JPWO2015005361A1 - 分離剤 - Google Patents
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Abstract
Description
特許文献2には、ビニルテトラゾールを重合して得られるポリマーが担持されてなる分離剤が記載されている。
また、非特許文献1には、親水性相互作用クロマトグラフィー用の分離剤として、テトラゾールで修飾されたニトリル改質シリカが記載されている。
そして、そのような構成単位を有する(メタ)アクリルモノマーを合成し、その(メタ)アクリルモノマーを重合して得られるリガンドが担持された分離剤が、市販されている従来の親水性相互作用クロマトグラフィー用の分離剤に比べ、特定の化合物に対して保持特性に優れることを見出し、以下に示す本発明を完成させた。
[2] 前記リガンドが、アミノイミダゾール、アミノイミダゾリン、アミノチアゾール、アミノトリアゾール、アミノテトラゾール、アミノチアジアゾール、アミノメチルイミダゾールからなる群から選ばれる化合物に由来する構成単位を有する(メタ)アクリルポリマーである、[1]に記載の分離剤。
[3] 前記リガンドがアミノテトラゾールに由来する構成単位を有する(メタ)アクリルポリマーである、[1]に記載の分離剤。
[4] 前記リガンドがアミノテトラゾールに由来する構成単位を有するメタクリルポリマーである、[1]に記載の分離剤。
[5] 前記担体がシリカゲルまたはシリカモノリスであることを特徴とする[1]〜[4]のいずれかに記載の分離剤。
本発明の分離剤は、式(I)で示される化合物に由来する構成単位が、(メタ)アクリルポリマーに含まれているリガンドが担持されて形成されるものである。
また、本発明でいう「(メタ)アクリル」には、「メタクリル」と「アクリル」の両方を含むものである。
特に、式(I)で示される化合物として、複素環に窒素原子を有する化合物を用いた場合には、その窒素原子が水素結合受容体として働き、これが親水性化合物の保持に影響を与える。
上記の化合物のうち、(メタ)アクリルアミドテトラゾールについて見ると、環に4つの窒素原子を含む化合物であり、脱プロトン化することにより共鳴安定化する酸性化合物である。さらにテトラゾール上の窒素原子は水素結合の受容体として働く。
式(I)で示される化合物は、例えば以下の式(II)で示される化合物と(メタ)アクリロイルクロリドとを、例えばテトラヒドロフランのような溶媒中で反応させることで、式(I)で示される構造を有する(メタ)アクリルアミドモノマーを得ることができる。なお、(メタ)アクリロイルクロリドは、メタクリロイルクロリドまたはアクリロイルクロリドを意味する。
5−アミノテトラゾールのようなアミノテトラゾール、2−アミノイミダゾールのようなアミノイミダゾール、2−アミノ−2−イミダゾリンのようなアミノイミダゾリン、2−アミノチアゾールのようなアミノチアゾール、3−アミノ−1,2,4−トリアゾール、4-アミノ−1,2,4−トリアゾールのようなアミノトリアゾール 、2−アミノ−1,3,4−チアジアゾールのようなアミノチアジアゾール及び2−アミノ−1−メチル−1H−イミダゾールのようなアミノメチルイミダゾールが挙げられる。
上述した(メタ)アクリルアミドモノマーのラジカル重合は、フリーラジカル重合である。これに対し、特許文献2に記載のポリマーの重合は、原子移動ラジカル重合(ATRP)により行われるものであり、この重合法では銅錯体を触媒として用いる。この方法によれば、銅イオンのような金属イオンが担体に残存する可能性があり、この金属イオンが目的物質の分離に悪影響を及ぼす可能性がある。本発明では金属触媒を用いずにラジカル重合を行うことができるので、金属イオンの残存に起因する問題が生じない。
なお、本発明の分離剤に担持されるリガンドは、式(I)に示される構成単位に加えて、本発明の効果を損なわない範囲で他の化合物に由来する構成単位を含んでいてもよい。
その場合、式(I)で示される構成単位の割合が90モル%以上含まれていることが好ましい。
(メタ)アクリルポリマーの分子量が大きくなることは、式(I)で示される化合物に由来する構成単位の分離剤における割合が増えることにより、親水性化合物の保持力を高めることに寄与する。
例えば、重合の際に重合温度を低くしたり、RAFT試薬を添加することで、生成するポリマーが担持された分離剤の親水性を上げることができる。
例えば、前記ポリマーのMnやMwを大きくすることは、重合開始剤とモノマーとのモル比を大きくすることにより可能となる。
重合開始剤としては、例えば過硫酸化アンモニウムを用いることができる。
担体への担持の態様としては、物理的な吸着や化学的な結合を挙げることができる。
担体への担持が物理的吸着である場合には、式(I)で示される化合物に由来する構成単位を有するリガンドを適当な溶剤に溶解させた後、その溶液を下記の担体に塗工した後、溶剤を留去することによって担持させることができる。
物理的吸着により担持させる担体は、カラム管に収容され、分離における化学的及び物理的な耐久性を有する担体を用いることができる。このような担体としては、公知の担体を用いることができ、例えば、シリカ、アルミナ、マグネシア、ガラス、カオリン、酸化チタン、ケイ酸塩、及びヒドロキシアパタイト等の無機担体、及び、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート等の有機担体、が挙げられる。
前記担体は、目的物に対する分離能を高める観点から、多孔質であることが好ましい。担体は粒子状であってもよいし、カラム管に一体的に収容される一体型担体であってもよいが、分離剤の製造及びそのときの取り扱いの容易さの観点から、粒子状であることが好ましい。このような担体の具体例としてはシリカゲルが挙げられる。
担体に予め表面処理を行う。例えば、担体としてシリカゲルを用いる場合、アクリル系モノマーとシランカップリング剤を反応させて得られる化合物をスペーサーとして用い、これをシリカゲルと反応させる。
スペーサーとして用いることのできる化合物は、例えば(メタ)アクリロイルクロリドとアミノアルコキシシランを反応させて得ることができる。アミノアルキルアルコキシシランのアルキル基の炭素数は、例えば1〜5のものを挙げることができ、アルコキシ基の炭素数は1〜3のものを挙げることができる。アミノアルキルアルコキシシランの具体例としては、3−アミノプロピルトリエトキシシランを挙げることができる。
THFのような溶媒の中でトリエチルアミンの存在下、メタクリロイルクロリドと3−アミノプロピルトリエトキシシランを反応させた場合には、3−メタクリルアミドプロピルトリエトキシシランが得られる。
このようにして得られたスペーサーのアルコキシ基と、シリカゲルとを反応させ、シリカゲルとスペーサーを結合させる。
なお、この際の式(I)で示される(メタ)アクリルアミドモノマーの濃度については、50〜800mg/mL程度を挙げることができる。メタクリルアミドテトラゾールを用いる態様としては50〜500mg/mL程度を挙げることができ、それ以外のアクリルアミド系モノマーの濃度は、例えば300〜600mg/mLを挙げることができる。重合の際の前記モノマーの濃度を増加させることで、得られる分離剤の親水性基選択性や疎水性選択性を高めることができる。反応温度は20〜100℃、反応時間は1〜24時間程度を挙げることができる。
担体としては、その表面処理を容易に行う観点から、シラノール基を担体の表面に有しているものが好ましい。
上記のスペーサーとして用いることのできるシランカップリング剤としては、ビニルメチルクロロシラン、ビニルジメチルエトキシシラン、ビニルエチルジクロロシラン、ビニルメチルジアセトキシシラン、ビニルメチルジエトキシシラン、1−ビニルシラトラン、ビニルトリアセトキシシラン、ビニルトリクロロシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリフェノキシシラン、ビニルトリス(2−メトキシエトキシ)シラン、ビニルトリイソプロポキシシラン、スチリルエチルトリメトキシシラン、メタクリロキシプロピルジメチルクロロシラン、3−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、3−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、3−メタクリロキシプロピルトリス(メトキシエトキシ)シラン、3−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、3−アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、1,3−ジビニル−1,3−ジメチル−1,3−ジクロロジシロキサン、1,3−ジビニルテトラエトキシジシロキサン、1,3−ジビニルテトラメチルジシラザンなどを挙げることができる。
Si(OR)4 + H2O → Si(OH)(OR)3 + ROH
Si-OH + Si-OH → Si-O-Si + H2O
Si-OH + Si-OR → Si-O-Si + ROH
アルコキシシランの加水分解及び重縮合は、使用するカラムの形態に応じて、例えばキャピラリーカラムの中で行わせてもよい。
アルコキシシランのアルコキシ基としては、炭素数が1〜5程度のものを挙げることができ、その中でもメトキシ基、エトキシ基を好ましく挙げることができる。
上記の他にも、特開2006−150214号公報に記載の、マクロ細孔と該マクロ細孔の内壁面に形成される中細孔を有する一体型の無機系多孔質体(モノリス担体)も使用することができる。
キャピラリーカラムとしては、フューズドシリカキャピラリーを挙げることができる。フューズドシリカキャピラリーは、公知の方法により作製することもできるし、市販品のカラムの内壁を処理して得ることもできる。
シリカゾル−ゲル反応は、公知の条件を用いることができる。
このようなポリマーモノリスを用いる場合には、これに物理的吸着により、式(I)で表される化合物に由来する構成単位を持ったポリマーを担持させて用いることができる。
具体的には、予め調製したシリカモノリスに、アクリル系モノマーとシランカップリング剤を反応させて得られる化合物をスペーサーとして用い、これをシリカモノリスと反応させる。例えば、3−アミノプロピルトリエトキシシランとメタクリルクロリドを反応させると、3−メタクリルアミドプロピルトリエトキシシランが得られる。
このようにして得られたスペーサーのアルコキシ基と、シリカゲルとを反応させ、シリカゲルとスペーサーを結合させる。
アクリル系モノマーに由来する二重結合を有するスペーサーが結合したシリカモノリスと、前述した式(I)で示される(メタ)アクリルアミドモノマーとを共に重合反応を起こさせることで、式(I)で示される化合物に由来する構成単位を有する(メタ)アクリルポリマーが担体であるシリカモノリスと化学的に結合する。
その際の(メタ)アクリルアミド系モノマーの濃度は50〜800mg/mL程度を挙げることができる。メタクリルアミドテトラゾールを用いる態様としては50〜500mg/mL程度を挙げることができ、それ以外のアクリルアミド系モノマーの濃度は、例えば300〜600mg/mLを挙げることができる。重合の際の前記モノマーの濃度を増加させることで、得られる分離剤の親水性基選択性や疎水性選択性を高めることができる。例えば反応温度は20〜100℃、反応時間は1〜24時間程度を挙げることができる。
1. 5−メタクリルアミド−1H−テトラゾールの合成
<実験操作>
(1) 5−アミノ−1H−テトラゾール 3.09g、テトラヒドロフラン90mL, 水11.4mLの溶液にメタクリロイルクロリド3.79mLを30分かけて滴下し、3時間後に水90mLを加え、冷蔵保存した。
(2)この溶液を吸引ろ過し、ろ紙上の白い固体を真空乾燥した。
作製した(メタ)アクリルアミドモノマーの1H NMRの測定結果を図1に示す。収率は70%であった。
2-1. 3−メタクリルアミドプロピルトリエトキシシラン(MAS)の合成およびシリカゲルへの担持
<実験操作>
(1)3−アミノプロピルトリエトキシシラン11.09gをTHF25mLに溶解し、 トリエチルアミン7.39mLを加えた。
(2)氷冷下でメタクリロイルクロライド5.08mLを30分かけて滴下。
(3)21時間後、この溶液を吸引ろ過し、 エバポレーターで濃縮後、真空乾燥を行った。(MASの単離)
(4)乾燥させたシリカゲル13.67gにトルエン60mLを加え、120℃で蒸留(共沸)した。
(5)MAS、ピリジン8.46gおよびヒドロキノンを加え、24時間加熱還流した。
(6)還流終了後、メタノールでろ過し、ろ紙上の固体を乾燥した。(MAS-Siの単離)
<実験操作>
(1)MAS-Si 700mgに対し、400〜1300mgのメタクリルアミドモノマーを用い、溶媒5mL中で、60℃、3時間ラジカル重合を行った。開始剤には、すべて過硫酸アンモニウムを用い、溶媒は水/ピリジン=4/1とした。
(2)重合後、メタノールおよびアセトンでろ過し、乾燥した。
(3)出来上がった充填剤を、スラリー溶媒(メタノール/水=4/1)20mLを用いてステンレスカラムに充填した。
3-1. カラムテスト法
カラムテスト法を用いて、表1の各項目について表2に示す各分離剤について評価を行った。
測定条件
移動相: α(AX), α(CX)…Acetonitrile (ACN)/AcONH4 buffer (100 mM, pH 4.76 )
上記以外の項目…Acetonitrile (ACN)/AcONH4 buffer (20 mM, pH 4.76 )
カラム温度: 30 °C
検出器: UV 254 nm
実施例のカラム(以下、PTzカラムともいう)及び市販のカラム(TSKgel Amide-80, Halo−HILIC)の測定結果を表2に示した。ウリジンの保持k(U)に関して、実施例のカラムではk(U)=4.562〜8.944の値が得られた。これは、市販カラムの中で最大の保持を有するTSKgel Amide-80のk(U)=4.58と同等以上であり、大きく上回るものもあった。親水性選択性の大きさを表すα(OH)の値は1.927〜2.25であった。よって、このPTzカラムはウリジンなどの親水性物質に対しての保持や選択性が非常に高いと考えられる。また、α(Tb/Tp)の値が1以上であることから、酸性型の分離剤であると考えられる。図3として、実施例のカラムと市販品のカラムのk(U)を比較した結果を示す。
8種の核酸および核酸塩基を試料とし、 PTzカラム(実施例)、TSK gel Amide-80(5μm)、Halo-HILICの3つのカラムでその分離性能を比較した。
8種の試料 (Guanine, Guanosine, Uracil, Uridine, Adenine, Adenosine, Cytosine, Cytidine) の分離性能比較の結果を図4に示した。
測定条件
移動相: ACN/20 mM AcONH4buffer = 90/10
検出器: UV 254 nm
カラム温度: 30 ℃
カラムテスト法に利用した検体を使って、log k(U)(k(uridine)の対数値)および log k(TMPAC)(k (trimethylphenylammonium chloride)の対数値)の値をプロットすることにより、カラムを分類することができる。
この手法の長所は、性質が分からないカラムを分類する際、たった2つの試料を用いることである程度の分類が可能であり、簡便に行えることである。市販のカラム15本(図5参照)とPTzカラムを用いてこのプロットを行った。
log k(U) および log k(TMPAC)を用いたプロットの結果を図5に示した。ここから読み取れるように、市販のカラムはアミン系、シリカ系、アミド系などに分類することができる。その中でも、PTzカラムはアミド系のカラムと性質が類似していた。
実施例のカラム(以下、PTzカラムともいう)及び市販のカラム(TSKgel Amide-80, Halo−HILIC)を用いたカラムテストの結果を表5に示した。なお、TSKgel Amide-80はポリアクリルアミド修飾型、Halo−HILICは未修飾のシリカ型のカラムである。
MA tetrazoleによる固定相は、水中で重合した場合と同様にα(Tb/Tp)が1以上であることから、酸性型の分離剤であると考えられる。
AA tetrazole型固定相で、α(Tb/Tp)が0.68と塩基性の性質を示した。
MA thiazoleやMA thiazdiazoleの重合修飾によって中性〜弱塩基性のHILIC固定相を、MA triazoleの重合修飾によって塩基性のHILIC固定相を調製できる。表3に記載の用いた条件では、MA tetrazole修飾型カラムのプロット位置は双性イオン型の領域にとどまったが、k(U)=10のMA tetrazole修飾型カラムではずっと右上の領域にプロットが現れた。
1. 多孔性シリカモノリスカラムの調製
多孔性シリカモノリスの調製は、公知の方法により行った。具体的には、アルコキシシランの加水分解、重縮合により引き起こされるゾル-ゲル法により行った。
2. フューズドシリカキャピラリーの内壁処理
100μm I.D.×375μm O.D.のヒューズドシリカキャピラリーカラム(Polymicro Technologies)に1N-水酸化ナトリウムを送液し、40℃で3時間放置した。次に1N−塩酸で洗浄を行った後、40℃で3時間放置した。最後に、超純水、アセトンの順に洗浄を行い、乾燥した。
3. Hybrid型シリカモノリスキャピラリーカラムの調製
氷冷下でポリエチレングリコール(PEG) 0.9gと尿素2gに0.01N酢酸20mlを加えて30分間撹拌した。混合溶液にテトラメトキシシランとメチルトリメトキシシランの混合アルコキシシラン(3:1 vol/vol)を9ml滴下し30分間撹拌を行った。さらに、40℃で10分間加熱した後、混合溶液をPTFEフィルター(0.45μm)でろ過した。この混合溶液を内壁処理を行ったフューズドシリカキャピラリー中に注入し、40℃で24時間反応を行いゲル化させた。次に、両端を0.06g/ml尿素水に浸した状態でこのキャピラリーを90℃加熱エージング処理し(24時間)、その後120℃で熱処理を4時間行った。熱処理を行うことにより骨格の再結合、および尿素の分解により発生するアンモニアによるシリカの溶解によるメソポアの形成を行った。その後、キャピラリー内をメタノールで洗浄した。最後にキャピラリー内により完全に乾燥させ熱処理を行い、シリカモノリスキャピラリーカラムを得た。
4. シリカモノリスキャピラリーカラムのMASによるシリル化
メタノール、トルエンで置換したシリカモノリスキャピラリーカラムにMAS、トルエン、ピリジン混合溶液(体積比=1:1:1)をシリンジポンプで24時間送液した(反応温度80℃)。その後、トルエンでキャピラリー内の洗浄を行った。同様の操作を再度行いシリカモノリスキャピラリーカラムのMAS化を行った。
5. 重合修飾型固定相の調製
重合開始剤を含んだモノマー(実施例1で作製したものと同じもの)溶液を、あらかじめ水で置換したMASカラムに室温で十分量送液し、カラム内にモノマー溶液の充填を行った。その後、それぞれの重合温度(60℃)に設定されたウォーターバス中に両端を密栓したカラムを投入し所定の時間重合させた。最後にHPLCポンプにより水またはメタノールを送液し、キャピラリー内を洗浄することにより重合修飾型シリカモノリスキャピラリーカラムを得た。モノマーの構造は図1に、重合条件は以下に示した。
モノマー濃度:150mg/ml
反応時間:2hr
開始剤:5mg(過硫酸アンモニウム)/ 1% NH3aq in water
実施例1と同一条件
実施例2の4.で作製したMAS化されたシリカモノリスキャピラリーカラムに、下記の条件で調製したモノマー溶液を充填し、以下の表7に示すように、モノマーの濃度を変えてカラム内重合反応を行い、各モノリスカラムを得た。
開始剤: 過硫酸アンモニウム (5mg/ml in 4.1mol/l NH3aq)
温度60℃
反応時間:2hr
このモノマーを重合してできるポリマーは、水又はMeOHへの溶解性が富んでいるため、モノマーの仕込み量が比較的大きかった。当該実験ではその仕込み量範囲の広さを利用して、モノマーの仕込み量とカラム性能(保持や選択性)の評価を行った。結果を表7に示す。
Mobile phase: AN90%-20 mM AcONH4 buffer pH 4.7, Flow rate: 0.5 ml/min, Pressure: 12 kgf, temperature: 30℃, Detection: 254 nm, Sample: α(CH2): k(uridine)/k(5-methyluridine), α(OH): k(uridine)/k(2'-deoxyluridine), α(Tb/Tp): k(theobromine)/k(theophylline), α(V/A): k(vidarabine)/k(adenosine), α(2dG/3dG): k(2'-deoxyguanosine)/k(3'-deoxyguanosine), k(TPA): N,N,N-trimethylphenylammonium chloride
また、選択性に関しても他のカラムに比べ特徴的な値を示していた。親水性選択性は最も大きな値を示しており、疎水性選択性も比較的大きな値を示していた。OH基の向きや位置選択性は他のカラムの方が大きな結果となった。
クロマトグラフィーの条件と、分離対象とした化合物は以下の通りである。
Mobile phase: AN90% 20 mM AcONH4 buffer, Column: a: PSDMA 26cm, b: PAEMA 26 cm, c: PAAm 25cm, d: PTZ-150 26.7 cm, Flow rate: 0.5 ml/min, Pressure: 15 kgf, temperature: 30℃, Detection: 254 nm
Sample 1: toluene, 2: trifluorothymidine, 3: 5'-deoxy-5-fluorouridine, 4: 2'-deoxy-5-fluorouridine, 5: 2'-deoxy-2'-fluorouridine, 6: thymidine, 7: 2'-deoxyuridine, 8: 5-fluorouridine, 9: uridine
Claims (5)
- 担体と担体に担持されたリガンドから形成された親水性相互作用クロマトグラフィー分離剤であって、該リガンドが、下記式(I)で示される化合物に由来する構成単位を有する(メタ)アクリルポリマーである、分離剤。
- 前記リガンドが、アミノイミダゾール、アミノイミダゾリン、アミノチアゾール、アミノトリアゾール、アミノテトラゾール、アミノチアジアゾール、アミノメチルイミダゾールからなる群から選ばれる化合物に由来する構成単位を有する(メタ)アクリルポリマーである、請求項1に記載の分離剤。
- 前記リガンドがアミノテトラゾールに由来する構成単位を有する(メタ)アクリルポリマーである、請求項1に記載の分離剤。
- 前記リガンドがアミノテトラゾールに由来する構成単位を有するメタクリルポリマーである、請求項1に記載の分離剤。
- 前記担体がシリカゲルまたはシリカモノリスであることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の分離剤。
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