CN103878036A

CN103878036A - 一种强极性碱性化合物的分离分析或分离制备方法

Info

Publication number: CN103878036A
Application number: CN201210563467.8A
Authority: CN
Inventors: 梁鑫淼; 龙珍; 张秀莉; 王超然; 郭志谋
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2012-12-21
Filing date: 2012-12-21
Publication date: 2014-06-25

Abstract

本发明提供了一种强极性碱性化合物的分离分析及分离制备方法，该方法适用于所有强极性碱性化合物的分离分析和分离制备，尤其是在反相上保留较弱或者没有保留的碱性化合物的制备，LC-UV分析、LC-MS分析等。主要为以硅胶基质的阳离子交换材料为固定相，以各种有机酸、无机酸以及质谱兼容的挥发性盐为洗脱剂，使得反相上难以保留或保留较弱的碱性化合物具有很好的保留，并得到较好的分离、纯化等。本发明为强极性碱性化合物的定量、定性以及新型强极性碱性化合物的发现提供了新的途径。该方法运行过程重复性高和可操作性强，易于实现标准化和产业化，对高效、选择性的分离强极性碱性化合物具有一定的指导意义。

Description

一种强极性碱性化合物的分离分析或分离制备方法

技术领域

本发明涉及强极性碱性化合物的分离分析和分离制备，具体的说是用阳离子交换材料作为固定相，以质谱兼容的溶剂作为流动相，实现离子交换与MS的联用对强极性碱性化合物进行分离检测，解决这类化合物分离难和检测难的问题。另外，强极性碱性化合物用传统的离子交换或者亲水分离得到的产品通常含有盐，不利于后续工作的开展，如NMR,MS检测等，本发明可用于强极性碱性化合物的无盐制备。

技术背景

碱性化合物在各个领域都有广泛的应用。比如，在医药行业，碱性药物占据了已有药物的70%，同时，碱性化合物还是众多药物的中间体或者先导物，在维护人类健康的过程中有着不可代替的作用（David V.McCalley，Journal of Chromatography A,1217(2010)858）。

在众多的碱性化合物中，强极性碱性化合物在生命科学领域以及医药领域都扮演着重要的角色。如，五羟色胺，一种神经递质。作为神经递质的五羟色胺，在脑内可参与多种生理功能及病理状态的调节，如睡眠、摄食、体温、精神情感性疾病的调节（穆朝娟等，国外医学精神病学分册）。近年来的一些研究又表明，五羟色胺在脑中含量的变化，可以影响血脑屏障通透性的改变。因此，检测组织和血液中五羟色胺的含量对各种疾病的诊断有着重要的意义。此外，一些强极性碱性化合物还是药物合成的中间体，如胞嘧啶。在有机合成的过程中，往往存在大量的副产物，不经提纯的药物中间体混合物直接参与反应，势必会对药物质量产生较大的影响。除了作为神经递质，药物中间体以外，强极性碱性化合物还在其它领域有着重要的作用，如作为药物原料的吡啶，食品安全中引人关注的瘦肉精——莱克多巴胺等等。

分离强极性碱性化合物是一件很难的事。在普通的反相材料上，强极性碱性化合物往往保留时间较短，有的甚至在死时间出峰，难以将其与干扰物质进行分离（Hao Luo等，journal of chromatography A,1202(2008)8）。有研究者，通过极性共聚或者极性包埋等方法，将极性基团引入反相固定相中，增强其耐受高浓度水溶液甚至是耐受纯水流动相体系的能力，已达到增强强极性碱性化合物保留的作用(Z.M,Guo等，，journal ofchromatography A,1217(2010)4555）。但，目前大多数商品化的极性反相柱耐受纯水（低有机相浓度流动相体系）的能力以及在该条件下的稳定性较差。另外，即使是使用纯水作为流动相，为强极性化合物提供的保留时间的可调空间仍然较小，很多时候并不能满足目标化合物与干扰物质的分离。亲水作用色谱作为反相作用色谱的一个补充，可以很好的实现强极性化合物的分离。但亲水作用色谱在使用的过程中，往往需要用到缓冲盐，缓冲盐的使用不利于化合物的后续表征工作的开展，如NMR，活性筛选等等。此外，亲水作用色谱还具有难平衡，用初始流动相溶解样品难等问题（Y.Yang等,Journal Chromatography A1216(2009)5518）。保留好，质谱兼容，无需盐作为流动相添加剂就能分离的色谱模式，对强极性碱性化合物的使用及新型强极性碱性化合物的发现具有重要的价值，同时也是目前色谱领域内急需解决的一个问题。

发明内容

本发明的目的是提供强极性碱性化合物的分离方法，主要涉及强极性碱性化合物的质谱兼容的分离分析方法开发和无盐的分离制备方法开发。

其利用硅胶基质的阳离子交换固定相高对强极性碱性化合物进行较好的保留和分离，该方法可广泛用于强极性碱性化合物的分离分析和分离制备。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种强极性碱性化合物的分离方法，

1）固定相：一种阳离子交换色谱材料作为强极性碱性化合物分离的固定相。其结构式如下：

其中SiO₂为硅胶。

2）流动相：以有机溶剂和离子交换剂作为流动相，将碱性化合物从固定相表面洗脱，以满足LC-UV，LC-PDA,LC-ELSD，LC-MS等分离检测的需要；

具体为：

1）固定相：固定相结构示意图中R1指的是碳数为1～8的烷基中的一种，R2是碳数为1～8的烷基或者苯环中的一种；R3为磺酸基、磷酸基和羧基中的一种；

2）流动相中：有机溶剂指的是与水相溶的有机溶剂，包括甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇、四氢呋喃、丙酮等；离子交换剂指的是质谱兼容的酸和盐，盐有甲酸铵，乙酸铵等铵盐，酸为甲酸，乙酸，盐酸，三氟乙酸，草酸，乙二酸等；分离过程中使用到的有机相的浓度范围为0%-100%，离子交换剂的浓度范围是0-2摩尔。

本发明的优点：

1、对强极性生物碱具有很好的保留。本发明采用了先进的阳离子交换材料作为固定相。利用该色谱材料中带负电的离子交换基团与碱性化合物中带正电荷基团之间的静电作用力，实现强极性碱性化合物在该材料上很好的保留，从而实现反相材料无法达到的优良分离效果。

2、分离方法质谱兼容，可实现离子交换与质谱的无转换联用。本发明中采用的硅胶基质的阳离子交换固定相具有适中的离子交换容量，保障了强极性碱性化合物在其表面适当的保留。这样的保留既不会太弱（即具有较宽的流动相调控空间），又不会过强（即不需要强的洗脱剂，如钠盐，钾盐等）。在本发明中，用三氟乙酸等可以提供氢离子的离子交换剂即可将目标化合物从固定相表面洗脱下来，并且实现较好的分离。三氟乙酸等提供氢离子的离子交换剂大多质谱兼容，因此该方法可以实现阳离子交换与质谱的联用，成功解决了强极性碱性化合物的分离和检测难题。

3．无盐的离子交换制备强极性生物碱。无论是用亲水作用色谱还是普通的离子交换色谱，流动相中大多会使用盐，盐的使用为后续工作带来很多的麻烦，如NMR，MS,活性筛选等等。因此，在这些分离过程之后需要对化合物进行脱盐。对强极性碱性化合物而言，脱盐是一件相当困难的事，因为除亲水和离子交换，常见的材料中很少有能实现其很好保留的色谱材料。在本发明中，分离过程中不需要盐，少了后续脱盐等步骤，分离得到的化合物可以直接进行核磁表征，MS表征以及活性筛选。

4．重复性好。本发明中使用的色谱固定相具有很好的稳定性，使用两千次以上仍能维持较好的性能，如高的柱效和对称的色谱峰形等。为开发强极性碱性化合物的重复制备和定性定量分析方法提供了能极大的方便。

附图说明

图1本发明实施例1用于神经递质五羟色胺的检测色谱图（λ＝210nm）；

图2本发明实施例2用于药物合成中间体胞嘧啶的检测色谱图（λ＝210nm）；

图3本发明实施例3用药物合成原料吡啶的检测色谱图（λ＝210nm）；

图4本发明中实施例4食品安全中非法添加剂—莱克多巴胺的检测色谱图（λ＝210nm）。

图5本发明中实施例5天然产物—塘沽特山莨菪强极性组分的分离检测色谱图（图5.A,λ＝210nm；图5.B，λ＝250nm）。

具体实施方式

实施例1：神经递质五羟色胺的检测

五羟色胺即为血清素，是一种重要的神经递质，在调节动物的性格以及情感方面具有重要的作用，常用于抗抑郁，减缓压力和改善睡眠等。近年来，更有学者报道称，五羟色胺在大脑中的含量变化可以引起血脑屏障通透性的改变。因此，检测五羟色胺的含量变化等，对探测生命活动、疾病诊断方面有着重要的作用。然而，五羟色胺是一种极性较强的碱性化合物，在反相上保留较弱（如图1.A所示）。为了达到与干扰物质分离的目的，往往需要加入离子对试剂以增强其保留。但离子对试剂的加入不利于与质谱联用进行高灵敏度的检测。

本发明中，使用硅胶基质的强阳离子交换材料，以乙腈和三氟乙酸为流动相，可实现五羟色胺很好的保留（如图1.B所示），并且该方法中使用的流动相质谱兼容，可与质谱联用进行检测。另外，该方法具有很宽的流动相可调空间。以粒径5微米的SCX硅胶键合固定相为色谱填料，以乙腈（A)、1%TFA(B)和水（C）为流动相，在不同洗脱条件下，观察五羟色胺的保留。图1.B的洗脱梯度为：0-20min，5%-50%A,30%B，20-30min,50%-70%A,30%B；检测波长为：210nm,保留可以达到22.2min。图1.C的分离条件为50%A,50%B，检测波长为：210nm,保留可以达到8.8min。较宽的流动相可调空间，为五羟色胺与干扰物质的分离提供了更大的可能性，从而实现复杂样品中，五羟色胺的高效、高灵敏度检测。

实施例2：药物合成中间体胞嘧啶的检测

胞嘧啶是精细化工、农药和医药的重要中间体，特别在医药领域，主要用于合成抗艾滋病药物及抗乙肝药物拉米夫定，抗癌药物吉西他宾、依诺他宾以及5-氟胞嘧啶等。胞嘧啶主要由二巯基尿嘧啶、浓氨水和氯乙酸为原料合成制得，在合成过程中，有一些副产物存在，为了提高胞嘧啶的纯度，降低杂质对后续合成步骤的干扰，需要对胞嘧啶进行提纯。胞嘧啶是一种强极性碱性化合物，合成中常用的提纯手段——重结晶难以用到胞嘧啶的提纯上。色谱分离是胞嘧啶提纯的一种有效手段。

在常用的反相色谱中，胞嘧啶几乎没有保留（如图2.A所示）；可以使胞嘧啶得到很好保留的HILIC作用色谱往往需要用盐，不利于它的纯化分离。本发明中，使用硅胶基质的强阳离子交换材料，以乙腈和三氟乙酸为流动相，可实现胞嘧啶很好的保留（如图2.B所示），并且该方法中使用的流动相质谱兼容，可与质谱联用进行检测。另外，该方法具有很宽的流动相可调空间。以粒径5微米的SCX硅胶键合固定相为色谱填料，以乙腈（A)、1%TFA(B)和水（C）为流动相，在不同洗脱条件下，观察胞嘧啶的保留。图2.B的洗脱梯度为：0-20min，5%-50%A,30%B；检测波长为：210nm,保留可以达到22.2min。检测波长为：210nm,保留可以达到14.6min。较宽的流动相可调空间，为胞嘧啶与干扰物质的分离提供了更大的可能性，从而实现复杂样品中，胞嘧啶的高效、高灵敏度检测和纯化制备。

实施例3：药物合成原料吡啶的检测

吡啶是精细化工、农药和医药的重要原料，可以通过亲电取代、亲核取代以及氧化还原反应进行衍生，合成一系列的医药、化工产品。吡啶主要从石油中提炼得到，将吡啶从复杂体系中纯化出来，可以极大的保障后续的一系列合成反应的质量。对吡啶的纯化，色谱方法是一个重要的途径。但吡啶极性较大，用普通的反相分离很难将其与干扰物质分离（保留较弱，如图3.A所示）；可以使吡啶得到很好保留的HILIC作用色谱往往需要用盐，不利于它的纯化分离。本发明中，使用硅胶基质的强阳离子交换材料，以乙腈和三氟乙酸为流动相，可实现吡啶很好的保留，并且该方法中使用的流动相质谱兼容，可与质谱联用进行检测。另外，该方法具有很宽的流动相可调空间。以粒径5微米的SCX硅胶键合固定相为色谱填料，以乙腈（A)、1%TFA(B)和水（C）为流动相，在不同洗脱条件下，观察吡啶的保留。图3.B的洗脱梯度为：0-20min，5%-50%A,30%B；检测波长为：210nm,保留可以达到22.4min。图3.C的分离条件为50%A,50%B，检测波长为：210nm,保留可以达到15.8min。较宽的流动相可调空间，为吡啶与干扰物质的分离提供了更大的可能性，从而实现复杂样品中，吡啶的高效、高灵敏度检测和纯化制备。

实施例4：食品安全中非法添加剂——莱克多巴胺的检测

莱克多巴胺曾是一种医药原料，美国FDA于2000年批准将其用于畜牧业和养殖业，代替危害性较大的克伦特罗用于动物蛋白质含量的提高。但莱克多巴胺是否真正安全，是否会像克伦特罗一样危害人间，还需要进一步的研究数据来验证。为了监测各种复杂体系中莱克多巴胺的含量，从而验证其在生物体内的活性、毒性等，分离是其中的关键。目前常用的莱克多巴胺监测方法为，以C18为固定相，离子对试剂为流动相添加剂。该监测方法可以适用于LC-UV监测，但更为灵敏的检测手段，如LC-MS，该方法则不适用（离子对试剂质谱不兼容）。为了实现微量甚至痕量的莱克多巴胺的检测，发展质谱兼容的液相方法很有必要。本发明中，使用硅胶基质的强阳离子交换材料，以乙腈和三氟乙酸为流动相，可实现莱克多巴胺很好的保留，并且该方法中使用的流动相质谱兼容，可与质谱联用进行检测。另外，该方法具有很宽的流动相可调空间。以粒径5微米的SCX硅胶键合固定相为色谱填料，以乙腈（A)、1%TFA(B)和水（C）为流动相，在不同洗脱条件下，观察莱克多巴胺的保留。图4.B的洗脱梯度为：0-20min，5%-50%A,30%B；检测波长为：210nm,保留可以达到25.7min。图4.C的分离条件为50%A,50%B，检测波长为：210nm,保留可以达到6.2min。较宽的流动相可调空间，为莱克多巴胺与干扰物质的分离提供了更大的可能性，从而实现复杂样品中，莱克多巴胺的高效、高灵敏度检测和纯化制备。

实施例5：天然产物——塘沽特山莨菪强极性组分的分离检测

以托品烷类生物碱为代表的生物碱在山莨菪中广泛存在，并因其高的活性受到普遍关注。在已报道的方法中，多以反相的方法来分离塘沽特山莨菪中的生物碱，但多年来在该药材中发现的生物碱的品种较少。纠其原因有以下两点：一、该药材中生物碱的极性普遍偏高，在反相中保留较弱，能用反相分离得到的生物碱种类较少；在传统的植化手段中，如硅胶柱，死吸附严重，生物碱难以分离得到；二、该药材中存在大量的非生物碱，在没有合理的前处理前很难将其中的生物碱分离得到。本发明中，使用了专利申请号为201110179917.9的前处理方法，结合强阳离子交换材料和离子交换剂TFA，可成功解决山莨菪中强极性部分生物碱的分离。

首先，称取山莨菪原药材95克，加入1升95%乙醇80摄氏度回流，重复上述提取过程1次，每次3小时，将提取液浓缩，得浸膏1.65毫升（相对密度1.05）；然后，将1毫升山莨菪浸膏溶解到纯甲醇中，配成5毫升粗碱溶液。取硅胶基质的强阳离子交换（SCX）SPE柱（100毫克，3毫升）,用3毫升纯甲醇活化、平衡，取0.2毫升粗碱溶液上样。用3毫升甲醇清洗SPE柱以除去粗碱中的非生物碱。最后用3毫升250毫摩尔每升的高氯酸铵-甲醇溶液洗脱生物碱。

以粒径10微米的C18HCE硅胶键合固定相为色谱填料，以含20毫摩尔硫酸钠（用磷酸和乙醇胺调水溶液pH到2.8）的乙腈（A）和含20毫摩尔硫酸钠（用磷酸和乙醇胺调水溶液pH到2.8）水溶液(B)为流动相，将山莨菪生物碱富集片段进行一维分离。洗脱梯度为：0-30min10%-30%A;30-40min30%-100%A。分离图，如图5.A。

将一维中极性最大的片段（图5A中F1所对应的部分）收集起来，以粒径5微米的SCX硅胶键合固定相为色谱填料，以乙腈（A)、1%TFA(B)和水（C）为流动相，进行分离。图5.B的洗脱梯度为：0-20min，10%-30%A,15%B；20-30min，30%-50%A,15%B；检测波长为：210nm。由图可见，原本在反相上死时间出来的化合物（图5A中F1），在SCX上得到很好的分离（图5.B）。该类方法还可用于其它天然产物中强极性碱性化合物的分离分析和分离制备。

本发明适用于所有强极性碱性化合物的分离分析和分离制备，尤其是在反相上保留较弱或者没有保留的碱性化合物的制备，LC-UV分析、LC-MS分析等。以硅胶基质的阳离子交换材料为固定相，以各种有机酸、无机酸以及质谱兼容的挥发性盐为洗脱剂，使得反相上难以保留或保留较弱的碱性化合物具有很好的保留，并得到较好的分离、纯化等。本发明为强极性碱性化合物的定量、定性以及新型强极性碱性化合物的发现提供了新的途径。该方法运行过程重复性高和可操作性强，易于实现标准化和产业化，对高效、选择性的分离强极性碱性化合物具有一定的指导意义。

Claims

1.一种强极性碱性化合物的分离分析或分离制备方法，

采用色谱柱分离，分离过程中使用的固定相为阳离子交换色谱固定相，其结构式如下：

其中SiO₂为硅胶，R₁是碳数为1～8的烷基中的一种，R₂是碳数为1～8的烷基或者苯环中的一种；R3为磺酸基、磷酸基和羧基中的一种；

原料上样后，分离过程中以有机溶剂和离子交换剂作为流动相或以有机溶剂和离子交换剂的水溶夜作为流动相，将强极性碱性化合物依次从固定相表面洗脱。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

从固定相表面洗脱下的强极性碱性化合物可用于LC-UV、LC-PDA、LC-ELSD或LC-MS分析检测。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

有机溶剂为与水相溶的有机溶剂，包括甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇、四氢呋喃、丙酮中的一种或二种以上；

离子交换剂为质谱兼容的酸或盐，盐有甲酸铵、乙酸铵中的一种或二种以上，酸为甲酸、乙酸、盐酸、三氟乙酸、草酸、乙二酸中的一种或二种以上。

4.按照权利要求1或3所述的方法，其特征在于：

当以非水体系分离时，洗脱剂为有机溶剂和离子交换剂，有机溶剂的体积分数为0%-100%；此时，离子交换剂为甲酸、乙酸、三氟乙酸、草酸、乙二酸、甲酸铵和乙酸铵；

当以含水体系分离时，以有机溶剂和离子交换剂的水溶液作为流动相时，有机溶剂的浓度从0%-100%，离子交换剂的浓度从0-2摩尔每升，且二者不同时为零。

5.按照权利要求1或3所述的方法，其特征在于：

洗脱方法可以为梯度洗脱也可以为等度洗脱；

当采用非水体系做等度分离时，洗脱条件可以是:体积分数为100%的有机溶剂，或体积分数为100%的离子交换剂，体积分数为100%的离子交换剂为甲酸、乙酸、草酸、乙二酸、三氟乙酸中的一种或二种以上，或者溶有离子交换剂的有机溶剂，溶有离子交换剂的有机溶剂为0.0001-100毫摩尔的甲酸甲醇、甲酸乙腈、甲酸异丙醇溶液、甲酸乙醇、乙酸甲醇、乙酸乙腈、乙酸异丙醇、乙酸乙醇、甲酸铵乙腈、甲酸铵甲醇、甲酸铵异丙醇、甲酸铵乙醇、乙酸铵甲醇、乙酸铵异丙醇、乙酸铵乙腈、乙酸铵乙醇溶液中的一种或二种以上；

当采用有水体系做等度分离时，洗脱条件可以是：0.0001-2摩尔/升的离子交换剂水溶液和有机溶剂溶液混合，混合液中有机溶剂溶液体积分数为0%-100%；

当采用非水体系梯度洗脱时，先以0-100毫摩尔/升的离子交换剂或体积分数为0%到80%的有机溶剂-离子交换剂溶液平衡色谱柱；待上样完成后，逐步增大流动相的洗脱强度，即增大有机溶剂或离子交换剂中的一种或两种于流动相的含量，以实现分离、洗脱强极性碱性化合物混合物的目的；

当以含水体系进行分析，先以0-100毫摩尔/升的离子交换剂水溶液和/或体积分数为0%-99%的有机溶剂中的0或2种平衡色谱柱，待上样完成后，增大流动相的洗脱能力，即增大有机相或离子交换剂中的一种或两种于流动相的含量，以达到分离、洗脱分析物的目的。

6.按照权利要求1或3所述的方法，其特征在于：

所述强极性碱性化合物为含氮的有机化合物，其Pka为4-12，在溶液体系中可以电离，并显现出正电荷，其在C18柱上的保留因子（k’）通常为-1-20；化合物的保留因子k’等于化合物的保留时间减去死时间所得之差除以死时间；

化合物的保留时间指，化合物从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也即从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间；死时间指不被固定相滞留的组分，从进样到出现最大峰值所需的时间；

将天然产物（如中草药等）的提取物或有机合成的产物，以反相色谱柱如C18柱为固定相，以与水互溶的有机相或酸水或盐溶液中的一种、二种或三种为流动相进行分离，将保留因子（k’）通常为-1-20的化合物的混合物收集，作为本发明的分离对象；与水互溶的有机相指，甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙醇、DMSO、DMF；酸水指浓度为0.001-2摩尔每升的甲酸，乙酸，三氟乙酸，磷酸，盐酸，草酸，乙二酸，硝酸；盐溶液指浓度为0.001-2摩尔每升的与水互溶的甲酸盐，乙酸盐，三氟乙酸盐，磷酸盐，高氯酸盐，卤化盐，碳酸盐，三乙胺盐；

用于本发明的天然产物提取物和有机合成的产物是指，可以溶于权利要求1所描述的流动相且对权利要求1所描述固定相没有明显破坏性的化合物的混合物。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：

用于分析的强极性碱性化合物的浓度范围为:以权利要求1描述的固定相为固定相，以权利要求3描述的流动相为流动相，以权利要求4描述的洗脱条件为洗脱条件，以权利要求2描述的检测器为检测器建立的分析方法的检测限或检出限为浓度下限，以分析物在溶剂中的饱和浓度为浓度上限，溶解强极性碱性化合物的溶剂为水或与水互溶的有机溶剂或水溶液或有机溶液中的一种到四种。

8.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述的强极性碱性化合物，是指以含体积分数0.1%甲酸的体积分数10%乙腈水溶液为流动相，C18柱为固定相，保留因子在-1到20范围内的碱性化合物为强极性碱性化合物。