CN105492904A - 分离剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于，提供一种对亲水性化合物的分离有用的亲水相互作用色谱用的新分离剂。一种分离剂，其为由载体和在载体上负载的配体形成的亲水相互作用色谱分离剂，其中，该配体为具有来源于以下列式(I)表示的化合物的构成单元的(甲基)丙烯酸聚合物。在式(I)中，在构成杂环的原子间具有1或2个双键，X1选自S、SCH3 +、O、NH、NCH3、CH2、CHR和CR1R2，X2、X3和X4分别选自N、NH、NCH3、CH2、CHR、NCH3 +、CH、CR、CR1R2，其中R1和R2分别为取代或未取代的碳原子数1~18的烷基、碳原子数6~18的芳基、碳原子数2~18的烯基、碳原子数2~18的炔基、碳原子数7~18的芳烷基、碳原子数2~18的酰基、碳原子数3~18的环烷基、羧基、氨基、碳原子数6~18的芳氧基或碳原子数1~18的烷氧基、卤素、羟基、硝基和氰基中的任一种，其中R为取代或未取代的碳原子数1~18的烷基、碳原子数6~18的芳基、碳原子数2~18的烯基、碳原子数2~18的炔基、碳原子数7~18的芳烷基、碳原子数2~18的酰基、碳原子数3~18的环烷基、羧基、氨基、碳原子数6~18的芳氧基或碳原子数1~18的烷氧基、卤素、羟基、硝基和氰基中的任一种，X1、X2、X3和X4中的至少2个不为CH2、CH、CR或CR1R2，R3为H或CH3。

Description

分离剂
技术领域
本发明涉及色谱用的分离剂，特别是涉及用于亲水性物质的分离的亲水相互作用液相色谱用的分离剂。
背景技术
高效液相色谱(HPLC)是在生命科学、医药学等各种领域得到应用的分析方法之一，近年来特别是在高度的分离或高速领域要求高性能化。HPLC有各种分离模式，作为在目前的HPLC分析中广泛利用的模式，可举出反相色谱(RPLC)。但是，在生命科学领域中重要的生理活性物质、代谢物等为高极性且亲水性的化合物多，在RPLC中这些亲水性化合物的保留变小，因此分离变难。为了分离这样的化合物而设计的是亲水相互作用液相色谱(HydrophilicInteractionLiquidChromatography，HILIC)(非专利文献2)。虽然HILIC可归类于正相液相色谱(NPLC)，但由于在流动相中使用有机溶剂与水或缓冲液的混合溶剂，所以不同于一般的NPLC。在一般的NPLC中，由于在流动相中使用非水溶性溶剂，所以难以溶解亲水性的化合物。但是，在HILIC中，由于利用水系的流动相，所以适合于在正相条件下不洗脱的亲水性化合物的分离。
在专利文献1中，记载了使用硅胶作为载体，并在该载体上结合了来源于丙烯酰胺的结构作为配体的分离剂。
在专利文献2中，记载了负载有将乙烯基四唑聚合而得到的聚合物的分离剂。
另外，在非专利文献1中，作为亲水相互作用色谱用的分离剂，记载了用四唑进行修饰的腈改性二氧化硅。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第2504005号公报
专利文献2：中国专利第101837284号说明书
非专利文献
非专利文献1：Chromatographia,73,865-870(2011)
非专利文献2：J.Chromatography.A,1218,5920-5938(2011)。
发明内容
发明所要解决的课题
专利文献1和2、非专利文献1所记载的分离剂的亲水性不高，有改善的余地。本发明提供一种亲水相互作用色谱用的新分离剂。
解决课题的手段
本发明人着眼于来源于如四唑那样的以式(I)表示的化合物的构成单元的离子相互作用或氢键。
于是，合成具有这样的构成单元的(甲基)丙烯酸单体，发现负载有将该(甲基)丙烯酸单体聚合而得到的配体的分离剂，与市售的以往的亲水相互作用色谱用的分离剂相比，对特定化合物的保留特性优异，从而完成以下所示的本发明。
[1]一种分离剂，所述分离剂是由载体和在载体上负载的配体形成的亲水相互作用色谱分离剂，其中，该配体为具有来源于以下列式(I)表示的化合物的构成单元的(甲基)丙烯酸聚合物。
[化1]
在式(I)中，在构成杂环的原子间具有1或2个双键，X1选自S、SCH3 +、O、NH、NCH3、CH2、CHR和CR1R2，X2、X3和X4分别选自N、NH、NCH3、CH2、CHR、NCH3 +、CH、CR、CR1R2，其中R1和R2分别为取代或未取代的碳原子数1~18的烷基、碳原子数6~18的芳基、碳原子数2~18的烯基、碳原子数2~18的炔基、碳原子数7~18的芳烷基、碳原子数2~18的酰基、碳原子数3~18的环烷基、羧基、氨基、碳原子数6~18的芳氧基或碳原子数1~18的烷氧基、卤素、羟基、硝基和氰基中的任一种，其中R为取代或未取代的碳原子数1~18的烷基、碳原子数6~18的芳基、碳原子数2~18的烯基、碳原子数2~18的炔基、碳原子数7~18的芳烷基、碳原子数2~18的酰基、碳原子数3~18的环烷基、羧基、氨基、碳原子数6~18的芳氧基或碳原子数1~18的烷氧基、卤素、羟基、硝基和氰基中的任一种，X1、X2、X3和X4中的至少2个不为CH2、CH、CR、CR1R2，R3为H或CH3。)
[2][1]所记载的分离剂，其中，上述配体为具有来源于选自氨基咪唑、氨基咪唑啉、氨基噻唑、氨基三唑、氨基四唑、氨基噻二唑、氨基甲基咪唑的化合物的构成单元的(甲基)丙烯酸聚合物。
[3][1]所记载的分离剂，其中，上述配体为具有来源于氨基四唑的构成单元的(甲基)丙烯酸聚合物。
[4][1]所记载的分离剂，其中，上述配体为具有来源于氨基四唑的构成单元的甲基丙烯酸聚合物。
[5][1]~[4]中任一项所记载的分离剂，其特征在于，上述载体为硅胶或二氧化硅整体料(silicamonolith)。
发明的效果
本发明的分离剂是在载体上负载具有来源于以上述式(I)表示的化合物的构成单元的(甲基)丙烯酸聚合物而形成的。根据本发明，提供对进行特定亲水性化合物的分离有用的新分离剂。
附图说明
[图1]为示出在实施例中制备的甲基丙烯酰胺单体的1HNMR测定结果的图。
[图2]为示出用于柱试验的化合物的结构的图。
[图3]为示出比较填充有本发明的分离剂和市售品的分离剂的柱的k(U)而得到的结果的图。
[图4]为示出使用填充有本发明的分离剂和市售品的分离剂的柱的核酸衍生物等8种亲水性化合物的分离结果(色谱图)的图。
[图5]为对填充有本发明的分离剂的柱和市售品的柱，示出将logk(U)和logk(TMPAC)标绘而得到的结果的图。
[图6]为对填充有本发明的分离剂(使用不同的(甲基)丙烯酰胺类单体)的柱和市售品的柱，示出将α(Tb/Tp)和α(U/2dU)标绘而得到的结果的图。
[图7]为对填充有本发明的分离剂(以不同的浓度使用5-甲基丙烯酰胺基-1H-四唑)的柱和市售品的柱，示出将α(Tb/Tp)和α(U/2dU)标绘而得到的结果的图。
[图8]为对本发明的分离剂(整体柱(monolithiccolumn))与市售品和比较对象的柱，示出将α(Tb/Tp)和α(U/2dU)标绘而得到的结果的图。
[图9]为示出使用本发明的分离剂(整体柱)与比较对象的柱分离氟尿嘧啶化合物而得到的色谱图的图。
具体实施方式
<本发明的分离剂所负载的配体>
本发明的分离剂是负载在(甲基)丙烯酸聚合物中含有来源于以式(I)表示的化合物的构成单元的配体而形成的分离剂。
另外，在本发明中所谓的“(甲基)丙烯酸”包含“甲基丙烯酸”和“丙烯酸”这两者。
[化2]
在式(I)中，在构成杂环的原子间具有1或2个双键，X1选自S、SCH3 +、O、NH、NCH3、CH2、CHR和CR1R2，X2、X3和X4分别选自N、NH、NCH3、CH2、CHR、NCH3 +、CH、CR、CR1R2，其中R1和R2分别为取代或未取代的碳原子数1~18的烷基、碳原子数6~18的芳基、碳原子数2~18的烯基、碳原子数2~18的炔基、碳原子数7~18的芳烷基、碳原子数2~18的酰基、碳原子数3~18的环烷基、羧基、氨基、碳原子数6~18的芳氧基或碳原子数1~18的烷氧基、卤素、羟基、硝基和氰基中的任一种，其中R为取代或未取代的碳原子数1~18的烷基、碳原子数6~18的芳基、碳原子数2~18的烯基、碳原子数2~18的炔基、碳原子数7~18的芳烷基、碳原子数2~18的酰基、碳原子数3~18的环烷基、羧基、氨基、碳原子数6~18的芳氧基或碳原子数1~18的烷氧基、卤素、羟基、硝基和氰基中的任一种，X1、X2、X3和X4中的至少2个不为CH2、CH、CR或CR1R2，R3为H或CH3。
在式(I)中，X1、X2、X3和X4分别优选选自S、N、O、NH、NCH3、CH2，更优选选自S、N和NH。
由于在作为配体的(甲基)丙烯酸聚合物中含有来源于以式(I)表示的化合物的构成单元，所以通过来源于式(I)的构成单元的离子相互作用或氢键的作用，对分离剂保留亲水性化合物的能力造成影响。
特别是在使用杂环中具有氮原子的化合物作为以式(I)表示的化合物的情况下，该氮原子作为氢键受体起作用，这对亲水性化合物的保留造成影响。
在上述化合物中，就(甲基)丙烯酰胺基四唑来看，则为在环上含有4个氮原子的化合物，是通过脱质子化而共振稳定化的酸性化合物。此外，四唑上的氮原子作为氢键的受体起作用。
以式(I)表示的化合物也可使用市售的化合物，还可使用公知的方法进行合成。
以式(I)表示的化合物例如可通过使以下的以式(II)表示的化合物与(甲基)丙烯酰氯在例如四氢呋喃那样的溶剂中反应，从而得到具有以式(I)表示的结构的(甲基)丙烯酰胺单体。需说明的是，(甲基)丙烯酰氯指甲基丙烯酰氯或丙烯酰氯。
[化3]
(在式(II)中，在构成杂环的元素间具有1或2个双键，X1~X4表示与式(I)相同的基团，R3表示氢或甲基。)
作为以式(II)表示的化合物的具体实例，例如可列举出以下化合物。
可列举出如5-氨基四唑那样的氨基四唑，如2-氨基咪唑那样的氨基咪唑，如2-氨基-2-咪唑啉那样的氨基咪唑啉，如2-氨基噻唑那样的氨基噻唑，如3-氨基-1,2,4-三唑、4-氨基-1,2,4-三唑那样的氨基三唑，如2-氨基-1,3,4-噻二唑那样的氨基噻二唑和如2-氨基-1-甲基-1H-咪唑那样的氨基甲基咪唑。
由于上述式(I)的(甲基)丙烯酰胺单体中，通过酰胺键将聚合性官能团与杂环键合，所以将其聚合得到的(甲基)丙烯酸聚合物中，通过酰胺键将其主链与上述杂环键合。
通过将上述(甲基)丙烯酰胺单体进行自由基聚合，可得到在(甲基)丙烯酸聚合物中含有来源于以式(I)表示的化合物的构成单元的配体。
上述(甲基)丙烯酰胺单体的自由基(radical)聚合为自由基(freeradical)聚合。与之相对的是，专利文献2所记载的聚合物的聚合通过原子转移自由基聚合(ATRP)来进行，在该聚合法中使用铜络合物作为催化剂。根据该方法，如铜离子那样的金属离子有可能会残留于载体中，该金属离子有可能会对目标物质的分离造成不良影响。由于在本发明中可不使用金属催化剂而进行自由基聚合，所以不会产生由金属离子的残留所引起的问题。
需说明的是，除了以式(I)表示的构成单元以外，本发明的分离剂所负载的配体可在不损害本发明的效果的范围内含有来源于其它化合物的构成单元。
在这种情况下，优选以90摩尔%以上的比例含有以式(I)表示的构成单元。
对于以式(I)表示的化合物的聚合，如下所述，可在载体存在下进行，还可与载体分开进行。在载体存在下进行的情况下，可制成化学键合型的分离剂，在与载体分开进行聚合的情况下，可制备物理吸附型的分离剂。
从亲水性化合物的分离性能的观点出发，优选上述(甲基)丙烯酸聚合物的数均分子量(Mn)和重均分子量(Mw)尽可能大，优选为5000~20000。上述(甲基)丙烯酸聚合物的分子量分散(Mw/Mn)无特殊限定，可列举出1.0~5.0的方案。
由于(甲基)丙烯酸聚合物的分子量变大会增加来源于以式(I)表示的化合物的构成单元在分离剂中的比例，所以有助于提高亲水性化合物的保留能力。
对于在下述载体上负载有上述(甲基)丙烯酸聚合物的分离剂的亲水性，也可通过改变其聚合条件来进行调整。
例如，通过在聚合时降低聚合温度或添加RAFT试剂，可提高负载了生成的聚合物的分离剂的亲水性。
上述(甲基)丙烯酸聚合物的Mn、Mw和Mw/Mn可通过尺寸排阻色谱(SEC)来求得。
上述(甲基)丙烯酸聚合物的Mn、Mw可通过在10~1000的范围内调整在下述聚合工序中使用的聚合引发剂与单体的摩尔比来进行调整。另外，分子量可使用链转移剂而减小。作为链转移剂，例如可使用作为水溶性RAFT剂的二硫代羧酸衍生物。
例如，可通过增大聚合引发剂与单体的摩尔比来增大上述聚合物的Mn、Mw。
作为聚合引发剂，例如可使用过硫酸铵。
本发明的分离剂是在载体上负载含有来源于以式(I)表示的化合物的构成单元的配体而形成的。
作为向载体负载的方案，可列举出物理吸附、化学键合。
在向载体的负载为物理吸附的情况下，可通过以下方法来进行负载：将具有来源于以式(I)表示的化合物的构成单元的配体溶解于适合的溶剂中后，将该溶液涂布于下列载体上后，蒸馏除去溶剂。
通过物理吸附而负载的载体可使用能够容纳于柱管中，且在分离中具有化学耐久性和物理耐久性的载体。作为这样的载体，可使用公知的载体，例如可列举出二氧化硅、氧化铝、氧化镁、玻璃、高岭土、氧化钛、硅酸盐和羟基磷灰石等无机载体，和聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯等有机载体。
从提高对目标物的分离能力的观点出发，上述载体优选为多孔性。载体可为粒子状，也可为一体式地容纳于柱管中的一体型载体，但从分离剂的制备和此时的操作的容易性的观点出发，优选为粒子状。作为这样的载体的具体实例，可列举出硅胶。
在通过化学键合来进行向载体的负载的情况下，例如可使用以下方法。
预先对载体进行表面处理。例如，在使用硅胶作为载体的情况下，使用使丙烯酸类单体与硅烷偶联剂反应得到的化合物作为间隔物，使其与硅胶反应。
可用作间隔物的化合物例如可使(甲基)丙烯酰氯与氨基烷氧基硅烷反应得到。氨基烷基烷氧基硅烷的烷基的碳原子数例如可举出为1~5，烷氧基的碳原子数可举出为1~3。作为氨基烷基烷氧基硅烷的具体实例，可举出3-氨基丙基三乙氧基硅烷。
在如THF那样的溶剂中在三乙胺存在下、使甲基丙烯酰氯与3-氨基丙基三乙氧基硅烷反应的情况下，得到3-甲基丙烯酰胺基丙基三乙氧基硅烷。
使这样得到的间隔物的烷氧基与硅胶反应，将硅胶与间隔物键合。
通过使键合有具有来源于丙烯酸类单体的双键的间隔物的硅胶与上述以式(I)表示的(甲基)丙烯酰胺单体一起发生聚合反应，具有来源于以式(I)表示的化合物的构成单元的(甲基)丙烯酸聚合物与作为载体的硅胶化学键合。作为聚合时使用的溶剂，可使用溶解以式(I)表示的(甲基)丙烯酰胺单体的二甲基甲酰胺(DMF)系的溶剂或水/吡啶。
需说明的是，对于此时的以式(I)表示的(甲基)丙烯酰胺单体的浓度，可列举出50~800mg/mL左右。作为使用甲基丙烯酰胺基四唑的方案，可列举出50~500mg/mL左右，除此之外的丙烯酰胺类单体的浓度例如可列举出300~600mg/mL。通过增加聚合时的上述单体的浓度，可提高得到的分离剂的亲水性基团选择性、疏水性选择性。反应温度可列举出20~100℃，反应时间可列举出1~24小时左右。
即使在不使用硅胶作为载体的情况下，通过在载体表面键合具有如乙烯基那样的聚合性官能团的间隔物，然后使该聚合性官能团与以式(I)表示的(甲基)丙烯酰胺单体的聚合性官能团发生聚合反应，从而可与载体化学键合。
作为载体，从容易进行其表面处理的观点出发，优选在载体的表面具有硅烷醇基的载体。
作为可用作上述间隔物的硅烷偶联剂，可列举出乙烯基甲基氯硅烷、乙烯基二甲基乙氧基硅烷、乙烯基乙基二氯硅烷、乙烯基甲基二乙酰氧基硅烷、乙烯基甲基二乙氧基硅烷、1-乙烯基杂氮硅三环(1-vinylsilatrane)、乙烯基三乙酰氧基硅烷、乙烯基三氯硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三苯氧基硅烷、乙烯基三(2-甲氧基乙氧基)硅烷、乙烯基三异丙氧基硅烷、苯乙烯基乙基三甲氧基硅烷、甲基丙烯酰氧基丙基二甲基氯硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-甲基丙烯酰氧基丙基三(甲氧基乙氧基)硅烷、3-丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-丙烯酰氧基丙基甲基二甲氧基硅烷、1,3-二乙烯基-1,3-二甲基-1,3-二氯二硅氧烷、1,3-二乙烯基四乙氧基二硅氧烷、1,3-二乙烯基四甲基二硅氮烷等。
作为载体的粒径，无论配体向载体的负载是物理吸附还是化学键合，通常使用3~15μm的载体。
相对于100重量份的分离剂总量，上述配体对上述载体的负载量通常为10~30重量部，优选为15~25重量部。
另外，也可使用整体载体作为载体，这样的整体载体例如可列举出二氧化硅整体料，所述二氧化硅整体料可如以下反应式所示，通过由烷氧基硅烷的水解和缩聚而引起的溶胶-凝胶法而得到。
Si(OR)4+H2O→Si(OH)(OR)3+ROH
Si-OH+Si-OH→Si-O-Si+H2O
Si-OH+Si-OR→Si-O-Si+ROH
烷氧基硅烷的水解和缩聚可根据使用的柱的形态，例如在毛细管柱中进行。
作为烷氧基硅烷的烷氧基，可列举出碳原子数为1~5左右的烷氧基，其中可优选列举出甲氧基、乙氧基。
除此之外，也可使用日本特开2006-150214号公报所记载的具有大微孔和在该大微孔的内壁面形成的中微孔的一体型的无机类多孔体(整体载体)。
作为毛细管柱，可列举出熔融二氧化硅毛细管。熔融二氧化硅毛细管可通过公知的方法来进行制作，也可处理市售品的柱的内壁而得到。
二氧化硅溶胶-凝胶反应可使用公知的条件。
另外，作为整体柱，除了二氧化硅整体料以外，也可使用公知的聚合物整体料。
在使用这样的聚合物整体料的情况下，可通过物理吸附而在其上负载具有来源于以式(I)表示的化合物的构成单元的聚合物进行使用。
在使用二氧化硅整体料的情况下，作为向该整体料的负载方法，可列举出上述化学键合。
具体而言，对于预先制备的二氧化硅整体料，使用使丙烯酸类单体与硅烷偶联剂反应得到的化合物作为间隔物，使其与二氧化硅整体料反应。例如，若使3-氨基丙基三乙氧基硅烷与甲基丙烯酰氯反应，则得到3-甲基丙烯酰胺基丙基三乙氧基硅烷。
使这样得到的间隔物的烷氧基与硅胶反应，将硅胶与间隔物键合。
通过使键合有具有来源于丙烯酸类单体的双键的间隔物的二氧化硅整体料与上述以式(I)表示的(甲基)丙烯酰胺单体一起发生聚合反应，具有来源于以式(I)表示的化合物的构成单元的(甲基)丙烯酸聚合物与作为载体的二氧化硅整体料化学键合。
此时的(甲基)丙烯酰胺类单体的浓度可列举出50~800mg/mL左右。作为使用甲基丙烯酰胺基四唑的方案，可列举出50~500mg/mL左右，除此之外的丙烯酰胺类单体的浓度例如可列举出300~600mg/mL。通过增加聚合时的上述单体的浓度，可提高得到的分离剂的亲水性基团选择性、疏水性选择性。例如，反应温度可列举出20~100℃，反应时间可列举出1~24小时左右。
实施例
通过实施例来更具体地说明本发明，但本发明只要不超出其要旨，则不限于以下实施例的记载。
以下示出本发明的实施例。
1.5-甲基丙烯酰胺基-1H-四唑的合成
<实验操作>
(1)用30分钟向3.09g的5-氨基-1H-四唑、90mL的四氢呋喃、11.4mL的水的溶液中滴加3.79mL的甲基丙烯酰氯，在3小时后加入90mL的水，冷藏保存。
(2)将该溶液抽滤，将滤纸上的白色固体真空干燥。
[化4]
5-甲基丙烯酰胺基-1H-四唑的合成
<结果>
将制备的(甲基)丙烯酰胺单体的1HNMR测定结果示出于图1中。收率为70％。
2.含有四唑的聚合物修饰型固定相(PTz)的合成
2-1.3-甲基丙烯酰胺基丙基三乙氧基硅烷(MAS)的合成和向硅胶的负载
<实验操作>
(1)将11.09g的3-氨基丙基三乙氧基硅烷溶解于25mL的THF中，加入7.39mL的三乙胺。
(2)在冰冷却下用30分钟滴加5.08mL的甲基丙烯酰氯。
(3)在21小时后，将该溶液抽滤，用蒸发器进行浓缩后，进行真空干燥。(MAS的分离)
(4)在13.67g的经干燥的硅胶中加入60mL的甲苯，于120℃进行蒸留(共沸)。
(5)加入MAS、8.46g的吡啶和氢醌，加热回流24小时。
(6)在回流结束后，用甲醇进行过滤，将滤纸上的固体干燥。(MAS-Si的分离)。
2-2.利用甲基丙烯酰胺单体的聚合的固定相合成
<实验操作>
(1)相对于700mg的MAS-Si，使用400~1300mg的甲基丙烯酰胺单体，在5mL的溶剂中，于60℃进行3小时的自由基聚合。引发剂均使用过硫酸铵，溶剂设为水/吡啶=4/1。
(2)在聚合后，用甲醇和丙酮进行过滤，并进行干燥。
(3)使用20mL的调浆溶剂(slurrysolvent,甲醇/水=4/1)将制备好的填充剂填充于不锈钢柱中。
[化5]
PTz固定相的合成
3.利用柱试验法的特性评价
3-1.柱试验法
使用柱试验法，针对表1的各项目，对表2所示的各分离剂进行评价。
测定条件
流动相：α(AX)、α(CX)…乙腈(ACN)/AcONH4缓冲液(100mM，pH4.76)
上述以外的项目…乙腈(ACN)/AcONH4缓冲液(20mM，pH4.76)
柱温：30℃
检测器：UV254nm。
<结果与考察>
将实施例的柱(以下也称为PTz柱)和市售的柱(TSKgelAmide-80、Halo-HILIC)的测定结果示出于表2中。关于尿苷的保留k(U)，在实施例的柱中得到k(U)=4.562~8.944的值。这为市售柱中具有最大保留的TSKgelAmide-80的k(U)=4.58的同等以上，也有远超过市售柱的值。表示亲水性选择性的大小的α(OH)的值为1.927~2.25。因此，认为该PTz柱对尿苷等亲水性物质的保留、选择性非常高。另外，α(Tb/Tp)的值为1以上，由此认为是酸性型的分离剂。作为图3，示出比较实施例的柱和市售品的柱的k(U)而得到的结果。
[表1]
表1.柱试验的项目.
[表2]
表2.本发明的分离剂与未负载有(甲基)丙烯酸聚合物的分离剂、市售的分离剂的柱试验的结果
4.与市售的柱的比较
将8种核酸和核酸碱基作为样品，用PTz柱(实施例)、TSKgelAmide-80(5μm)、Halo-HILIC这3种柱比较其分离性能。
<结果与考察>
将8种样品(鸟嘌呤、鸟苷、尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、腺苷、胞嘧啶、胞苷)的分离性能比较的结果示出于图4中。
测定条件
流动相：ACN/20mMAcONH4缓冲液=90/10
检测器：UV254nm
柱温：30℃。
如图4的色谱图所示，在Amide-80(5μm)中腺苷与尿苷同时洗脱而无法分离，在Halo-Hilic中腺嘌呤与腺苷同时洗脱而无法分离。与之相对的是，只有PTz可达成这8种化合物全部的分离。因此，确认PTz柱对如核苷或核酸类那样的亲水性化合物的分离性能高。
<参考例：关于柱的分类(与市售的柱的比较)>
使用在柱试验法中利用的试样，将logk(U)(k(尿苷)的对数值)和logk(TMPAC)(k(三甲基苯基氯化铵)的对数值)的值标绘，由此可将柱分类。
这种方法的优点在于，在将性质未知的柱分类时，可只使用2种样品进行分类，可简便地进行分类。使用15根市售的柱(参照图5)和PTz柱进行这种标绘。
<结果>
将使用logk(U)和logk(TMPAC)标绘的结果示出于图5中。如由此所察的那样，市售的柱可分类为胺类、二氧化硅类、酰胺类等。其中，PTz柱的性质与酰胺类的柱相似。
通过与上述1.相同的方法，制备以下表3所示的(甲基)丙烯酰胺单体。但是，在将3-氨基-1,2,4-三唑和5-氨基-1H-四唑作为原料的反应中不使用四氢呋喃而只在水性溶剂中进行反应，并使用碳酸氢钾作为碱。这些单体的生成通过1HNMR和MS进行确认，得到一致的结果。
[表3]
表3.(甲基)丙烯酰胺单体(IUPAC名称(上层)和简称(下层))的结构
在以下表4所记载的条件下，将用在上述2-1.中制备的3-甲基丙烯酰胺基丙基三乙氧基硅烷(MAS)修饰的硅胶粒子和硅胶粒子状的在上述表3中记载的(甲基)丙烯酰胺单体聚合。需说明的是，由于MAthiazole、MAthiadiazole的单体和聚合物的水溶性低，所以在溶解所有单体的二甲基甲酰胺(DMF)系中进行聚合。
[表4]
*聚合温度60℃、聚合时间3小时是通用的；
+APS(过硫酸铵)使用将5mg溶解于1mL的水-DMF(3:7，v/v)得到的溶液。
<结果与考察>
将使用实施例的柱(以下也称为PTz柱)和市售的柱(TSKgelAmide-80、Halo-HILIC)的柱试验的结果示出于表5中。需说明的是，TSKgelAmide-80为聚丙烯酰胺修饰型的柱，Halo-HILIC为未修饰的二氧化硅型的柱。
[表5]
关于尿苷的保留k(U)，在使用表4所记载的单体(MAtetrazole除外)的柱中得到k(U)=0.40~0.57的值。若与使用同时聚合的MAtetrazole的柱的k(U)=5.15相比，则该值小从而亲水性不高，但该值是可用作亲水性色谱用的分离剂的值。另外，在MAthiadiazole、MAtriazole、AAtetrazole的情况下，表示固定相表面的pH的状态的α(Tb/Tp)的值为1以下，表示用这些单体修饰的固定相表面为碱性。
与在水中进行聚合的情况相同，使用MAtetrazole的固定相的α(Tb/Tp)为1以上，由此认为是酸性型的分离剂。
在AAtetrazole型固定相中，α(Tb/Tp)为0.68，显示碱性的性质。
接着，若横轴取α(OH)、纵轴取α(Tb/Tp)，对各柱的值进行标绘，则如图6所示。若α(Tb/Tp)在1附近，则表示为中性的表面，若为1以上，则表示为酸性的表面，若为1以下，则表示为碱性的表面。α(OH)越大，表示羟基的选择性越高，标绘的右上方为亲水性变大的方向。使用表4所记载的单体制备的固定相相当于16~20。
通过MAthiazole、MAthiazdiazole的聚合修饰可制备中性~弱碱性的HILIC固定相，通过MAtriazole的聚合修饰可制备碱性的HILIC固定相。在表3所记载的使用的条件下，MAtetrazole修饰型柱的标绘位置局限于两性离子型的区域，但k(U)=10的MAtetrazole修饰型柱的标绘出现在最右上方的区域。
对于在实施例1中制备的PTz柱，示出图7作为显示各单体浓度的分离特性的图。纵轴和横轴与图6相同，图中的符号的数字也指与图6相同的对象。根据图7所示的结果，通过增加单体浓度可提高PTz柱的亲水性和选择性。
<实施例2：一体型载体(整体柱)>
1.多孔性二氧化硅整体柱的制备
多孔性二氧化硅整体料的制备通过公知的方法来进行。具体而言，通过由烷氧基硅烷的水解、缩聚而引起的溶胶-凝胶法来进行。
2.熔融二氧化硅毛细管的内壁处理
向100μmI.D.×375μmO.D.的熔融二氧化硅毛细管柱(PolymicroTechnologies)中输送1N-氢氧化钠，于40℃放置3小时。接着，用1N-盐酸进行清洗后，于40℃放置3小时。最后，按超纯水、丙酮的顺序进行清洗，并进行干燥。
3.混合(hybrid)型二氧化硅整体毛细管柱的制备
在冰冷却下向0.9g的聚乙二醇(PEG)和2g的尿素中加入20ml的0.01N醋酸并搅拌30分钟。向混合溶液中滴加四甲氧基硅烷与甲基三甲氧基硅烷的混合烷氧基硅烷(3:1vol/vol)9ml，并进行30分钟的搅拌。进而，于40℃加热10分钟后，将混合溶液用PTFE过滤器(0.45μm)过滤。将该混合溶液注入进行过内壁处理的熔融二氧化硅毛细管中，于40℃进行24小时的反应以使其凝胶化。接着，在将两端浸渍于0.06g/ml尿素水中的状态下将该毛细管于90℃进行加热陈化处理(24小时)，然后于120℃进行4小时的热处理。通过进行热处理而使骨架再结合，以及通过由尿素的分解产生的氨导致二氧化硅溶解，由此形成间隙孔。然后，用甲醇清洗毛细管内部。最后，由毛细管内使其完全干燥而进行热处理，得到二氧化硅整体毛细管柱。
4.二氧化硅整体毛细管柱的使用MAS的甲硅烷基化
用注射泵向用甲醇、甲苯置换过的二氧化硅整体毛细管柱中输送24小时的MAS、甲苯、吡啶混合溶液(体积比=1:1:1)(反应温度为80℃)。然后，用甲苯进行毛细管内部的清洗。再次进行相同的操作以进行二氧化硅整体毛细管柱的MAS化。
5.聚合修饰型固定相的制备
在室温下向事先用水置换过的MAS柱中输送足量的含有聚合引发剂的单体(与在实施例1中制备的单体相同的单体)溶液，在柱内进行单体溶液的填充。然后，在设定为各自的聚合温度(60℃)的水浴中投入将两端盖严的柱并进行规定时间的聚合。最后，通过HPLC泵输送水或甲醇，清洗毛细管内部，由此得到聚合修饰型二氧化硅整体毛细管柱。单体的结构示出于图1中，聚合条件如下所示。
·聚合修饰型固定相的制备条件
单体浓度：150mg/ml
反应时间：2hr
引发剂：5mg(过硫酸铵)/1%NH3水溶液。
测定条件
与实施例1相同的条件
[表6]
表6.整体柱的柱试验结果
<整体柱的制备-2>
在实施例2的4.中制备的MAS化的二氧化硅整体毛细管中填充在下列条件下制备的单体溶液，如以下表7所示，改变单体的浓度，进行柱内聚合反应，得到各整体柱。
引发剂：过硫酸铵(5mg/ml于4.1mol/lNH3水溶液中)
温度60℃
反应时间：2hr
由于将该单体聚合而生成的聚合物在水或MeOH中的溶解性充足，所以单体的投料量较大。在该实验中利用其投料量范围的广度，进行单体的投料量与柱性能(保留、选择性)的评价。将结果示出于表7中。
[表7]
色谱条件：
流动相：AN90%-20mMAcONH4缓冲液pH4.7；流速：0.5ml/min；压力：12kgf；温度：30℃；检测：254nm；样品：α(CH2)：k(尿苷)/k(5-甲基尿苷)，α(OH)：k(尿苷)/k(2’-脱氧尿苷)，α(Tb/Tp)：k(可可碱)/k(茶碱)，α(V/A)：k(阿糖腺苷)/k(腺苷)，α(2dG/3dG)：k(2’-脱氧鸟苷)/k(3’-脱氧鸟苷)，k(TPA)：N,N,N-三甲基苯基氯化铵。
在如上制备的整体柱中，使用单体浓度为200mg/ml的柱(PTZ200)与各种HILIC型整体柱和粒子填充型柱，比较分离特性。色谱条件、分离对象的样品与表7相同。将结果示出于表8和图8中。图8的纵轴和横轴与图6相同，图中的符号的数字也指与图6相同的对象。将表8所记载的PSDMA、PAAm、PAEMA的各单体的结构示出于图8中。
[表8]
本发明所涉及的PTZ-200在整体柱(聚合修饰整体料型)中表现最大的保留。另外，若与粒子填充型柱相比，则具有ZIC-HILIC的1.75倍、NH2-MS的1.51倍、Amide-80的0.8倍的保留能力。若考虑整体柱的孔隙率，则可知PTZ-200显现非常大的保留。该特征可以说十二分地弥补整体柱的弱点即保留能力的低下。
另外，关于选择性，与其它的柱相比，显示特征性的值。亲水性选择性显示最大的值，疏水性选择性也显示较大的值。就OH基的倾向、位置选择性而言，其它的色谱柱得到较大的结果。
另外，使用以下柱进行氟尿嘧啶的类似物的分离，所述柱是使用改变单体浓度制备的PTZ-150和上述表8所记载的PSDMA、PAEMA、PAAm进行制备的柱。作为分离对象的化合物组的结构极其相似，通常难以将它们同时分离。将结果示出于图9中。
色谱条件和作为分离对象的化合物如下所示。
流动相：AN90%20mMAcONH4缓冲液；柱：a：PSDMA26cm，b：PAEMA26cm，c：PAAm25cm，d：PTZ-15026.7cm；流速：0.5ml/min；压力：15kgf；温度：30℃；检测：254nm
样品1：甲苯，2：三氟胸苷，3：5’-脱氧-5-氟尿苷，4：2’-脱氧-5-氟尿苷，5：2’-脱氧-2’-氟尿苷，6：胸苷，7：2’-脱氧尿苷，8：5-氟尿苷，9：尿苷。
根据图9的结果，在PSDMA、PAEMA中无法分离所有的化合物。在PAAm中可确认所有的峰顶，但4、5、6、7的样品无法完全分离。但是，PTZ-150柱可完全分离所有的化合物。这是通过作为PTZ特征的大的保留和良好的选择性而达成分离的一个实例。
在本发明中，通过将具有来源于以式(I)表示的化合物的结构的单体在如硅胶那样的载体上聚合、修饰而开发新分离剂。在填充有本发明所开发的分离剂的柱中，负载有MAtetrazole的分离剂为弱酸性型的柱，显示尿苷的保留和亲水性选择性极高的特性。在本发明的分离剂中，与市售的柱相比，特别是使用负载有MAtetrazole的分离剂的柱的亲水性物质的保留和选择性非常大，而且核苷或核酸碱基的分离性能优异。
产业上的可利用性
预计本发明的分离剂对目前为止难以分离的各种亲水性化合物的分离非常有用。因此，具有本发明的分离剂的柱不仅可期待发现或改良今后的生物关联物质(也包含糖类、肽、蛋白质)的新分离条件，而且可期待提高分离的生物关联物质的鉴定、分析的便利性。

Claims (5)

1.一种分离剂，所述分离剂是由载体和在载体上负载的配体形成的亲水相互作用色谱分离剂，其中，所述配体为具有来源于以下列式(I)表示的化合物的构成单元的(甲基)丙烯酸聚合物：
[化1]
在式(I)中，在构成杂环的原子间具有1或2个双键，X1选自S、SCH3 +、O、NH、NCH3、CH2、CHR和CR1R2，X2、X3和X4分别选自N、NH、NCH3、CH2、CHR、NCH3 +、CH、CR、CR1R2，其中R1和R2分别为取代或未取代的碳原子数1~18的烷基、碳原子数6~18的芳基、碳原子数2~18的烯基、碳原子数2~18的炔基、碳原子数7~18的芳烷基、碳原子数2~18的酰基、碳原子数3~18的环烷基、羧基、氨基、碳原子数6~18的芳氧基或碳原子数1~18的烷氧基、卤素、羟基、硝基和氰基中的任一种，其中R为取代或未取代的碳原子数1~18的烷基、碳原子数6~18的芳基、碳原子数2~18的烯基、碳原子数2~18的炔基、碳原子数7~18的芳烷基、碳原子数2~18的酰基、碳原子数3~18的环烷基、羧基、氨基、碳原子数6~18的芳氧基或碳原子数1~18的烷氧基、卤素、羟基、硝基和氰基中的任一种，X1、X2、X3和X4中的至少2个不为CH2、CH、CR、CR1R2，R3为H或CH3。
2.权利要求1所述的分离剂，其中，所述配体为具有来源于选自氨基咪唑、氨基咪唑啉、氨基噻唑、氨基三唑、氨基四唑、氨基噻二唑、氨基甲基咪唑的化合物的构成单元的(甲基)丙烯酸聚合物。
3.权利要求1所述的分离剂，其中，所述配体为具有来源于氨基四唑的构成单元的(甲基)丙烯酸聚合物。
4.权利要求1所述的分离剂，其中，所述配体为具有来源于氨基四唑的构成单元的甲基丙烯酸聚合物。
5.权利要求1~4中任一项所述的分离剂，其特征在于，所述载体为硅胶或二氧化硅整体料。
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