CN108267526A - Hplc测定上清丸中黄芩苷的方法 - Google Patents

Hplc测定上清丸中黄芩苷的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定上清丸中黄芩苷的方法。方法包括：(1)对照品溶液的制备；(2)供试品溶液的制备；(3)HPLC检测。本发明方法的操作简便、准确度高、专属性好、精密度较高、重现性良好，有利于保证上清丸的质量稳定和临床疗效。

Description

HPLC测定上清丸中黄芩苷的方法
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，特别涉及同时测定上清丸中黄芩苷成分的方法。
背景技术
上清丸具有清热散风，解毒，通便等功效，其药效是多种活性成分共同作用的结果，目前上清丸的检 测的方法主要为显微鉴别。上清丸中的主要药材为黄芩，而黄芩苷是黄芩的主要成分。同时现代药理研究 表明黄芩苷具有抗菌、抗病毒、解热、抗癌、抗氧化、抗心律失常、降压和镇静、调节免疫功能等多方面 的作用。《中国民族民间医药》2008年8月收载的肖燕《上清丸质量标准的研究》中，具有样品处理繁琐、 流动相毒性大等问题。
发明内容
本发明的目的就是针对上清丸的检测现状，为有效地控制上清丸的内在质量，提供一种测定上清丸中 黄芩苷的方法，有利于对上清丸产品质量的有效控制及保证其临床疗效。
一种测定上清丸中黄芩苷的方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：
分别称取黄芩苷对照品，置于容量瓶中，加甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液； (2)供试品溶液的制备：
上清丸供试品溶液的制备：取上清丸，置锥形瓶中，加甲醇，称重，超声处理45-60min，放冷，再称 定重量，用同种溶剂补重，摇匀，取续滤液，用微孔滤膜滤过，即得上清丸供试品溶液；
(3)HPLC检测：
分别吸取步骤(1)和(2)所得的黄芩苷对照品溶液和上清丸供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪 中进行测定；
其中，色谱条件为：色谱柱为C18反相色谱柱；紫外检测器；柱温为35℃；检测波长为277nm；流动 相A为乙腈，流动相B为0.38％磷酸溶液，流速为1.0ml/min；分析时间40分钟；等度洗脱，流动相A: 流动相B＝48:52。
所述步骤(1)对照品溶液的制备优选为下述方法进行：
分别称取黄芩苷对照品10.70mg置于50ml容量瓶中，加甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成 对照品溶液。
所述步骤(2)供试品溶液的制备优选为下述方法进行：
取上清丸内容物，研细，称取0.5g，置锥形瓶中，加甲醇50ml，称重，超声处理45-60min，放冷， 再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，取续滤液，用微孔滤膜滤过，即得上清丸供试品溶液；
所述步骤(3)中的色谱柱优选柱长为250mm的C18反相色谱柱。
所述步骤(3)中流速优选为1ml/min。
所述步骤(1)和(2)中甲醇浓度优选为100％。
所述步骤(2)中超声处理时间优选为60分钟。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明方法的操作简便、准确度高、专属性好、精密度较高、 重现性良好，有利于保证上清丸的质量稳定和临床疗效。
附图说明
图1为检测波长色谱图；
图2为三种标准品的HPLC色谱图；
图3为上清丸HPLC色谱图；
图4为缺黄芩阴性对照HPLC色谱图；
图5为黄芩苷对照品标准曲线图；
图6为黄芩苷B检测限；
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1 测定上清丸中黄芩苷的方法
1.1药品与试剂
黄芩苷(批号：110715-221318，含量测定用，中国食品药品鉴定鉴定研究院)，上清丸：9g/丸，批号 分别为20160310、20160506、20160504、20150701、20151203、20141205、20150901、20150308、20141003、 20160502，由九芝堂股份有限公司提供。甲醇为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司)，水为超纯水，其 余试剂均为分析纯。
1.2仪器
Waters2695高效液相色谱仪；KQ 3200DE型数控超声波清洗器(昆山市仪器有限公司)；Milli-Q纯 水系统(美国Millipore公司)；ZORBAX SB C-18分析柱(4.6mm×250mm，5μm，美国Agilent公司)； AY220电子分析天平(日本岛津)，CP225D电子分析天平(赛多利斯)。
2方法与结果
2.1波长筛选、流动相选择、提取方法与时间选择
采用SPD-M20A检测器对样品进行了全波长扫描(见图1)，根据光谱图，综合峰形、峰高、峰面积 等因素，选择277nm为检测波长。
考察了不同比例的甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液等流动相对样品的洗脱效果，综合考虑图谱分 离度、柱效、对称因子等结果，最后选择甲醇-0.38％磷酸为流动相。又根据样品的检测结果(见图2至图 3)，发现黄芩苷色谱峰在检测40min之内全部出峰，从而确定检测时间为40min。
称取上清丸0.5g，分别用30％甲醇，50％甲醇，70％甲醇，甲醇，乙醇，丙酮超声提取。通过检测结 果发现，50％乙醇为溶剂提取，三个指标性成分总体含量比较大，因此选择甲醇为提取溶剂。随后考察精 密加入甲醇25ml，50ml，75ml，100ml超声提取的效果，结果表明，精密加入甲醇50ml已经能将化学成 分提取完全。最后考察超声提取时间对提取效果的影响，分别采用15min，30min，45min，60min，90min 超声提取，结果显示随着提取时间增长，超声提取时间45min与60min指标性成分含量无明显增大，为确 保提取完全，选择超声60min为最终超声提取时间。
通过对提取溶剂、方法、体积、时间考察，最终确定选择甲醇50ml超声提取60min为片剂提取方法。
表1 提取溶剂结果比较表
表2 提取方法与时间选择结果比较表
2.2色谱条件
通过考察检测器、流动相体系、色谱柱、柱温和流速等条件，经过反复优化，得到黄芩苷色图谱的最 佳色谱条件为：紫外检测器，流动相：甲醇(A)-0.38％磷酸水溶液(B)＝48:52，等度洗脱，Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，柱温为35℃，流速为1.0mL/min，进样量为10μl，检测波长277nm， 检测时间：40min。
2.3供试品溶液制备
取本品10丸，剪碎，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密量取甲醇50ml，称定重量，超声处理 (300W，40kHz)1h，放冷，补足损失的甲醇量，过滤，取续滤液，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。
2.4对照品溶液制备
精密称取量黄芩苷对照品10.70mg，用甲醇溶解于50mL的容量瓶中，超声处理使其充分溶解，并用 甲醇定容制成储备液。
2.5线性关系考察
精密称取黄芩苷对照品10.70mg，置50ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得贮备 液(0.1997mg/ml)。分别精密吸取贮备液1、2、3、5、10ml至10ml量瓶内，用甲醇稀释至刻度，摇匀， 即得系列对照品溶液(0.01997、0.03994、0.05991、0.09985、0.1997mg/ml)，精密吸取上述溶液各10μl，注 入高效液相色谱仪，测定，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标绘制标准曲线。结果表明：黄芩苷对照品 在0.1997～1.997μg范围内线性关系良好，其回归方程为：Y＝39127106X+8528，r＝1，结果见表4，图4-6。
由表4可看出，该方法测得的成分线性良好。
表4 对照品回归方程、相关系数、线性范围
2.6检测限与定量限考察
2.6.1检测限精密吸取浓度为0.001997mg/ml的对照品溶液5μl，注入液相色谱仪，测定，信噪比 约为3，故检测限为9.99ng，结果见图6。
2.6.2定量限 精密吸取浓度为0.001997mg/ml的对照品溶液6μl，进样6次，注入液相色谱仪，测定， 信噪比约为10，故定量限为11.98ng。其峰面积积分值RSD为2.24％，结果见表7。
表5 定量限试验结果表
2.7精密度、重现性与稳定性实验
取批号为160310上清丸供试品溶液于同1d内重复进样连续进样6次，计算黄芩苷峰面积RSD％，考察 仪器日内精密度。
取批号为160310样品，分别制备6份，进行测定，计算含量及其RSD％，考察方法的重现性。
分别在0，2，4，8，16，24h对同一供试品溶液进行测定，记录峰面积，计算出相对保留时间和相对峰 面积RSD％，以考察样品的稳定性。
表6 方法学考察结果
2.8加样回收试验
精密称取已知含量的160310供试品6份(黄芩苷含量为7.7mg/g)，分别精密加入一定量的黄芩苷对照 品，照2.3项下制备回收率试验液，依法测定，计算回收率，结果见表7。
表7 方法回收率试验结果(n＝6)
2.9耐用性考察
采用拟定的方法，使用3个不同的色谱柱对同一批样品(150607、160310、160311)进行测定，结果 见表8与表9。结果表明，本方法耐用性良好。
表8 仪器及色谱柱型号
表9 耐用性试验结果表
2.10样品含量测定
按2.3,2.4所述供试品、对照品溶液的制备步骤，采用2.2色谱条件，检测10批样品，累计10批样品 中20个含量测定数据。结果见表10。
表10 批样品含量测定结果表
10批样品中黄芩苷含量平均值为60.26mg/丸，按9折计算为54.23mg/片。暂定本品每片含黄芩苷以黄 芩苷(C34H44O19)计不得少于54.23mg。

Claims (7)

1.一种测定上清丸中黄芩苷的方法，包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：
分别称取黄芩苷对照品，置于容量瓶中，加甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：
上清丸供试品溶液的制备：取上清丸，置锥形瓶中，加甲醇，称重，超声处理45-60min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，取续滤液，用微孔滤膜滤过，即得上清丸供试品溶液；
(3)HPLC检测：
分别吸取步骤(1)和(2)所得的黄芩苷对照品溶液和上清丸剂供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定；
其中，色谱条件为：色谱柱为C18反相色谱柱；紫外检测器；柱温为30～35℃；检测波长为277nm；流动相A为甲醇，流动相B为0.38％磷酸溶液，流速为0.8～1.2ml/min；分析时间40分钟；等度洗脱，流动相A:流动相B＝48:52。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)对照品溶液的制备按照下述方法进行：
分别称取黄芩苷对照品10.70mg置于50ml容量瓶中，加甲醇，超声溶解并定容至刻度，摇匀，制成对照品溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)供试品溶液的制备按照下述方法进行：
上清丸供试品溶液的制备：
取上清丸内容物，研细，称取0.5g，置锥形瓶中，加甲醇50ml，称重，超声处理45-60min，放冷，再称定重量，用同种溶剂补重，摇匀，取续滤液，用微孔滤膜滤过，即得上清丸供试品溶液。
4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的色谱柱是柱长为250mm的C18反相色谱柱。
5.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中流速为1ml/min。
6.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)和(2)中甲醇浓度为100％。
7.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)上清丸供试品溶液的制备中超声处理时间为60分钟。
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