CN115166121A - 一种基于gc-ims分析特征气味物质鉴别黄精不同炮制品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药饮片分析鉴别技术领域,涉及一种基于GC‑IMS分析特征气味物质鉴别黄精不同炮制品的方法,包括:1)制备黄精不同炮制品作为待测样品;2)利用GC‑IMS分析得到待测样品对应的GC‑IMS二维谱图;3)对GC‑IMS二维谱图进行积分,对积分得到的峰进行定性,并计算峰体积,得到挥发性物质在不同炮制品中的相对含量;4)对GC‑IMS二维谱图分别进行三维谱图转换、直接对比图转换、差异对比图转换、指纹图谱分析和聚类分析,通过待测样品所含挥发性物质的差异,区别黄精不同炮制品。本发明通过分析气味差异物质,对黄精不同炮制品进行鉴别,为建立黄精不同炮制品的质量控制方法提供新思路。
Description
技术领域
本发明属于中药饮片分析鉴别技术领域,涉及一种基于GC-IMS分析特征气味物质鉴别黄精不同炮制品的方法。
背景技术
黄精为百合科植物黄精(Polygonatumsibiricum Red.)、多花黄精(PolygonatumcyrtonemaHua)、滇黄精(PolygonatumkingianumColl.et Hemsl.)的干燥根茎,是临床常用的补气养阴类中药,始载于《名医别录》,被列为上品;黄精的炮制始于南北朝,炮制方法主要有清蒸法、加辅料蒸法、煮法等,例如单蒸法和重蒸法、九蒸九晒法、黑豆汁制法、酒制法等;黄精的蒸制炮制方法经历了南北朝、唐至五代、宋代、明代、清代、近代之后,人们在不断总结前人炮制经验的基础上,逐步形成了成熟的蒸制方法并一直沿用至今。
黄精主要含多糖、皂苷、生物碱、木脂素、黄酮、植物甾醇、氨基酸以及挥发油等成分,具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的功效。生黄精具麻味,刺人咽喉。蒸后补脾、润肺、益肾的功能增强,并可除去麻味,以免刺激咽喉,用于脾胃虚弱,肺虚燥咳,肾虚精亏;如治肾虚精亏、头晕足软的枸杞丸。酒黄精能助其药势,使其滋而不腻,更好地发挥补益作用;如用于治疗气血两亏的九转黄精丹及用于肾虚阳痿,梦遗滑精的海马保肾丸。在前期实验研究过程中,收集大量的蒸黄精和酒黄精,发现目前市售的黄精炮制品质量参差不齐,有的蒸制时间长,性状虽然符合《中国药典》规定的性状标准,但是多糖含量测定却不合格;有的蒸制时间短,性状达不到《中国药典》规定的性状标准,但多糖含量测定却合格。这可能与现行药典收载的黄精炮制品的性状标准过于宽泛,黄精炮制品质量标准制定不合理有关,因此需要对黄精质量控制标准进行提升研究,促进黄精质量的标准化和规范化。
为了对黄精炮制品进行质量提升的研究,前期将外观性状作为重要的评价指标发现:黄精蒸制后不仅外观色泽发生了明显的变化,相应的其气味也发生了明显变化;生黄精和制黄精均具有香甜的气味,区别在于炮制前后香甜的程度发生了变化,生黄精是淡淡的香甜味,制黄精是浓郁、厚重的香甜味;另外生黄精“久闻其生味,有刺目之感”,因此可将气味的变化用于黄精炮制品的质量控制,由此尝试建立一种采用气味识别的方法进行黄精炮制品质量的鉴定,进而对黄精不同炮制品进行很好的区分。
气相-离子迁移谱(gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)是近年来发展起来的新型检测方法,其原理是将被检测的样品蒸气或微粒先进行离子化形成离子,然后使产生的离子进入弱电场中进行漂移,在漂移过程中离子与逆流的中性漂移气体分子不断发生碰撞;由于在一定的条件下,各种离子的迁移率互不相同,使得不同的离子通过电场的漂移时间各不相同,由此实现样品的分离。近年来,该技术由于灵敏度高等优点,已开始应用于药学、食品科学、农业领域等方面,尤其是用于药材的检测,比如不同品种中药鉴别,不同采收期识别,不同干燥方法,不同炮制品比较,不同产地中药识别,贮存期研究等。但是上述方法用于黄精不同炮制品的鉴别未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于GC-IMS分析特征气味物质鉴别黄精不同炮制品的方法,通过分析气味差异物质,对黄精不同炮制品进行鉴别,为建立黄精不同炮制品质量控制方法提供新思路。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案是:
一种基于GC-IMS分析特征气味物质鉴别黄精不同炮制品的方法,包括以下步骤:
1)制备黄精不同炮制品作为待测样品;
2)利用GC-IMS分析分别得到待测样品对应的GC-IMS二维谱图;
3)对步骤2)的GC-IMS二维谱图进行积分,然后对积分得到的峰进行定性,进一步计算峰体积,得到挥发性物质在黄精不同炮制品中的相对含量;
4)对步骤2)的GC-IMS二维谱图分别进行三维谱图转换、直接对比图转换、差异对比图转换、指纹图谱分析和聚类分析,通过待测样品所含挥发性物质的差异,区别黄精不同炮制品。
进一步的,所述步骤2)中,GC-IMS图谱的测定方法是:
称取1g粉末状的待测样品,置于20mL顶空进样瓶中,在60℃、500r·min-1孵化20min,采用气相离子迁移谱仪得到待测样品的GC-IMS图谱;
检测条件是:采用0.53mm×30m、1μm的MXT-WAX色谱柱,载气和漂移气均为N2,载气流量分别为0-2min,2mL·min-1;2-10min,2-10mL·min-1;10-20min,10-100mL·min-1;20-59min,100–150mL·min-1;漂移气流量150mL·min-1;柱温为60℃;IMS温度为45℃,进样针温度为85℃,进样体积200μL。
进一步的,所述步骤3)中,定性分析的方法是通过NIST数据库和IMS数据库对GC-IMS二维谱图上每个峰进行定性,确定出GC-IMS二维谱图上每个峰对应的挥发性物质。
进一步的,所述步骤3)中,待测样品中的挥发性物质包括醛类21种、酯类6种、醇类14种、酮类10种、酸类5种、呋喃类5种和烷类1种。
进一步的,所述步骤3)的挥发性物质中,单体和二聚体两种存在形式的挥发性物质有5-甲基糠醛、2-乙酰基呋喃、乙酸、糠醛、当归内酯、1-己醇、2-甲基四氢呋喃-3-酮、1-戊醇、3-甲基丁醇、2-庚酮、庚醛、1-丁醇、异丁醇、己醛、1-丙醇、戊醛、2-丁酮、乙酸乙酯、丙醛、异丁酸、3-羟基-2-丁酮、羟基丙酮和丁醛。
进一步的,所述步骤4)中,所述指纹图谱分析是将GC-IMS二维谱图中所有的待分析峰自动生成指纹图谱,从指纹图谱看出黄精不同炮制品的完整挥发性物质信息以及黄精不同炮制品所含挥发性物质的差异。
进一步的,所述步骤4)中,聚类分析是通过待测样品之间的距离远近,判断出待测样品中所含挥发性物质的差异大小。
进一步的,所述聚类分析包括动态主成分分析和“最近邻”指纹分析。
进一步的,所述步骤2)、步骤3)和步骤4)均是通过VOCal软件来完成的。
本发明的有益效果是:
1、本发明将GC-IMS用于黄精不同炮制品的气味检测,将传统气味鉴别经验数据化,找出黄精不同炮制品的气味差异物质,并将其作为有效判断黄精不同炮制品和控制其质量的新标准。
2、本发明采用气相色谱-离子迁移谱GC-IMS对黄精不同炮制品的挥发性物质进行检测,并比较挥发性物质的变化,确定黄精不同炮制品对应的特征挥发性物质,结合PCA主成分分析和“最近邻”指纹分析,得到黄精不同炮制品之间的差异大小,从而对黄精不同炮制品进行区分。检测方法简单,为建立黄精不同炮制品的鉴别方法和进一步建立黄精不同炮制品的质量控制新方法提供思路。
3、本发明在检测时,采用气相离子迁移谱仪得到待测样品的GC-IMS图谱,仪器无需真空,样品无需富集浓缩,通过直接顶空进样的方式可快速检测黄精不同炮制品中的挥发性物质,操作方便。
附图说明
图1为黄精不同炮制品中的挥发性物质定性分析(以生黄精为例);
图2为黄精不同炮制品的挥发性物质的GC-IMS三维谱图;
图3为黄精不同炮制品的挥发性物质直接对比图;
图4为以黄精作参比扣减的黄精不同炮制品的挥发性物质差异对比图;
图5A为黄精不同炮制品挥发性物质的指纹图谱对比(1);
图5B为黄精不同炮制品挥发性物质的指纹图谱对比(2);
图6为黄精不同炮制品挥发性物质的PCA分析结果;
图7为黄精不同炮制品挥发性物质的“最近邻”指纹分析结果。
具体实施方式
现结合附图以及实施例对本发明做详细的说明。
本发明的目的是,比较黄精不同炮制品挥发性特征气味物质的差异,从而根据挥发性特征气味物质鉴别区分黄精不同炮制品,从而提供一种黄精不同炮制品辨识的新方法。
本发明提供的方法是,采用气相色谱-离子迁移谱GC-IMS对黄精不同炮制品的挥发性物质进行检测并比较成分变化,结合PCA主成分分析和“最近邻”指纹分析,分析黄精不同炮制品之间的差异大小,从而鉴别黄精不同炮制品。
下面以具体的实施例对本发明提供的方法进行说明。
1)制备黄精不同炮制品作为待测样品。
黄精药材购自陕西汉中,经鉴定为百合科植物黄精(PolygonatumsibiricumRed.)的干燥根茎。黄酒:绍兴黄酒酿造有限公司,酒精度12%。称取黄精样品,按照表1方法炮制。
表1黄精的炮制方法
2)利用GC-IMS分析分别得到待测样品对应的GC-IMS二维谱图。
MXT-WAX色谱柱(0.53mm×30m,1μm),载气和漂移气均为N2,载气流量(0-2min,2mL·min-1;2-10min,2-10mL·min-1;10-20min,10-100mL·min-1;20-59min,100–150mL·min-1),漂移气流量150mL·min-1,柱温为60℃,IMS温度为45℃,进样针温度85℃,进样体积为200μL。
实施时,三个样品,黄精HJ、蒸黄精ZHJ和酒黄精JHJ,分别采用上述方法得到对应的GC-IMS二维谱图,且每个样品平行测试3次。
表2分析软件和插件
3)对步骤2)的GC-IMS二维谱图进行积分,然后通过定性分析确定出待测样品中挥发性物质。
积分是对GC-IMS二维谱图上的每个点进行画框选峰,然后根据积分得到的峰,定性每个点对应的挥发性物质,完成定性分析。
本实施例中,通过VOCal软件中NIST数据库和IMS数据库完成定性分析。
根据每个样品挥发性物质的气相色谱保留时间和IMS迁移时间,以C4-C9正酮作为外标参考,计算每种物质的保留指数,对照NIST2014数据库和IMS数据库的定性功能对样品中挥发性物质进行定性分析。参见图1和表3。
图1中,横坐标是相对迁移时间,纵坐标是保留时间,可定性的黄精样品中主要挥发性物质有单体和二聚体共62种,图1中的编号和表3中相应编号物质对应,图1上的每个点代表一个挥发性物质。
表3黄精不同炮制品挥发性物质的定性分析
由定性结果可知,黄精不同炮制品检测出挥发性物质共有62种,其中包含醛类21种、酯类6种、醇类14种、酮类10种、酸类5种、呋喃类5种和烷类1种。
挥发性物质中,单体和二聚体两种存在形式的物质有5-甲基糠醛、2-乙酰基呋喃、乙酸、糠醛、当归内酯、1-己醇、2-甲基四氢呋喃-3-酮、1-戊醇、3-甲基丁醇、2-庚酮、庚醛、1-丁醇、异丁醇、己醛、1-丙醇、戊醛、2-丁酮、乙酸乙酯、丙醛、异丁酸、3-羟基-2-丁酮、羟基丙酮和丁醛。
进一步的,计算积分选出来的峰的峰体积,然后得到挥发性物质在黄精不同炮制品中的相对含量,结果如表4所示。
表4黄精不同炮制品所含成分的相对含量
4)对步骤2)GC-IMS二维谱图分别进行三维谱图转换、直接对比图转换、差异对比图转换、指纹图谱分析和聚类分析,通过待测样品所含挥发性物质的差异,区别黄精不同炮制品。
本实施例主要采用VOCal软件的Reporter插件直接对比样品之间的谱图差异,可直接对比黄精、蒸黄精和酒黄精的特征挥发性物质。
参见图2,对GC-IMS谱图进行三维谱图转换,得到黄精不同样品的三维谱图,Y轴代表气相色谱的保留时间(s),X轴代表离子迁移时间(归一化处理),Z轴代表峰强度(V)。
从图2中可直观看出不同的黄精炮制品中挥发性物质存在差异;但由于观察不便,因此采取二维俯视图(参见图3)进行差异对比。
参见图3,纵坐标代表气相色谱的保留时间(s),横坐标代表离子迁移时间(归一化处理)。整个图背景为蓝色,横坐标1.0处红色竖线为RIP峰(反应离子峰,经归一化处理)。RIP峰两侧的每一个点代表一种挥发性物质。颜色代表物质的浓度,白色表示浓度较低,红色表示浓度较高,颜色越深表示浓度越大;从图中可看出黄精炮制前后挥发性物质存在明显差异,而两种工艺炮制的黄精中挥发性物质很相似。
为了更加明显地比较黄精不同炮制品之间的差异,可采用差异对比模式:选取其中一个样品的谱图(HJ或ZHJ)作为参比,其他样品的谱图扣减参比。如果二者挥发性物质一致,则扣减后的背景为白色,而红色代表该物质的浓度高于参比,蓝色代表该物质的浓度低于参比,具体如图4所示。
由图4的差异对比图可以更加明显地看出,炮制前后黄精中的挥发性物质存在明显差异,而两种工艺炮制的黄精(蒸黄精和酒黄精)所含的挥发性物质很相似,具体的,从图4中相应成分位点颜色深浅可明确成分含量差异。
为了明确黄精不同炮制品具体哪些物质存在差异,采用VOCal软件的GalleryPlot插件,选取黄精的3种不同炮制品,每个样品重复3次,所得GC-IMS二维图谱中所有的待分析峰自动生成指纹图谱,结果见图5A和图5B。
图5A和图5B中,每一行代表一个黄精样品中选取的全部信号峰,图中每一列代表同一挥发性物质在不同黄精样品中的信号峰。从图中可看出黄精每种样品的完整挥发性物质信息以及黄精不同样品所含挥发性物质的差异。
进一步的,通过初步对比指纹图谱可以看出,黄精的不同炮制品所含挥发性物质既有共同的区域,也有各自的特征峰区域。总体来说,黄精生品和黄精炮制品(蒸黄精和酒黄精)差异较大,可能是因为两个炮制品经过了加热加辅料炮制,而生品无;黄精的两种炮制品(蒸黄精和酒黄精)比较相似,可能是因为均经过了蒸制操作,而蒸黄精和酒黄精的图谱差异在于辅料黄酒的应用。其中A区域中的物质在黄精炮制后含量下降,包括1-丙醇(单体和二聚体)、2-庚酮(单体和二聚体)、2-正戊基呋喃、1-己醇(单体和二聚体)、乙酸甲酯、1-戊烯-3-醇、3-甲基丁醇(单体和二聚体)、反-2-庚烯醛、乙酸乙酯(单体和二聚体)、异丁醇(单体和二聚体)、1-戊醇(单体和二聚体)、1-丁醇(单体和二聚体)、反-2-己烯醛、乙醇、己醛(单体和二聚体)、3-羟基-2-丁酮(单体和二聚体)、2-丁酮(单体和二聚体)、庚醛(单体和二聚体)和丁醛(单体和二聚体),还有编号分别为55,27,21,18,17,20,28,30,43,33,38,29,50,40,45和12的物质,总共48种物质,可作为黄精的特征挥发性物质;B区域中的物质在黄精炮制后含量上升,且在酒黄精中的含量最高,包括1,8-桉树脑,还有编号分别为53,23,37,54,22,32,42的物质,总共8种物质,可作为酒黄精的特征挥发性物质;C区域中的物质在黄精炮制后含量上升,且在蒸黄精中的含量更高,包括5-甲基糠醛(单体和二聚体)、2-乙酰基呋喃(单体和二聚体)、当归内酯(单体和二聚体)、辛醛、糠醛(单体和二聚体)和2-甲基四氢呋喃-3-酮(单体和二聚体),还有编号分别为8,11,48,14,6的物质,总共16种物质,可作为蒸黄精的特征挥发性物质;D区域中的物质在黄精炮制后含量上升,且在两种工艺炮制的黄精中的含量一样,包括异丁醛、γ-丁内酯、羟基丙酮(单体和二聚体)、2-甲基丁醛、丙烯醛、丙酸、2,3-丁二酮、丙醛(单体和二聚体)和乙酸(单体和二聚体),还有编号分别为9,7,4,3,2,1,19,36,46,41,47,51,52,16,44,49,10,13,35,39和26的物质,总共33种物质,可作为蒸黄精和酒黄精共有的特征挥发性物质。E区域中的物质是黄精三种炮制品共有的挥发性物质,包括丙酮、壬醛和戊醛(单体和二聚体),还有编号分别为31,24和25的物质,总共7种。
采用Dynamic PCA对黄精不同炮制品的挥发性物质进行动态主成分分析,结果如图6所示。该图可直观显示黄精不同炮制品间的差异,样品之间距离近则代表差异小,距离远则代表差异明显。
从图6可看出,黄精和其两个制品(蒸黄精、酒黄精)之间距离很远,代表黄精炮制前后挥发性物质发生了很大变化;蒸黄精和酒黄精之间距离很近,代表两种炮制工艺制得的黄精(蒸黄精和酒黄精)中的挥发性物质存在较小的差异;不同炮制品平行样间距离紧密,代表样品平行性好;另外,降维后前两个主成分累计贡献率为94%,能对原始数据的特征进行较好表征。
采用Fingerprint Similarity Analysis插件对黄精不同炮制品的挥发性物质进行“最近邻”指纹分析,结果如图7所示。
从图7可以看出:通过“最近邻”指纹分析,计算样本间的欧几里得距离(简称欧式距离),检索最小距离来找到“最近邻”,观察与更远的群体相比,相对紧密的群体测量结果[23]。从图7可以看出,黄精不同炮制品挥发性物质聚类清晰,黄精和其两个炮制品(蒸黄精、酒黄精)之间的欧式距离远,相似度较低,表明黄精炮制前后挥发性物质发生了很大变化,而蒸黄精和酒黄精相对集中,彼此之间相似度较高,表明两种炮制工艺的黄精中的挥发性物质存在较小的差异。
经过结果分析可知,黄精中的挥发性物质主要包括醛类、酮类、醇类、酸类、呋喃类、内酯类和酯类等。黄精、蒸黄精、酒黄精所含挥发性物质区分明显,其中:黄精和其两个炮制品(蒸黄精、酒黄精)比较挥发性物质发生了很大变化,而两种炮制工艺的黄精(蒸黄精、酒黄精)的挥发性物质存在较小的差异。分析其原因认为黄精中含有较多的挥发性物质,经过加热炮制(蒸黄精)和加热加辅料炮制(酒黄精)后其所含挥发性物质发生了明显的变化,出现了浓郁、厚重的香甜味,所以黄精和其两种炮制品(蒸黄精和酒黄精)之间差异明显,而黄精的两种炮制品(蒸黄精和酒黄精)因为均经过了蒸制加热炮制,所以彼此之间差异较小。
本发明通过对黄精不同炮制品的图谱分析检测发现,48种物质可作为黄精的特征挥发性物质,16种物质可作为蒸黄精的特征挥发性物质,8种物质可作为酒黄精的特征挥发性物质,黄精不同炮制品中检测出的可定性的挥发性物质共62种,结合定量分析,得到黄精不同炮制品挥发性物质之间的相对含量;再通过对黄精不同炮制品挥发性成分的聚类分析,分析黄精不同炮制品间的差异大小,从而有效的鉴别黄精不同炮制品;结果准确度高,实现从气味特征鉴别黄精不同炮制品的新思路。
Claims (9)
1.一种基于GC-IMS分析特征气味物质鉴别黄精不同炮制品的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)制备黄精不同炮制品作为待测样品;
2)利用GC-IMS分析分别得到待测样品对应的GC-IMS二维谱图;
3)对步骤2)的GC-IMS二维谱图进行积分,然后对积分得到的峰进行定性,进一步计算峰体积,得到挥发性物质在黄精不同炮制品中的相对含量;
4)对步骤2)的GC-IMS二维谱图分别进行三维谱图转换、直接对比图转换、差异对比图转换、指纹图谱分析和聚类分析,通过待测样品所含挥发性物质的差异,区别黄精不同炮制品。
2.根据权利要求1所述的基于GC-IMS分析特征气味物质鉴别黄精不同炮制品的方法,其特征在于,所述步骤2)中,GC-IMS图谱的测定方法是:
称取1g粉末状的待测样品,置于20mL顶空进样瓶中,在60℃、500r·min-1孵化20min,采用气相离子迁移谱仪得到待测样品的GC-IMS图谱;
检测条件是:采用0.53mm×30m、1μm的MXT-WAX色谱柱,载气和漂移气均为N2,载气流量分别为0-2min,2mL·min-1;2-10min,2-10mL·min-1;10-20min,10-100mL·min-1;20-59min,100–150mL·min-1;漂移气流量150mL·min-1;柱温为60℃;IMS温度为45℃,进样针温度为85℃,进样体积200μL。
3.根据权利要求2所述的基于GC-IMS分析特征气味物质鉴别黄精不同炮制品的方法,其特征在于,所述步骤3)中,定性分析的方法是通过NIST数据库和IMS数据库对GC-IMS二维谱图上每个峰进行定性,确定出GC-IMS二维谱图上每个峰对应的挥发性物质。
4.根据权利要求3所述的基于GC-IMS分析特征气味物质鉴别黄精不同炮制品的方法,其特征在于,所述步骤3)中,待测样品中的挥发性物质包括醛类21种、酯类6种、醇类14种、酮类10种、酸类5种、呋喃类5种和烷类1种。
5.根据权利要求4所述的基于GC-IMS分析特征气味物质鉴别黄精不同炮制品的方法,其特征在于,所述步骤3)中的挥发性物质中,单体和二聚体两种存在形式的挥发性物质有5-甲基糠醛、2-乙酰基呋喃、乙酸、糠醛、当归内酯、1-己醇、2-甲基四氢呋喃-3-酮、1-戊醇、3-甲基丁醇、2-庚酮、庚醛、1-丁醇、异丁醇、己醛、1-丙醇、戊醛、2-丁酮、乙酸乙酯、丙醛、异丁酸、3-羟基-2-丁酮、羟基丙酮和丁醛。
6.根据权利要求5所述的基于GC-IMS分析特征气味物质鉴别黄精不同炮制品的方法,其特征在于,所述步骤4)中,所述指纹图谱分析是将GC-IMS二维谱图中所有的待分析峰自动生成指纹图谱,从指纹图谱看出黄精不同炮制品的完整挥发性物质信息以及黄精不同炮制品所含挥发性物质的差异。
7.根据权利要求6所述的基于GC-IMS分析特征气味物质鉴别黄精不同炮制品的方法,其特征在于,所述步骤4)中,聚类分析是通过待测样品之间的距离远近,判断出待测样品中所含挥发性物质的差异大小。
8.根据权利要求7所述的基于GC-IMS分析特征气味物质鉴别黄精不同炮制品的方法,其特征在于,所述聚类分析包括动态主成分分析和“最近邻”指纹分析。
9.根据权利要求1-8任一项所述的基于GC-IMS分析特征气味物质鉴别黄精不同炮制品的方法,其特征在于,所述步骤2)、步骤3)和步骤4)均是通过VOCal软件来完成的。
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