PT2601305T - Sequência específica para o fitoplasma da flavescência dourada (fd), respectivas utilizações e kits de diagnóstico da fd - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

SEQUÊNCIA ESPECÍFICA PARA O FITOPLASMA DA FLAVESCÊNCIA

DOURADA (FD), RESPECTIVAS UTILIZAÇÕES E KITS DE DIAGNÓSTICO DA FD A presente invenção obteve uma licença de distribuição estrangeira atribuída pelo Ministero Dello Sviluppo Economico, U.I.B.M. Divisione XI, no dia 26 de Maio de 2010, Protocolo número 59395. A presente invenção diz respeito a uma nova sequência genómica específica para o fitoplasma causador da Flavescência Dourada (FD) em videiras, a um método para o diagnóstico da FD em videiras e em partes das mesmas, incluindo porta-enxertos, e a um kit para a detecção dos fitoplasmas agentes da FD em amostras de plantas.

ESTADO DA TÉCNICA

Os amarelecimentos da videira, Grapevine Yellows (GY) , são um complexo de doenças que inicialmente se consideravam como sendo causadas por vírus mas sabe-se actualmente que a sua etiologia é fitoplasmática. A primeira doença de GY descrita para a Vitis vinifera, e a mais conhecida entre as doenças de GY, é sem dúvida a Flavescência Dourada (FD), que foi identificada pela primeira vez no sudoeste da França durante a década de 1950 (Caudwell, 1957), e que, posteriormente, se propagou para outras regiões vitícolas da França, norte de Itália e países europeus limítrofes, incluindo Espanha, Portugal e Sérvia. A Bois noir (BN), cujos sintomas são indistinguíveis dos da FD, também foi identificada pela primeira vez na França e, posteriormente, nas mais importantes regiões vitícolas da Europa.

Sintomas semelhantes aos do síndrome de GY são causados por diferentes fitoplasmas e surgem em folhas, rebentos e cachos da videira. Os sintomas típicos incluem descoloração e necrose das nervuras das folhas e das lâminas das folhas, enrolamento das folhas para baixo, lenhificação dos rebentos ausente ou incompleta, crescimento retardado e necrose dos rebentos, abortamento das inflorescências e dessecação dos bagos. Estes sintomas estão relacionados com a deposição de calose nas placas crivosas e subsequente degeneração do floema. Embora até ao momento não seja conhecido nenhum cultivar resistente de Vitis vinifera ou porta-enxertos, as diferentes variedades de uva diferem consideravelmente no que diz respeito à severidade dos sintomas. Variando entre um rápido declínio e morte em cultivares altamente susceptíveis e porta-enxertos tolerantes como portadores do patógeno sem manifestar sintomas.

Os fitoplasmas são patógenos de plantas microscópicos, semelhantes a, mas muito mais pequenos do que bactérias. São procariotas limitados ao floema, não helicoidais e sem parede celular (Firrao, G., et ai, 2004.) . Ao contrário dos vírus, os fitoplasmas têm o seu próprio metabolismo, um metabolismo muito reduzido, e algumas das moléculas essenciais para a sua sobrevivência são adquiridas do hospedeiro. Os fitoplasmas representam um clade monofilético dentro da classe Mollicutes, que se divide actualmente em pelo menos 15 subgrupos com base em análises de sequências de alguns genes conservados. Um novo táxon, 'Candidatus Phytoplasma' foi definido e alguns grupos ou subgrupos foram recentemente descritos como espécies 'Ca. Phytoplasma''.

Os genomas completos de quatro fitoplasmas foram sequenciados, fornecendo novas informações sobre a sua biologia e sobre as suas interacções com plantas e insectos hospedeiros ("Ca. Phytoplasma asteris" estirpe AY-WB NC_007716 e OY NC_005303 "Ca. P. mali" NC_011047, "Ca. P. australiense" NC_010544).

Os dados disponíveis confirmam a ausência de genes para um metabolismo autónomo e a sua dependência do parasitismo intracelular. Verificou-se que os fitoplasmas de alguns grupos estão sistematicamente associados às GY. Estes propagam-se através de um insecto vector; também a propagação de videiras infectadas causada pelo homem contribui para a disseminação das GY ao longo de uma grande distância. Isto implica um elevado risco de disseminação das GY para regiões onde poderiam surgir novos surtos se existissem vectores competentes ou também se estes fossem introduzidos.

As GY, no entanto, têm diferentes espécies de fitoplasmas como agentes causadores, bem como diferentes insectos vectores, que são ou cicadelídeos ou fulgomorfos (Homoptera: Auchenorrhyncha) que se alimentam especificamente ou apenas ocasionalmente de videiras. É importante referir que duas ou mais espécies de fitoplasma podem infectar simultaneamente a mesma videira causando, portanto, infecções mistas.

Embora os fitoplasmas sejam microrganismos não cultiváveis e, no caso das GY, os postulados de Koch ainda não terem sido comprovados, quando se verifica que os fitoplasmas de um grupo ou subgrupo específico estão sistematicamente associados a uma doença específica da uva, estes são considerados como sendo os agentes causadores da mesma. Na realidade, a identificação de fitoplasmas como sendo a causa das GY foi possível, ao longo das últimas décadas, graças a métodos de detecção molecular, que permitem distinguir as espécies de fitoplasma envolvidas na etiologia de cada doença. A classificação dos fitoplasmas, que não são cultiváveis e que estão actualmente descritos no género provisório "Candidatus Phytoplasma," baseia-se principalmente na filogenia do gene 16S rRNA, na diversidade genómica, e no conjunto de plantas e insectos hospedeiros.

Os fitoplasmas estão associados com as grapevine yellows.

Em 2003 Boudon-Padieu (Boudon-Padieu, E., 2003) enumerou vários fitoplasmas que se verificou estarem consistentemente associados com as GY. O fitoplasma Stolbur (16SrXII-A), o agente causador da Bois noir (BN), foi identificado em videiras no Chile e fitoplasmas do mesmo grupo, mas também do grupo 16SrI (aster yellows) foram identificados em cultivares Syrah na França. A BN também foi encontrada no Canadá. O fitoplasma Stolbur também foi identificado na Ucrânia em videiras doentes com GY, e a sua presença na Sérvia pôde ser confirmada. Recentemente, novos e repetidos surtos de BN causaram problemas em várias regiões vitícolas na Europa. Estes dados confirmam que a BN é uma doença endémica na Europa, na Ásia Menor e no Mediterrâneo. Os fitoplasmas de Aster yellows (16SrI-B), clover phyllody (16SrI-C) e elm yellows (16Sr-V) foram encontrados esporadicamente em videiras doentes com GY em Itália (18), e a infecção de videiras pelo fitoplasma aster yellows (16SrI-B) foi reportado pela Tunísia. A infecção de papaias e videiras por "Ca. Phytoplasma australiense" foi identificada em Israel, no entanto, a confusão com o fitoplasma stolbur, que também se encontra nesta região, é possível. Um estudo em Itália revelou a presença de GY em 80% das vinhas examinadas. A BN encontra-se difundida por todo o país enquanto a Flavescência dourada (FD) está principalmente circunscrita às regiões Norte. Recentemente, a existência de videiras infectadas por fitoplasmas de FD/C foi reportada na Eslovénia e na Sérvia. 0 fitoplasma da FD pertence ao grupo taxonómico 16SrV (Lee et al. , 2000) e é a doença em videiras causada por fitoplasmas mais importante e destrutiva e os fitoplasmas responsáveis pela mesma apresentam uma elevada especificidade de vectores, sendo transmitida em condições naturais apenas pelo cicadelideo S. titanus (Hemiptera: Cicadellidae). OS. titanus passa todo o seu ciclo de vida em videiras. É um vector altamente móvel e eficiente, e que é em grande parte responsável pela propagação epidémica da FD. Tanto as ninfas como os adultos podem adquirir o fitoplasma enquanto se alimentam. Após um período de latência estes podem transmitir a doença até morrerem. A FD foi denominada de "catastrófica" na França, e é tão severa que na UE está sujeita a quarentena.

As videiras afectadas pela doença são caracterizadas por alterações de cor das folhas (amarelecimento ou avermelhamento), lenhificação reduzida dos rebentos e cachos secos. Os impactos incluem redução da vitalidade das videiras, diminuição da produção, e diminuição da qualidade do vinho devido a uma elevada acidez e baixo teor de açúcar dos frutos das plantas infectadas. Ausência de sintomas ou sintomas muito ligeiros podem ser observados no porta-enxerto mais popular. Este facto tem um papel fundamental na disseminação da FD, e apenas análises biomoleculares de controlo extensivas e contínuas podem ajudar a manter a planta mãe da videira livre de fitoplasmas. Quando não for utilizada nenhuma análise de controlo, na presença dos insectos vectores, a doença propaga-se rapidamente, afectando até 80-100% das videiras dentro de poucos anos. A FD é responsável pela destruição de grandes áreas vitícolas na França e em Itália, e pela sua disseminação em todo o sul da Europa, apesar da obrigatoriedade de utilização de programas de controlo .

Os cultivares mais populares como o Chardonnay, o Cabernet Sauvignon, o Pinot noir, o Riesling, o Sauvignon blanc, e o Sémillon são altamente susceptíveis à FD. Alguns cultivares como o Sangiovese e o Garganega são extremamente susceptíveis e se as plantas forem frequentemente inoculadas estas serão fortemente danificadas; por vezes as videiras doentes não conseguem sobreviver às temperaturas do inverno e morrem. A FD é causada por duas estirpes de fitoplasma: a primeira pertence ao grupo taxonómico 16SrVD, e a segunda pertence ao grupo taxonómico 16SrVC. A detecção fiável de fitoplasmas em videiras é ainda um desafio apesar da existência de uma ampla variedade de ferramentas de diagnóstico. As baixas titulações dos patógenos e respectivas flutuações anuais e também sazonais, e a sua distribuição irregular em videiras infectadas causam problemas. A inspecção visual é limitada por uma infecção latente em alguns porta-enxertos e por longos períodos de infecção sem sintomas na Vitis vinifera. A partir de 1982, anticorpos monoclonais e anti-soros policlonais foram produzidos para a detecção de fitoplasmas de FD através da imunização de coelhos com extractos parcialmente purificados de plantas de Vicia faba infectadas com FD ou do vector experimental E. variegatus. Estes anti-soros também foram utilizados para a observação de fitoplasmas através de microscopia electrónica de imunoadsorção (ISEM) e microscopia de fluorescência. A utilização de anti-soros policlonais foi descrita como bem sucedida em diagnósticos, com base em ensaios Dot-Blot e ELISA, do fitoplasma da FD em plantas de fava infectadas e em indivíduos de S. titanus recolhidos em vinhas afectadas com GY. No entanto, estes anti-soros não produziram resultados satisfatórios, em termos de sensibilidade e especificidade, para a detecção de agentes de FD em videiras. Em resumo, ainda não está disponível nenhuma ferramenta serológica fiável para testes E.L.I.S.A., ou métodos semelhantes, em tecidos de videira.

Efectivamente, têm sido desenvolvidos vários métodos para a detecção da FD; estes incluem métodos convencionais de PCR/RFLP com base na análise de genes ribossomais e não ribossomais (Lee et ai., 2004 ; Botti et ai., 2007) e mais recentemente, ensaios de PCR em tempo real (RT-PCR) (Bianco et ai. 2004; Galetto et ai. 2005 ; Angelini et ai. 2007; Hren et ai., 2007) . Contudo, nenhum destes ensaios permite distinguir facilmente e imediatamente o fitoplasma da FD de outros fitoplasmas que se encontram esporadicamente em videiras (EY= elm yellow, ALY=alder yellow), devido ao facto de os tempos necessários para o processamento da amostra serem muito longos (PCR/RFLP). Algumas sequências de nucleótidos relativas ao "Ca. Phytoplasma vitis" estão disponíveis em bases de dados online (16S rpl22, rps3, secY etc.) mas nenhuma destas é adequada para o design de um ensaio de RT PCR para a identificação específica do fitoplasma associado à FD. O único método actualmente disponível para identificar exclusivamente a FD consiste num ensaio de diagnóstico molecular que inclui duas fases principais com várias etapas analíticas (Bianco et ai., 2004) . As fases principais podem ser resumidas da seguinte forma: o DNA extraído de amostras de videira é submetido a uma primeira amplificação genética (PCR end-point) produzindo amplicões, que são posteriormente utilizados na segunda etapa principal como um padrão para um ensaio de RT PCR. Em detalhe, dois conjuntos diferentes de primers (iniciadores moleculares), como descrito por Lee et ai., 1993 ou por Deng e Hiruki, 1991; Schneider et al., 1995, concebidos para a amplificação do 16S rDNA de todos os fitoplasmas conhecidos, são utilizados para o primeiro ciclo de amplificação. Os amplicões são então submetidos a um PCR aninhado (nested-PCR) utilizando primers desenvolvidos para a amplificação especifica de DNA do grupo de aster yellows e Stolbur (Davis et al., 1997), ou primers concebidos para a amplificação especifica do grupo de elm yellows (Lee et al., 1994).

Para desenvolver um ensaio de RT PCR para uma detecção simultânea de fitoplasmas pertencentes aos subgrupos 16SrV-C e 16SrV-D, foram concebidos primers específicos. 0 fragmento amplificado contém o local de clivagem de BfaI que se encontra nos subgrupos 16SrV-C e 16SrV-D. No mesmo fragmento uma única mutação de bases (T em vez de C) acontece na posição 1068 das estirpes de referência EY1 e ULW interrompendo desta forma o local de restrição de Bfa I (Fig. 1) . A presença deste local de restrição foi proposto como um marcador distintivo para a identificação de fitoplasmas associados aos agentes da FD (Lee et al., 1998) e foi recentemente adoptado para a identificação de fitoplasmas associados com a FD em Itália (Pasquini et al., 2001) . A desvantagem desta metodologia, que inclui duas reacções de amplificação, consiste num longo tempo de execução e num custo elevado. Além disso, um especialista qualificado nesta área está bem consciente de que várias etapas analíticas podem implicar riscos de contaminação cruzada das amostras. Tendo em conta o efeito "catastrófico" causado pela FD, os porta-enxertos sem sintomas, a dificuldade em distinguir a FD da EY e/ou ALY, e os cultivares valiosos que são severamente afectados por esta doença, é evidente que um método rápido e fiável para a detecção da doença poderia permitir a activação de programas de controlo nacionais e internacionais, e poderia beneficiar as medidas de prevenção contra a disseminação da doença em viveiros de plantas, centros verdes e áreas de cultivo.

Ainda não existem ferramentas curativas ou tratamentos químicos que sejam eficazes contra o patógeno. Por esta razão, após os novos e destrutivos surtos de FD registados na década de 1990 na França, depois no norte de Itália e agora nas áreas balcânicas, e como a FD está incluída na lista de quarentena da EPPO, diversas iniciativas (i.e. o Ministro da Agricultura Italiano publicou um decreto para a obrigatoriedade do controlo da doença, D.M. n. 32442, 31 de Maio de 2000: "Misure per la lotta obbligatoria contro la Flavescenza Dorata delia vite", publicado em G.U. n.159 de 10 de Julho de 2000) estabelecem oficialmente as medidas que devem ser aplicadas para conter infecções de FD. Em detalhe, nessas áreas onde a FD está presente como um foco, a erradicação da doença por eliminação e destruição da planta infectada é obrigatória. Além disso, também é obrigatório realizar tratamentos com insecticida duas vezes por ano contra o Scaphoideus titanus Bali. Outras medidas adicionais de controlo podem ser impostas pelos serviços locais de protecção fitossanitária - Plant Protection Services (PPS), de acordo com cada situação específica, incluindo a completa erradicação de vinhas com plantas sintomáticas.

Os fitoplasmas associados com a German Palatinate grapevine yellows (PGY) foram descritos na literatura apenas uma vez e, desde então, não foram encontrados outros casos desta infecção em videiras. Estes são aparentemente transmitidos pelo cicadelídeo Oncopsis alni (Schrank) (Maixner, M., e W. Reinert. 1999; Maixner, M., W. Reinert, e H. Darimont. 2000), e foram classificados como membros do grupo 16SrV com base no seu gene 16S rRNA. Os fitoplasmas de Palatinate Grapevine Yellows (PGY), normalmente observados em outras plantas que não sejam videiras, também foram encontrados esporadicamente em videiras. A PGY surgiu como uma nova doença de amarelecimentos da videira (grapevine yellows) na década de 1990 na Alemanha. Nas vinhas, o vector pode inocular uma videira através de uma alimentação imprevisível neste hospedeiro atípico. Correspondendo a um baixo risco de infecção, a PGY encontra-se quase exclusivamente em vinhas bastante velhas e com uma baixa incidência (<1%), mas parece surgir onde quer que a videira cresça em estreita proximidade com amieiros (Maixner et al., 2000) . Até agora, a transmissão experimental de fitoplasmas de PGY por espécimes de S. titanus permanece sem êxito (M. Maixner e E. Boudon-Padieu, resultados não publicados). É importante olhar para a epidemiologia de doenças causadas por fitoplasmas pertencentes ao 16SrV. Embora o fitoplasma da FD seja fortemente epidémico, e seja reconhecido pela European and Mediterranean Plant Protection Organization (EPPO) como uma praga sujeita a quarentena (EPPO/CABI, 2003), outros fitoplasmas do mesmo subgrupo, como ο ΕΥ, o PGY e o ALY, não são epidémicos. Estes encontram-se esporadicamente em videiras, provavelmente porque os seus vectores se alimentam de videiras ocasionalmente e estes não sobrevivem o suficiente para adquirir o patógeno da videira. Os produtores de videira, portanto, são obrigados a eliminar as plantas infectadas por fitoplasmas de FD, mas por outro lado não é obrigatório ou necessário destruir as plantas infectadas por EY, ALY e por outros fitoplasmas ocasionalmente encontrados em videiras, até à data. Consequentemente, devido a tratamentos rigorosos que se seguem a uma infecção de FD (ou a uma suspeita de infecção de FD) como a erradicação das plantas, tratamentos com insecticidas, quarentena e outros, e devido ao facto de quando uma infecção de FD estiver realmente presente nenhum porta-enxerto poder ser mantido e não ser possível nenhuma propagação desta videira, enquanto, por exemplo, quando uma infecção de EY ou de ALY estiver presente não é preciso adoptar as mesmas medidas, é evidente que um teste de diagnóstico e/ou ferramenta que permita uma identificação inequívoca e específica da presença ou da ausência de FD numa infecção fitoplasmática seria muito útil e poderia evitar medidas drásticas e perdas desnecessárias de videiras valiosas.

DESCRIÇÃO A presente descrição fornece uma nova sequência de nucleótidos da SEQ ID NO 5 que codifica o gene rpll4 (gene da proteína ribossomal 114) de fitoplasmas pertencentes aos subgrupos 16SrV-C e 16SrV-D, em que o grupo (16SrV) inclui pelo menos os fitoplasmas patogénicos associados com outras doenças como a Alder yellow (ALY), Elm Yellow (EY), Elm witch's broom (ULW) e a FD, por vezes encontrados em videiras assintomáticas. (também denominados "Ca. phytoplasma vitis" embora a nomenclatura para os fitoplasmas ainda esteja em discussão no meio científico). 0 gene rpll4 codifica a proteína ribossómica L14 que se crê que ligue o 23S rRNA entre os centros para a peptidil transferase e a GTPase. Em detalhe, o centro da peptidil transferase (PTC) do ribossoma reside na subunidade ribossomal grande e catalisa as duas reacções químicas principais da síntese proteica: formação da ligação peptídica e libertação do peptídeo. A libertação do peptídeo deve depender mais da catálise química envolvendo provavelmente um grupo de rRNA do PTC (Polacek, N. e Mankin, A.S, 2005) . A nova sequência disponibilizada permite ο reconhecimento de diferentes fitoplasmas pertencentes aos referidos subgrupos e fornece uma nova ferramenta para uma identificação especifica dos subgrupos destes microorganisms. A sequência é apresentada como SEQ ID NO 5 e a proteína codificada pela sequência é apresentada na SEQ ID NO 6. A SEQ ID NO 5 é quase idêntica para a FD, a ALY, a EY e a ULW, contudo, alguns nucleótidos definidos como "n" na lista de sequências e os respectivos aminoácidos definidos como "Xaa" na lista de sequências permitem distinguir o fitoplasma causador de FD na videira dos outros três fitoplasmas conhecidos, pertencentes ao mesmo subgrupo da FD, nomeadamente o ALY, o EY e o ULW. A presente sequência fornece, portanto, uma ferramenta útil para a detecção específica da presença do fitoplasma relativo à FD numa amostra de videira. A sequência do gene rpll4 (381bp), específica para o fitoplasma relativo à FD, é representada na SEQ ID NO 1, e codifica para a proteína ribossomal rpL14, específica para o fitoplasma associado com a FD que difere em dois polimorfismos de nucleótido único (SNPs) dos outros fitoplasmas pertencentes ao grupo taxonómico 16SrV.

Esta sequência é viável como uma ferramenta de diagnóstico pois inclui dois SNPs específicos para a FD na posição 108 e na posição 171. Devido aos SNPs identificados pelos autores da presente invenção é agora possível, após a leitura da doutrina da presente descrição, elaborar um ensaio de diagnóstico que identifica especificamente o fitoplasma associado à FD.

Como referido anteriormente, o gene rpll4 é caracterizado por dois SNPs na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 1 que permite distinguir estirpes de fitoplasma associado à FD de outros fitoplasmas (não associados com a FD), tais como os fitoplasmas associados à EY e à ALY, ocasionalmente presentes em videiras. A presente descrição fornece, portanto, uma sequência de nucleótidos da SEQ ID NO 5 ou a sequência complementar à SEQ ID NO 5, uma sequência de nucleótidos da SEQ ID No. 1 ou a sequência complementar à SEQ ID NO 1 ou fragmentos da mesma, os referidos fragmentos incluindo um ou ambos os nucleótidos 108 e 171 da SEQ ID NO 1, ou os seus nucleótidos complementares, ou os referidos fragmentos que sejam adequados para a amplificação de um fragmento da SEQ ID NO 1, ou a sequência complementar à SEQ ID NO 1 que inclui um ou ambos os nucleótidos 108 e 171 da SEQ ID NO 1, ou dos seus nucleótidos complementares, onde a referida sequência ou fragmentos da mesma são específicos para estirpes de fitoplasma associadas com a doença das videiras Flavescência dourada, um vector de nucleótidos que inclui a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO 5 ou a sequência complementar à SEQ ID NO 5, a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO 1, ou a sequência complementar à SEQ ID NO 1, ou fragmentos da mesma, os referidos fragmentos incluem um ou ambos os nucleótidos 108 e 171 da SEQ ID NO 1, ou os seus nucleótidos complementares, um método para o diagnóstico da doença das videiras Flavescência dourada que inclui: a) identificação de um ou de ambos os nucleótidos na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 5, ou dos seus nucleótidos complementares na sequência complementar à SEQ ID NO 1, numa amostra de planta que inclui floema, na qual a presença de um resíduo C na posição 108 da SEQ ID NO 5, ou de um resíduo G na posição do seu nucleótido complementar na sequência complementar à SEQ ID NO 5, e/ou de um resíduo G na posição 171 da SEQ ID NO 1, ou de um resíduo C na posição do seu nucleótido complementar na sequência complementar à SEQ ID NO 1, indica a presença na amostra de pelo menos uma das estirpes de fitoplasma associadas com a doença das videiras Flavescência dourada, e um kit para o diagnóstico da doença das videiras Flavescência dourada, que inclui reagentes para a identificação no floema de uma planta de um ou de ambos os nucleótidos na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 5, e/ou dos seus nucleótidos complementares na sequência complementar à SEQ ID NO 5.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS A Figura 1 representa um alinhamento do gene rpll4 de três estirpes de FD e ALY, EY e ULW (sendo a última uma estirpe de fitoplasma associada à elm witch's broom identificado em ulmeiros. Esta pertence ao grupo taxonómico 16SrV-A, agora designado por "Ca. Phytoplasma ulmi"). O alinhamento demonstra claramente um SNP C/T na posição 108 e um SNP G/A na posição 171 cada um permitindo a identificação especifica de fitoplasmas associados com a FD. A Figura 2 mostra um exemplo de um gráfico de amplificação. O número do ciclo é apresentado ao longo do eixo X e no eixo Y são apresentadas as unidades unidades arbitrárias de fluorescência (na verdade estas são um incremento acima da fluorescência de base). É possível observar um sinal de amplificação apenas para as amostra de videira infectada pelo fitoplasma da FD assim como para o controlo positivo. Não foi detectada nenhuma amplificação no controlo negativo. Isto demonstra que o ensaio de RT PCR da FD foi específico para o fitoplasma da FD.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS SEQUÊNCIAS SEQ ID No. 1: gene rpll4 do fitoplasma associado à FD atgattcaagtaaatacccgtttaaaagtagctgataatagtggtgctaaagaagtt tta 60 gttattaatattcctggttcaagtaaaagacgttatgctcaaataggcgatgttgtt gta 120 gtcgctattaaaaaaagtattccatctggaatggtaaaatcaggagaaaagtctaaa get 180 ttaattttacgtactaaaaaaggcttagcaggaaaaaatggttcttatattaaattt gat 240 gataacgcagtagttattatcaaagatgatatgactttaaaagggacaaggattttt gga 300 cctgtagttaaaaatcaaaaactaaaagatagtaaattttctaaatttctttcttta get 360 gaaaaagtttttgtaatatga 381

Nucleótidos no. 108 e 171 sublinhados e em negrito correspondem ao SNP de interesse.

Sublinhado, do nucleótido 72 ao 97 o primer directo (forward) da SEQ ID NO 2 em baixo SEQ ID No 2: tcctggttcaagtaaaagacgttatg do nucleótido 102 ao 119 o primer aninhado (nested) da SEQ ID NO 3 em baixo SEQ ID No 3 aataggcgatgttgttg e do nucleótido 147 ao 171 a sequência complementar do primer reverso (reverse) da SEQ ID No 4 em baixo: SEQ ID No 4: cttttctcctgattttaccattcca

SEQ ID No 5: gene rpll4 dos fitoplasmas dos subgrupos 16SrV-C e 16SrV-D atg att caa nta aat ann cgt tta aaa gta get gat aat agt ggt get 48 aaa gaa gtt tta gtt att aat att cct ggt tea agt aaa aga cgt tat 9 6 get caa ata ggn gat gtt gtt gta gtc get att aaa aaa agt att cca 144 tet gga atg gtn aaa tea gga gaa aan tet aaa get tta att tta cgt 192 act aaa aaa ggc tta gca gga aaa aat ggt tet tat att aaa ttt gat 240 gat aan gca gta gtt att atn aaa gat gat atg act tta aaa ggg aca 288 agg att ttn gga cct gta gtt aaa aat caa aaa eta aaa gat agt aaa 336 ttt tet aaa ttt ett tet tta get gaa aaa gtt ttt gta ata tga 381 onde n na posição 10 é G ou A ,n na posição 17 é C ou G, n na posição 18 é C ou T,n na posição 108 é C ou T, n na posição 156 é A ou G, n na posição 171 é G ou A, n na posição 246 é C ou T, n na posição 261 é C ou T, n na

posição 297 é C ou T

SEQ ID No 6: proteína ribossomal L14 dos fitoplasmas dos subgrupos 16SrV-C e 16SrV-D

Met lie Gin Xaa Asn Xaa Arg Leu Lys Val Ala Asp Asn Ser Gly Ala

Lys Glu Val Leu Val lie Asn lie Pro Gly Ser Ser Lys Arg Arg Tyr

Ala Gin lie Gly Asp Val Val Val Val Ala lie Lys Lys Ser lie Pro

Ser Gly Met Val Lys Ser Gly Glu Xaa Ser Lys Ala Leu lie Leu Arg

Thr Lys Lys Gly Leu Ala Gly Lys Asn Gly Ser Tyr lie Lys Phe Asp

Asp Xaa Ala Val Val lie Xaa Lys Asp Asp Met Thr Leu Lys

Gly Thr

Arg lie Xaa Gly Pro Val Val Lys Asn Gin Lys Leu Lys Asp Ser Lys

Phe Ser Lys Phe Leu Ser Leu Ala Glu Lys Val Phe Val lie onde 'Xaa' na posição 4 significa lie, Val, ou Leu., 'Xaa' na posição 6 significa Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, lie, ou Met, 'Xaa' na posição 57 significa Lys, ou Asn, 'Xaa' na posição 82 significa Lys, ou Asn, 'Xaa' na posição 87 significa lie, ou Met, 'Xaa' na posição 99 significa Leu, ou Phe.

SEQ ID No 7: proteína ribossomal L14 da estirpe associada à FD

Met lie Gin Val Asn Thr Arg Leu Lys Val Ala Asp Asn Ser Gly Ala

Lys Glu Val Leu Val lie Asn lie Pro Gly Ser Ser Lys Arg Arg Tyr

Ala Gin lie Gly Asp Val Val Val Val Ala lie Lys Lys Ser lie Pro

Ser Gly Met Val Lys Ser Gly Glu Lys Ser Lys Ala Leu lie Leu Arg

Thr Lys Lys Gly Leu Ala Gly Lys Asn Gly Ser Tyr lie Lys Phe Asp

Asp Asn Ala Val Val lie lie Lys Asp Asp Met Thr Leu Lys Gly Thr

Arg lie Phe Gly Pro Val Val Lys Asn Gin Lys Leu Lys Asp Ser Lys DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Os elementos desta invenção são: 1. Um método para o diagnóstico da doença das videiras Flavescência dourada que inclui a seguinte etapa: a) identificação de um ou de ambos os nucleótidos na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 5, e/ou os seus nucleótidos complementares na sequência complementar à SEQ ID NO 5, numa amostra de planta que inclui o floema; onde a presença de um resíduo C na posição 108 da SEQ ID NO 5, e/ou de um resíduo G no seu nucleótido complementar na sequência complementar à SEQ ID NO 5 e/ou de um resíduo G na posição 171 da SEQ ID NO 5, e/ou de um resíduo C no seu nucleótido complementar, indica a presença na amostra de pelo menos uma das estirpes de fitoplasma associadas com a doença da videira

Flavescência dourada. 2. O método do ponto 1 onde a identificação da etapa a) inclui a primeira etapa na qual são realizados o PCR, PCR em tempo real, Ligação, Hibridação Alelo-específica, extensão do primer (iniciador molecular), clivagem invasiva ou reacção de sequenciação, e a segunda etapa na qual o produto obtido na primeira etapa é detectado através da monitorização da luz emitida pelos referidos produtos, ou através da medição da massa dos referidos produtos, ou monitorização da radioactividade emitida pelo referido produto, ou pela sequenciação do referido produto. 3. O método de qualquer um dos pontos 1 ou 2 onde a referida monitorização da emissão de luz é realizada pela monitorização da fluorescência, da luminescência, do tempo de vida da fluorescência, da transferência de energia de ressonância por fluorescência, ou polarização de fluorescência, a referida medição da massa é realizada por espectrometria de massa ou análise heteroduplex, e a referida monitorização da radioactividade é realizada com ferramentas sensíveis à radioactividade. 4. O método de qualquer um dos pontos 1-3 onde o referido método é realizado na fase de fomato sólido como microarranjo ou microplaca. 5. 0 método de qualquer um dos pontos 1-3 onde a referida identificação é realizada com um RT PCR utilizando um primer directo da SEQ ID NO 2, uma sonda alelo-específica da SEQ ID NO 3 e um primer reverso da SEQ ID NO 4. 6. Um kit para o diagnóstico da doença da videira Flavescência dourada que inclui reagentes para a identificação num floema de uma videira dos nucleótidos na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 5 ou 1, e/ou dos seus nucleótidos complementares na sequência complementar à SEQ ID NO 5 ou 1. 7. O kit de acordo com a reivindicação 6 que inclui também suportes sólidos onde os oligonucleótidos para a identificação de um ou de ambos os nucleótidos na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 5 ou 1, e/ou um ou ambos dos seus nucleótidos complementares na sequência complementar à SEQ ID NO 5 ou 1 estão ancorados em posições conhecidas no referido suporte numa ou mais cópias por posição. 8. O kit do ponto 7 que inclui também sondas e/ou oligonucleótidos marcados correspondentes e/ou complementares a uma região a montante e/ou a jusante de um ou de ambos os nucleótidos na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 5 ou 1, e/ou sobrepostos a uma região que inclui um ou ambos os nucleótidos na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 5 ou 1. 9. O kit do ponto 8 onde uma ou mais das referidas sondas e/ou oligonucleótidos são marcados. 10. A sequência de nucleótidos da SEQ ID NO 1, esta sequência codifica para o gene rpll4 (381bp) específico para o fitoplasma relacionado com a FD. A presente descrição fornece uma sequência de nucleótidos da SEQ ID NO 5 ou a sequência complementar à SEQ ID NO 5 que codifica o gene rpll4 dos fitoplasmas pertencentes aos subgrupos 16SrV-C e 16SrV-D. A descrição também fornece a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO 5 ou a sequência complementar à SEQ ID NO 5 ou fragmentos da mesma, estes fragmentos incluem um ou ambos os nucleótidos 108 e 171 da SEQ ID NO 5 ou os seus nucleótidos complementares, ou os referidos fragmentos sendo adequados para a amplificação de um fragmento da SEQ ID NO 5 ou a sequência complementar à SEQ ID NO 5 que inclui um ou ambos os nucleótidos 108 e 171 da SEQ ID NO 5 ou dos seus nucleótidos complementares. A presença de um C na posição 108 da SEQ ID NO 5 (ou de um G na posição correspondente na fita complementar) e/ou de um G na posição 171 da SEQ ID NO 5 (ou de um C na posição correspondente na fita complementar) na SEQ ID NO 5 é especifica para o fitoplasma associado com a doença da videira FD. A presente descrição também fornece uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO 6 que codifica para a proteína ribossomal L14 de fitoplasmas pertencentes aos subgrupos 16SrV-C e 16SrV-D, e uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO 7 que codifica para a proteína ribossomal L14 do fitoplasma associado à FD. A presente descrição fornece a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO 1 ou a sequência complementar à SEQ ID NO 1 ou fragmentos da mesma, estes fragmentos incluem um ou ambos os nucleótidos 108 e 171 da SEQ ID NO 1 ou dos seus nucleótidos complementares, ou os referidos fragmentos sendo adequados para a amplificação de um fragmento da SEQ ID NO 1 ou ou a sequência complementar à SEQ ID NO 1 que inclui um ou ambos os nucleótidos 108 e 171 da SEQ ID NO 1 ou dos seus nucleótidos complementares, onde a referida sequência ou fragmentos da mesma são específicos para as estirpes de fitoplasma associadas com a doença da videira FD . A sequência, permitindo detectar especificamente as estirpes de fitoplasma associadas com a doença da videira FD pode portanto ser a SEQ ID NO 1 ou a sua sequência complementar, e os fragmentos podem ser fragmentos da SEQ ID NO 1 ou fragmentos da sequência complementar à mesma, desde que incluam um ou ambos os nucleótidos 108 da SEQ ID NO 1 (um nucleótido C ou o seu complementar G no caso de um fragmento da sequência complementar) e 171 (um nucleótido G ou o seu complementar C no caso de um fragmento da sequência complementar) ou que estes possam ser utilizados para amplificar um fragmento da SEQ ID NO 1 que inclui um ou ambos dos referidos nucleótidos, como referido anteriormente nucleótidos específicos representam SNPs que tornam a SEQ ID NO 1 especifica para as estirpes de fitoplasma associadas com a doença da videira Flavescência dourada e permitem, cada um individualmente ou em conjunto com o outro, a distinção do referido fitoplasma de outros fitoplasmas muito semelhantes, pertencentes ao mesmo grupo taxonómico, e que não estão associados à FD.

Os fragmentos devem ser fragmentos de dimensão adequada para serem utilizados na detecção das estirpes de fitoplasma associadas com a doença da videira FD com qualquer técnica comum conhecida para a detecção de SNPs. Normalmente, um especialista qualificado nesta área saberia que pode ser de aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200 nucleótidos, até à sequência completa no caso de uma sequenciação completa do gene para identificação do fitoplasma relativo à FD.

Os fragmentos da presente descrição podem ser utilizados como sondas para PCR, como sondas para a detecção de SNPs com microarranjos, ou podem ser os produtos das técnicas utilizadas para a identificação de SNPs. Consequentemente, de acordo com a técnica utilizada num método para identificação de um ou de ambos os nucleótidos 108 e 171 da SEQ ID NO 5, os fragmentos podem ser fragmentos a montante e/ou a jusante relativamente ao nucleótido 108 e/ou ao nucleótido 171 da SEQ ID NO 5, ou podem ser fragmentos que incluem um dos anteriormente referidos nucleótidos ou ambos. Um especialista qualificado nesta área está bem consciente que numa detecção de um SNP, a identificação do(s) nucleótido (s) de interesse pode ser realizada em qualquer uma das fitas da sequência de nucleótidos, portanto, os fragmentos da invenção podem ser concebidos para identificar um ou ambos os nucleótidos 108 e 171 da SEQ ID NO 5 ou 1, e/ou para identificar um ou ambos os nucleótidos complementares aos nucleótidos 108 e 171 da sequência de nucleótidos complementar à SEQ ID NO 5 ou 1 que é implicitamente apresentada na disponibilizada SEQ ID NO 5 ou 1. A seguinte descrição irá clarificar em maior detalhe os fragmentos da invenção, sendo todos eles caracterizados pelo facto de poderem ser utilizados para a identificação dos anteriormente referidos SNPs. A SEQ ID NO 5 é especifica para o grupo de fitoplasmas que inclui os fitoplasmas causadores de FD, ALY, EY e ULW Por outro lado, a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO 1 ou os fragmentos da mesma aqui apresentados são específicos para ambas as estirpes do fitoplasma associadas com a FD, i.e. estirpes associadas à FD pertencentes ao grupo taxonómico 16SrVD e estirpes causadoras de FD pertencentes ao grupo taxonómico 16SrVC. Consequentemente, a SEQ ID NO 1 representa uma das possíveis incorporações da SEQ ID NO 5, em particular a incorporação onde o nucleótido 108 é C e nucleótido 171 é G.

Como indicado anteriormente na presente especificação, a sequência ou os fragmentos da mesma aqui descritos são aplicáveis como ferramentas de diagnóstico para a identificação, numa amostra de videira, do fitoplasma associado com a doença da videira Flavescência dourada. A descrição também fornece vectores como vectores de clonagem ou vectores de expressão incluindo uma sequência de nucleótidos da SEQ ID NO 5 ou da SEQ ID NO 1 ou fragmentos da mesma, os referidos fragmentos incluem um ou ambos os nucleótidos 108 e 171 da SEQ ID NO 5 ou 1. O vector pode ser utilizado como um controlo positivo ou como um controlo negativo num método de diagnóstico para a detecção do fitoplasma associado à FD numa amostra de floema de videira, dependendo dos nucleótidos na posição 108 e 171 (o C e o G fornecerão um controlo positivo enquanto outros nucleótidos fornecerão um controlo negativo) ou pode ser também utilizado como uma ferramenta de investigação para o desenvolvimento de anticorpos e/ou para o estudo de possíveis terapias para o tratamento da doença da planta.

Um elemento da invenção é um método para o diagnóstico da doença da videira Flavescência dourada que inclui a etapa a) identificação de um ou de ambos os nucleótidos na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 5, e/ou de um ou de ambos dos seus nucleótidos complementares na sequência complementar à SEQ ID NO 5, numa amostra de videira que inclui o floema, na qual a presença de um resíduo C na posição 108 da SEQ ID NO 5 e/ou de um resíduo G no seu nucleótido complementar na sequência complementar à SEQ ID NO 5 e/ou de um resíduo G na posição 171 da SEQ ID NO 5 e/ou de um resíduo C no seu nucleótido complementar na sequência complementar à SEQ ID NO 5, indica a presença na amostra de pelo menos uma das estirpes de fitoplasma associadas com a doença da videira Flavescência dourada.

De acordo com a presente descrição, a frase "...no seu nucleótido complementar na sequência complementar à SEQ ID NO.." também pode ser definida como "o seu complemento" o que significa a posição complementar relativamente à posição de um nucleótido na sequência de referência, na sequência complementar à sequência de referência, portanto, na frase "...no seu nucleótido complementar na sequência complementar à SEQ ID NO..." ou "nucleótido N na posição correspondente na sequência complementar à SEQ ID NO..", onde N pode ser qualquer nucleótido, ou uma frase com um significado semelhante com ligeiras variações, pode ser substituída com "o seu ou o complementar". A amostra, de acordo com a presente descrição, pode ser qualquer amostra que possa ser obtida de uma videira, desde que que a amostra inclua o floema da planta por a presença dos fitoplasmas ser limitada pelo fluido desta planta.

Um especialista qualificado nesta área saberá como obter esta amostra; quando a amostra é recolhida de uma planta é possível obter o fluido directamente das nervuras da folha. As amostras de floema também estão disponíveis em rebentos de videira ou nos frutos ou nas sementes ou nos porta-enxertos. Os protocolos para a recolha de amostras com floema estão disponíveis para um especialista qualificado nesta área sem necessidade de adicionar detalhes na presente descrição (Pasquini, et. ai, 2001) .

No método da invenção, o floema que pode ser obtido da amostra com métodos padrão pode ser utilizado como tal, ou uma extracção dos ácidos nucleicos totais (TNA) pode ser realizada com métodos padrão (como por exemplo com o método descrito por Angelini, et al. 2001 Flavescence dorée in France and Italy: occurrence of closely related phytoplasma isolates and their near relationships to Palatinate grapevine yellows and an alder yellows phytoplasma. Vitis 40:79-86. (página 80 coluna 2), ou por Seruga Music et al. 2008, página 121. A identificação de um ou de ambos os nucleótidos na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 5 (e/ou de um ou mais dos seus nucleótidos complementares na sequência complementar à SEQ ID NO 5) pode ser realizada com qualquer técnica conhecida que seja adequada para a detecção de um SNP conhecido, da presença do nucleótido C na posição 108 da SEQ ID NO 5 e/ou do nucleótido G na posição correspondente na sequência complementar à SEQ ID NO 5 e /ou do nucleótido G na posição 171 da SEQ ID NO 5 e/ou do nucleótido C na posição correspondente na sequência complementar à SEQ ID NO 5, e indica a presença na amostra do fitoplasma associado com a doença da videira FD.

Como exemplo, a identificação da etapa a) pode incluir a primeira etapa da amplificação por PCR de um ou de mais fragmentos, que incluem um ou ambos os SNPs de interesse e a análise subsequente do(s) fragmento(s) amplificado (s) ou através da determinação da massa do(s) fragmento (s) amplificado(s) e portanto definindo o par de bases presente na posição de interesse ou através de uma simples sequenciação do(s) fragmento (s) ou utilizando o(s) fragmento (s) amplificado (s) para outras técnicas de detecções, como algumas das técnicas exemplificadas a seguir.

Se ambos os SNPs são amplificados, cada um num fragmento diferente, pode ser seleccionado um tamanho do amplicão diferente para os dois fragmentos, de forma a facilitar a detecção.

Numa incorporação da invenção, a etapa de identificação a) pode incluir a primeira etapa na qual são realizados o PCR em tempo real (RT-PCR) , Ligação, Hibridação Alelo- específica, extensão do primer (iniciador molecular), clivagem invasiva ou reacção de sequenciação, e a segunda etapa na qual o produto obtido na primeira etapa é detectado através da monitorização da luz emitida pelos referidos produtos, ou através da medição da massa dos referidos produtos, ou monitorização da radioactividade emitida pelo referido produto, ou pela sequenciação do referido produto.

Será imediatamente compreendido por um especialista qualificado nesta área que qualquer outro protocolo e técnica conhecida, adequados para a identificação de um SNP numa sequência de nucleótidos, pode ser aplicado ao método aqui descrito. Várias técnicas conhecidas para a identificação de SNPs e adequadas para a realização do método de diagnóstico aqui descrito são resumidas em Kwok 2001.

Conhecem-se numerosas técnicas para a identificação de um determinado SNP num ácido nucleico, algumas das quais são aplicáveis a tecnologias de suporte sólido como as microplacas ou microarranjos ou chips e são, portanto, adequadas para a análise de um elevado número de amostras. Quando a análise tem que ser realizada numa vinha ou num viveiro de videiras, os métodos para a detecção do SNP de interesse que são facilmente aplicáveis a uma grande quantidade de amostras são convenientes.

Quando é utilizado o RT PCR, é possível aplicar um protocolo clássico de RT PCR disponível em manuais de RT PCR e em protocolos laboratoriais. Os métodos utilizados para a verificação da identidade dos amplicões, produzidos em PCR em tempo real, são suficientemente poderosos para detectar pequenas variações entre sequências. As variações na sequência, incluindo polimorfismos de nucleótido único (SNPs) foram identificadas com êxito em ensaios de RT PCR. Uma abordagem comum para a detecção de variações nas sequências é comparar as curvas de fusão. Em geral, o efeito da substituição de bases na cinética de fusão dos produtos do PCR é demasiado pequeno para ser detectado fidedignamente; no entanto, os heteroduplexes de amplicões relativamente longos, que diferem num SNP, podem ser distinguidos dos homoduplexes com base nas suas curvas de fusão.

As curvas de fusão de sondas de fluorescência breve podem ser utilizadas para distinguir amplicões. Este método é sensível aos SNPs, que causam normalmente uma alteração de vários graus no pico de fusão. 0 desenho de primers adequados para o RT-PCR é facilmente viável com programas aptos, disponíveis para pessoas qualificadas nesta área (um par possível de primers é apresentado na SEQ ID NO 2 e 4) e o acesso à SEQ ID NO 1 e à SEQ ID No 5 e ao SNP de interesse na posição 108 do mesmo, é suficiente para um especialista qualificado nesta área elaborar imediatamente o ensaio de RT PCR sem o uso de competências inovadoras ou de experimentações complexas. O mesmo se aplica à detecção do SNP de interesse na posição 171 ou de ambos os SNPs. Um especialista qualificado nesta área poderá desenhar facilmente primers e oligonucleótidos para a amplificação e detecção do SNP na posição 171 ou para a amplificação e detecção de um fragmento que inclua ambos os SNPs. O PCR em tempo real pode envolver o uso de sondas de ácidos nucleicos ou primers marcados com fluorescência, ou corantes fluorescentes que se ligam ao DNA como o SYBR® Green e outros referidos na presente descrição, para detectar e quantificar um produto de PCR em cada ciclo durante a amplificação. Se desejado, podem ser utilizados diferentes corantes fluorescentes para diferentes SNPs.

Portanto, de acordo com a presente descrição, o(s) produto(s) amplificado(s) ou as sondas podem ser marcados com um fluoróforo, seguindo as instruções do fabricante quando a curva de fusão de sondas de fluorescência breve for analisada.

Muitas abordagens de RT PCR utilizam dois repórteres fluorescentes diferentes e dependem da transferência de energia de um repórter (o doador de energia) para um segundo repórter (o receptor de energia) quando os repórteres estão muito próximos. 0 segundo repórter pode ser um supressor ou um flúor. Um supressor irá absorver a energia do primeiro repórter e emitir essa energia como calor, em vez de luz, o que resulta numa diminuição do sinal de fluorescência. 0 flúor absorve a energia e emite-a com outro comprimento de onda através de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET), o que resulta numa diminuição da fluorescência do doador de energia e aumento da fluorescência do receptor de energia. A mudança da fluorescência é proporcional à acumulação de produtos do PCR.

Uma alternatica comum à abordagem da curva de fusão é a utilização de sondas de hidrólise (como a TaqMan).

As sondas de hidrólise são marcadas com um corante fluorescente na extremidade 5' e com um supressor na extremidade 3', e devido ao facto de os dois repórteres estarem muito próximos, o sinal de fluorescência desaparece. Durante a etapa de recozimento (annealing), a sonda hibridiza com o produto do PCR sintetizado nos ciclos de amplificação anteriores. A sonda resultante: o híbrido alvo é um substrato para a actividade de exonuclease 5'->3' da Taq DNA polimerase, que degrada a sonda recozida (3) e liberta o flúor. 0 flúor é libertado dos efeitos do supressor, e a fluorescência aumenta. Numa incorporação a identificação do SNP de interesse pode ser realizada por um RT PCR, utilizando um par de primers adequado e uma sonda de oligonucleótidos alelo-especifica adequada (TaqMan ® sonda), p.ex. uma sonda MGB (Minor Groove Binding). A sonda alelo-especifica "TaqMan" pode ser concebida com base na informação do SNP descrita anteriormente. A extremidade 5' da sonda TaqMan é marcada com um corante fluorescente reporter R (p.ex. FAM ou VIC), e ao mesmo tempo, a extremidade 3' da mesma é marcada com um supressor Q (substância supressora). Portanto, sob estas condições, a fluorescência não é detectável uma vez que o supressor absorve a energia da fluorescência. Uma vez que a extremidade 3' da sonda TaqMan é fosforilada, não ocorre nenhuma reacção de extensão da sonda TaqMan durante a reacção do PCR.

Numa incorporação da invenção, as sondas TaqMan® MGB podem ser marcadas com 6-carboxifluoresceina (FAM) na extremidade 5' e com um supressor não fluorescente (NFQ) com um minor groove binder (MGB) na extremidade 3'.

Na presente invenção as sondas MGB apresentaram uma temperatura de fusão (Tm) superior e uma especificidade mais elevada e onde as sondas MGB têm uma sequência mais especifica do que as sondas padrão de DNA, especialmente para discrepâncias de uma única base a temperaturas de hibridação elevadas.

Todas as reacções de RT PCR podem ser realizadas num Sistema de Detecção de Sequências ABI PRISM® 7300 (Applied Biosystems) em placas ópticas de 96 poços com coberturas ópticas adesivas (ambos Applied Biosystems) utilizando as seguintes condições: 10 min a 95°C, seguidos por 40 ciclos de 15 s a 95°C e 1 min a 61,5°C, o que permitiu a execução de todas as reacções na mesma placa. O RT PCR pode ser realizado num volume final de reacção de 25 pL contendo 5 pL da amostra de DNA, 300 nm de primers, 250 nm de sonda e 1* TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), que inclui ROX como um corante de referência passivo.

As sondas e primers adequados podem ser concebidos com vários algoritmos e programas disponíveis, também na web, ou o desenho dos mesmos pode ser encomendado em serviços comerciais disponíveis. De forma não restritiva as sondas adequadas podem ser um primer directo com um comprimento de 26 nucleótidos, começando na posição 72 de 5' para 3' da SEQ ID NO 5, aqui descrita como SEQ ID NO 2, uma sonda TaqMan ® com um comprimento de 17 nucleótidos começando na posição 102 de 5' para 3' da SEQ ID NO 1, aqui descrita como SEQ ID NO 3 marcada p.ex. com 6-FAM na extremidade 5', e um primer reverso com 25 nucleótidos de comprimento começando na posição 147 de 5' para 3' da SEQ ID NO 1, aqui descrita como SEQ ID NO 4. Quando a sonda TaqMan ® é utilizada, o SNP (C/T) de interesse é localizado no centro da referida sonda.

Quando as SEQ ID NOs 2-4 são utilizadas neste ensaio, a temperatura adequada de recozimento é de aproximadamente 61-61,5 °C. Os ensaios com a utilização de TaqMan ® são bem conhecidos e, em principio, estão disponíveis para um especialista qualificado nesta área protocolos completos. O ensaio de discriminação alélica da 5'-nuclease, ou ensaio TaqMan, é um ensaio com baseado em PCR para a genotipagem de SNPs. A região paralela ao SNP é amplificada na presença de duas sondas alelo-específicas fluorescentes. As sondas não apresentam fluorescência em solução devido a um supressor na extremidade 3'. A presença de duas sondas permite a detecção de ambos os alelos num único tubo. Além disso, devido ao facto de as sondas estarem incluídas no PCR, os genótipos são determinados sem qualquer processamento pós PCR.

As técnicas adequadas para a execução do método aqui descrito incluem também a Hibridação Alelo-especifica também conhecida como ASO (hibridação de oligonucleótidos alelo-especifica). Este protocolo baseia-se na distinção, através de hibridação, de duas moléculas de DNA que diferem numa base (i. e. o SNP de interesse) . Os TNA obtidos pela amostra de floema são amplificados com os adequados primers de PCR concebidos para amplificar a região da SEQ ID NO 5 que inclui um ou ambos os nucleótidos 108 e 171, numa incorporação conveniente, os amplicões PCR são marcados com fluorescência. Os fragmentos obtidos por PCR são aplicados aos fragmentos oligonucleotidicos imobilizados da SEQ ID No 1 que inclui o SNP ou os SNPs de interesse. Após as condições adequadas de hibridação e lavagem, a intensidade da fluorescência é medida para cada oligonucleótido de SNP. Devido ao facto de um SNP ser analisado, as condições de hibridação e de lavagem devem ser rigorosas, ou seja, condições que apenas permitam a permanência de sequências 100% combinadas na forma de fita dupla. Os meios típicos para regular o rigor de um protocolo de hibridação são a concentração salina (quanto maior for a concentração mais baixo será o rigor) e/ou a concentração de formamida (quanto maior for a %, maior será o rigor) e/ou temperatura (quanto mais elevada a temperatura, maior será o rigor). Condições rigorosas adequadas para a identificação de SNPs com RT-PCR são conhecidas e existem protocolos padrão publicados para esta reacção.

Este tipo de identificação pode ser realizado também numa fase sólida, i.e. em suporte sólido (definidos a seguir) como microplaca, chip de microarranjo e semelhantes, permitindo a análise de um grande número de amostras.

Numa incorporação particular, serão utilizados microarranjos. A lâmina de microarranjo é uma ferramenta de diagnóstico muito poderosa, capaz de identificar, numa única experiência, a presença/ausência de um elevado número de alvos. Os Os chips beneficiam de uma propriedade importante do DNA, que é a combinação das bases complementares na sua estrutura (o T combina-se com o A e o G com o C). A técnica de diagnóstico consiste num sinal luminoso (emitido por um fluoróforo a diferentes comprimentos de onda) que corresponde à hibridação entre o fragmento alvo marcado com o fluoróforo e a sonda correspondente vinculada à lâmina de microarranjo. Esta ligação, com consequente emissão de luz, mostra que no grupo das sondas analisadas está presente um fragmento de DNA complementar à sonda "iluminada" e, consequentemente, permite saber a identidade do fragmento alvo. Existem várias técnicas bem conhecidas para a marcação de ácido nucleico analisado (directo, indirecto) através da criação de ligação com os fluoróforos que emitem luz a diferentes comprimentos de onda (normalmente no vermelho e no verde) . A sonda na lâmina de microarranjo não está ligada ao fluoróforo, portanto a lâmina de microarranjo que não está hibridada, quando observada num microscópio confocal não mostra qualquer sinal luminoso.

Antes da hibridação no microarranjo, é realizada uma amplificação do DNA alvo com PCR, para aumentar a quantidade de DNA alvo, o que irá facilitar a detecção do sinal, e para marcar o DNA alvo para a detecção no microarranjo. A marcação pode ser realizada com qualquer molécula de marcação normalmente utilizada em detecção de microarranjos.

Embora no arranjo, apenas possa ser detectada uma cópia no chip, é preferível colocar várias cópias da sonda em cada ponto, que inclui um fragmento da SEQ ID NO 5, na qual está presente um C na posição correspondente à posição 108 SEQ ID NO 1 (e/ou está presente um G na posição correspondente à posição 108 da SEQ ID NO 5 na sequência complementar à SEQ ID NO 5) e/ou na qual está presente um G na posição correspondente à posição 171 da SEQ ID NO 5 (e/ou está presente um C na posição correspondente à posição 171 SEQ ID NO 5 na sequência complementar à SEQ ID NO 5) (i.e. os fragmentos correspondentes da SEQ ID NO 1), para aumentar o sinal no microarranjo quando o fitoplasma associado à FD estiver presente na amostra analisada e for amplificado. A reacção de amplificação PCR normalmente requer a utilização de pares específicos de primers para a amplificação de diferentes regiões da sequência de interesse. É evidente que a região amplificada terá que incluir 0 nucleótido que corresponde a um ou a ambos os nucleótidos 108 e 171 da SEQ ID NO 5 (ou um ou ambos os nucleótidos complementares ao nucleótido 108 e 171 da SEQ ID NO 5 na sequência complementar à SEQ ID NO 5) i.e. as posições que diferenciam os SNPs, nos amplicões.

Na presente descrição, os fragmentos que incluem o nucleótido correspondente ao nucleótido 107 da SEQ ID NO 1 (ou o nucleótido complementar ao nucleótido 107 da SEQ ID NO 1 na sequência complementar à SEQ ID NO 1) são fragmentos nos quais os nucleótidos a montante e a jusante do referido nucleótido, estão perfeitamente combinados com os nucleótidos a montante e a jusante do referido nucleótido na SEQ ID NO 1 ou na sua sequência complementar quando o nucleótido complementar ao nucleótido 107 é considerado.

Por uma combinação perfeita entende-se um alinhamento de 100% entre a SEQ ID NO 5 ou a SEQ ID NO 1 (ou as suas sequências complementares) e o fragmento de acordo com a presente descrição. 0 desenho dos primers para a amplificação pode ser realizado com qualquer programa adequado disponível (exemplos não limitantes: o Primer Premier, que pode ser utilizado para o desenho de primers para moldes individuais, alinhamentos, desenho de primers degenerados, análise de enzimas de restrição, análise de sequências consenso (contigs) e desenho de primers de sequenciação; o AllelelD e o Beacon Designer podem desenhar primers e sondas de oligonucleótidos para ensaios complexos de detecção como os ensaios multiplex, desenhar primers entre espécies, desenhar primers específicos para espécies e desenhar primers para reduzir o custo da experimentação; o PrimerPlex é um software que pode desenhar primers ASPE (Extensão de Primers Alelo-específicos) e captar sondas multiplex para genotipagem de SNPs utilizando sistemas de arranjo de suspensão, como o Luminex xMAP® e BioRad Bioplex, Primer Express) ou serviços comercialmente disponíveis para o desenho de oligos.

Começando na SEQ ID NO 1 ou 5, aqui descritas, e sabendo que o fragmento a ser hibridado no microarranjo deve incluir um ou ambos os nucleótidos 108 e 171 da SEQ ID NO 1 ou 5, um especialista qualificado nesta área saberá como fornecer primers adequados para a amplificação. Uma fita de nucleótidos complementar à sequência amplificada será identificada no microarranjo para a hibridação seguinte. No microarranjo, os fragmentos de controlo podem ser identificados para verificar a eficiência do método utilizado.

Em todos os métodos para realizar a identificação dos SNPs, quando a SEQ ID NO 5 é referida é evidente que os mesmos métodos se aplicam automaticamente às incorporações da SEQ ID NO 1, uma vez que a SEQ ID NO 1 está incluída na SEQ ID NO 5. Um especialista qualificado nesta área pode portanto ler a SEQ ID NO 5 em vez da SEQ ID NO 1 para todas as incorporações desta especificação relativamente à identificação do fitoplasma associado à FD.

Os primers adequados para a amplificação do fragmento que inclui o SNP na posição 108, que será hibridado no arranjo são também os primers que têm a SEQ ID NO 2 e a SEQ ID NO 4, aqui referidos como primers exemplificativos. O desenho de primers para a amplificação de um fragmento que inclui o SNP na posição 171 é facilmente viável, para um especialista qualificado nesta área, começando na SEQ ID NO 5 ou 1, assim como o desenho de primers para a amplificação de um fragmento que inclui ambos os SNPs de interesse.

As condições de hibridação para a técnica de hibridação alelo-específica estão disponíveis e um exemplo de condições adequadas pode ser 16 horas de hibridação a 48°C (25% de formamida).

Como exemplo, a hibridação por microarranjo pode ser realizada seguindo um protocolo padrão como o apresentado a seguir, onde algumas etapas podem ser omitidas, modificadas ou adicionadas por um especialista qualificado nesta área:

Hibridação por microarranjo e condições de lavagem:

Pré-hibridação: 1. Tampão de pré-hibridação: 5x SSC, 0.1% SDS e 1% BSA. Aquecer até aproximadamente 50°C, sob agitação; 2. As lâminas a analisar são colocadas numa tina para coloração; o tampão de pré-hibridação é adicionado, e a incubação é realizada a aproximadamente 48°C durante 45-60 min, sob agitação; 3. As lâminas são lavadas com água desionizada, através de aproximadamente 10 imersões, em duas tinas diferentes. O excesso de água é removido agitando o suporte da lâmina para cima e baixo duas vezes; 4. As lâminas são posteriormente imersas em isopropanol, aproximadamente 10 vezes, num movimento para cima e para baixo, à temperatura ambiente e secas por rotação. As lâminas são utilizadas imediatamente após a pré-hibridação (menos de 1 hora) uma vez que a eficiência da hibridação diminui rapidamente se as lâminas estiverem a secar durante um período superior ao referido.

Hibridação: 5. 2X tampão de hibridação: 50% formamida, 10X SSC e 0.2% SDS. Incubar a solução até esta atingir os 48°C; 6.

As misturas de marcadores são ressuspendidas em 9 μΐ de água, e aquecidas a 95°C durante 3 min para desnaturar, e são centrifugadas à velocidade angular máxima durante 1 min.; 7. Os seguintes elementos são adicionados em cada tubo para bloquear a hibridação não específica. Realizar uma mistura master (master-mix) , para cada tubo, com os seguintes ingredientes: • DNA de timo de vitela (lpg/pL) 8μ1 • poly(A)-DNA (lOmg/mL) 2μ1 • tRNA de levedura (4mg/mL) 2μ1 8. Depois, aproximadamente 21 μΐ 2X de tampão de hibridação pré-aquecido a 48°C é adicionado à mistura alvo, bem misturado, e centrifugado. As amostras são mantidas a 48°C até serem colocadas na lâmina; 9. O alvo marcado é aplicado a uma lâmina de microarranjo pré-hibridada e coberta com uma lamela de vidro de 22 x 60 mm; 10. A lâmina é colocada numa câmara de hibridação hermeticamente fechada (Corning. Acton, MA), e são adicionados 12 μΐ de água nos pequenos reservatórios existentes em cada extremidade da câmara; 11. A câmara hermeticamente fechada é colocada num banho de água a 48°C e incubada durante 40-60hr (2).

Lavagens pós-hibridação: 12. 0 arranjo é removido da câmara de hibridação com cuidado para não agitar a lamela; 13. A lâmina é colocada num suporte para uma placa de coloração que contém IX SSC, 0.1% SDS, e 0.1 mM DTT a aproximadamente 48°C; 14. A lamela é gentilmente removida enquanto a lâmina está na solução e é agitada durante 15 min.; 15. As lâminas são transferidas para um placa de coloração que contém 0. IX SSC, 0.1% SDS, e 0.1 mM DTT a aproximadamente 48°C e agitadas durante 5 min.; 16. Repetir a etapa 15 mais duas vezes; 17. As lâminas são transferidas para uma placa de coloração que contém 0.IX SSC e 0.1 mM DTT à temperatura ambiente e agitadas durante 5 min.;18. Repetir a etapa 17 durante um tempo adicional; 19. As lâminas são secas por rotação.

As condições exemplificadas anteriormente são um protocolo padrão no qual se baseará um especialista qualificado nesta área, que será capaz de aplicar todas as modificações apropriadas para a realização do método da invenção, sem ser necessário o uso de competências inovadoras. A marcação adequada para os exemplos anteriores, e para todos os exemplos seguintes onde é utilizada a fluorescência para a detecção, pode ser realizada com, por exemplo, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Fluoresceina, 6-Fam, Hex, Tet, Tamra, Joe, Rox, IRDyeTM700, IRDyeTM800, corantes Dyomics , corantes Atto Dyes ou qualquer outro corante comercial adequado, seguindo as instruções do fabricante.

Outra técnica possível para a execução do método da invenção é através da abordagem da extensão de base única (SBE - Single base extension) .

De acordo com esta técnica a região alvo é amplificada por PCR seguida por uma reacção de sequenciação de base única, utilizando um primer que volta a recozer uma base dentro da região polimórfica. Têm sido descritos vários métodos de detecção. Um pode marcar o primer e aplicar os produtos da extensão numa electroforese em gel. Ou o produto da extensão de base única pode ser repartido em fragmentos mais pequenos e medido por espectrometria de massa. 0 método de detecção mais popular envolve dideoxinucleotideos terminadores, marcados com fluorescência, que param a extensão da cadeia. A extensão do primer é um mecanismo de discriminação alélica muito robusto. É muito flexível e requer o número mais baixo de primers/sondas. 0 desenho da sonda e optimização do ensaio são normalmente muito simples. Relativamente ao método descrito anteriormente, um especialista qualificado nesta área, começando da sequência e dos SNPs aqui apresentados pode facilmente e imediatamente desenhar sondas adequadas utilizando apenas um software normalmente disponível para o desenho de sondas. Considerando o tamanho reduzido da SEQ ID NO 5 e 1 e um ou no máximo dois SNPs por identificar, o desenho das sondas adequadas não será particularmente difícil ou laborioso e não será necessário o uso de competências inovadoras para tal, sendo suficiente uma simples aplicação de procedimentos padrão ou até a utilização de serviços comercialmente disponíveis para o desenho de sondas. Existem numerosas variações da abordagem da extensão do primer que se baseia na capacidade da DNA polimerase incorporar desoxirribonucleosídeos específicos complementares à sequência do molde de DNA. No entanto, podem ser agrupadas em duas categorias: a primeira é uma abordagem de sequenciação (incorporação alelo- especifica de nucleótidos) na qual é determinada a identidade da base polimórfica no DNA alvo; a segunda é uma abordagem de PCR alelo-específico onde a DNA polimerase é utilizada para amplify o DNA alvo apenas se os primers do PCR forem perfeitamente complementares à sequência do DNA alvo.

Na abordagem de sequenciação, é possível determinar a sequência do DNA alvo amplificado directamente por espectrometria de massa ou executar reacções de extensão do primer com o DNA alvo amplificado como um molde e analisar os produtos para determinar a identidade da(s) base(s) incorporada(s) no sítio polimórfico (incorporação alelo-específica de nucleótidos). Têm sido desenvolvidas várias opções para a análise do produto da extensão do primer em ensaios homogéneos.

Na abordagem de PCR alelo-específico depende-se da DNA polimerase para a extensão do primer apenas quando a sua extremidade 3' for perfeitamente complementar ao molde. Quando esta condição for satisfeita é produzido um produto do PCR. Ao determinar se o produto do PCR é produzido ou não, pode-se inferir o alelo presente no DNA alvo. Têm sido utilizadas diferentes abordagens para detectar a formação de produtos específicos de PCR em ensaios homogéneos, p.ex. com base na análise da curva de fusão, ou com base na hibridação de sondas específicas para o alvo. Uma variação desta abordagem é a extensão alelo-específica do primer. Nesta o produto do PCR que contém o sítio polimórfico funciona como molde, e a extremidade 3' da sonda de extensão do primer consiste na base alélica. A extensão do primer acontece apenas se a base 3' complementa o alelo presente no DNA alvo. A monitorização do evento de extensão do primer permite, portanto, determinar o(s) alelo(s) encontrado(s) na amostra de DNA. A SBE também pode ser facilmente executada em microarranjos utilizando a bem conhecida técnica SBE-TAG. Os protocolos adequados para a realização desta incorporação da invenção são descritos em manuais como, por exemplo, no "DNA microarrays: a molecular cloning manual" por David Bowtell, Joseph Sambrook, Protocolo 6, páginas 403-420, aqui incorporado como referência. No protocolo 6 do referido manual são descritas em detalhe todas as informações necessárias para que um especialista qualificado nesta área possa desenvolver esta incorporação da invenção, desde a selecção e desenho de primers até aos tampões. Um especialista qualificado nesta área pode, consequentemente, executar com facilidade a incorporação da SBE-tag na invenção com base na doutrina da presente descrição, sem ter que usar competências inovadoras e sem preparações complexas. Outro protocolo adequado para a identificação SBE do SNP de interesse em microarranjos é o arranjo com marcação Affymetrix, este protocolo também está disponível em manuais, como o manual referido anteriormente por Bowtell e Sambrook, e é descrito em detalhe no Protocolo 7, páginas 421-428 aqui incorporado como referência.

Uma outra técnica adequada para a identificação dos SNP(s) de interesse é a técnica da ligação. Na ligação de oligonucleótidos alelo-específica, através do desenho de oligonucleótidos complementares à sequência alvo, com a base alelo-específica na sua extremidade 3' ou extremidade 5', é possível determinar o genótipo da sequência alvo amplificada por PCR, determinando se um oligonucleótido complementar à sequenciação do DNA adjacente ao sítio polimórfico se liga ao oligonucleótido alelo-específico ou não. Este ensaio baseia-se no facto de a DNA ligase ser uma enzima que é altamente específica na reparação de cortes na molécula de DNA. Quando dois oligonucleótidos adjacentes são recozidos a um molde de DNA, estes são ligados conjuntamente apenas se os oligonucleótidos se combinarem perfeitamente com o molde na junção.

Os oligonucleótidos alelo-específicos podem, portanto, interrogar a natureza da base no sítio polimórfico. 0(s) alelo(s) presente(s) no DNA alvo pode(m) ser deduzido(s) pela determinação da ocorrência ou não da ligação. A ligação tem o mais elevado nível de especificidade e é o mecanismo de discriminação alélica mais fácil de optimizar, mas é a reacção mais lenta e requer o maior número de sondas modificadas. No entanto, a ligação como um mecanismo tem o potencial de genotipagem sem uma prévia amplificação do alvo por PCR. Isto pode ser alcançado ou pela reação de ligação em cadeia (LCR) ou pela utilização de sondas de ligação (sondas cadeado) que são primeiro circuladas pela DNA ligase, seguida pela amplificação de sinal por círculo rolante. A técnica da ligação também é aplicável em microarranjos, neste caso, a técnica é designada mais especificamente Ligation Detection Reaction - Universal Array (LDR-UA) e permite a detecção de Polimorfismos de Nucleótido Único (SNPs) em moléculas de DNA. A técnica LDR-UA tira proveito de duas sondas diferentes, denominadas Sonda Comum (CP) e Sonda Discriminante (DP), que são concebidas para recozer DNA de fita simples justaposto no alvo. A DP recoze no DNA na extremidade 5' da CP. As duas sondas podem ser ligadas por uma ligase termoestável como a Ligase Pfu. Se a complementaridade entre a extremidade 3' da DP e o DNA alvo não for perfeita, a reacção de ligação é comprometida. Por esta razão a última base na extremidade 3' da DP é também designada por base discriminante. 0 sistema requer que as sondas conduzam as seguintes modificações:

Cada DP deve ser marcada na sua extremidade 5' com um fluoróforo diferente. A CP deve ser fosforilada na sua extremidade 5' e deve ser alargada na sua extremidade 3' com uma sequência "cZIP Code", que é complementar e inversa à sequência "Zip Code" encontrada no arranjo universal (Universal Array). Cada CP corresponde a diferentes "ZIP Code". 0 produto da ligação é hibridado ao UA. Cada ponto do UA é composto por diferentes sequências de DNA "Zip Code" que capturam as sequências correspondentes do "cZIP Code" na extremidade 3' da CP. 0 evento de ligação CP-DP posiciona o fluoróforo na extremidade 5' da DP no ponto correspondente do UA que é visualizado com o subsequente scaneamento do UA. 0 sinal de um ponto indica, portanto, a combinação perfeita entre a DP e o DNA alvo.

Novamente, para as técnicas de ligação, o desenho de sondas começando da SEQ ID NO 5 ou 1 e sabendo que os SNPs de interesse estão na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 5 ou 1, torna a selecção dos primers simples para um especialista qualificado nesta área. A CP e a DP (o termo também é alargado à técnica da ligação quando não é realizada em suportes sólidos) e podem ser encomendadas a serviços comerciais especializados no desenho e construção deste tipo de sondas. Para a finalidade do método aqui descrito nem será necessário desenhar uma DP para cada forma alélica dos SNPs, porque o único objectivo é a identificação de um C (ou de um G no caso de uma fita complementar) na posição 108 da SEQ ID NO 5 e/ou de um G (ou C no caso de uma fita complementar) na posição 171 da SEQ ID NO 5.

As sondas DP específicas para o alelo T (A no caso de uma fita complementar) na posição 108 da SEQ ID NO 5 e/ou para o alelo A (T no caso de uma fita complementar) na posição 171 da SEQ ID NO 5 podem ser fornecidas marcadas com uma cor diferente por uma questão de plenitude do método.

Numa outra incorporação adicional, a identificação do SNP (s) na posição 108 e/ou 171 da SEQ ID NO 5 ou 1 pode ser realizada pela técnica da clivagem invasiva como descrito, p.ex. por Wilkins Stevens P. et al 2001.

Como indicado anteriormente, também esta técnica é conhecida para um especialista qualificado nesta área, sendo uma abordagem adequada para a identificação de SNPs. O ensaio de clivagem invasiva é uma reacção de amplificação de sinal com uma sonda em ciclos, utilizada para a detecção de polimorfismos de nucleótido único (SNPs). A reacção requer dois oligonucleótidos sintéticos, denominados 'oligonucleótido a montante' e 'sonda' , que se recozem sequência alvo com uma sobreposição de 1 nt, o que vai criar um complexo de sobreposição bifurcada semelhante a uma estrutura produzida durante o deslocamento da fita na síntese de DNA. As nucleases 5' específicas para a estrutura, cuja função celular principal se acredita que seja o processamento de fragmentos de Okazaki, clivam o substrato bifurcado no sítio da sobreposição, libertando o braço 5' e uma base de nucleótidos emparelhados da sonda. O braço 5' clivado serve como um sinal indicador da presença do alvo numa amostra analisada. Através da realização da reacção invasiva à temperatura de fusão da sonda (Tm), podem ser obtidos diversos eventos de clivagem para cada alvo. Normalmente, uma reacção invasiva de amplificação de sinal gera 30-50 sondas clivadas/alvo/min, o que resulta em 103-104 vezes o sinal de amplificação numa reacção de 1-3 h. A habilidade única das nucleases 5' para clivar especificamente o substrato sobreposto pode ser utilizada para a detecção de mutações de base única. Para detectar um nucleótido específico na sequência alvo, o oligonucleótido a montante e a sonda são concebidos para criar sobreposições neste nucleótido, garantindo uma clivagem ensuring eficiente da sonda. Uma substituição na posição deste nucleótido elimina a sobreposição e reduz dramaticamente a taxa de clivagem, o que resulta numa discriminação de mutações de pelo menos 300:1. Este poder discriminatório torna o ensaio de clivagem invasiva uma excelente ferramenta para a identificação de SNPs. A detecção de sinal pode ser realizada pelos métodos: electroforese, ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) em microplaca (microtiter), espectrometria de massa de ionização por dessorção a laser assistida por matriz -tempo de voo (MALDI-TOF) , e pela metodologia da transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET). O ensaio de clivagem invasiva, como as outras técnicas referidas anteriormente, é adaptável a um formato de fase sólida apresentando a possibilidade de análise de múltiplos SNPs ou múltiplas amostras para um único SNP em paralelo. A detecção de SNPs através da reacção invasiva de clivagem pode ser realizada em microplacas de 96 poços com nanogramas de DNA por SNP.

Além disso, o SNP pode ser identificado pelo método SniPer, que permite a discriminação de alelos através da análise da presença ou ausência de amplificação por RCA (amplificação por circulo rolante). Em resumo, o DNA a ser utilizado como molde é linearizado. A seguir, a sonda é hibridada ao referido DNA linearizado. Quando a sequência da sonda e a sequência do DNA linearizado como molde são complementares entre si e formam uma fita complementar, o DNA genómico pode ser convertido num DNA circular através de uma reacção de ligação. Como resultado, a RCA do DNA circular prossegue. Por outro lado, quando as extremidades da sonda não se combinam com o DNA genómico, o DNA não é ligado para se transformar num DNA circular. Portanto, a reacção RCA não continua.

Portanto, no método Sniper, é concebida uma sonda de fita simples que recoze com o DNA genómico e é circularizável. Esta sonda de fita simples é designada sonda cadeado. As sequências das duas extremidades desta sonda cadeado são concebidas para corresponderem ao SNP a ser detectado. Depois, esta sonda cadeado e o DNA genómico são misturados para ligação. Se as duas extremidades da sonda cadeado e o sitio do SNP do DNA genómico forem complementares um ao outro, as duas extremidades da sonda cadeado são unidas por ligação, originando uma sonda circular. Se as duas extremidades da sonda cadeado e o sitio do SNP do DNA genómico não forem complementares um ao outro, a sonda não se torna circular. Portanto, apenas as sondas cadeado que são complementares ao SNP a ser detectado se tornam circulares e são amplificadas pela DNA polimerase. Através da detecção da presença ou da ausência desta amplificação, o SNP pode ser detectado. Para a detecção utilizam-se os oligonucleótidos sintéticos que têm um corante fluorescente e um supressor nas respectivas extremidades e também uma estrutura em grampo.

Finalmente, uma técnica adicional aplicável ao método de diagnóstico aqui apresentado, é a amplificação de um fragmento que inclui um ou ambos os nucleótidos 108 e 171 da SEQ ID NO 5 ou 1 e a sequenciação dos mesmos com a identificação directa de um ou de ambos os nucleótidos 108 e 171 (e/ou dos seus nucleótidos complementares). A sequenciação pode ser realizada imediatamente e facilmente com sequenciadores automáticos.

Quando a sequência do fragmento é realizada, os primers de amplificação da SEQ ID NO 2 e 4 são adequados também para esta técnica. É evidente que qualquer par adequado de primers para a amplificação especifica de toda ou parte da SEQ ID NO 5 ou 1 pode ser utilizado na execução do método da invenção, desde que um ou ambos os nucleótidos 108 e 171 estejam incluídos no amplicão obtido (e/ou um ou ambos os nucleótidos correspondentes na sequência complementar à SEQ ID NO 5 ou 1) , ou qualquer sonda sobreposta num ou em ambos os nucleótidos 108 e 171 da SEQ ID NO 5 ou 1 (e/ou um ou ambos os nucleótidos correspondentes na sequência complementar à SEQ ID NO 5 ou 1) , e que a invenção não seja limitada a primers da SEQ ID NO 2-4.

Em todas as incorporações descritas anteriormente, nas quais as técnicas utilizadas permitem distinguir os dois alelos diferentes dos SNPs de interesse, pode ser realizado um controlo através da detecção também do alelo transportador de T (A no caso da fita complementar) na posição 108 da SEQ ID NO 5 e/ou de um A (T no caso da fita complementar) que são específicos para os fitoplasmas do mesmo grupo e subgrupos taxonómicos, que não estão associados à FD (mas confundíveis em termos de sintomas da planta até a um determinado ponto) (p.ex. fitoplasmas associados com a EY, a ALY e a ULW) . É evidente que num kit para a realização do método de diagnóstico aqui descrito, também podem ser fornecidas sondas adequadas para a detecção do alelo específico para os fitoplasmas associados com a EY, a ALY e a ULW.

Como indicado anteriormente, o método de diagnóstico aqui descrito pode ser realizado em suportes sólidos. Os suportes sólidos apropriados podem ser um grânulo de látex, uma lâmina de vidro, um chip de silício ou as paredes de uma microplaca de titulação. Em alguns casos, os oligonucleótidos específicos de marcadores são colocados no suporte sólido e a reacção de discriminação alélica é realizada no suporte, enquanto, em outros casos, os oligonucleótidos genéricos são colocados no suporte sólido e são utilizados para capturar sequências de tags complementares conjugadas com sondas específicas de marcadores. Quando os oligonucleótidos específicos de marcadores são colocados no suporte sólido, as matrizes oligonucleotídicas actuam como um conjunto de reactores onde as moléculas de DNA alvo encontram as suas contrapartes e a etapa de discriminação alélica para vários marcadores segue em paralelo. Quando os oligonucleótidos genéricos são colocados no suporte sólido, os oligonucleótidos em matriz são utilizados para classificar os produtos das reacções de discriminação alélica (também realizadas em paralelo) efectuadas em solução homogénea. Em ambos os casos, a identidade de um oligonucleótido sobre um grânulo de látex ou numa posição particular no microarranjo (sobre uma lâmina de vidro ou um chip de silício) é conhecida e os genótipos são deduzidos determinando qual oligonucleótido imobilizado está associado a um sinal positivo. A vantagem evidente de realizar reacções de genotipagem em suportes sólidos é que muitos marcadores ou, neste caso, muitas amostras, podem ser examinadas ao mesmo tempo. Além de economizar tempo e reagentes, a realização de numerosas reacções em paralelo também diminui a probabilidade de confundir amostras/resultados.

Como mencionado anteriormente, a detecção do produto obtido na primeira etapa do processo de identificação a), por exemplo o produto obtido pelas técnicas mencionadas anteriormente, pode ser realizado monitorizando a emissão de luz, por medição da massa, por monitorização da radioactividade ou por sequenciação do mesmo produto.

De acordo com a presente descrição, a referida monitorização da emissão de luz pode ser realizada por medição de fluorescência, luminescência, fluorescência resolvida no tempo, transferência de energia de por ressonância e fluorescência, ou polarização de fluorescência; a referida medição da massa pode ser realizada por espectrometria de massa; e a referida monitorização da radioactividade pode ser realizada com ferramentas sensíveis à radioactividade. A monitorização da emissão de luz é a modalidade de detecção mais utilizada na genotipagem, esta pode ser realizada através da medição ou detecção de luminescência, fluorescência, espectroscopia de fluorescência resolvida no tempo, transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) e polarização de fluorescência (FP). A luminescência é emitida numa reacção de luciferase dependente de ATP. Quando a produção de ATP está ligada com uma reacção de extensão do primer, a luminescência é observada cada vez que um desoxirribonucleótido é adicionado na reacção de extensão do primer. A luminescência pode ser medida com analisadores comerciais apropriados, seguindo as instruções do fabricante (por exemplo, Applied Biosystems 1700 Chemiluminescent Microarray Analyzer). A fluorescência pode ser medida utilizando dispositivos de imagem sensíveis à fluorescência comercialmente disponíveis ou dispositivos de medição conhecidos no estado da arte e sondas marcadas ou produtos amplificados de acordo com a tecnologia seleccionada para a realização do método aqui descrito. Os fluoróforos adequados para marcar os ácidos nucleicos de interesse podem ser seleccionados do grupo que consiste em Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Fluorescein, 6-Fam, Hex, Tet, Tamra, Joe, Rox, IRDyeTM700 , IRDyeTM800, Corantes Dyomics, Corantes Atto. A detecção pode ser realizada seguindo as instruções dos fabricantes. Um especialista qualificado está bem ciente de que todas as técnicas indicadas acima podem ser realizadas com fluoróforos seguindo protocolos convencionais . A detecção por fluorescência resolvida no tempo pode ser feita com corantes com uma meia-vida longa (tal como Lantanides), a leitura de fluorescência é feita um tempo suficiente após a excitação, para que a autofluorescência (que tem uma meia-vida muito curta) não seja observada. Uma vez que os lantanídeos são compostos inorgânicos que não podem ser utilizados para marcar os ácidos nucleicos directamente, um quelante orgânico unido à sonda deve ser utilizado para ligar os lantanídeos na reacção. Existem protocolos para este tipo de detecção. Também para este tipo de detecção, os métodos padrão e os protocolos de fabricantes estão disponíveis para os especialistas qualificados. A transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) acontece quando as duas condições seguintes são cumpridas. Em primeiro lugar, o espectro de emissão do corante doador fluorescente deve sobrepor-se ao comprimento de onda de excitação do corante receptor. Em segundo lugar, os dois corantes devem estar em estreita proximidade, porque a transferência de energia diminui rapidamente com a distância. 0 requisito de proximidade é o que torna o FRET um bom método de detecção para uma série de mecanismos de discriminação alélica. Basicamente, qualquer reacção que junta ou separa dois corantes pode usar FRET como método de detecção. A detecção pelo FRET, portanto, tem sido utilizada nas reacções de extensão de primers e de ligação onde os dois marcadores são aproximados. Também foi utilizado na reacção de 50 nuclease, na reacção de sinal molecular e nas reacções de clivagem invasiva em que o par dador/receptor vizinho é separado por clivagem ou ruptura da estrutura de tronco-laço que os mantém juntos. Os pares de corantes adequados para a detecção de FRET são conhecidos na técnica. A FP pode ser utilizada em várias técnicas de detecção de SNPs, sistemas comerciais como o Perkin Elmer AcycloPrime™-FP SNP Detection System estão disponíveis para os especialista qualificados.

De acordo com a presente descrição, também podem ser utilizados sistemas que não fazem uso de corantes fluorescentes para a detecção dos SNPs, um sistema normalmente utilizado é a espectrometria de massa (MS) em que é medido o peso molecular dos produtos formados. Na detecção por MS não são necessários marcadores. A MS de alta resolução pode facilmente distinguir entre moléculas de DNA que diferem em apenas uma base, em tempos de milissegundos para analisar cada amostra. A MS pode ser efectuada com espectrómetros de massa comercialmente disponíveis seguindo protocolos padrão.

Um outro método requer a utilização de radiomarcadores em vez de marcadores fluorescentes e neste caso a radioactividade da amostra é medida por métodos padrão correntes bem conhecidos na técnica. Outra concretização da presente invenção é um kit para o diagnóstico da doença das videiras Flavescência Dourada no floema de uma planta que inclui reagentes para a identificação de um ou ambos os nucleótidos nas posições 108 e 171 da SEQ ID NO 5 e/ou de um ou mais dos seus nucleótidos complementares na sequência complementar da SEQ ID NO 5. O kit da presente invenção inclui algumas ou todas as enzimas ou componentes necessários (apropriados) para executar o ensaio pretendido. Os exemplos de tais componentes incluem, mas não estão limitados a, oligonucleótidos com marcadores e/ou sem marcadores, polimerases (por exemplo Taq Polimerase), tampões (por exemplo tampão Tris), dNTP marcados ou não marcados, reagentes de controlo (por exemplo, amostras de tecidos, oligonucleótidos padrão para controlo positivo e negativo, etc), reagentes para a marcação e a detecção (corantes fluorescentes, por exemplo VIC, FAM), suportes sólidos, manuais, diagramas ilustrativos e/ou informações sobre o produto, inibidores e produtos para a embalagem (por exemplo gelo, produtos dessecantes). 0 kit da presente invenção pode ser um kit parcial que inclui apenas uma parte dos componentes necessários. Nesse caso, os utilizadores podem fornecer os restantes componentes. 0 kit da presente invenção pode incluir dois ou mais recipientes separados, cada um contendo uma parte dos componentes a serem utilizados. Por exemplo, o kit pode incluir um primeiro recipiente com uma enzima e um segundo recipiente que contém um oligonucleótido. Os exemplos específicos da enzima incluem também uma enzima de clivagem especifica para a estrutura, ligases ou outras enzimas para serem utilizadas nas técnicas de identificação e detecção descritas anteriormente, contidas num tampão de preservação apropriado ou num recipiente. Exemplos específicos de oligonucleótidos incluem nucleótidos para o RT-PCR, nucleótidos para a técnica de extensão descrita anteriormente, nucleótidos para a técnica de ligação referida anteriormente, oligonucleótidos para a técnica LDR-UA descrita anteriormente, oligonucleótidos para a técnica invasora descrita anteriormente, oligonucleótidos sonda para a técnica de hibridação descrita anteriormente, oligonucleótidos padrão para serem utilizados como controlo, etc. Os oligonucleótidos podem ser marcados de acordo com a técnica seleccionada. Em alternativa, um ou mais componentes da reacção podem ser proporcionados de forma a que sejam pré-divididos em porções de uma quantidade específica. Alguns componentes de reacção também podem ser misturados e divididos em porções de quantidade específica. É preferível que os componentes da reacção sejam pré-divididos em porções e contidos num reactor. Exemplos específicos do reactor incluem, mas não estão limitados a, tubos ou poços de reacção, ou microplacas de titulação. É preferível que o componente de reacção pré-dividido seja mantido seco num reactor por meio de, por exemplo, desidratação ou liofilização. 0 kit da invenção pode incluir ainda suportes sólidos em que oligonucleót idos para a identificação de um ou de ambos os nucleótidos na posição 108 e 171 SEQ ID NO 5 e/ou de um ou de ambos os seus nucleótidos complementares na sequência complementar da SEQ ID NO 5 são ancoradas em posições conhecidas no referido suporte numa ou mais cópias por posição. A ancoragem dos oligonucleótidos/sondas como descrito anteriormente na secção relativa às técnicas apropriadas para a realização do método será fixada ao suporte sólido por técnicas padrão seleccionadas dependendo do suporte escolhido. O kit da invenção pode incluir sondas marcadas correspondentes e/ou complementares a uma região da SEQ ID NO 5 a montante e/ou a jusante de um ou de ambos os nucleótidos na posição 108 e 171 de SEQ ID NO 5 e/ou sobrepondo uma região que inclui um ou ambos os nucleótidos na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 1.

Os oligonucleótidos a montante e a jusante podem ser directamente adjacentes a um dos nucleótidos 108 ou 171 da SEQ ID NO 1 ou ao seu nucleótido complementar na sequência complementar da SEQ ID NO 1, por exemplo no caso de kits para identificação por ligação ou por outras técnicas como exemplificado anteriormente, requerendo sondas directamente adjacentes ao SNP; ou pode não ser directamente adjacente ao nucleótido do SNP, quando os kits são para identificação com técnicas que não requerem sondas directamente adjacentes ao SNP, como exemplificado anteriormente.

Todas as sondas e oligonucleótidos da invenção (por exemplo sondas descritas para o método e para o kit) estão dentro da definição de fragmentos da SEQ ID NO 1 ou da sua sequência complementar e terão uma dimensão entre aproximadamente 8 e 100 nucleótidos, normalmente de uma dimensão entre aproximadamente 15 e 50 nucleótidos. Quando os fragmentos e as sondas não incluem um ou ambos os SNPs de interesse, estes também se incluem na definição de fragmentos da SEQ ID NO 5 ou da sequência complementar e terão uma dimensão entre aproximadamente 8 e 100 nucleótidos, normalmente de uma dimensão entre aproximadamente 15 e 50 nucleótidos. Os fragmentos, por outro lado, incluem também fragmentos que são maiores do que os oligonucleótidos e as sondas, podem ser representados por exemplo por amplificação e podem abranger desde o tamanho dos oligonucleótidos e das sondas indicados anteriormente até um comprimento igual ao da SEQ ID NO 1 menos um nucleótido.

De acordo com uma forma de realização da invenção anteriormente exemplificada, as sondas e os oligonucleótidos do kit podem ser marcados com um fluoróforo, por exemplo com um fluoróforo seleccionado do grupo que consiste em Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, Fluoresceína, 6-Fam, Hex, Tet, Tamra, Joe, Rox, IRDyeTM700, IRDyeTM800, Corantes Dyomics, Corantes Atto. Um especialista qualificado saberá que a selecção de outros corantes para marcar as sondas e os oligonucleótidos se incluem dentro das qualificações normais de um técnico especializado em genética molecular. O kit também pode incluir o vector descrito como controlo positivo ou negativo, como descrito anteriormente, ou pode incluir ambos os controlos positivo e negativo, ou seja, o controlo positivo incluirá os SNPs e/ou os SNPs específicos do fitoplasma associado à FD e referidos na presente descrição (isto é, a partir da SEQ ID NO 1) e o controlo negativo incluirá nos sítios descritos dos SNPs a sequência a partir da SEQ ID NO 5 quando SEQ ID NO 5 não for SEQ ID NO 1. Estes controlos irão permitir a verificação do funcionamento correcto do kit ou do método aqui descrito sem necessidade de ácidos nucleicos de fitoplasmas como controlos.

Como exemplo, podem ser preparados anticorpos monoclonais ou policlonais, que reconhecem especificamente a SEQ ID NO 7, de acordo com técnicas convencionais e até adquiridos por empresas especializadas na preparação de anticorpos a partir da SEQ ID NO 7. 0 anticorpo pode ser produzido de acordo com qualquer técnica padrão conhecida, tal como descrito também nos capítulos relacionados com a produção monoclonal e policlonal do manual " Basic Methods in Antibody Production and Characterization" (Métodos Básicos na Produção e Caracterização de Anticorpos) editado por G.C. Howard e D.R., CRC Press, 2001, ou noutro manual de laboratório normalmente utilizado, e a identificação de fitoplasma associado à FD pode ser realizada por ensaios imunológicos em amostras de floema de videira onde a lise celular foi realizada para expor a proteína ribossómica L14 da SEQ ID NO 7 expressa dentro da célula infectada. Portanto, como exemplo, o método para a detecção do fitoplasma associado à FD numa amostra de videira poderia ser realizado, onde um anticorpo primário que reconhece especif icamente a SEQ ID NO 7 e um anticorpo secundário marcado que reconhece especificamente o anticorpo primário, forem utilizados num ensaio de imunodetecção de uma amostra de floema de videira em que a lise celular foi realizada.

EXEMPLOS

Isolamento rpll4

Foram utilizadas neste trabalho 5 estirpes de fitoplasma (EY1, ULW, ALY, FD92 e FD-C) pertencentes ao grupo 16SrV. A FD92 e a FD-C representam duas estirpes de Flavescência dourada, enquanto a EY1 e a ALY são duas estirpes não associadas com a FD, mas esporadicamente presentes em videiras.

Extracção de DNA: os ácidos nucleicos totais (TNA) foram extraídos como descrito anteriormente (Angelini et al., 2001) . lg de folha de pervinca e nervuras de folha de videira frescas foi homogeneizada em 3% de tampão CTAB (3% CTAB, lOOmM Tris-HCl pH8, lOmM EDTA, 1.4 M NaCl, 0,1% 2-mercaptoetanol). lml de solução foi transferida para um tubo de l,5ml e incubado durante 20 min a 65 °C. Depois foi adicionado um volume igual de clorofórmio e, após a centrifugação, a fase superior que contém DNA foi precipitada com um volume igual de isopropanol e recolhido por centrifugação. O aglomerado de DNA foi lavado com etanol a 70%, seco e dissolvido em lOOul de TE (1OmM Tris, ImM EDTA, pH 7.6).

Para obter a sequência parcial do operão SlO-spc, o DNA extraído e não diluído foi amplificado com a utilização do primer directo rpFl(V), posicionado na extremidade 3' do gene rpsl9 (Lee et al. , 1998) e do primer reverso FD9r, posicionado na extremidade 3' do gene secY (Martini et al., 2002). Os amplicões rpFl(V)/FD9r tinham um tamanho esperado de aproximadamente 9Kbp. Os produtos directos do PCR foram diluídos 1:50 em água esterilizada e utilizados em ensaios de PCR aninhado realizados mediante o primer directo rp(V)FIA (Lee et al. , 2004) e o primer reverso FD9r2 (Martini et al. , 2002), que amplificou um produto com um tamanho esperado de aproximadamente 8Kbp, compreendido entre os genes rpl22 e secY no operão S10-spc.

Os PCRs foram realizados com o uso da Platinum® Taq DNA Polimerase de Alta Fidelidade (Invitrogen, Alemanha) . A mistura de PCR (volume total de 25μ1) continha um molde de DNA (Ιμΐ de DNA extraído para dPCR não diluído, e 2μ1 de produtos dPCR diluídos 1:50 para nPCR), 0.25mM cada dNTP, 0.4μΜ cada primer, 1.5U de Platinum® de Alta Fidelidade. Para a amplificação PCR, foram realizados 36 ciclos num aparelho automático de ciclagem térmica Thermocycler T3000 (Biometra GmbH, Goettingen, Alemanha), nas seguintes condições: 45seg a 94°C (desnaturação), 30seg a 56°C (recozimento) , 9min (dPCR) ou 8min (nPCR) a 68°C (extensão), e lOmin a 72°C (extensão de ciclo final). O DNA extraído de plantas pervinca saudáveis e a mistura da reacção de PCR desprovida de DNA foram utilizados como controlos negativos. Os produtos de PCR (5μ1) foram analisados por electroforese em 1% de gel de agarose, corados com brometo de etídeo, e visualizados com um Transiluminador UV. O produto do PCR rpFlA/FD9r2 que cobre a região do operão SlO-spc entre os genes rpl22 e secY foi sequenciado. Uma estratégia "sequence-walking" foi realizada mediante 30 primers intermediários concebidos na sequência em construção. A reconstrução da sequência de 6,3Kb do amplicão foi executada com a utilização do Programa Contig Assembly (CAP) do software Bioedit, versão 7.0.0 (http ://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html) .

Para procurar os Quadros de Leitura Abertos - Open Reading Frames (ORFs) e para deduzir as sequências das proteínas codificadas, a nossa sequência foi inteiramente analisada utilizando o ExPasy Proteomics Server (http://us.expasy.org/tools/dna.html) (Gasteiger et ai., 2003) .

Desenho do ensaio de diagnóstico

Os amplicões sequenciados foram comparados entre si para identificar uma variação na sequência que permitisse a identificação de regiões adequadas para a elaboração de ensaios de diagnóstico. O alinhamento da sequência foi realizado com o software ClustalW, foi observada uma elevada homologia de sequências entre diferentes isolados analisados. Em particular, foi identificado um nucleótido comum a ambos FD (FD92 e FD-C) que os diferenciam de outros isolados pertencentes ao grupo 16SrV (Figl). Este nucleótido foi localizado no gene rpll4 (381bp).

Uma parte deste gene foi submetido no software Primer Express, para elaborar um ensaio especifico para a FD com base neste SNP identificado.

Foi identificado um fragmento de nucleótido de lOObp que inclui dois primers e uma sonda adequada para detectar o fitoplasma da FD.

Optimização do ensaio - Especificidade e Sensibilidade Para obter a especificidade à FD com os primers da SEQ ID 2-4 modificámos o perfil térmico convencional do PCR.

Normalmente, o recozimento e a extensão são realizados a 60 °C, no entanto, se a reacção foi conduzida a esta T° não se observou nenhuma especificidade à FD. Portanto, foi aumentada a T° para 61,5 °C para atingir uma maior especificidade. De facto, ao trabalhar com esta condição de reacção de PCR, não foi observada nenhuma amplificação no controlo negativo (EY1 - ALY) (Tab. 1). Na Tabela 1 são apresentadas as diferenças entre o mesmo ensaio conduzido a 61,5 °C (A) e a 60 °C (B). É importante salientar duas diferenças principais: i) a 61,5 °C nenhum controlo negativo manifestou sinais de fluorescência, isto confirmou a especificidade do ensaio à FD ii) no entanto, a 60 °C observou-se um aumento da sensibilidade do ensaio para a amostra de videira infectada pela FD, como apresentado na coluna do valor ACt (diferença entre o ensaio A e o B). Em 7 amostras, o valor ACt foi 5 vezes superior no A do que no B, no entanto, os controlos negativos EY e ALY manifestaram amplificação do sinal. Na fig 2 é apresentado um exemplo de um gráfico de amplificação. Os resultados são apresentados na Tabela 1 a seguir.

Tabela 1. Comparação entre o ensaio da sonda FD66 realizado a 61,5 °C (A) e a 60 °C (B) , análises de PCR/RFLP e testes serológicos (E.L.I.S.A.) em amostras de folhas de videiras doentes e saudáveis.

Ct-médio

legenda: nt - não testado A Tabela 1 mostra as diferenças entre o mesmo ensaio realizado a 61,5 °C (A) e a 60 °C (B) e com o kit comercial ELISA (SEDIAG®, França) . As 15 amostras foram testadas para avaliar a sensibilidade e especificidade do ensaio de RTPCR FD66. Na condição A, o ensaio foi realizado a 61,5 °C e podemos observar uma elevada especificidade para o fitoplasma da FD mas menos sensibilidade. Na condição B, o ensaio foi realizado a 60 °C, e observou-se um aumento na sensibilidade do ensaio para a amostra de videira infectada com FD, mas uma baixa especificidade para o fitoplasma da FD. A diferença na sensibilidade das duas condições foi calculada utilizando o valor ACt. Não foi detectado nenhum fitoplasma utilizando o teste ELISA.

Preparação das amostras para o teste E.L.I.S.A.

As amostras foram preparadas seguindo as instruções do fabricante, e o teste ELISA foi realizado seguindo as mesmas instruções. Devido aos resultados negativos obtidos, e ao sinal muito fraco obtido apenas para o controlo fornecido no kit, diferentes lotes do Kit SEDIAG® 480 foram testados com os mesmos resultados apresentados na Tabela 1. A tabela mostra a comparação entre o método convencional actualmente utilizado (PCR-endpoint) e o teste de diagnóstico aqui proposto (baseado no PCR em tempo real). Não foi feita a comparação do método proposto com o pré-existente (Bianco et al. , 2004) porque: i) neste artigo o alvo era um produto do PCR enquanto no presente ensaio foi utilizado o TNA e ii) a sequência alvo no referido artigo era a do gene 16Sr DNA enquanto no método proposto é um gene de uma proteína ribossomal. O protocolo apresentado na literatura é sempre baseado na presença de um SNP. Este pode discriminar o FD do EY, mas, como descrito anteriormente, são necessárias duas reacções de amplificação para detectar especificamente o fitoplasma associado com a FD. Portanto, o método proposto na presente invenção representa uma nova tecnologia em comparação com as técnicas anteriores. Hibridação em microarranjos 0 DNA genómico amplificado é marcado com o kit "BioPrime® Total Genomic Labeling System" (INVITROGEN -18097-012) seguindo as instruções do fabricante. A amostra marcada é precipitada por Spin - Vacuum Savant e é posteriormente ressuspendida na solução de hibridação. Hibridação do microarranjo:

As sondas que incluem uma ou ambas as regiões de interesse SNPs foram bloqueadas na lâmina, para a detecção do fitoplasma SNP(s) associado com a FD referido na presente descrição, com 16 cópias por sonda. Antes da reacção de hibridação, deve ser realizada a activação da lâmina (química da superfície do vidro: lâminas com revestimento da superfície de EPÓXI; tampão de identificação: tampão Scott-Nexterion; concentração da sonda: 30μΜ), através da utilização de uma solução de bloqueio (lOx Citrato de Sódio Salino (SSC), 0.1% Dodecil Sulfato de Sódio (SDS), 0.066 Borohidreto de Sódio (NaBH4) , H2O até 50ml) . A lâmina é tratada com a solução de bloqueio durante 20 minutos a 42°C. As lavagens são realizadas: duas vezes (Citrato de sódio salino lx durante 5 minutos à temperatura ambiente), duas vezes (Citrato de sódio salino 0.lx durante 5 minutos à temperatura ambiente).

Pré-hibridação: É preparada uma solução que consiste em: 5x Citrato de Sódio Salino (SSC), 0.1% Dodecil Sulfato de Sódio, 200pg DNA Esperma de Salmão, 5x Solução de Denhardt (5g Ficoll, 5g Polivinilpirrolidona, 5g albumina de soro bovino, fracção V, H2O até 500ml), H2O até 2ml. A solução deve ser filtrada por filtros de 0.2pm. A área da lâmina que inclui as sondas é delimitada com uma "moldura" (Gene Frame 21x22mm e lamelas - AB1043 CELBIO). São colocados dentro desta área ΙΙΟμΙ de solução de pré-hibridação e a lâmina é coberta com a lamela. A lâmina com a pré-solução de hibridação é incubada a 42°C durante 2 horas.

Hibridação: É preparada uma solução que consiste em: 5X Citrato de Sódio Salino (SSC), 0.1% Dodecil Sulfato de Sódio, 25% Formamida, 200pg DNA Esperma de Salmão, H2O até 2ml. A solução deve ser filtrada por filtros de 0.2pm e pré- aquecido a 42°C. A amostra do DNA amplificado e marcado é ressuspendida em aproximadamente ΙΙΟμΙ de solução de hibridação. A amostra de DNA, ressuspendida na solução de hibridação, é desnaturada a 95°C. A solução de hibridação é colocada no centro da "moldura" que define a área que inclui as sondas alvo, e a lamela é colocada nesta área. A lâmina é incubada a 42°C durante 16 horas.

Lavagem pós-hibridação:

Ia LAVAGEM - num volume de solução de 50ml: lx

Citrato de Sódio Salino (SSC), 0.1% Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) durante 5 minutos a 42°C; 2a LAVAGEM - num volume de solução de 50ml: 0.2x

Citrato de Sódio Salino (SSC), 0.1% Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) durante 5 minutos a 42°C; 3a LAVAGEM - num volume de solução de 50ml: 0.2x

Citrato de Sódio Salino (SSC) durante 5 minutos a 42°C; 4a LAVAGEM - num volume de solução de 50ml: 0.2x

Citrato de Sódio Salino (SSC) durante 5 minutos a 42°C. A lâmina foi seca por centrifugação a 800 rpm durante 5 minutos.

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Claims (10)

REIVINDICAÇÕES

1. Um método para o diagnóstico da doença da videira Flavescence dorée que compreende a etapa de a) identificar um ou ambos os nucleótidos na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 5, e/ou os seus nucleótidos complementares na sequência complementar à SEQ ID NO 5, numa amostra de planta compreendendo floema; em que a presença de um resíduo C na posição 108 da SEQ ID NO 5, e/ou de um resíduo G no seu nucleótido complementar na sequência complementar à SEQ ID NO 5 e/ou de um resíduo G na posição 171 da SEQ ID NO 5, e/ou de um resíduo C no seu nucleótido complementar, indica a presença de pelo menos uma das estirpes do fitoplasma associado com a doença da videira Flavescence dorée na amostra.

2. O método de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa de identificação a) compreende uma primeira etapa em que uma PCR, PCR em tempo real, ligação, hibridação específica de alelo, extensão de iniciadores, clivagem invasiva ou reação de clivagem é levada a cabo, e uma segunda etapa em que o produto obtido na primeira etapa é detetado por monitorização da luz emitida pelo dito produto, ou medição da massa dos ditos produtos, ou monitorização da radioatividade emitida pelo dito produto, ou pela sequenciação do dito produto.

3. O método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2 em que a dita monitorização da emissão de luz é levada a cabo monitorizando a fluorescência, luminescência, fluorescência resolvida no tempo, transferência de energia de fluorescência por ressonância, ou polarização de fluorescência, a dita medição da massa é levada a cabo por espectrometria de massa ou análise heterodúplex, e a dita monitorização da radioatividade é levada a cabo com ferramentas sensíveis a radioatividade.

4. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 em que o dito método é realizado em formato de fase sólida como um microarranjo ou microplaca.

5. 0 método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 em que a dita identificação é levada a cabo com uma RT PCR utilizando um iniciador direto da SEQ ID NO 2, uma sonda específica de alelo da SEQ ID NO 3 e um iniciador inverso da SEQ ID NO 4.

6. Um kit para o diagnóstico da doença da videira Flavescence dorée que compreende reagentes para a identificação dos nucleótidos na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 5 ou 1 e/ou dos seus nucleótidos complementares na sequência complementar à SEQ ID NO 5 ou 1 num floema de planta de videira.

7. O kit de acordo com a reivindicação 6 que compreende adicionalmente suportes sólidos em que os oligonucleótidos para a identificação de um ou ambos os nucleótidos na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 5 ou 1 e/ou um ou mais dos seus nucleótidos complementares na sequência complementar à SEQ ID NO 5 ou 1 estão ancorados em posições conhecidas no dito suporte numa ou mais cópias por posição.

8. O kit de acordo com a reivindicação 7 que compreende adicionalmente sondas e/ou oligonucleótidos marcados correspondentes e/ou complementares a uma região a montante e/ou a jusante de um ou ambos dos nucleótidos na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 5 ou 1 e/ou sobrepostos a uma região que compreende um ou ambos os nucleótidos na posição 108 e 171 da SEQ ID NO 5 ou 1.

9. O kit de acordo com a reivindicação 8 em que uma ou mais das ditas sondas e/ou oligonucleótidos são marcados.

10. Uma sequência de nucleótidos da SEQ ID NO 1, a dita sequência codificando para o gene rpll4 (381 pb) específico para o fitoplasma relacionado com FD.