CN106520942A

CN106520942A - 人运动神经元存活基因smn1和smn2检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN106520942A
Application number: CN201610969688.3A
Authority: CN
Inventors: 王小舟; 倪晓龙; 张炳为; 苗保刚; 李明; 彭年才
Original assignee: SUZHOU TIANLONG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SUZHOU TIANLONG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2017-03-22

Abstract

本发明揭示了一种人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒及方法，试剂盒包括SMN1主反应液，SMN2主反应液，酶混合液，0拷贝质控，SMN1单拷贝质控，SMN1两拷贝质控，SMN2单拷贝质控和SMN2两拷贝质控；SMN1主反应液中包括SMN1基因的检测引物和SMN1的内参引物；SMN2主反应液中包括SMN2基因的检测引物和SMN2的内参引物；试剂盒采用PCR熔解曲线法，通过实时检测双链DNA熔解过程中荧光信号值的变化，根据不同扩增产物量的差异，目的基因与内参基因生成不同溶解峰，再通过软件处理判断SMN1与SMN2基因的拷贝数；本发明检测结果准确性高，灵敏度高，检测耗时短，成本低。

Description

人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及一种分子生物学领域，尤其是涉及一种PCR方法检测人运动神经元存活基因SMN1和SMN2拷贝数的试剂盒及检测方法。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular alrophy，SMA)是一种常见的致死性神经肌肉疾病之一，是由于脊髓前角细胞运动神经元退化变性所导致的进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉无力瘫痪及萎缩为特征的遗传性神经肌肉疾病。SMA发病年龄可以从出生前到青春期，主要临床症状和体征包括对称性、进行性的累及四肢近端肌肉为主的肌力、肌张力下降和腱反射减弱或消失，下肢臀部和股部肌群萎缩无力，出现行走鸭步。严重者上肢近端肌肉无力，抬肩举肩困难。智力和感觉基本正常。常见的并发症有；体重减轻，失眠，吸入性肺炎，脊柱侧凸，关节挛缩等。SMA人群发病率约为1/6000～1/10000，杂合子频率高达1/40-1/60，是仅次于囊性纤维变性(cystic fibrosis)的第2位常见的常染色体隐性遗传病。

根据患者的发病时间和临床症状(肌肉活动的最大程度和存活率)，SMA被分为I、II、III、IV4个类型，在4种SMA类型中，SMA I型为致命性，是位居世界儿童死亡率第一位的“杀手”(killer)。鉴于其严重性及给患者家庭带来的巨大悲痛，对SMA的科学研究一直受到国内外的高度重视。

目前，多重连接探针扩增技术(Multiplex ligation-dependent probeamplification，MLPA)：其基本原理为特异性探针与靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增、产物毛细管电泳分离及数据收集、软件计算等分析靶序列拷贝数变异。每个MLPA探针包括2个寡核苷酸片段，每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在MLPA反应中，2个寡核苷酸片段都与相邻的靶序列进行杂交，之后使用连接酶进行连接。此连接反应高度特异，只有当靶序列与探针特异性完全互补时，连接酶才能将2段探针连接成一条完整的核酸单链；只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增信号，如果检测的靶序列发生点突变或缺失，那么相应探针的扩增峰便会降低或缺失。因此，根据扩增峰的改变就可以判断靶序列是否存在拷贝数的异常。

PCR-DHPLC技术是一类在单核苷酸多态性(SNP)研究中常见的分析技术，具有成本低、检测快速、通量高的优点。其原理是在DNA链部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异判断是否存在DNA突变。在脊髓性肌萎缩症检测中，DHLPC分型的原理是通过将扩增产物洗脱峰形及峰高(面积)比例与参照样本比对，进而推测样本SMN基因的实际拷贝数。实践应用中，DHLPC的分辨力常受到实验设计、检测环境等诸多因素的影响，存在检测可靠性和稳定性欠佳的问题。因而该技术在SMA携带者中一般仅用于初级筛查，诊断结果常需辅以其他方法进行验证。

实时荧光定量PCR技术：定量PCR方法分析SMN基因拷贝数，目前已衍生出多种SMA携带者的检测方法，如SYBR Green I染料法。Feldkotter M等将一个SMN1∶SMN2＝2∶0的参照样本梯度稀释，模拟不同SMN1拷贝数的标准品，并通过未知样本与标准品荧光Cp值的拟合判断样本的实际拷贝数；Solovivo OO等则通过引入ALB内参基因，并依照相对定量算法2-△△Ct(Livak method)计算样本的SMN1基因拷贝数。荧光染料实时定量PCR法的应用大幅度提升了检测的易操作性，为大规模携带者的筛查提供了可能。但是SYBR Green I等荧光染料本身无序列特异性，无法区分扩增产物与引物二聚体及非特异产物产生的荧光信号差异。目标基因与内参基因的扩增效率差异是否稳定符合2-△△Ct相对定量算法的数学基础也是有待验证，因而该方法在携带者检测中的可靠性尚值得商榷。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒及检测方法，以提高检测的灵敏度、结果的的准确性、检测的效率，从而降低成本。

为实现上述目的，本发明提出如下技术方案：一种人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，包括：SMN1主反应液、SMN2主反应液、酶混合液、0拷贝质控、SMN1单拷贝质控、SMN1两拷贝质控、SMN2单拷贝质控和SMN2两拷贝质控；所述SMN1主反应液中包括用于扩增人运动神经元存活基因SMN1基因的检测引物和用于检测人运动神经元存活基因SMN1的内参引物；

所述SMN1基因的检测引物的序列为：

正向引物：TCCTTACAGGGTTTCAGAC(SMN1-FP)，

反向引物：AACCTTTCAACTTTTTAACAT(SMN1-RP)；

所述SMN1基因的内参引物序列为：

正向引物：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT(CFTR-FP)，

反向引物：CTCTATTTTAGACATCAAAA(CFTR-RP)；

所述SMN2主反应液中包括用于扩增人运动神经元存活基因SMN2基因的检测引物和用于检测人运动神经元存活基因SMN2的内参引物；

所述SMN2基因的检测引物序列为：

正向引物：TCCTTACAGGGTTTTAGAC(SMN2-FP)，

反向引物：AACCTTTCAACTTTTTAACAT(SMN2-RP)；

所述SMN2基因的内参引物序列为：

正向引物：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT(CFTR-FP)，

反向引物：CTCTATTTTAGACATCAAAA(CFTR-RP)。

优选地，所述SMN1主反应液包括40m～60m MTris，1mM～3mM MgCl2，400mg～600mg/LBSA，dNTPs，450nM～550nM SMN1-FP，450nM～550nM SMN1-RP，450nM～550nM CFTR-FP，450nM～550nM CFTR-RP，50×Syto9和超纯水。

优选地，所述SMN1主反应液包括50mM Tris，2mM MgCl2，500mg/L BSA，dNTPs，500nM SMN1-FP，500nM SMN1-RP，500nM CFTR-FP，500nM CFTR-RP，50×Syto 9和超纯水。

优选地，所述SMN2主反应液包括40m～60m MTris，1mM～3mM MgCl2，400mg～600mg/LBSA，dNTPs，450nM～550nM SMN2-FP，450nM～550nM SMN2-RP，450nM～550nM CFTR-FP，450nM～550nM CFTR-RP，50×Syto 9和超纯水。

优选地，所述SMN2主反应液包括50mMTris，2mMMgCl2，500mg/LBSA，dNTPs，500nMSMN2-FP，500nMSMN2-RP，500nMCFTR-FP，500nMCFTR-RP，50×Syto 9和超纯水。

优选地，所述酶混合液包括1U/Test DNA聚合酶和1U/Test Anti-taq抗体。

优选地，所述0拷贝质控为含有CFTR基因序列的质粒；所述SMN1单拷贝质控和所述SMN1两拷贝质控为含有SMN1基因序列的质粒与含CFTR基因序列的质粒混合液；所述SMN2单拷贝质控和所述SMN2两拷贝质控含有SMN2基因序列的质粒与含CFTR基因序列的质粒混合液。

本发明的人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

1)待测样品的处理，取人外周血本样并提取血液中的DNA，测定DNA浓度与纯度；

2)试剂配制，SMN1 PCR反应混合液的配制和SMN2PCR反应混合液的配制，所述SMN1PCR反应混合液为17.75μl所述SMN1主反应液与0.25μl所述酶混合液的混合液；所述SMN2 PCR反应混合液为17.75μl所述SMN2主反应液与0.25μl所述酶混合液的混合液；充分混匀后按照需要检测样本的数量配置使用量，分别按18μl量分装到PCR反应管中。

3)添加样品，向装有所述SMN1反应混合液的PCR反应管中分别加入2μl的所述0拷贝质控，SMN1单拷贝质控，SMN1两拷贝质控和样本DNA提取液，向装有所述SMN2反应混合液的PCR反应管中加入2μl的所述0拷贝质控，SMN1单拷贝质控，SMN1两拷贝质控和样本DNA提取液，使每一只所述PCR反应管中的总体积为20μl，并盖紧PCR反应管，瞬时低速离心。

4)PCR扩增及荧光检测，各反应管按一定顺序放入荧光定量PCR仪上，设置相应的反应程序，将荧光检测通道选择SYBR Green I检测通道；

5)PCR扩增完成后，利用配套的数据分析软件将SMN1/SMN2基因的熔解曲线数据进行归一化处理，计算出F值与△F值，进而对检测结果进行判读。

优选地，其特征在于，步骤1中的所述DNA浓度大于等于5ng/μl，OD260nm/OD280nm＝1.7～2.0。

优选地，步骤2中的SMN1主反应液、SMN2主反应液和酶混合液取出后需要在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm快速离心10sec。

本发明的有益效果是：

1.本发明技术方案中的检测人运动神经元存活基因(SMN1/SMN2)检测试剂盒，其检测特异性与灵敏度非常高，检测结果采用配套的分析软件，判读简单，更加适合临床检测；

2.在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，有效提高了检测效率与检测通量。

附图说明

图1是本发明的SMN1和SMN2的检测结果曲线示意图；

图2是本发明分析软件对SMN1/SMN2基因的熔解曲线数据归一化熔解峰值曲线处理过程流程示意图；

图3是本发明分析软件对非空白对照归一化熔解曲线数值计算负导数得到的熔解峰值曲线示意图；

图4是本发明分析软件中把有两个峰的根据指定的峰作为参考峰的曲线示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。

本发明所揭示的人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，采用PCR熔解曲线的方法检测人的运动神经元存活基因SMN1和SMN2的基因拷贝数，包括SMN1主反应液、SMN2主反应液、酶混合液、0拷贝质控、SMN1单拷贝质控、SMN1两拷贝质控、SMN2单拷贝质控和SMN2两拷贝质控。其中SMN1主反应液主要组成为(40-60)mMTris，(1-3)mMMgCl2，(400-600)mg/LBSA，dNTPs，(450-550)nMSMN1-FP，(450-550)nMSMN1-RP，(450-550)nM CFTR-FP，(450-550)nM CFTR-RP，50×Syto 9和超纯水；

上述SMN1主反应液中包含的引物序列如下：

用于扩增人运动神经元存活基因SMN1基因的检测引物，序列如下所不：

正向引物：SMN1-FP：TCCTTACAGGGTTTCAGAC，

反向引物：SMN1-RP：AACCTTTCAACTTTTTAACAT；

用于检测人运动神经元存活基因SMN1的内参引物，序列如下所示：

正向引物：CFTR-FP：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT，

反向引物：CFTR-RP：CTCTATTTTAGACATCAAAA；

SMN2主反应液主要组成为(40～60)mMTris，(1～3)mMMgCl2，(400-600)mg/LBSA，dNTPs，(450-550)nMSMN2-FP，(450-550)nMSMN2-RP，(450-550)nMCFTR-FP，(450-550)nMCFTR-RP，50×Syto 9和超纯水；

上述SMN2主反应液中包含的引物序列如下：

用于扩增人运动神经元存活基因SMN2基因的检测引物，序列如下所示：

正向引物：SMN2-FP：TCCTTACAGGGTTTTAGAC，

反向引物：SMN2-RP：AACCTTTCAACTTTTTAACAT；

用于检测人运动神经元存活基因SMN2的内参引物，序列如下所示：

正向引物：CFTR-FP：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT，

反向引物：CFTR-RP：CTCTATTTTAGACATCAAAA。

所述酶混合液主要组成为1U/Test DNA聚合酶、1U/Test Anti-taq抗体；0拷贝质控为含CFTR基因序列的质粒；SMN1单拷贝质控为含SMN1基因序列的质粒与含CFTR基因序列的质粒混合液；SMN1两拷贝质控为含SMN1基因序列的质粒与含CFTR基因序列的质粒混合液；SMN2单拷贝质控为含SMN2基因序列的质粒与含CFTR基因序列的质粒混合液；SMN2两拷贝质控为含SMN2基因序列的质粒与含CFTR基因序列的质粒混合液。

本发明的运动神经元存活基因(SMN1/SMN2)检测试剂盒，检测方法包括：待测样品的处理，取人外周血本样并提取血液中的DNA，测定DNA浓度与纯度；SMN1 PCR反应混合液的配制和SMN2PCR反应混合液的配制，并分装到PCR反应管中；向装有所述SMN1 PCR反应混合液的PCR反应管中分别加入2μl 0拷贝质控，SMN1单拷贝质控，SMN1两拷贝质控和样本DNA提取液；向装有所述SMN2PCR反应混合液的PCR反应管中分别加入2μl 0拷贝质控，SMN2单拷贝质控，SMN2两拷贝质控和样本DNA提取液；然后将各PCR反应管按照一定顺序放入荧光定量PCR仪上进行PCR扩增及荧光检测，检测的结果进行数据分析和检测结果的判读。

本发明具体的一个实施例，以人体外周样本为例，取血液中从血液样本中获DNA，推荐使用商业化的试剂盒提取外周血基因组DNA；测定DNA浓度与纯度，要求浓度大于等于5ng/μl，OD260nm/OD280nm＝1.7～2.0。取出SMN1主反应液、SMN2主反应液和酶混合液，其中SMN1主反应液包括50mM Tris，2mM MgCl2，500mg/L BSA，dNTPs，500nM SMN1-FP，500nMSMN1-RP，500nM CFTR-FP，500nM CFTR-RP，50×Syto 9和超纯水；SMN2主反应液包括50mMTris，2mMMgCl2，500mg/LBSA，dNTPs，500nMSMN2-FP，500nMSMN2-RP，500nMCFTR-FP，500nMCFTR-RP，50×Syto 9和超纯水。在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm快速离心10sec。计算需准备反应试剂人份数[n＝样本数+3(质控品数)]；将17.75μl SMN1主反应液和0.25μl酶混合液配制成SMN1 PCR反应混合液，将17.75μl SMN2主反应液和0.25μl酶混合液配制成SMN2 PCR反应混合液；按照这种体积比计算所需试剂的使用量，并在分别配制SMN1与SMN2 PCR反应混合液，加入一适当体积的离心管中，充分混匀后，分别按18μl量分装到PCR反应管中。向SMN1 PCR反应混合液中分别加入2μl的0拷贝质控、SMN1单拷贝质控、SMN1两拷贝质控、样本DNA提取液，终体积为20μl/管，盖紧反应管，瞬时低速离心，进行PCR扩增；同时，向SMN2 PCR反应混合液中分别加入2μl的0拷贝质控、SMN2单拷贝质控、SMN2两拷贝质控、样本DNA提取液，终体积为20μl/管，盖紧反应管，瞬时低速离心，进行PCR扩增。将各反应管按一定顺序放入荧光定量PCR仪上，荧光检测通道选择SYBR Green I检测通道，设置反应程序：

PCR扩增完成后，将数据导出，将原始数据导入配套分析软件，在样本设置中将SMN1两拷贝质控对应孔位设置为Std，0拷贝质控、SMN1单拷贝质控及SMN1检测样本孔位设置为Unk，点击确定；同时，在样本设置中将SMN2两拷贝质控对应孔位设置为Std，0拷贝质控、SMN2单拷贝质控及SMN2检测样本孔位设置为Unk，点击确定；点击参数设置，参考峰方向为右边锋，针对不同目标检测基因，目标基因选择SYBR-SMN1/SYBR-SMN2，阴阳性阈值选择为默认值，归一化区域起始区域为68.00～69.00℃，终止区域为80.00～81.00℃，点击确定，在结果界面读取归一化熔解峰值曲线及数据。其中配套分析软件工作原理为，将SMN1/SMN2基因的熔解曲线数据进行处理，计算出归一化熔解峰值曲线，F值与△F值。整个处理过程，如图2所示。该处理实施过程包括测定熔解曲线是否为非空白对照对应的熔解曲线，其方式为判断熔解曲线下降的幅值大于所有熔解曲线的最大下降幅值的20％；该处理实施过程还包括归一化熔解曲线，其方式为非空白对照的熔解曲线去除根据统计或指定的归一化起始区域与终止区域计算的背景曲线，空白对照的归一化熔解曲线为0值直线；该处理实施过程进一步包括归一化熔解峰值曲线以及计算F值与△F值，其方式为，把空白对照对应的归一化熔解峰曲线设定为0值直线，F值与△F值为空；对非空白对照的归一化熔解曲线数值计算负导数，得到熔解峰值曲线，在熔解峰值曲线上搜索一到两个峰，只有一个峰的作为参考峰1，没有目标峰，如图3所示，把有两个峰的根据指定的峰作为参考峰2(SMN1/SMN2基因把温度高对应的峰作为参考峰2如图4所示)，另外一个为目标峰3，把所有参考峰统计成相同的峰，再根据这个相同的峰，把熔解峰值曲线经过平移与放缩，成为归一化熔解峰值曲线，原来搜索的峰也经过相同的平移与放缩，成为归一化熔解峰值曲线的目标峰3与参考峰2，每条熔解曲线对应的F值，为其对应归一化熔解峰值曲线的目标峰3高除以参考峰2高，每条熔解曲线对应的△F，为设定的SMN1/SMN2两拷贝质控的F值减去测试样本的F值。

若SMN1的F值为0，则表示该样本的SMN1基因缺失；若SMN2的F值为0，则表示该样本的SMN2基因缺失；

其他样本分别以SMN1两拷贝质控、SMN2两拷贝质控作为标准品，检测结果判定如下：

SMN1和SMN2的检测结果图1所示，其中4为0拷贝曲线，5为单拷贝曲线，6为两拷贝曲线，7为大于两拷贝的曲线。

本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。

TCCTTACAGGGTTTCAGAC；

AACCTTTCAACTTTTTAACAT；

TTACTAGTTATGTGACCTTAGT；

CTCTATTTTAGACATCAAAA；

TCCTTACAGGGTTTTAGAC；

AACCTTTCAACTTTTTAACAT；

TTACTAGTTATGTGACCTTAGT；

CTCTATTTTAGACATCAAAA。

Claims

1.一种人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，其特征在于，包括：SMN1主反应液，SMN2主反应液，酶混合液，0拷贝质控，SMN1单拷贝质控，SMN1两拷贝质控，SMN2单拷贝质控和SMN2两拷贝质控；

所述SMN1主反应液中包括用于扩增人运动神经元存活基因SMN1基因的检测引物和用于检测人运动神经元存活基因SMN1的内参引物；

所述SMN1基因的检测引物的序列为：

正向引物：TCCTTACAGGGTTTCAGAC，

反向引物：AACCTTTCAACTTTTTAACAT；

所述SMN1基因的内参引物序列为：

正向引物：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT，

反向引物：CTCTATTTTAGACATCAAAA；

所述SMN2基因的检测引物序列为：

正向引物：TCCTTACAGGGTTTTAGAC，

反向引物：AACCTTTCAACTTTTTAACAT；

所述SMN2基因的内参引物序列为：

正向引物：TTACTAGTTATGTGACCTTAGT，

反向引物：CTCTATTTTAGACATCAAAA。

2.根据权利要求1所述的人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，其特征在于，所述SMN1主反应液包括40m～60m MTris，1mM～3mM MgCl2，400mg～600mg/LBSA，dNTPs，450nM～550nM SMN1-FP，450nM～550nM SMN1-RP，450nM～550nM CFTR-FP，450nM～550nMCFTR-RP，50×Syto 9和超纯水。

3.根据权利要求2所述的人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，其特征在于，所述SMN1主反应液包括50mM Tris，2mM MgCl2，500mg/L BSA，dNTPs，500nM SMN1-FP，500nMSMN1-RP，500nM CFTR-FP，500nM CFTR-RP，50×Syto 9和超纯水。

4.根据权利要求1所述的人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，其特征在于，所述SMN2主反应液包括40m～60m MTris，1mM～3mM MgCl2，400mg～600mg/LBSA，dNTPs，450nM～550nM SMN2-FP，450nM～550nM SMN2-RP，450nM～550nM CFTR-FP，450nM～550nMCFTR-RP，50×Syto 9和超纯水。

5.根据权利要求4所述的人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，其特征在于，所述SMN2主反应液包括50mMTris，2mMMgCl2，500mg/LBSA，dNTPs，500nMSMN2-FP，500nMSMN2-RP，500nMCFTR-FP，500nMCFTR-RP，50×Syto 9和超纯水。

6.根据权利要求1所述的人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括1U/TestDNA聚合酶和1U/TestAnti-taq抗体。

7.根据权利要求1所述的人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒，其特征在于，所述0拷贝质控为含有CFTR基因序列的质粒；所述SMN1单拷贝质控和所述SMN1两拷贝质控为含有SMN1基因序列的质粒与含CFTR基因序列的质粒混合液；所述SMN2单拷贝质控和所述SMN2两拷贝质控含有SMN2基因序列的质粒与含CFTR基因序列的质粒混合液。

8.基于权利要求1所述的人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)试剂配制，SMN1 PCR反应混合液的配制和SMN2PCR反应混合液的配制，所述SMN1 PCR反应混合液为17.75μl所述SMN1主反应液与0.25μl所述酶混合液的混合液；所述SMN2PCR反应混合液为17.75μl所述SMN2主反应液与0.25μl所述酶混合液的混合液；充分混匀后按照需要检测样本的数量配置使用量，分别按18μl量分装到PCR反应管中。

3)添加样品，向装有所述SMN1反应混合液的PCR反应管中分别加入2μ1的所述0拷贝质控，SMN1单拷贝质控，SMN1两拷贝质控和样本DNA提取液，向装有所述SMN2反应混合液的PCR反应管中加入2μl的所述0拷贝质控，SMN1单拷贝质控，SMN1两拷贝质控和样本DNA提取液，使每孔所述PCR反应管中的总体积为20μl，并盖紧PCR反应管，瞬时低速离心。

4)PCR扩增及荧光检测，各反应管按一定顺序放入荧光定量PCR仪上，设置相应的反应程序，其中荧光检测通道选择SYBR Green I检测通道；

9.根据权利要求8所述的人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤1中的所述DNA浓度大于等于5ng/μl，OD260nm/OD280nm＝1.7～2.0。

10.根据权利要求8所述的人运动神经元存活基因SMN1和SMN2检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤2中的SMN1主反应液、SMN2主反应液和酶混合液取出后需要在室温下融化并振荡混匀后，2000rpm快速离心10sec。