CN109642894B - 胺类化合物的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够更准确、并且更简便地进行胺类化合物的分析的液相色谱填充剂、填充了该液相色谱填充剂的液相色谱柱、以及使用了该液相色谱柱的胺类化合物的分析方法。本发明的液相色谱填充剂，其特征在于，由每1g填充剂导入了1.50mmol以上羧基的聚合物填充剂构成，基于亲水相互作用色谱(HILIC)的、表示上述聚合物填充剂表面的pH性的指数为1.30以上，并且基于亲水相互作用色谱(HILIC)的、表示上述聚合物填充剂表面的亲水性的指数为1.00以上且1.30以下。

Description

胺类化合物的分析方法
技术领域
本发明涉及液相色谱填充剂、液相色谱柱以及胺类化合物的分析方法。
本申请基于2016年8月29日在日本申请的特愿2016-167038号来主张优先权，将其内容援用到本文中。
背景技术
胺类化合物是医药、食品、肥料、工业用药品等各种物质所包含的重要化合物。此外，胺类化合物是在各种工业中的研究开发、品质试验等中成为分析对象的化合物。此外，在环境领域中，自来水中包含的对人体带来不良影响的胺类化合物广泛成为分析对象。
作为胺类化合物的分析方法，一般使用了采用液相色谱的分析方法。作为采用液相色谱的胺类化合物的分析方法，广泛已知例如，使用了ODS柱的反相色谱(RP)模式下的分析方法(例如，参照专利文献1)。ODS柱是进行了用于抑制胺类化合物吸附的封端处理的填充了十八烷基硅胶(ODS)等硅胶系填充剂的分析柱。
然而，采用RP模式的胺类化合物的分析方法中，有时在柱内不被充分保留亲水性高的胺类化合物。例如，使用了ODS柱的RP法中，亲水性高的胺类化合物不被柱保留。因此，为了使胺类化合物充分保留在柱内，有时需要添加1-戊烷磺酸钠等离子对试剂。如果像这样添加离子对试剂，则有时使柱的寿命显著恶化。
此外，近年来，也一般已知采用亲水相互作用色谱(HILIC)分离模式的分析方法，其使用了填充了导入有作为两性离子基的磺基甜菜碱基的硅胶填充剂的柱。然而，该采用HILIC分离模式的分析方法中，反而存在疏水性高的胺类化合物在柱内不被充分保留这样的课题。进而，该采用HILIC分离模式的分析方法中，存在下述课题：因为在RP用或HILIC用的硅胶填充剂中残存的硅烷醇基，作为碱性物质的胺类化合物吸附在柱内，对分析结果带来不良影响等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平6-174708号公报
非专利文献
非专利文献1：共立出版，高速液体クロマトグラフ法，1986年，p93
发明内容
发明所要解决的课题
本发明是鉴于这样的状况而提出的，其目的是提供能够更准确、并且更简便进行胺类化合物的分析的液相色谱填充剂、填充了该液相色谱填充剂的液相色谱柱、以及使用了该液相色谱柱的胺类化合物的分析方法。
用于解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而反复进行了深入研究，结果发现，通过使用每1g填充剂导入有1.50mmol以上羧基、并且将依照规定的采用HILIC分离模式的分析方法来控制表面的pH性和亲水性的聚合物粒子用于填充剂的柱，从而不仅HILIC分离模式，而且组合了RP与离子交换色谱的混合模式也起作用，从而获得表现对于胺类化合物的分离分析而言充分的性能的柱，完成了本发明。
即，本发明涉及以下事项。
[1]一种液相色谱填充剂，是具有羧基的聚合物填充剂，其特征在于，每1g上述聚合物填充剂导入有1.50mmol以上上述羧基，
基于亲水相互作用色谱(HILIC)的、表示上述聚合物填充剂表面的pH性的指数为1.30以上，并且基于亲水相互作用色谱(HILIC)的、表示上述聚合物填充剂表面的亲水性的指数为1.00以上且1.30以下。表示上述聚合物填充剂表面的pH性的指数以对可可碱(Tb)与茶碱(Tp)进行HILIC分离模式的液相色谱测定时的分离系数α1(Tb/Tp)定义。此外，表示上述聚合物填充剂表面的亲水性的指数以对尿苷(U)与2’-脱氧尿苷(2dU)进行HILIC分离模式的液相色谱测定时的分离系数α2(U/2dU)定义。各分离系数α1、α2为各自的物质的保留系数k的比，保留系数k都是在将甲苯的洗脱时间设为t0、将各物质的洗脱时间设为t的情况下，以k＝(t-t0)/t0定义。其中，上述HILIC分离模式的液相色谱测定条件是：柱温度为30℃，流动相为(乙腈)：(添加了乙酸10mmol/L和乙酸铵10mmol/L的水)＝90/10(混合前的体积)的混合液体。
[2]根据[1]所述的液相色谱填充剂，上述聚合物填充剂包含导入了羧基的聚乙烯醇树脂或聚羟基(甲基)丙烯酸酯树脂。
[3]一种液相色谱柱，其具备：[1]或[2]所述的液相色谱填充剂；和填充了上述液相色谱填充剂的液相色谱用外壳。
[4]一种胺类化合物的分析方法，其中，使用[3]所述的液相色谱柱，采用上述液相色谱柱进行的分离模式为使用了水溶性有机溶剂与水的混合溶剂作为流动相的HILIC分离模式、或组合了反相色谱(RP)与离子交换色谱的混合模式。
[5]根据[4]所述的胺类化合物的分析方法，上述水溶性有机溶剂为选自乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、丁酮和四氢呋喃中的至少1种。
[6]根据[5]所述的胺类化合物的分析方法，上述水溶性有机溶剂为乙腈。
发明效果
根据本发明，可以提供能够更准确、并且更简便地进行胺类化合物的分析的液相色谱填充剂、填充了该液相色谱填充剂的液相色谱柱、以及使用了该液相色谱柱的胺类化合物的分析方法。
附图说明
图1是测定实施例1的聚合物填充剂的分离系数α1(Tb/Tp)和分离系数α2(U/2dU)时的色谱图。
图2是实施例1的液相色谱柱的评价中的尿嘧啶与肾上腺素的色谱图。
具体实施方式
以下，对应用了本发明的液相色谱填充剂、填充了该液相色谱填充剂的液相色谱柱、和使用了该液相色谱柱的胺类化合物的分析方法的实施方式进行说明。
另外，本实施方式是为了更好地理解发明的宗旨而进行的具体说明，只要没有特别指定，就不限定本发明。
[液相色谱填充剂]
本发明的液相色谱填充剂是具有羧基的聚合物填充剂。其特征在于，每1g上述聚合物填充剂导入有1.50mmol以上的上述羧基。此外，基于亲水相互作用色谱(HILIC)的、表示上述聚合物填充剂表面的pH性的指数为1.30以上，并且表示上述聚合物填充剂表面的亲水性的指数为1.00以上且1.30以下。
(表示pH性的指数、表示亲水性的指数的定义)
这里，对本发明涉及的表示聚合物填充剂表面的pH性的指数和表示聚合物填充剂表面的亲水性的指数进行说明。
聚合物填充剂表面的、表示pH性的指数和表示亲水性的指数是2011年由池上等人提出的HILIC柱的性能评价指数，是通过基于一般可以应用的技术的评价法而定义的值(Journal of Chromatography A，1218号，2011年，5903-5919页)。这些指数通过使用市售的液相色谱分析装置(例如，Nexera-i(商品名，株式会社岛津制作所制)、Agilent1260Infinity(アジレント·テクノロジー株式会社制)等)，从而无论制造商、机器种类如何都能够再现良好地获得。然而，这些指数以HILIC分离模式测定。该HILIC分离模式的液相色谱测定条件是，作为检测器使用紫外检测器(UV，波长：254nm)，柱温度为30℃，流动相为(乙腈)：(添加了乙酸10mmol/L和乙酸铵10mmol/L的水)＝90/10(混合前的体积)的混合液体。
本发明中的表示聚合物填充剂表面的pH性的指数和表示聚合物填充剂表面的亲水性的指数如下求出：将聚合物填充剂填充到内径2.0mm、长度150mm或内径4.6mm、长度150mm的圆筒型的液相色谱用外壳中，制作液相色谱柱，使用该液相色谱柱，通过上述测定条件来求出。此外，基于上述的池上等人的文献，将此时的流动相的线性流速固定于3.3cm/min(在使用内径2.0mm的外壳的情况下，流动相的流量为0.11mL/min。在使用内径4.6mm的外壳的情况下，流动相的流量为0.55mL/min。)。
表示pH性的指数作为与包含酸碱相互作用的离子性相互作用(离子交换作用)对应的表示填充剂表面的pH性的指标，以对可可碱(Tb)与茶碱(Tp)进行HILIC分离模式的液相色谱测定时的分离系数α1(Tb/Tp)定义。如果表示pH性的指数为1.00以上，则由于聚合物填充剂显示阴离子性，因此表现阳离子交换作用。另一方面，如果表示pH性的指数小于1.00，则聚合物填充剂显示阳离子性，因此表现阴离子交换作用。因此，表示pH性的指数与1.00的差越大，则越可以使聚合物填充剂表现高离子交换性。
表示亲水性的指数作为表示基于填充剂表面的水合相厚度的亲水性基的选择性的指标，以对尿苷(U)与2’-脱氧尿苷(2dU)进行HILIC分离模式的液相色谱测定时的分离系数α2(U/2dU)定义。如果表示亲水性的指数为1.00以上，则表现基于聚合物填充剂的亲水性相互作用。
这里，分离系数α1、α2为分别各自的物质的保留系数k的比。对于HILIC，保留系数k都是在将不保留在柱内而洗脱出的甲苯的洗脱时间设为t0、将各物质的洗脱时间设为t的情况下，以k＝(t-t0)/t0定义。即，分离系数α1(Tb/Tp)＝k1/k2，k1为可可碱的保留系数，k2为茶碱的保留系数。此外，分离系数α2(U/2dU)＝k3/k4，k3为尿苷的保留系数，k4为2’-脱氧尿苷的保留系数。
另外也推定，在HILIC分离模式中，由于导入到聚合物填充剂的羧基而表现离子交换作用，但一般对于HILIC分离模式，往往作为也包括离子交换作用的分离方法处理。因此，在本说明书中，也以HILIC分离模式的名称进行说明。
(聚合物填充剂)
作为本发明涉及的聚合物填充剂，使用了至少导入了羧基的亲水性聚合物，但可以使用除了羧基以外，还导入了羧基烷基、磺基、磺基烷基等的亲水性聚合物。
作为导入了羧基的聚合物填充剂，优选为通过化学修饰或被覆而导入羧基的聚合物填充剂。作为这样的导入了羧基的聚合物填充剂，优选为聚乙烯醇树脂或聚羟基(甲基)丙烯酸酯树脂。
聚合物填充剂中的羧基的导入量可以利用对聚合物填充剂的化学修饰量或被覆量来调节。本发明的液相色谱填充剂，为了获得基于HILIC分离模式、或组合了反相色谱(RP)与离子交换色谱的混合模式的充分的分析性能，聚合物填充剂中的羧基的导入量为每1g填充剂为1.50mmol以上，优选为1.60mmol以上，更优选为1.80mmol以上。如果聚合物填充剂中的羧基的导入量为每1g填充剂小于1.50mmol，则进行HILIC分离模式的液相色谱测定时的表示pH性的指数变得小于1.30，有时不能表现充分的离子交换作用，因此不能使胺类化合物充分保留于柱。
表示聚合物填充剂表面的pH性的指数为1.30以上，更优选为1.30以上且1.60以下，进一步优选为1.40以上且1.60以下。如果表示pH性的指数小于1.30，则有时聚合物填充剂不表现充分的离子交换作用，因此在HILIC分离模式、或组合了RP与离子交换色谱的混合模式下，胺类化合物不被充分地保留于柱而被洗脱。此外，如果表示pH性的指数为1.60以下，则聚合物填充剂的离子交换作用不会过强，胺类化合物被充分地保留于柱。
表示聚合物填充剂表面的亲水性的指数为1.00以上且1.30以下，优选为1.05以上且1.25以下，更优选为1.10以上且1.20以下。如果表示亲水性的指数小于1.00，则尿苷与2’-脱氧尿苷基于亲水性相互作用，显示出胺类化合物不洗脱出，损害作为HILIC用柱所使用的液相色谱填充剂的本质。此外，如果表示亲水性的指数超过1.30，则填充剂的亲水性过高，因此有时组合了PR与离子交换色谱的混合模式不起作用。
为了具有充分的分离性能和高灵敏度，获得可耐受1MPa～30MPa的压力的强度，聚合物填充剂的形状优选为体积平均粒径为1μm～30μm的球状，更优选为体积平均粒径为3μm～10μm的球形。
本发明中的体积平均粒径使用库尔特计数法如下测定。即，作为测定装置使用精密粒度分布测定装置(商品名：Multisizer 4，ベックマン·コールター株式会社制)，在聚合物填充剂0.2g中添加アイソトン(稀释液)25mL，施加3分钟超声波使其分散后，以约1000个的测定个数测定体积平均粒径。为了将聚合物填充剂的体积平均粒径控制在优选的范围，使用风力分级、采用筛分的分级、利用了沉淀的分级等。
作为本发明中的导入了羧基的聚合物填充剂的制造方法，可举出例如，日本特开2007-191581号公报所记载的方法等。该方法中，通过在将聚乙烯醇树脂基材或聚羟基(甲基)丙烯酸酯树脂基材用含有羧基的水溶性高分子进行了覆膜后，使含有羧基的水溶性高分子交联，来对上述的树脂基材导入羧基。此外，羧基的导入量可以通过滴定来求出。
根据本发明的液相色谱填充剂，由每1g填充剂导入1.50mmol以上羧基的聚合物填充剂构成，基于HILIC的、表示聚合物填充剂表面的pH性的指数为1.30以上，并且表示聚合物填充剂表面的亲水性的指数为1.00以上且1.30以下，因此能够更准确、并且更简便地进行胺类化合物的分析。
[液相色谱柱]
本发明的液相色谱柱可举出例如，具备形成圆筒型等的液相色谱用外壳(以下，简称为“外壳”。)、和填充在该外壳内部的填充剂的柱。本发明的液相色谱柱中，作为填充剂，使用了本发明的液相色谱填充剂。
(外壳)
外壳的材质和大小没有特别限定。作为外壳，优选使用一般作为液相色谱用外壳使用的不锈钢制或聚醚醚酮(PEEK)树脂制的圆筒型外壳。
在外壳为圆筒型的情况下，为了获得充分的分离性能和高检测灵敏度，其内径优选为1.0mm～8.0mm，更优选为2.0mm～6.0mm，进一步优选为2.0mm～4.6mm。如果圆筒型外壳的内径为1.0mm以上，则可在外壳内容易并且充分地填充液相色谱填充剂。另一方面，如果圆筒型外壳的内径为8.0mm以下，则在高速分析时也可充分地获得柱性能。此外，柱压力不会过高，可以使能够测定的流动相的流速范围宽。
外壳的长度优选为35mm～300mm，更优选为35mm～250mm，进一步优选为50mm～250mm。如果外壳的长度为35mm以上，则能够使胺类化合物充分地保留于柱，作为结果，能够将胺类化合物分离。另一方面，如果外壳的长度为300mm以下，则柱压力不会过高，能够使胺类化合物充分地从柱中洗脱出。
根据本发明的液相色谱柱，本发明的液相色谱填充剂被填充于外壳，因此能够更准确、并且更简便地进行胺类化合物的分析。
[胺类化合物的分析方法]
本发明的胺类化合物的分析方法是如下的分析方法：使用本发明的液相色谱柱，采用该液相色谱柱的分离模式是使用了水溶性有机溶剂与水的混合溶剂作为流动相的HILIC分离模式、或组合了反相色谱(RP)与离子交换色谱的混合模式。这里，作为胺类化合物，可以举出具有将氨的氢原子的一部分或全部用烃基等有机基取代后的结构的化合物。
(流动相)
作为本发明的胺类化合物的分析方法中的流动相，使用了水溶性有机溶剂与水的混合溶剂。
作为水溶性有机溶剂，可举出乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇等醇类、丙酮、丁酮等酮类、和四氢呋喃等醚类等。其中，作为水溶性有机溶剂，优选为选自乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、丁酮和四氢呋喃中的至少1种，更优选为乙腈。本发明的胺类化合物的分析方法中，可以单独使用这些水溶性有机溶剂的1种，也可以组合使用2种以上。
(分离模式)
本发明的胺类化合物的分析方法中，采用液相色谱柱的分离模式为HILIC分离模式、或组合了RP与离子交换色谱的混合模式，因此通过调节作为流动相的混合溶剂中的水溶性有机溶剂与水的组成比率，能够选择性地表现HILIC分离模式与混合模式。
流动相可以根据分析对象(胺类化合物)的种类来适当选择。通常，混合溶剂中的水溶性有机溶剂的组成比率(混合前体积比)在50％～70％具有界限。如果使水溶性有机溶剂的组成比率(混合前体积比)比该界限低，则表现组合了RP与离子交换色谱的混合模式。另一方面，如果使水溶性有机溶剂的组成比率(混合前体积比)比该界限高，则表现HILIC分离模式。即，根据进行分析的胺类化合物的种类，确定想要表现的分离模式，根据该分离模式，确定混合溶剂中的水溶性有机溶剂的组成比率(混合前体积比)。
混合溶剂中的水溶性有机溶剂与水的组成比率(混合前体积比)通常优选为水溶性有机溶剂：水＝1：99～99：1，更优选为5：95～95：5。
HILIC分离模式中，混合溶剂中的水溶性有机溶剂与水的组成比率(混合前体积比)通常优选为水溶性有机溶剂：水＝50：50～99：1，更优选为60：40～99：1，进一步优选为70：30～95：5，特别优选为75：25～95：5。
组合了RP与离子交换色谱的混合模式中，混合溶剂中的水溶性有机溶剂与水的组成比率(混合前体积比)通常优选为水溶性有机溶剂：水＝1：99～70：30，更优选为1：99～50：50，进一步优选为5：95～50：50，特别优选为10：90～50：50。
此外，本发明的胺类化合物的分析方法中，出于调整亲水性水平和试样的保留时间的目的，可以在流动相中以任意的比例添加甲酸、乙酸、硝酸等酸、或甲酸铵、乙酸铵等盐。
本发明的胺类化合物的分析方法中，分析时的柱流速没有特别限定。关于柱流速，即，在胺类化合物的分析时，在本发明的液相色谱柱内流动的包含胺类化合物的流动相的线性流速优选为1.5cm/min～15.0cm/min(例如，在外壳的内径为2.0mm的情况下，流量为0.05mL/min～0.50mL/min)，更优选为3.0cm/min～9.0cm/min(例如，在外壳的内径为2.0mm的情况下，流量为0.10mL/min～0.30mL/min)。
根据本发明的胺类化合物的分析方法，使用本发明的液相色谱柱，采用该液相色谱柱的分离模式是使用了水溶性有机溶剂与水的混合溶剂作为流动相的HILIC分离模式、或组合了RP与离子交换色谱的混合模式，因此根据胺类化合物的种类，来适当选择HILIC分离模式与混合模式，能够更准确、并且更简便地进行胺类化合物的分析。
如后述的实施例所示那样，通过每1g填充剂导入1.50mmol以上羧基，从而阳离子交换作用充分起作用而表现RP模式与离子交换色谱的混合模式，因此能够使仅仅依靠RP模式难以保留的胺类充分保留。此时，例如，以尿嘧啶作为RP指标物质时的肾上腺素的保留系数优选为2.0以上，更优选为2.5以上。在实现该保留系数时，可以视为组合了反相色谱(RP)与离子交换色谱的混合模式起作用了。
本发明的胺类化合物的分析方法中，能够对1种以上胺类化合物进行分离和分析，特别是如果采用上述的混合模式，则也能够通过1次分析同时测定RP模式下易于保留的芳香族化合物等化合物、和仅在RP模式下亲水性过强而不被保留的胺类等离子性物质。
实施例
以下，通过实施例和比较例进一步具体地对本发明进行说明，但本发明不限定于以下实施例。
(表示pH性的指数和表示亲水性的指数的妥当性评价)
关于基于HILIC的、表示pH性的指数和表示亲水性的指数，按照上述的非专利文献(Journal of Chromatography A，1218号，2011年，5903-5919页)进行了文献数据的妥当性确认。
作为柱，使用了上述的非专利文献所记载的ZIC(注册商标)HILIC(内径2.0mm，长度150mm，メルク株式会社制)。上述的非专利文献所记载的表示pH性的指数为1.20，表示亲水性的指数为2.03。
作为液相色谱分析装置，使用了Nexera-i(商品名，株式会社岛津制作所制)。测定条件按照上述的非专利文献，使用紫外检测器(UV，波长：254nm)作为检测器，柱温度为30℃，流动相组成为(乙腈)：(添加了乙酸10mmol/L和乙酸铵10mmol/L的水)＝90/10的比率(混合前的体积)的混合液体。此外，使流动相的流量为0.11mL/min(线性流速：3.3cm/min)，依次注入甲苯1000μg/mL、茶碱100μg/mL、可可碱100μg/mL、尿苷100μg/mL、2-脱氧尿苷100μg/mL(都溶解于流动相)的试验样品1μL并确认洗脱时间，然后算出表示pH性的指数和表示亲水性的指数。
其结果，表示pH性的指数为1.24，表示亲水性的指数为1.99，可以确认到能够再现上述的非专利文献所记载的值。
在以下的实施例和比较例中，通过本装置和测定条件，求出表示pH性的指数和表示亲水性的指数。然而，仅比较例2使用了内径为4.6mm的柱，因此使流动相的流量为0.55mL/min(线性流速：3.3cm/min)，使各个试验样品的进样量为4μL。
[实施例1]
(凝胶和柱的制作)
填充剂中，按照日本特开2007-191581号公报所记载的方法，对聚乙烯醇树脂(粒径5.0μm)基材，相对于每1g基材导入了2.09mmol羧基，制作实施例1的聚合物填充剂(导入了羧基的聚合物填充剂)。
另外，将导入到聚乙烯醇树脂基材的羧基量通过滴定进行了定量。
将该聚合物填充剂0.35g加入到0.5mol/L甲酸水溶液1.2ml后，利用超声波浴实施分散处理，在甲酸水溶液中均匀地分散导入羧基的填充剂，调制出浆料溶液。
使用所得的浆料溶液，在圆筒型，并且内径2.0mm、长度150mm的PEEK制外壳(株式会社巴制作所制)中填充了上述的聚合物填充剂。
即，通过向外壳内注入上述的浆料溶液，从外壳的入口侧向着出口侧通液水，从而将浆料溶液以29MPa(恒定压力)加压20分钟，在外壳内形成包含聚合物填充剂的填充层，获得了实施例1的液相色谱柱。
按照上述的方法，求出实施例1的填充剂的表示pH性的指数和表示亲水性的指数，结果能够确认到，表示pH性的指数(可可碱与茶碱的分离系数α1(Tb/Tp))为1.44，表示亲水性的指数(尿苷与2’-脱氧尿苷的分离系数α2(U/2dU))为1.09，尿苷在2’-脱氧尿苷之后被洗脱，因此具有作为HILIC用填充剂的性能。
将对实施例1的聚合物填充剂的分离系数α1(Tb/Tp)和分离系数α2(U/2dU)进行测定时的色谱图示于图1中。另外，在图1中，符号1表示甲苯的峰，符号2表示茶碱(Tp)的峰，符号3表示2’-脱氧尿苷(2dU)的峰，符号4表示尿苷(U)的峰，符号5表示可可碱(Tb)的峰。
(柱的评价)
作为液相色谱分析装置，使用Nexera-i(商品名，株式会社岛津制作所制)，作为检测器，使用紫外检测器(UV，波长：275nm)，进行了实施例1的液相色谱柱的评价。
作为流动相，使用了将乙腈与50mmol/L甲酸水溶液以乙腈：50mmol/L甲酸水溶液＝20：80(混合前体积比)的比例混合而得的混合溶液。
使柱的温度为40℃，使柱内的流动相的流量为0.2mL/min(线性流速：6.0cm/min)，注入尿嘧啶(RP模式下的t0指标物质)50μg/mL与作为胺类化合物的肾上腺素1000μg/mL的混合试样2μL，对尿嘧啶与肾上腺素进行了分离分析。
将柱的评价结果示于表1中，将实施例1的柱的评价中的色谱图示于图2中。另外，在图2中，符号1表示尿嘧啶的峰，符号2表示肾上腺素的峰。
由表1的结果可以确认到：肾上腺素的洗脱时间为9.06分钟，肾上腺素的保留系数(由k＝(t肾上腺素的洗脱时间-t0指标物质的洗脱时间)/t0指标物质的洗脱时间来定义)为4.10，实施例1的液相色谱柱也充分地具有作为组合了RP与离子交换色谱的混合模式的性能。
[实施例2]
(凝胶和柱的制作)
使用与实施例1相同的聚乙烯醇树脂基材，并且通过与实施例1同样的方法，制作出每1g基材导入了1.76mmol羧基的、实施例2的聚合物填充剂(导入了羧基的聚合物填充剂)。
将该聚合物填充剂通过与实施例1同样的方法填充到与实施例1相同的外壳中，获得了实施例2的液相色谱柱。
按照上述的方法，求出实施例2的聚合物填充剂的表示pH性的指数和表示亲水性的指数，结果可以确认到，表示pH性的指数为1.37，表示亲水性的指数为1.19，具有作为HILIC用填充剂的性能。
(柱的评价)
使用与实施例1相同的装置，并且通过与实施例1同样的测定条件，注入尿嘧啶50μg/mL与肾上腺素1000μg/mL的混合试样2μL，将尿嘧啶与肾上腺素进行了分离分析。
将柱的评价结果示于表1中。
由表1的结果可以确认到，肾上腺素的洗脱时间为6.56分钟，肾上腺素的保留系数为2.63，虽然与实施例1相比可见肾上腺素的保留力降低，但是也充分地具有作为组合了RP与离子交换色谱的混合模式的性能。
[实施例3]
(凝胶和柱的制作)
使用与实施例1相同的聚乙烯醇树脂基材，并且通过与实施例1同样的方法，每1g基材导入1.62mmol羧基，制作出实施例3的聚合物填充剂(导入了羧基的聚合物填充剂)。
将该聚合物填充剂通过与实施例1同样的方法填充到与实施例1相同的外壳中，获得了实施例3的液相色谱柱。
按照上述的方法，求出实施例3的聚合物填充剂的表示pH性的指数和表示亲水性的指数，结果能够确认到，表示pH性的指数为1.33，表示亲水性的指数为1.19，具有作为HILIC用填充剂的性能。
(柱的评价)
使用与实施例1相同的装置，并且通过与实施例1同样的测定条件，注入尿嘧啶50μg/mL与肾上腺素1000μg/mL的混合试样2μL，对尿嘧啶与肾上腺素进行了分离分析。
将柱的评价结果示于表1中。
由表1的结果可以确认到，肾上腺素的洗脱时间为6.44分钟，肾上腺素的保留系数为2.57，与实施例1相比可见肾上腺素的保留力降低，但是也充分地具有作为组合了RP与离子交换色谱的混合模式的性能。
[比较例1]
(凝胶和柱的制作)
使用与实施例1相同的聚乙烯醇树脂基材，并且通过与实施例1同样的方法，制作出每1g基材导入了1.38mmol羧基的、比较例1的聚合物填充剂(导入了羧基的聚合物填充剂)。
将该聚合物填充剂通过与实施例1同样的方法填充到与实施例1相同的外壳中，获得了比较例1的液相色谱柱。
按照上述的方法，求出比较例1的聚合物填充剂的表示pH性的指数和表示亲水性的指数，结果可以确认到，表示pH性的指数为1.22，表示亲水性的指数为1.36，具有作为HILIC用填充剂的性能。
(柱的评价)
使用与实施例1相同的装置，并且通过与实施例1同样的测定条件，注入尿嘧啶50μg/mL与肾上腺素1000μg/mL的混合试样2μL，对尿嘧啶与肾上腺素进行了分离分析。
将柱的评价结果示于表1中。
由表1的结果来看，肾上腺素与尿嘧啶未分离而洗脱出。可以认为这是因为，由于表示pH性的指数低，因此特别是不表现离子交换作用，从而并不充分地具有作为组合了RP与离子交换色谱的混合模式的性能。
[比较例2]
作为市售的柱，使用了填充有未导入羧基的二醇基导入型的填充剂的HILIC用柱(商品名：HILIC-1，内径4.6mm，长度150mm，サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社制)。
按照上述的方法，求出比较例2的二醇基导入型的填充剂的表示pH性的指数和表示亲水性的指数，结果可以确认到，表示pH性的指数为1.00，表示亲水性的指数为0.89，虽然为HILIC用柱，但是表示亲水性的指数低于1.00。
(柱的评价)
使用与实施例1相同的装置，使柱内的流动相的流量为1.0mL/min(线性流速：6.0cm/min)，除此以外，通过与实施例1同样的测定条件，注入尿嘧啶50μg/mL与肾上腺素1000μg/mL的混合试样10μL，对尿嘧啶与肾上腺素进行了分离分析。
柱的评价结果示于表1中。
根据表1的结果，肾上腺素在尿嘧啶之前洗脱出。可以认为这是因为，表示pH性的指数低，因此特别是离子交换作用不表现，从而并不充分地具有作为组合了RP与离子交换色谱的混合模式的性能。
[比较例3]
作为市售柱，使用了填充有未导入羧基的酰胺基导入型的填充剂的HILIC用柱(商品名：Amide-80，内径2.0mm，长度150mm，東ソー株式会社制)。
按照上述的方法，求出比较例3的酰胺基导入型的填充剂的表示pH性的指数和表示亲水性的指数，结果可以确认到，表示pH性的指数为1.31，表示亲水性的指数为1.65，具有作为HILIC用填充剂的性能。
(柱的评价)
使用与实施例1相同的装置，并且通过与实施例1同样的测定条件，注入尿嘧啶50μg/mL与肾上腺素1000μg/mL的混合试样2μL，对尿嘧啶与肾上腺素进行了分离分析。
将柱的评价结果示于表1中。
根据表1的结果，肾上腺素的洗脱时间为3.34分钟，肾上腺素的保留系数为0.67，虽然略微保留了肾上腺素，但是与实施例1相比可见肾上腺素的保留力大幅降低。此外，由于表示亲水性的指标高，因此特别是RP作用不表现，从而并不充分地具有作为组合了RP与离子交换色谱的混合模式的性能。
[比较例4]
作为市售柱，使用了表示pH性的指数和表示亲水性的指数的妥当性评价所使用的、ZIC(注册商标)HILIC(内径2.0mm，长度150mm，メルク株式会社制)。
如上所述，可以确认到表示pH性的指数为1.24，表示亲水性的指数为1.99，具有作为HILIC用填充剂的性能。
(柱的评价)
使用与实施例1相同的装置，并且通过与实施例1同样的测定条件，注入尿嘧啶50μg/mL与肾上腺素1000μg/mL的混合试样2μL，对尿嘧啶与肾上腺素进行了分离分析。
将柱的评价结果示于表1中。
根据表1的结果，肾上腺素的洗脱时间为2.94分钟，肾上腺素的保留系数为0.38，虽然略微保留了肾上腺素，但是与实施例1相比可见肾上腺素的保留力大幅降低。此外，表示pH性的指数低，并且表示亲水性的指标高，因此并不充分地具有作为组合了RP与离子交换色谱的混合模式的性能。
Figure GDA0003005048160000171
产业可利用性
本发明涉及由导入了羧基的聚合物填充剂构成的填充剂、填充了该填充剂的液相色谱柱、和使用了该液相色谱柱的胺类化合物的分析方法，上述填充剂是用于分析胺类化合物的液相色谱填充剂，通过HILIC分离模式、或组合了RP与离子交换色谱的混合模式，可以使各种胺类化合物良好地保留、分离。因此，本发明在各种工业中的研究开发、品质试验、以及环境分析等中、对作为医药、食品、肥料、工业用药品等各种物质所包含的重要化合物的胺类化合物进行分析的情况下变得有用。

Claims (3)

1.一种胺类化合物的分析方法，其中，使用具备液相色谱填充剂、和填充了所述液相色谱填充剂的液相色谱用外壳的液相色谱柱，并且使用水溶性有机溶剂与水的混合溶剂作为流动相，
采用所述液相色谱柱进行的分离模式为组合了反相色谱即RP与离子交换色谱的混合模式，所述混合模式中、作为所述流动相的所述混合溶剂中的混合前的体积比是：
水溶性有机溶剂:水＝1:99～70:30，
所述液相色谱填充剂是具有羧基的聚合物填充剂，
所述聚合物填充剂包含导入了羧基的聚乙烯醇树脂或导入了羧基的聚羟基(甲基)丙烯酸酯树脂，
每1g所述聚合物填充剂导入有1.50mmol以上的所述羧基，
基于亲水相互作用色谱即HILIC的、表示所述聚合物填充剂表面的pH性的指数为1.30以上，并且基于亲水相互作用色谱即HILIC的、表示所述聚合物填充剂表面的亲水性的指数为1.00以上且1.30以下，
表示所述聚合物填充剂表面的pH性的指数以对可可碱即Tb与茶碱即Tp进行HILIC分离模式的液相色谱测定时的分离系数α1定义，
表示所述聚合物填充剂表面的亲水性的指数以对尿苷即U与2’-脱氧尿苷即2dU进行HILIC分离模式的液相色谱测定时的分离系数α2定义，
各分离系数α1、α2分别为各自的物质的保留系数k之比，
所述分离系数α1＝k1/k2，k1是可可碱的保留系数，k2是茶碱的保留系数，
所述分离系数α2＝k3/k4，k3是尿苷的保留系数，k4是2’-脱氧尿苷的保留系数，
保留系数k都是在将甲苯的洗脱时间设为t0、将各物质的洗脱时间设为t的情况下，以k＝(t-t0)/t0定义，
其中，所述HILIC分离模式的液相色谱测定条件是：
柱温度为30℃，
流动相为以混合前的体积计，(乙腈)：(添加了乙酸10mmol/L和乙酸铵10mmol/L的水)＝90/10的混合液体。
2.根据权利要求1所述的胺类化合物的分析方法，所述水溶性有机溶剂为选自乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、丁酮和四氢呋喃中的至少1种。
3.根据权利要求2所述的胺类化合物的分析方法，所述水溶性有机溶剂为乙腈。
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