ES2627665T3 - Una secuencia específica para el fitoplasma de la flavescence dorée (fd), usos y kit diagnósticos de fd - Google Patents

Abstract

Un método para el diagnóstico de la enfermedad Flavescencia dorada de la vid, que comprende la etapa de a) identificar uno o ambos de los nucleótidos en las posiciones 108 y 171 de SEQ ID NO 5, y/o sus nucleótidos complementarios en la secuencia complementaria a SEQ ID NO: 5, en una muestra vegetal que comprende floema; en el que la presencia de un resto C en la posición 108 de SEQ ID NO 5, y/o de un resto G en su nucleótido complementario en la secuencia complementaria a SEQ ID NO 5, y/o de un resto G en la posición 171 de SEQ ID NO 5, y/o de un resto C en su nucleótido complementario, indica la presencia en la muestra de al menos una de las cepas de fitoplasma asociadas con la enfermedad Flavescencia dorada de la vid.

Description

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fitoplasmas como causa de GY fue hecha posible durante las décadas pasadas por métodos de detección molecular, que permiten distinguir una de otra las especies de fitoplasma envueltas en cada etiolología de enfermedad.

La clasificación de fitoplasmas, que son incultivables y actualmente descritos bajo el género provisional "Candidatus Phytoplasma" está principalmente basada en 16 rRNA el gene filogenia, en la diversidad genómica, y en la variedad de huéspedes de la planta y de los insectos. Fitoplasmas son asociados con la GY.

En 2003 Boudon-Padieu (Boudon-Padieu, E., 2003) catalogó varios fitoplasmas que fueron encontrados para ser coherentemente asociados con GY. El fitoplasma de Stolbur (16SrXII-A), el agente causal de Bois noir (BN), fue relatado de la vid en Chile y fitoplasmas del mismo grupo, pero también del grupo de 16SrI (el áster yellows) fue identificado en cultivar Syrah en Francia. BN ahora ha sido relatado también en Canadá. Stolbur fitoplasma también fue identificado en vides infectadas GY en Ucrania, y podrían confirmar su presencia en Serbia.

Recientemente, los brotes nuevos y repetidos de BN causaron problemas en varias regiones vitícolas en Europa. Estos datos confirman que BN es una enfermedad endémica en Europa, Asia Menor y Mediterráneo. El áster yellows (la 16SrIb), el trébol phyllody (16SrI-C) y el olmo yellows (la 16Sr-v) fitoplasmas fue encontrado esporádicamente en vides infectadas GY en Italia (18), y la infección de vid por el áster yellows (la 16SrI-b) fitoplasma fue relatada de Túnez. Infección de papaya y vid por "California. Fitoplasma australiense" fue relatado de Israel, sin embargo, la confusión con stolbur fitoplasma, que es también presenteen esta región, es posible. Un estudio en Italia reveló la presencia de GY en el 80 % de los viñedos inspeccionados.

BN es extendido en todo el país mientras que la Flavescence dorée (FD) principalmente es restringido a las regiones del norte. Recientemente, la presencia de vides infectadas por fitoplasmas de la FD/C ha sido relatada en Eslovenia y Serbia. La FD fitoplasma pertenece al 16SrV el grupo taxonómico (Leeet al., 2000) y esta es la enfermedad más importante y el fitoplasma más destructivo de la vid y su causar fitoplasmas muestra una alta especificidad vector, que es transmitido en condiciones naturales sólo por el saltahoja S. titanus (Hemiptera: Cicadellidae).

S. titanus pasa su ciclo de vida entero sobre la vid. Esto es vector sumamente móvil y eficiente que es en gran parte responsable de la extensión epidémica de la FD. Tanto las ninfas como adultos son capaces de adquirir el fitoplasma alimentando. Después de un período latente ellos son capaces de transmitir la enfermedad hasta su muerte. La FD fue llamada "catastrófica" en Francia, y es tan severo que en Unión Europea es sujeto de poner en cuarentena.

Las vides infectadas por la enfermedad son caracterizadas por las alteraciones en color de las hojas (el amarilleo o enrojeciendo), bajo de la lignifications de brotes y de la sequedad de manojos. Los impactos incluyen la vitalidad reducida de vides, reducciones de producción, y la calidad de vino reducida debido al alto contenido ácido y bajo de azúcar de fruta de plantas infectadas. Ningunos síntomas o síntomas muy débiles son visibles sobre el rizoma más popular. Este hecho juega un papel crítico en la extensión de la FD, y mandos sólo ampliados y continuos bio moleculares pueden ayudar en el cuidado de la planta de vid de madre libredel fitoplasmas.

Cuando ningunas medidas de control son usadas, en la presencia del insecto vectors, las enfermedades se difunden rápidamente, infectando hasta el 80-100 % de vides dentro de unos años. La FD ha destruido grandes áreas vitícolas en Francia e Italia, y esto se extiende por todas partes de Europa del sur a pesar de programas de control obligatorios. Cultivars popular como Chardonnay, Cabernet Sauvignon, Pinot noir, el Riesling, Sauvignon blanc, y Sémillon es sumamente susceptible a la FD. Algún cultivars como Sangiovese y Garganega es sumamente susceptible, y, de ser inoculadas con frecuencia, las plantas fuertes son dañadas; a veces las vides infectadas no pueden sobrevivir a la temperatura del invierno, y mueren.

La FD es causada por dos variedades de fitoplasma: el primero pertenece al grupo taxonómico 16SrVD, y el segundo pertenece al grupo taxonómico16SrVC.

La detección confiable de fitoplasmas en la vid es todavía un desafío aunque una amplia variedad de instrumentos diagnósticos esté disponible. Cada año causan problemas titres del patógeno que temporalmente fluctuan, y distribución irregular en vides infectadas. La inspección visual es impedida por la infección latente en algunos rizomas y los largos períodos de infección sin síntomas en Vitis vinifera.

Como a partir de 1982, anticuerpos monoclonales y antisuero polyclonal fueron producidos para la detección de fitoplasmas de la FD por la inmunización de conejos con extractos parcialmente purificados de la FD-infected Vicia faba plantas o de vector experimental E. variegatus. Estos antisueros también fueron usados para observar fitoplasmas mediante la microscopía immunosorbent de electrones (ISEM) y la microscopía de luz de fluorescencia. Antisueros polyclonales fueron relatados como satisfactoriamente empleados para la mancha de punto y el diagnóstico del fitoplasma ELISA-basado sobre la FD en plantas infectadas y en S. titanus solo individuos tranquilos en viñedos

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Así, en estas condiciones, la fluorescencia no es perceptible ya que el quencher absorbe la energía de la fluorescencia. Ya que el final 3' de la sonda TaqMan rd fodforilado, ninguna reacción de extensión ocurre de la sonda TaqMan durante la reacción PCR.

En una encarnación de la invención, las sondas TaqMan® MGB pueden ser etiquetadas por 6-carboxyfluorescein (FAM) en el final 5' y con quencher no fluorescente (NFQ) con la carpeta de surco menor (MGB) en el final 3'.

Las sondas MGB en la presente invención reveló una temperatura más alta que se derrite (Tm) y aumentó la especificidad y eran sondas MGB era una secuencia más específica que las sondas ADN estándar, sobre todo para cada desajustes de base en temperaturas de hibridación elevadas.

Todas las reacciones RT PCR pueden ser realizadas sobre un ABI PRISM® 7300 Sistema de Detección de Secuencia (Biosystems Aplicado) en 96 platos ópticos con cubiertas ópticas adhesivas (ambos Biosystems Aplicados) la utilización de las condiciones de ciclismo siguientes: 10 minuto en 95°C, seguido de 40 ciclos de 15 a 95°C y 1 minuto en 61,5°C, que permitió a la carrera de todas las reacciones sobre el mismo plato. RT PCR puede ser realizado en un volumen de reacción final de 25 µ La l que contiene 5 µ La l de ADN de la muestra, 300 cartillas nm, 250 nm de la sonda y 1 × TaqMan® la Mezcla principal Universal PCR (Biosystems Aplicado), que incluye ROX como un tinte de referencia pasivo.

Cartillas y sondas convenientes pueden ser diseñadas con varios algoritmos y los programas disponibles también en Internet, o su estilo puede ser comisionado vía servicios disponibles en comercio. En una manera non limitativa, sondas convenientes podrían ser una cartilla avanzada de 26 nucleótidos en la longitud que comienza en posición 72 de 5 ' a 3 ' de la SEC ID el No. 5, a condición de que aquí como la SEC ID el No. 2, una sonda TaqMan® de 17 nucleótidos en la longitud que comienza en la posición 102 de 5' a 3' de la SEC ID el No. 1, a condición de que aquí como la SEC ID el No. 3 etiquetara p.ej. por 6-FAM en el final 5', y una cartilla inversa de 25 nucleótidos en la longitud que comienza en la posición 147 de 5' a 3' de la SEC ID el No. 1, como la SEC ID el No. 4. Cuando una sonda TaqMan® es usada, el SNP (C/T) de interés es localizado en el centro en la dicha sonda.

Cuando en este análisis es usada la SEC ID NÚMEROS 2-4, la temperatura de templadura conveniente es de aproximadamente 61-61,5 °C. Los análisis que usan TaqMan® son conocidos en el arte y a la persona experta están disponible protocolos llenos, en principio. El análisis de discriminación allelica nucleasa 5 ', o el análisis TaqMan, es un análisis basado sobre el PCR para el genotipo SNPs. La región flanking el SNP es amplificada en la presencia de dos sondas allele-específicas fluorescentes. Las sondas no hacen fluoresce en la solución debido a un quencher en final 3'. La presencia de dos sondas permite la detección de ambos alleles en un tubo solo. Además, porque las sondas son incluidas en el PCR, el genotipo es determinado sin cualquier tratamiento de post-PCR.

Las técnicas convenientes para realizar el método aquí revelado comprenden también Hibridación Específica Allele también conocida como ASO (en inglés Allele Specific Oligonucleotide, o sea hibridación específica allele oligonucleotide).

Este protocolo confía en la distinción entre dos moléculas de ADN que se diferencian por una base (es decir el SNP de interés) por la hibridación. El TNA obtenido por la muestra de líber es amplificado con cartillas convenientes PCR diseñadas para amplificar una región de la SEC ID el No. 5 comprendiendo un o ambos de los nucleótidos 108 y 171, en una encarnación conveniente, el PCR amplicons es la fluorescencia etiquetada. Los fragmentos obtenidos por PCR son que aplicado a inmovilizado oligonucleotide los fragmentos de la SEC ID el No. 1 comprendiendo el SNP o los SNPS de interés. Después de la hibridación conveniente y de las condiciones lavadoras, la intensidad de fluorescencia es medida para cada oligonucleide.

Debido al hecho que es analizado un SNP, la hibridación rigurosa y las condiciones lavadoras tendrán que ser usadas, donde por riguroso la persona experta entenderá las condiciones que permitirán sólo al 100 % de las secuencias híbridas correspondientes para permanecer en la doble forma de hilo. El medio típico para regular la severidad de un protocolo híbrido es la concentración de sal (más alta es la concentración y más baja es la severidad) y/o la concentración formamide (más alta es la % y más alta es la severidad) y/o la temperatura (más alta es la temperatura y más alta es la severidad). Se conocen condiciones de severidad convenientes para la identificación de SNPS por RT-PCR en el arte y protocolos estándar publicados para esta reacción.

Este tipo de identificación puede ser realizado también en una fase sólida, p. ej. sobre un apoyo sólido (definido sucesivamente) como el microtítulo, el chip de microserie y similares, permitiendo a la selección de un grande número de muestras.

En una encarnación particular, las microseries serán usadas. La diapositiva de microserie es un instrumento diagnóstico muy poderoso capaz de identificarse, en un experimento solo, la presencia/ausencia de un alto número de objetivos. Los

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En una encarnación aún remota, la identificación del SNP (s) en posición 108 y/o 171 de la SEC ID el No. 5 o 1 puede ser realizado por la técnica de la hendidura invasiva como descrito, p.ej. por Wilkins Stevens P. et 2001.

Como indicado encima, también esta técnica es conocida por la persona experta como un acercamiento conveniente para la identificación de SNPS.

El análisis de hendidura invasivo es un ciclismo de sonda, la reacción de amplificación de la señal usada para la detección de polimorfismos de nucleótido solos (SNPs).

La reacción requiere dos oligonucleotides sintéticos, llamados el ‘oligonucleotide ascendente’ y ‘sonda', que templa a la secuencia meta con una superposición de 1 nt.

Esto crea un complejo de superposición bifurcado que se parece a una estructura generada durante la síntesis del ADN de desplazamiento del hilo. 5' nucleases específicos de estructura, cuya función de célula primaria, como se cree, es de procesar los fragmentos de Okazaki, hender el sustrato bifurcado en el sitio de la superposición, y liberaR el 5' y una base del nucleótido apareado de la sonda. El hendido 5 ' sirve como una señal que indica la presencia del objetivo en una muestra analizada.

Realizando la reacción invasiva en la sonda que derrite la temperatura (la Tm), pueden ser alcanzados múltiples acontecimientos de hendidura para cada objetivo. Típicamente una reacción de amplificación de señal invasiva genera 30-50 sondas hendidas/objetivo/minuto, causando 103-104-fold amplificación de señal en una reacción de 1-3 h. La capacidad única de 5 '-nucleases para expresamente hender el sustrato que se superpone puede ser utilizada para la detección de mutaciones de una sola base. Descubrir un nucleótido particular en la secuencia meta, el oligonucleotide ascendente y la sonda son diseñados para crear la superposición en este nucleótido, asegurando la hendidura eficiente de la sonda. Una substitución a esta posición del nucleótido elimina la superposición y reduce radicalmente la tarifa de hendidura, causando la discriminación de mutación de al menos 300:1.

Tal poder discriminatorio hace el análisis de hendidura invasivo un instrumento excelente para la identificación de SNPS.

La detección de señal puede ser realizada por la electrofóresis, la microplaca (el microtítulo), el análisis immunosorbente del enzima ligado (ELISA, en inglés enzyme-linked immunosorbent assay), el láser matrix-assisted tiempo-de-vuelo desorción/ionización (MALDI-TOF, en inglés matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight), los métodos de espectrometría de masas, la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (el FRET), y la metodología.

El análisis de hendidura invasivo, como otras técnicas mencionadas anteriormente, es adaptable a un formato de fase sólido que presenta la posibilidad de analizar SNPS múltiples o muestras múltiples para un solo SNP en paralelo. La detección de SNP que usa la reacción de hendidura invasiva puede ser realizada en 96 microplacas con las cantidades de nanogramo de ADN por SNP.

Además, el SNP puede ser identificado por el método de SniPer que permite a la discriminación de alleles examinando la presencia o la ausencia de amplificación por RCA (rodando la amplificación de círculo). Brevemente, el ADN para ser usado como una plantilla es linealizado. Entonces, una sonda es hidridada a este ADN linealizado. Cuando la secuencia de sonda y la secuencia del ADN linealizado como una plantilla son complementarias el uno al otro y forman un hilo complementario, el ADN genómico puede ser convertido en un ADN circular por la reacción de ligadura. Por consiguiente, RCA de los beneficios del ADN circular, pero el ADN no es ligado para ser circular cuando los finales de la sonda no coincide con el ADN genómico.

Así, la reacción RCA no continúa. Por lo tanto, en el método Sniper es diseñada una sonda sola bloqueada que templa con el ADN genómico, y es circularizabile. Es llamada sonda de candado esta sonda sola-bloqueada. Las secuencias de los dos finales de esta sonda de candado son diseñadas de modo que correspondan al SNP para ser descubierto. Entonces, esta sonda de candado y el ADN genómico son mezclados con la ligadura. Si los dos finales de la sonda de candado y el sitio de SNP del ADN genómico son complementarios el uno al otro, los dos finales de la sonda de candado son unidos por ligadura, cediendo una sonda circular. Si los dos finales de la sonda de candado y el sitio de SNP del ADN genómico no son complementarios el uno al otro, la sonda no se hace circular.

Por lo tanto, sólo aquellas sondas de candado que son complementarias al SNP para ser descubierto se hacen circulares y son amplificadas por la polimerasis de ADN. Descubriendo la presencia o la ausencia de esta amplificación, el SNP puede ser descubierto. Para la detección, son usados los oligonucleotides sintéticos que tienen un tinte fluorescente y un quencher a sus respectivos finales y también tienen una estructura de horquilla.

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Tipos de muestras

n. Código de las muestras A B Δ CT PCR/RFLP ELISA

Hojas de vid

1 136 31,17 30,07 1 + -

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137 34,46 34,41 0 + -

3

143 32,36 27,25 5 + -

4

144 32,49 26,43 6 + -

5

145 32,2 29,62 3 + -

6

146 34,56 28,09 6 + -

7

147 32,2 28,36 4 + -

8

148 33,03 25,96 7 + -

9

150 34,17 29,84 4 + -

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151 35,03 33,96 1 + -

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152 32,96 26,88 6 + -

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153 31,23 27,97 3 + -

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154 32,04 29,62 2 + -

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155 34,31 28,69 6 + -

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257 32,33 24 8 + -

controlo positivo

FD 18 16 2 + +( muy débil)

controlo negativo

EY negativo 33 - + -

ALY

negativo 33 - + -

AY

negativo negativo negativo nt

STOL

negativo negativo negativo

Leyenda:

nt - no probado

5  La tabla 1 muestra las diferencias entre el mismo análisis conducido a 61,5 °C (A) y 60 °C (B) y con el kit comercial ELISA (SEDIAG, Francia). 15 muestras fueron probadas para evaluar la sensibilidad y la especificidad del análisis FD66 RTPCR. En la condición A, el análisis fue conducido a 61,5 °C y podemos observar la alta especificidad para fitoplasma FD, pero menos sensibilidad. En la condición B, el análisis fue conducida a 60 °C, y hemos observado una sensibilidad aumentada del análisis para la muestra de vid infectada por la FD, pero una especificidad pobre para el

10 fitoplasma de la FD. La diferencia en la sensibilidad de las dos condiciones fue calculada usando el valor ΔCt. Ningún fitoplasma fue descubierto usando la prueba ELISA.

Preparación de la muestra para la prueba E.L.I.S.A.

15 Las muestras estuvieron preparadas siguiendo las instrucciones del fabricante, y la prueba E.L.I.S.A. fue realizada a la misma manera. Debido a los resultados negativos obtenidos, y a la mucha débil señal obtenida sólo para el control previsto en el kit, las hornadas diferentes del kit SEDIAG 480 fueron probadas con los mismos resultados relatados en la Tabla 1.

20 La tabla muestra una comparación entre el método convencional actualmente usado (el PCR-PUNTO-FINAL) y la prueba diagnóstica aquí propuesta (basada PCR en tiempo real).

No comparamos el método propuesto con el preexistente (Bianco et al., 2004) porque: i) en estas hojas el objetivo era un producto PCR mientras en el presente análisis usamos el TNA e ii) el objetivo de secuencia en el papel antedicho era el

25 gene 16Sr del ADN mientras en el presente método propuesto, el objetivo es un gene de una proteína ribosomal.

El protocolo relatado en la literatura está siempre basado en la presencia de un SNP. Esto puede distinguir FD DE EY, pero, como antes descrito, son necesarias dos reacciones de amplificación para expresamente descubrir el fitoplasma

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asociado con la FD. Por lo tanto, el método propuesto en la presente invención representa una nueva tecnología comparada a las técnicas anteriores.

Hybridisacion sobre microserie

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El ADN genómico amplificado es etiquetado por el kit "Sistema de Etiquetaje Total Genómico BioPrime®" (INVITROGEN

-18097-012) siguiendo las instrucciones del fabricante. La muestra etiquetada es precipitada por Spin – Vacuum Savant y es posteriormente re suspendida en la solución hibridada.

10 Microserie de hibridisación:

Las pruebas (sondas) que comprenden un o ambas regiones SNPS de interés han sido bloqueadas sobre la diapositiva para la detección del fitoplasma SNP (s) asociado con la FD revelado en la presente descripción, en 16 copias por prueba (sonda). Antes de la reacción hibridada, la activación de la diapositiva será realizada (la química superficial de 15 vidrio: EPOXY Surface Coating Slides; spotting buffer: Scott-Nexterion buffer para manchar; concentración de prueba (sonda): 30 µ M), por el empleo de una solución obstructora (10x Citrato de Salina de Sodio (SSC), Sodio del 0.1 % Dodecyl Sulfato (SDS), 0.066 Sodio Tetrahydridoborate (NaBH4), H2O hasta 50ml). La diapositiva es tratada con la solución obstructora durante 20 minutos a 42°C. Los lavados son realizados: dos veces (Citrato de Salina de Sodio 1x durante 5 minutos en temperatura ambiente), dos veces (Citrato de Salina de Sodio 0.1x durante 5 minutos en

20 temperatura ambiente).

Prehibridisación:

Una solución que consiste en: 5x el Citrato de Salina de Sodio (SSC), el Sodio del 0.1 % Dodecyl el Sulfato, 200 µ el 25 ADN de Esperma de Salmón de g, 5x la Solución de Denhardt (5g Ficoll, 5g el Polivinilo pyrrolidone, 5g albumin de suero bovino, fracción la V, H2O hasta 500ml), H2O hasta 2ml está preparada. La solución debe ser filtrada por 0.2 µ filtros de

m. La diapositiva del área que comprende las pruebas es delimitada "con un marco" (el Marco Génico 21x22mm y resbalones de cubierta -AB1043 CELBIO). 110 µ la l de solución prehibridisada es colocada dentro de este área y la diapositiva es cubierta del resbalón de cubierta. La diapositiva con la solución prehibridisada es incubada a 42°C durante

30 2 horas.

Hibridisación:

Una solución que consiste en: 5X el Citrato de Salina de Sodio (SSC), el Sodio del 0.1 % Dodecyl el Sulfato, el 25 % 35 Formamide, 200 µ el ADN de Esperma de Salmón de g, H2O hasta 2ml está preparado. La solución debe ser filtrada por

0.2 µ filtros de m y precalentada a 42°C. La muestra del ADN amplificado y etiquetado es re suspendido en aproximadamente 110 µ la l de solución h. La muestra de ADN, suspendida de nuevo en la solución hibridisada, es desnaturalizada a 95°C. La solución hibridisada es colocada en el centro "del marco" que define el área que comprende las sondas objetivo, y el resbalón de cubierta es colocado sobre este área. La diapositiva de ahí es incubada a 42°C

40 durante 16 horas.

Post-hibridisación lavada:

1r LAVADO -en un volumen de 50ml solución: 1x Citrato de Salina de Sodio (SSC), Sodio del 0.1 % Dodecyl Sulfato

45 (SDS) durante 5 minutos a 42°C; 2o LAVADO - en un volumen de 50 solución ml: 0.2x Citrato de Salina de Sodio (SSC), Sodio del 0.1 % Dodecyl Sulfato (SDS) durante 5 minutos a 42°C; 3r LAVADO -en un volumen de 50ml solución: 0.2x Citrato de Salina de Sodio (SSC) durante 5 minutos a 42°C; 4o LAVADO - en un volumen de 50ml solución: 0.2x Citrato de Salina de Sodio (SSC) durante 5 minutos a 42°C.

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La diapositiva ha sido secada por la centrifugación a 800 revoluciones por minuto durante 5 minutos.

BIBLIOGRAFÍA

55 -ANGELINI, E. et al 2001 “Flavescence dorée in France and Italy: occurrence of closely related phytoplasma isolates and their near relationships to palatinate grapevine yellows and an alder yellows phytoplasma.” Vitis, 40, 79–86. -ANGELINI, E. et al 2007 “A new Taqman method for the identification of phytoplasmas associated to grapevine yellows by real time PCR assay.” Journal of Microbiological Methods. 6 8, 613-622. -Belli G. et al 1973. “Presenza di una malattia del tipo "Flavescence dorée" in vigneti dell'Oltrepò pavese.” Rivista di

60 Patologia Vegetale Ser. IV, 9 (Suppl.): 50-56.

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Claims (1)

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