CN116359423B - 一种基于gc-ims特征性气味差异物质辨识大黄饮片基原的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于GC‑IMS特征性气味差异物质辨识大黄饮片基原的方法，属于中药饮片分析鉴定技术领域。将待测样品大黄饮片粉末经顶空进样用气相色谱‑离子迁移谱进行测试，通过对待测样品的特征指纹图谱分析确定标志性挥发性有机物，根据标志性挥发性有机物峰强度比值辨识药用大黄饮片、掌叶大黄饮片和唐古特大黄饮片。本发明基于GC‑IMS分析的特征性气味物质辨识大黄饮片基原的方法，能够快速、无损、无需真空且复杂的样品前处理，方法简单，环保，鉴别过程中所用的耗材少，且鉴别检测成本低，结果直观，适合批量快速辨识不同基原的大黄饮片。
Description
技术领域
本发明属于中药饮片分析鉴定技术领域，具体涉及一种基于GC-IMS特征性气味差异物质辨识大黄饮片基原的方法。
背景技术
《中国药典》2020年版收载大黄药材为蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.、唐古特大黄RheumtanguticumMaxim. ex Bal£.和药用大黄RheumofficinaleBaill.的干燥根及根茎。大黄具有广泛药效作用，与其所含大量活性成分有关，大黄主要含有蒽醌类、蒽酮类、二苯乙烯类、鞣质类等化合物。其中大黄起泻下作用的主要是结合蒽醌类、蒽酮类，起清热作用和湿退黄作用的主要是游离蒽醌类，起凉血作用的主要是鞣质类，起活血作用的主要是黄酮类。研究发现唐古特大黄、掌叶大黄、药用大黄中各类成分的含量存在差异，唐古特大黄的蒽酮、鞣质及黄烷醇类成分均高于药用大黄及掌叶大黄，掌叶大黄的游离蒽醌类成分含量普遍高于唐古特大黄及药用大黄，提示掌叶大黄专长于“清热泻火、利湿退黄”，而唐古特大黄专长于“泻下攻积、逐瘀通经”。2020版《中国药典》一部收载的含大黄及其炮制品的中成药制剂达一百多种，由于不同基原大黄所含化学成分上的差别，使其在临床作用功效上表现出差异性和相对的专属性，所以不同大黄基基原对中医临床、中成药组方及其疗效均存在一定影响，因此大黄基原的有效辨识对于指导其临床精准用药具有重要意义。
大黄基原鉴定方法主要有性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定(HPLC、UPLC等)及DNA条形码(ITS2、psbA-trnH及matK等)。三种基原大黄药用植物区别主要在于叶片分裂程度，药用大黄掌状浅裂，呈大齿形或宽三角形；掌叶大黄叶片浅裂至半裂，呈较窄三角形；唐古特大黄叶深裂，裂片狭长呈三角状披针形或狭长形。性状和显微鉴定对大黄基原植物或药材特征的完整性要求较高，鉴别过程需依靠长期经验积累，而经过深加工的大黄饮片及中成药，形态特征被破坏，基原鉴定难度增大。理化鉴定依据中药材主要成分进行鉴定，但操作较为繁琐且对于多基原中药因其存在共有成分难以实现鉴定。与传统鉴定方法相比，DNA分子能为物种鉴定提供丰富信息，通过ITS2、psbA-trnH及matK等DNA条形码能够有效鉴别大黄正伪品，但难以精确到基原物种。与传统DNA条形码相比，叶绿体基因组具有更丰富变异位点和更强物种分辨率，可有效鉴别唐古特大黄、掌叶大黄和药用大黄，但是此方法实验操作以及分析复杂，且耗材较大，成本较高。气相-离子迁移谱（GC-IMS）是近年新兴的用于中药气味检测的新方法，其应用范围较为广泛，如中药品种鉴别，生长期识别，储存期研究等。GC-IMS分析特征气味物质，能够快速、无损、无需真空且复杂的样品前处理，方法简单，环保，鉴别过程中所用耗材少，鉴别检测成本低，结果直观，本发明将其用于快速辨识不同基原大黄饮片。
综上所述，研发一种基于气味辨识大黄饮片基原的高效精准检测方法，可有效判别市售大黄饮片基原，对下一步实现大黄临床精准用药提供有力技术保障。
发明内容
针对现有技术辨识大黄饮片基原方法存在检测过程复杂、检测成本高、难度大的问题，本发明提供了一种基于GC-IMS特征性气味差异物质辨识大黄饮片基原的方法，通过特征性气味差异物质，对未知基原的大黄饮片进行辨识，为建立高效精准的大黄饮片基原辨识方法提供新思路。
本发明通过以下技术方案实现：
一种基于GC-IMS特征性气味差异物质辨识大黄饮片基原的方法，将待测样品大黄饮片粉末经顶空进样用气相色谱-离子迁移谱进行测试，通过对待测样品的特征指纹图谱分析确定标志性挥发性有机物，根据标志性挥发性有机物峰强度比值辨识药用大黄饮片、掌叶大黄饮片和唐古特大黄饮片；
所述的药用大黄饮片的标志性挥发性有机物为2-乙酰基呋喃和异丁酸-二聚体，根据2-乙酰基呋喃和异丁酸-二聚体之间的峰强度比值辨识药用大黄饮片；
所述的掌叶大黄饮片的标志性挥发性有机物为4-甲基-3戊烯-2-酮-二聚体、3-羟基-2-丁酮-二聚体和四氢呋喃-二聚体，根据4-甲基-3戊烯-2-酮-二聚体与四氢呋喃-二聚体、和/或3-羟基-2-丁酮-二聚体与四氢呋喃-二聚体之间的峰强度比值辨识掌叶大黄饮片；
所述的唐古特大黄饮片的标志性挥发性有机物为；2-已烯醛-单体、正戊醛-二聚体、1-戊醇、1-戊烯-3-酮和仲丁醇-单体，根据2-已烯醛-单体与仲丁醇-单体、和/或正戊醛-二聚体与仲丁醇-单体、和/或1-戊醇与仲丁醇-单体、和/或1-戊烯-3-酮与仲丁醇-单体之间的峰强度比值辨识唐古特大黄饮片。
进一步地，相对于其他两种基原大黄饮片，所述的药用大黄饮片中2-乙酰基呋喃峰强度高，异丁酸-二聚体峰强度低；所述的掌叶大黄饮片中4-甲基-3戊烯-2-酮-二聚体和3-羟基-2-丁酮-二聚体峰强度高，四氢呋喃-二聚体峰强度低；所述的唐古特大黄饮片中2-已烯醛-单体、正戊醛-二聚体、1-戊醇、1-戊烯-3-酮峰强度高，仲丁醇-单体峰强度低。
进一步地，所述的根据标志性挥发性有机物峰强度比值辨识药用大黄饮片、掌叶大黄饮片和唐古特大黄饮片的方法为，药用大黄饮片中，2-乙酰基呋喃峰强度是异丁酸-二聚体峰强度的3-19倍；掌叶大黄饮片中，4-甲基-3戊烯-2-酮-二聚体峰强度是四氢呋喃-二聚体峰强度的2-9倍，3-羟基-2-丁酮-二聚体峰强度是四氢呋喃-二聚体峰强度的5-14倍；唐古特大黄饮片中，2-已烯醛-单体峰强度是仲丁醇-单体峰强度的5-11倍，正戊醛-二聚体峰强度是仲丁醇-单体峰强度的13-21倍，1-戊醇峰强度是仲丁醇-单体峰强度的5-9倍，1-戊烯-3-酮峰强度是仲丁醇-单体峰强度的8-17倍。
进一步地，所述的待测样品大黄饮片样品粉末顶空进样方式为：称取待测样品粉末1g，置20mL顶空进样瓶中，80℃孵育15分钟后进样。
进一步地，所述的气相色谱-离子迁移谱的技术条件为：色谱柱为MXT-WAX，30meter，ID：0.53mm，df：1.0μm；色谱柱温度为60℃；载气/漂移气：N2；IMS温度：45℃；自动顶空进样单元中，进样体积：100μL；孵育时间：15min；孵育温度：80℃；进样针温度：85℃；孵化转速：500rpm。
进一步地，通过Gallery Plot获得待测样品的特征指纹图谱，分析标志性挥发性有机物。
有益效果
（1）本发明提供的基于GC-IMS分析的特征性气味物质辨识大黄饮片基原的方法，使用顶空进样，采用气相色谱-离子迁移谱技术对未知基原大黄饮片样品进行分析，根据特征指纹图谱分析确定的标志性挥发性有机物，根据标志性挥发性有机物峰强度比值辨识药用大黄饮片、掌叶大黄饮片和唐古特大黄饮片，进而辨识大黄饮片基原，可应用于未知基原大黄饮片的辨识；
（2）本发明基于GC-IMS分析的特征性气味物质辨识大黄饮片基原的方法，能够快速、无损、无需真空且复杂的样品前处理，方法简单，环保，鉴别过程中所用的耗材少，且鉴别检测成本低，结果直观，适合批量快速辨识不同基原的大黄饮片。
附图说明
图1为不同基原大黄饮片的三维谱图，从左上到右下依次为：药用大黄饮片YD3、YD4、YD5；掌叶大黄饮片ZD7、ZD8、ZD9；唐古特大黄饮片TD3、TD4；
图2为不同基原大黄饮片的二维俯视图，从左到右依次为：药用大黄饮片YD3、YD4、YD5；掌叶大黄饮片ZD7、ZD8、ZD9；唐古特大黄饮片TD3、TD4；
图3为不同基原大黄饮片的差异图谱，从左到右依次为：药用大黄饮片YD3、YD4、YD5；掌叶大黄饮片ZD7、ZD8、ZD9；唐古特大黄饮片TD3、TD4；
图4和图5为不同基原大黄饮片的特征指纹图谱，其中图4为不同基原大黄饮片的特征指纹图谱的上半部分，图5为不同基原大黄饮片的特征指纹图谱的下半部分；每一行代表一个样品中选取的全部信号峰，每一列代表同一挥发性有机物在不同样品中的信号峰；
图6为不同基原大黄饮片的PCA分析图；
图7为不同基原大黄饮片的PLS-DA分析图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是进一步说明本发明的特征及优点，而不是对本发明的限制。
本发明中不同基原大黄饮片购自甘肃、湖北、安徽等地，不同基原大黄饮片的来源如下表1所示：
表1 不同基原大黄饮片的来源表
实施例1
1. 仪器：FlavourSpec®气相色谱‑离子迁移谱联用仪
待测样品：如表1所示
2. 方法与结果
检测条件：色谱柱为MXT-WAX，30meter，ID：0.53mm，df：1.0μm；色谱柱温度为60℃；载气/漂移气：N2；IMS温度：45℃；自动顶空进样单元中，进样体积：100μL；孵育时间：15min；孵育温度：80℃；进样针温度：85℃；孵化转速：500rpm；
样品测定：精密称取不同基原大黄饮片粉末各1g，分别置20 mL顶空进样瓶中，80℃孵育15分钟后进样，用气相色谱-离子迁移谱进行测试，每种样品取三个平行样；
直观分析：采用Reporter插件直接对比不同基原大黄饮片的气味物质差异，①不同基原大黄饮片的三维谱图如图1所示，从左上到右下依次为：药用大黄饮片YD3、YD4、YD5，掌叶大黄饮片ZD7、ZD8、ZD9，唐古特大黄饮片TD3、TD4，三维谱图中一个峰代表一种挥发性物质，红色代表浓度高，白色代表浓度低。②不同基原大黄饮片挥发性有机物的GC-IMS二维俯视图如图2所示，从左到右依次为：药用大黄饮片YD3、YD4、YD5，掌叶大黄饮片ZD7、ZD8、ZD9，唐古特大黄饮片TD3、TD4，其整个图背景为蓝色，横坐标处红色竖线为RIP峰（反应离子峰）。纵坐标代表气相色谱的保留时间（s），横坐标代表离子迁移时间，RIP峰两侧的每一个点代表一种挥发性有机物。颜色代表物质的浓度，白色表示浓度较低，红色表示浓度较高，颜色越深表示浓度越大。③不同基原大黄饮片挥发性有机物的GC-IMS差异谱图如图3所示，从左到右依次为：药用大黄饮片YD3、YD4、YD5，掌叶大黄饮片ZD7、ZD8、ZD9，唐古特大黄饮片TD3、TD4。其中以药用大黄饮片YD3谱图作为参比，如果二者挥发性有机物一致，则扣减后的背景为白色，而红色代表该物质的浓度高于参比，蓝色代表该物质的浓度低于参比。由图1~3可知，不同基原大黄饮片的气味物质差异较为明显。
指纹图谱分析：采用Gallery Plot插件对形成的特征指纹图谱进行对比，分析标志性挥发性有机物，得到的不同基原大黄饮片的离子迁移谱图Gallery对比图如图4和图5所示（图4为不同基原大黄饮片的特征指纹图谱的上半部分，图5为不同基原大黄饮片的特征指纹图谱的下半部分），图中每一行代表一个样品中选取的全部信号峰；图中每一列代表同一挥发性有机物在不同样品中的信号峰；颜色代表物质的浓度，白色表示浓度较低，红色表示浓度较高，颜色越深表示浓度越大。对气味物质进行定性分析，共检测出83种气味物质，主要包括萜烯类，醛类、酯类、酮类和醇类等，筛选标志性挥发性有机物，当2-乙酰基呋喃峰强度明显较高，而异丁酸-二聚体峰强度明显较低时为药用大黄饮片（见表2），当4-甲基-3戊烯-2-酮-二聚体、和3-羟基-2-丁酮-二聚体峰强度明显较高，而四氢呋喃-二聚体峰强度明显较低时为掌叶大黄饮片（见表3），当2-已烯醛-单体、正戊醛-二聚体、1-戊醇、1-戊烯-3-酮峰强度明显较高，而仲丁醇-单体峰强度明显较低时为唐古特大黄饮片（见表4）。
表2 药用大黄饮片标志性挥发性有机物峰强度
表3掌叶大黄饮片特征性差异气味物质
表4唐古特大黄饮片特征性差异气味物质
因此，2-乙酰基呋喃、异丁酸-二聚体可作为药用大黄饮片的标志性挥发性有机物，采用2-乙酰基呋喃、异丁酸-二聚体峰强度比值判断是否为药用大黄饮片，2-乙酰基呋喃峰强度是异丁酸-二聚体峰强度的3-19倍时为药用大黄饮片；4-甲基-3戊烯-2-酮-二聚体、3-羟基-2-丁酮-二聚体和四氢呋喃-二聚体可作为掌叶大黄饮片的标志性挥发性有机物，采用四氢呋喃-二聚体与任一其它挥发性有机物的峰强度比值判断是否为掌叶大黄饮片， 4-甲基-3戊烯-2-酮-二聚体峰强度是四氢呋喃-二聚体峰强度的2-9倍，3-羟基-2-丁酮-二聚体峰强度是四氢呋喃-二聚体峰强度的5-14倍可以判断为掌叶大黄饮片；2-已烯醛-单体、正戊醛-二聚体、1-戊醇、1-戊烯-3-酮和仲丁醇-单体可作为唐古特大黄饮片的标志性挥发性有机物，采用仲丁醇-单体与任一其它挥发性有机物的峰强度比值判断是否为唐古特大黄饮片，2-已烯醛-单体峰强度是仲丁醇-单体峰强度的5-11倍，和/或正戊醛-二聚体峰强度是仲丁醇-单体峰强度的13-21倍，和/或1-戊醇峰强度是仲丁醇-单体峰强度的5-9倍，和/或1-戊烯-3-酮峰强度是仲丁醇-单体峰强度的8-17倍可判断为唐古特大黄饮片。
聚类分析：选取所有峰进行PCA分析、PLS-DA分析，结果如图6和图7所示，可以看出，不同基原大黄饮片各自聚集在一起，区分度高，差异明显。
本发明通过对不同基原大黄饮片的图谱分析检测发现，不同基原大黄饮片中共检测出可定性的气味物质83种，其中药用大黄饮片标志性挥发性有机物（特征性气味差异物质）成分2个，掌叶大黄饮片标志性挥发性有机物（特征性气味差异物质）成分3个，唐古特大黄饮片标志性挥发性有机物（特征性气味差异物质）成分5个。结合聚类分析，分析不同基原大黄饮片间的差异大小，从而有效的辨识大黄饮片不同基原；结果准确度高，实现从特征性气味差异物质辨识大黄饮片不同基原的新思路。
Claims (5)
1.一种基于GC-IMS特征性气味差异物质辨识大黄饮片基原的方法，其特征在于，将待测样品大黄饮片粉末经顶空进样用气相色谱-离子迁移谱进行测试，通过对待测样品的特征指纹图谱分析确定标志性挥发性有机物，根据标志性挥发性有机物之间的峰强度比值辨识药用大黄饮片、掌叶大黄饮片和唐古特大黄饮片；
所述的药用大黄饮片的标志性挥发性有机物为2-乙酰基呋喃和异丁酸-二聚体，根据2-乙酰基呋喃和异丁酸-二聚体之间的峰强度比值辨识药用大黄饮片；
所述的掌叶大黄饮片的标志性挥发性有机物为4-甲基-3戊烯-2-酮-二聚体、3-羟基-2-丁酮-二聚体和四氢呋喃-二聚体，根据4-甲基-3戊烯-2-酮-二聚体与四氢呋喃-二聚体、和/或3-羟基-2-丁酮-二聚体与四氢呋喃-二聚体之间的峰强度比值辨识掌叶大黄饮片；
所述的唐古特大黄饮片的标志性挥发性有机物为；2-已烯醛-单体、正戊醛-二聚体、1-戊醇、1-戊烯-3-酮和仲丁醇-单体，根据2-已烯醛-单体与仲丁醇-单体、和/或正戊醛-二聚体与仲丁醇-单体、和/或1-戊醇与仲丁醇-单体、和/或1-戊烯-3-酮与仲丁醇-单体之间的峰强度比值辨识唐古特大黄饮片；
所述的根据标志性挥发性有机物之间的峰强度比值辨识药用大黄饮片、掌叶大黄饮片和唐古特大黄饮片的方法为，药用大黄饮片中，2-乙酰基呋喃峰强度是异丁酸-二聚体峰强度的3-19倍；掌叶大黄饮片中，4-甲基-3戊烯-2-酮-二聚体峰强度是四氢呋喃-二聚体峰强度的2-9倍，3-羟基-2-丁酮-二聚体峰强度是四氢呋喃-二聚体峰强度的5-14倍；唐古特大黄饮片中，2-已烯醛-单体峰强度是仲丁醇-单体峰强度的5-11倍，正戊醛-二聚体峰强度是仲丁醇-单体峰强度的13-21倍，1-戊醇峰强度是仲丁醇-单体峰强度的5-9倍，1-戊烯-3-酮峰强度是仲丁醇-单体峰强度的8-17倍。
2.根据权利要求1所述的基于GC-IMS特征性气味差异物质辨识大黄饮片基原的方法，其特征在于，相对于其他两种基原大黄饮片，所述的药用大黄饮片中2-乙酰基呋喃峰强度高，异丁酸-二聚体峰强度低；所述的掌叶大黄饮片中4-甲基-3戊烯-2-酮-二聚体和3-羟基-2-丁酮-二聚体峰强度高，四氢呋喃-二聚体峰强度低；所述的唐古特大黄饮片中2-已烯醛-单体、正戊醛-二聚体、1-戊醇、1-戊烯-3-酮峰强度高，仲丁醇-单体峰强度低。
3.根据权利要求1所述的基于GC-IMS特征性气味差异物质辨识大黄饮片基原的方法，其特征在于，所述的待测样品大黄饮片样品粉末顶空进样方式为：称取待测样品粉末1g，置20mL顶空进样瓶中，80℃孵育15分钟后进样。
4.根据权利要求1所述的基于GC-IMS特征性气味差异物质辨识大黄饮片基原的方法，其特征在于，所述的气相色谱-离子迁移谱的技术条件为：色谱柱为MXT-WAX，30meter，ID：0.53mm，df：1.0μm；色谱柱温度为60℃；载气/漂移气：N2；IMS温度：45℃；自动顶空进样单元中，进样体积：100μL；孵育时间：15min；孵育温度：80℃；进样针温度：85℃；孵化转速：500rpm。
5.根据权利要求1所述的基于GC-IMS特征性气味差异物质辨识大黄饮片基原的方法，其特征在于，通过Gallery Plot获得待测样品的特征指纹图谱，分析标志性挥发性有机物。
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