤3)中，所述固相萃取柱为硅胶柱；每种洗脱剂的用量均为3倍柱体积；

所述步骤4)中，所述大孔树脂的型号为D4020；

所述吸附层析中，所述水的用量为所述层析柱柱体积的2-5倍；

所述体积分数为20％-40％的乙醇溶液、体积分数为50％-60％的乙醇溶液和体积分数为70％-80％的乙醇溶液的用量均为所述层析柱柱体积的3-5倍；

所述洗脱的流速为0.5-2.0mL/min。

2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述甘薯为徐薯18；

所述干燥的方式为热风干燥或冷冻干燥；

所述粉碎后所得甘薯粉的粒径为80-100目。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述干燥的方式为冷冻干燥；

所述冷冻干燥在真空冷冻干燥机中进行；所述冷冻干燥的条件如下：真空度为50-100Pa，温度为-60－-70℃，时间为36-60小时；

所述冷冻干燥前还包括在-20℃--40℃冰箱里预冻24h-36h的步骤。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，每次浸提时，所述甘薯粉与提取剂的配比为1g:(2-5)mL。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述浸提进行2-5次；每次浸提的时间为24小时。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，所述固相萃取分离之前，还包括：将所述甘薯粗提物溶于氯仿和甲醇混合液中，制备甘薯粗提物溶液的步骤；

所述氯仿和甲醇的混合液中，氯仿和甲醇的体积比为1:1-3:1；

所述甘薯粗提物与氯仿和甲醇的混合液的配比为1g:(1-5)mL。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中，所述甲醇溶液中初步纯化的甘薯粗提物与甲醇的配比为1g：10mL。

8.权利要求1-7中任一项所述方法制备得到的甘薯提取物。

9.权利要求8中所述的甘薯提取物在制备下述产品中的应用：1)真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂；2)真核生物肿瘤细胞粘附抑制剂；3)真核生物肿瘤细胞迁移抑制剂；4)预防和/或治疗肿瘤药物；所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述肿瘤为癌；所述癌细胞为乳腺癌细胞或结肠癌细胞；所述癌为乳腺癌或结肠癌。

10.一种产品，其活性成分为权利要求8中所述的甘薯提取物；

其中，所述产品为：1)真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂；2)真核生物肿瘤细胞粘附抑制剂；3)真核生物肿瘤细胞迁移抑制剂；4)预防和/或治疗肿瘤药物；所述真核生物为哺乳动物；所述肿瘤细胞为癌细胞；所述肿瘤为癌；所述癌细胞为乳腺癌细胞或结肠癌细胞；所述癌为乳腺癌或结肠癌。