CN109554459A - 一种检测人运动神经元存活基因拷贝数的相对定量试剂盒 - Google Patents

一种检测人运动神经元存活基因拷贝数的相对定量试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种用于检测人运动神经元存活基因拷贝数的试剂盒。本发明提供种多重荧光PCR法检测人运动神经元存活基因的拷贝数，分别设计SMN1基因第7及第8外显子、SMN2基因第7及第8外显子、SMN基因第6外显子和内参基因CFTR的特异性引物和探针。本发明的设计巧妙，可通过3个独立PCR反应分别对SMN1基因第7及第8外显子、SMN2基因第7及第8外显子、SMN基因第6外显子进行拷贝数的相对定量。本发明操作简便、特异性强、灵敏度佳，SMN基因第6外显子拷贝数结果，可提升结果的准确性，更适合用于临床脊髓性肌萎缩症患者的分型及携带者的筛查。

Description

一种检测人运动神经元存活基因拷贝数的相对定量试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种用于检测人运动神经元存活基因拷贝数的试剂盒。
背景技术
脊髓性肌萎缩症（Spinal Muscular Atrophy, SMA），为一种常见的常染色体隐性遗传疾病，因位于第五号染色体（5q13）的人运动神经元存活基因1（Survival of MotorNeuron 1, SMN1）产生大片段缺失、转换或点突变等，其中95%以上为第7号外显子和/或第8号外显子大片段缺失；导致渐进性退化、对称性肌肉无力、萎缩等病征。新生儿发病率为1/6,000~1/10,000，在正常人群中携带率为1/40~1/60。根据临床症状与发病年龄可将SMA分为四型，其中I~III型称为儿童型SMA：SMA I型为最严重的亚型，患者在出生后6个月内发病，一般生存期在2岁以内；SMA II型为中度型，患者通常在6~18个月内发病，其生存期仰赖于外来健康支援照护，可存活至成年；SMA III型为轻度型，患者由出生后18个月至成年都有可能发病，其病情进展较为缓慢，最终仍死于呼吸肌麻痹，SMA IV型为成人型，30岁后发病，症状轻微，生存期正常。该病居致死性常染色体隐性遗传病的第二名，目前尚无治疗手段。
目前的研究已确立SMA的致病决定基因为SMN1基因缺陷，其中SMN2基因拷贝数与SMA表型的轻重直接相关。透过SMN基因拷贝数的相对定量检测，应用于产前筛查可有效预防出生缺陷，降低社会照护成本；抑或是对患者分型诊断皆具有临床评价意义。
现有的SMA致病基因诊断技术包含：聚合酶链反应─单链构象多态性(PCR-SSCP)、聚合酶链反应─限制酶片段长度多态性(PCR-RFLP)、变性高效液相分析(DHPLC)、高分辨熔解曲线(HRM)、多重连接探针扩增(MLPA)、实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)等技术。然而，PCR-RFLP仅适用于检测SMN1基因的纯合缺失，无法辨识出SMN1基因杂合缺失的SMA致病基因携带者的正常人；无论是DHPLC与MLPA均需在PCR反应结束后，开管对PCR产物进行后续处理分析，在操作过程中容易造成环境污染。
目前临床上SMA的常规检测多使用荷兰MRC公司生产的多重连接探针扩增(Multiple Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA)检测试剂盒，该试剂盒使用多组参考探针对SMN基因拷贝数进行半定量检测，然而MLPA所需的设备门槛与试剂成本高。因此本发明于多重荧光PCR的技术上，除了检测SMN1基因、SMN2基因第7及第8外显子的拷贝数外，增加SMN基因第6外显子拷贝数的相对定量以复核SMN1基因与SMN2基因的拷贝数结果，在提高操作便利性的同时也增加整体检测结果的准确度。
随着我国出生缺陷防控政策的相继执行，SMA致病机制与分子机制也已明朗，因此开发准确可靠、便利经济，同时能实现标准化、规模化的检测试剂盒，进行SMN1基因、SMN2基因状态的识别，对SMA的防治与筛查及患者的分型诊断为首当之务。
发明内容
本发明的目的针对现有技术的不便与不足，提供一种多重实时荧光PCR法检测人运动神经元存活基因拷贝数的相对定量试剂盒及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明在一个试剂盒内包含SMN1基因与SMN2基因的第7及第8外显子检测，搭配SMN基因第6号外显子检测，采用相对定量检测设计，通过3个独立PCR反应分别对SMN1基因第7及第8外显子(第一反应液)、SMN2基因第7及第8外显子(第二反应液)、SMN基因第6外显子(第三反应液)进行扩增。第一反应液、第二反应液皆含3个荧光通道，能够分别检测出SMN1基因的第7及第8外显子的拷贝数与SMN2基因的的第7及第8外显子的拷贝数；第三反应液含2个荧光通道可检测SMN基因的总拷贝数，能够复验第一反应液、第二反应液的结果。所述试剂盒包括如下：
1、第一反应液为针对SMN1基因的第7外显子、第8外显子拷贝数的相对定量检测；
包含SMN1基因第7外显子特异性上游引物Ex7-1F(为SEQ ID No.4所示寡核苷酸序列)、第7外显子公用下游引物Ex7-R(为SEQ ID No.5所示寡核苷酸序列) 与探针Ex7-D(为SEQID No.6所示寡核苷酸序列)、SMN2基因第7外显子封闭引物Ex7-2B(为SEQ ID No.7所示寡核苷酸序列)、SMN1基因第8外显子特异性上游引物Ex8-1F(为SEQ ID No.8所示寡核苷酸序列) 、第8外显子公用下游引物Ex8-R(为SEQ No.9所示寡核苷酸序列)与探针Ex8-D(为SEQID No.10所示寡核苷酸序列)、SMN2基因第8外显子封闭引物Ex8-2B(为SEQ ID No.11所示寡核苷酸序列)、内参照CFTR上游引物P1(为SEQ ID No.1所示寡核苷酸序列)、下游引物P2(为SEQ ID No.2所示寡核苷酸序列)及探针P3(为SEQ ID No.3所示寡核苷酸序列)；
2、第二反应液为针对SMN2基因的第7外显子、第8外显子拷贝数的相对定量检测；
包含SMN2基因第7外显子特异性上游引物Ex7-2F(为SEQ ID No.12所示寡核苷酸序列)、第7外显子公用下游引物Ex7-R(为SEQ ID No.5所示寡核苷酸序列)与探针Ex7-D(为SEQID No.6所示寡核苷酸序列)、SMN1基因第7外显子封闭引物Ex7-1B(为SEQ ID No.13所示寡核苷酸序列)、SMN2基因第8外显子特异性上游Ex8-2F(为SEQ ID No.14所示寡核苷酸序列)引物、第8外显子公用下游引物Ex8-R(为SEQ ID No.9所示寡核苷酸序列)与探针Ex8-D(为SEQ ID No.10所示寡核苷酸序列)、SMN1基因第8外显子封闭引物Ex8-1B(为SEQ ID No.15所示寡核苷酸序列)、内参照CFTR上游引物P1(为SEQ ID No.1所示寡核苷酸序列)、下游引物P2(为SEQ ID No.2所示寡核苷酸序列)及探针P3(为SEQ ID No.3所示寡核苷酸序列)；
3、第三反应液为针对SMN基因的第6外显子拷贝数的相对定量检测；
包含：SMN基因第6外显子保留区域之上游引物Ex6-F(为SEQ ID No.16所示寡核苷酸序列)、下游引物Ex6-R(为SEQ ID No.17所示寡核苷酸序列)及探针Ex6-D(为SEQ ID No.18所示寡核苷酸序列)、内参照CFTR上游引物P1(为SEQ ID No.1所示寡核苷酸序列)、下游引物P2(为SEQ ID No.2所示寡核苷酸序列)及探针P3(为SEQ ID No.3所示寡核苷酸序列)；
酶混合液包含热启动Taq酶及UNG酶；
第一对照包含特异性质粒(为SEQ ID No.19所示核苷酸序列)及TE水；
第二对照包含特异性质粒(为SEQ ID No.20所示核苷酸序列)及TE水；
第三对照包含特异性质粒(为SEQ ID No.21所示核苷酸序列)及TE水；及
第四对照包含TE水。
引物探针序列：
第一对照、第二对照、第三对照序列：
试剂组分配方：
第一反应液配方：50~100mM KCl、10~20mM Tris-HCl、1.0~2.0mM MgCl2、100~300nmol/L dATP、100~300nmol/L dCTP、100~300nmol/L dGTP、300~600nmol/L dUTP，SMN1基因第7外显子特异性上游引物Ex7-1F100~300nmol/L，第7外显子公用下游引物Ex7-R100~300nmol/L，第7外显子公用探针Ex7-D150~250nM，SMN2基因第7外显子封闭引物Ex7-2B200~400nmol/L，SMN1基因第8外显子特异性上游引物Ex8-1F为500~700nmol/L，第8外显子公用下游引物Ex8-R500~700nmol/L，第8外显子公用探针Ex8-D 200~300nM，SMN2基因第8外显子封闭引物Ex8-2B 300~600nmol/L，内参照CFTR上游引物P1100~300nmol/L，内参照CFTR下游引物P2100~300nmol/L，内参照CFTR探针P3 100~200nM。
第二反应液配方：50~100mM KCl、10~20mM Tris-HCl、1.0~2.0mM MgCl2、100~300nmol/L dATP、100~300nmol/L dCTP、100~300nmol/L dGTP、300~600nmol/L dUTP，SMN2基因第7外显子特异性上游引物Ex7-2F100~300nmol/L，第7外显子公用下游引物Ex7-R100~300nmol/L，第7外显子公用探针Ex7-D150~250nM，SMN1基因第7外显子封闭引物Ex7-1B 200~400nmol/L，SMN2基因第8外显子特异性上游引物Ex8-2F为500~700nmol/L，第8外显子公用下游引物Ex8-R 500~700nmol/L，第8外显子公用探针Ex8-1B200~300nM，SMN1基因第8外显子封闭引物 300~600nmol/L，内参照CFTR上游引物P1 100~300nmol/L，内参照CFTR下游引物P2 100~300nmol/L，内参照CFTR探针P3100~200nM。
第三反应液配方：50~100mM KCl、10~20mM Tris-HCl、1.0~2.0mM MgCl2、100~300nmol/L dATP、100~300nmol/L dCTP、100~300nmol/L dGTP、300~600nmol/L dUTP，SMN基因第6外显子保留区域之上游引物Ex6-F100~300nmol/L，SMN基因第6外显子下游引物Ex6-R100~300nmol/L，SMN基因第6外显子探针Ex6-D 200~300nM，内参照CFTR上游引物P1 100~300nmol/L，内参照CFTR下游引物P2 100~300nmol/L，内参照CFTR探针P3 100~200nM。
酶混合液配方：热启动酶1U/µL，UNG酶1U/µL，以3:2的比例配制而成的酶混合液。
第一对照中的特异性质粒为SMN1基因第7外显子、SMN1基因第8外显子与内参照CFTR基因的人工合成DNA序列，其拷贝数比为1:1:2；对照溶液质粒终浓度为0.02pg/µL；
第二对照中的特异性质粒为SMN2基因第7外显子、SMN2基因第8外显子与内参照CFTR基因的人工合成DNA序列，其拷贝数比为1:1:2；对照溶液质粒终浓度为0.02pg/µL；
第三对照的特异性质粒为SMN基因第6与内参照CFTR基因的人工合成DNA序列，其拷贝数比为1:2。对照溶液质粒终浓度为0.02pg/µL；
第四对照包含TE水。
本发明中，在检测SMN1基因第7外显子时，为减少SMN2基因第7外显子对SMN1基因第7外显子的影响，使用扩增阻抗设计与SMN2基因完全相配的封闭性引物Ex7-2B，该引物相对于SMN1第7外显子优先结合SMN2第7外显子，但3’端经磷酸化修饰而无法扩增。依据SMN1基因第7外显子检测的设计策略；对SMN1基因第8外显子检测引入封闭性引物Ex8-2B，对SMN2基因第7外显子检测引入封闭性引物Ex7-1B，对SMN2基因第8外显子检测引入封闭性引物Ex8-1B。
检测时的具体操作方法如下，
提取人细胞基因组DNA，用微量紫外分光亮度计测定核酸浓度并调整至2~16ng/µL。
对照品准备：将第一对照、第二对照、第三对照分别依序稀释1(S1):5(S2):25(S3)三个浓度备用，第四对照不需稀释，做为阴性对照使用。
多重PCR反应体系配制，总反应体积24µL，如下表：
样本检测：将对照品相应的三个浓度样本与第四对照、待测gDNA样本依序加入反应孔位，加样体积均为5µL。
PCR反应程序：37℃ 10分、95℃ 10分；进入以下循环：95℃ 15秒、65℃ 45秒（信号收集），共40循环。
反应所使用仪器为Roche Cycler480 II，每一循环实时采集Cy5、FAM、HEX荧光信号；各个反应下，每个荧光代表的基因目标，如下表所示：
结果分析：采用∆Cp值法相对定量方式，3个PCR反应的通用要求，
(i)相应的对照品（第一对照、第二对照、第三对照）的1(S1):5(S2):25(S3)三个浓度下，其最小浓度样本（S3）Cy5荧光通道Cp值≦30，FAM及HEX荧光通道Cp值≦31；
(ii)各目标基因与内标基因的线性指标Error value应小于0.2；
(iii) 第四对照（阴性对照）其Cy5、FAM及HEX荧光通道皆无信号。
根据检测所得的Cp值，以相应的对照样本三个浓度∆Cp的平均值，进行拷贝数的相对定量，按照下述公式进行计算：
对照样本(S1)的目标基因(FAM/HEX) ∆Cp_对照样本S1= Cp_目标基因S1– Cp_内参照基因S1；
对照样本(S2)的目标基因(FAM/HEX) ∆Cp_对照样本S2= Cp_目标基因S2– Cp_内参照基因S2；
对照样本(S3)的目标基因(FAM/HEX) ∆Cp_对照样本S3= Cp_目标基因S3– Cp_内参照基因S3；
对照样本的目标基因(FAM/HEX)的平均值∆Cp_对照样本平均值={∆Cp_对照样本S1+∆Cp_对照样本S2+∆Cp_对照样本S3}/3；
待测样本的目标基因(FAM/HEX) ∆Cp_待测样本= Cp_目标基因– Cp_内参照基因。
其次，以对照样本的平均值∆Cp_对照样本平均值为基准与待测样本的∆Cp值进行校准；
待测样本的目标基因(FAM/HEX) ∆∆Cp= ∆Cp_待测样本–∆Cp_对照样本平均值；
最后，计算表达水平比率：2-∆∆Cp=表达量的比值=待测样本目标基因相对拷贝数Cs。
以SMN1基因第7和第8外显子、SMN2基因第7和第8外显子、SMN基因第6外显子均为1拷贝数作为对照样本，结果判定于下表：
本发明的优点在于：
1、本发明开展3个多重PCR反应，除了SMN1基因及SMN2基因外，另针对SMN基因第6外显子设计特异性引物与探针，用以对SMN基因的总拷贝数做相对定量检测；于试剂盒内即可达到复核SMN1基因与SMN2基因的拷贝数结果的检测效果，能有效提高检测的准确性。
2、本发明能有效的节约样本量，仅需30ng即可得到SMN1基因与SMN2基因拷贝数的判定，无需后续实验操作，检测只需90分钟；操作简便、快速检测。
3、本发明结合扩增阻抗设计与核苷酸化学修饰手段，有效增加整体检测的特异性。在检测SMN1基因第7外显子时，为减少SMN2基因第7外显子对SMN1基因第7外显子的影响，使用扩增阻抗设计与SMN2基因完全相配的封闭性引物Ex7-2B，该引物相对于SMN1第7外显子优先结合SMN2第7外显子，但3’端经磷酸化修饰而无法扩增。依据SMN1基因第7外显子检测的设计策略；对SMN1基因第8外显子检测引入封闭性引物Ex8-2B，对SMN2基因第7外显子检测引入封闭性引物Ex7-1B，对SMN2基因第8外显子检测引入封闭性引物Ex8-1B。
发明的有益效果：1、为临床筛查，如产前、婚前检测提供快速的结果参考；2、一次检测结果可实现SMA携带者与正常人的区分，亦能实现SMA患者的分型、患病严重程度；3、检测快速、便利的相对定量SMN基因拷贝数且具有高通量、重复性佳、结果可靠、成本低廉等优点。
具体实施方式
为了更好理解本发明的内容，透过具体实施范例进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施范例。
实施例1
1、核酸提取：
临床诊断为SMA的患者20例，另外包含195例孕妇的全血样本。使用德必碁生物科技（厦门）有限公司生产的核酸提取试剂（备案号：闽厦械备20160080号）来提取EDTA抗凝管所采集的全血样本，提取后用微量紫外分光亮度计测定核酸纯度及浓度，其OD260/OD280应在1.6~2.0之间；用灭菌双蒸馏水稀释基因组DNA浓度至2ng/µL备用。
2、对照品序列稀释
将第一对照、第二对照、第三对照，分别取出10µL加入3个离心管中，再加入40µL 1×TE溶液，混匀后分别得到3种5倍稀释对照品；在3种5倍稀释对照品，分别取出10µL加入3个离心管中，再加入40µL 1× TE 溶液，混匀后分别得到3种25倍稀释对照品。第四对照不需稀释，直接取用。
3、多重PCR反应体系配制，总反应体积24µL，如下表：
样本检测：将对照品相应的三个浓度样本与第四对照、待测gDNA样本依序加入反应孔位，加样体积均为5µL。
4、PCR反应程序：37℃ 10分、95℃ 10分；进入以下循环：95℃ 15秒、65℃ 45秒（信号收集），共40循环。
反应所使用仪器为Roche Cycler480 II，每一循环实时采集Cy5、FAM、HEX荧光信号；各个反应下，每个荧光代表的基因目标，如下表所示：
5、结果分析：实验结果满足数据分析的通用要求，如下：
(i)相应的对照品（第一对照、第二对照、第三对照）的1(S1):5(S2):25(S3)三个浓度下，其最小浓度样本（S3）Cy5荧光通道Cp值≦30，FAM及HEX荧光通道Cp值≦31；
(ii)各目标基因与内标基因的线性指标Error value应小于0.2；
(iii) 第四对照（阴性对照）其Cy5、FAM及HEX荧光通道皆无信号。
SMN1基因第7与第8外显子、SMN2基因第7与第8外显子、SMN基因第6外显子拷贝数相对定量结果：20例SMA患者检测结果如表1、273例孕妇检测结果如表2：
表1、20例SMA患者检测结果
表2、273例孕妇检测结果
6、结果分析验证：同时应用荷兰MRC公司的P060 SMA probemix 100rxn检测试剂盒对检测与本试剂盒平行检测。20例SMA患者与273例孕妇检测结果与本试剂盒检测结果一致率100%。
实施例2
一、试剂特异性验证：临床常见病原体交叉反应
1、实验样本
采取13份特异性样本对试剂的特异性进行验证，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、EB病毒、人巨细胞病毒、人类疱疹病毒6A型、人类疱疹病毒6B型、人类微小病毒B19、水痘带状疱疹病毒B型、腺病毒2型、JC多瘤病毒、BK多瘤病毒。
2、实验过程
用第一反应液、第二反应液及第三反应液分别检测以上13份特异性样本，分析检测结果，验证试剂的特异性。
3、实验结果
三种反应液检测13份特异性样本皆为Undetermined，表明特异性好，无交叉反应的情况，具体结果见下表：
表3、三种反应液与临床常见病原体交叉反应结果（UD=Undetermined）
二、试剂特异性验证：第一反应液与同源基因─SMN2基因交叉反应验证
1、实验样本
采取20例临床样本，以MLPA法检测为SMA患者（SMN1基因第7、第8外显子的拷贝数为0）样本的SMN2基因拷贝数为2，5例，编号为1~5；SMA患者样本的SMN2基因拷贝数为3，10例，编号为6~15；SMA患者样本的SMN2基因拷贝数为4，5例，编号为16~20。
2、实验过程
用第一反应液检测上述20例临床样本，分析检测结果，验证试剂检测与上述样本有无影响SMN1基因拷贝数判断。
3、实验结果
第一反应液检测20例临床样本皆能准确判断SMN1基因第7、第8外显子拷贝数皆为0，表明特异性好，无交叉反应的情况，具体结果见下表：
表4、第一反应液与同源基因─SMN2基因交叉反应结果
三、试剂特异性验证：第二反应液与同源基因─SMN1基因交叉反应验证
1、实验样本
采取30例临床样本，以MLPA法检测为SMN2基因为0拷贝数的样本，SMN1基因拷贝数为2，10例，编号为1~10；SMN2基因拷贝数为3，10例，编号为11~20。
2、实验过程
用第一反应液检测上述20例临床样本，分析检测结果，验证试剂检测与上述样本有无影响SMN2基因拷贝数判断。
3、实验结果
第二反应液检测20例临床样本皆能准确判断SMN2第7、第8外显子拷贝数皆为0，表明特异性好，无交叉反应的情况，具体结果见下表：
表5、第二反应液与同源基因─SMN1基因交叉反应结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 德必碁生物科技(厦门)有限公司
<120> 一种检测人运动神经元存活基因拷贝数的相对定量试剂盒
<130> 21
<160> 21
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aagtcaccaa agcagtacag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaatgtgat gaaggccaaa 20
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttactgggaa gaatcatagc ttcctatgac 30
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctttattttc cttacagggt gtc 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaagtaagat tcactttcat 20
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gctggcagac ttactcctta atttaaggaa 30
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctttattttc cttacagggt gtt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aaaaaccatc tgtaaaagac cgg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
attaccaata attatccaat atcatt 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aatctaatcc acattcaaat tttctcaact 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aaaaaccatc tgtaaaagac cga 23
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctttattttc cttacagggt gtt 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctttattttc cttacagggt gtc 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aaaaaccatc tgtaaaagac cga 23
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
aaaaaccatc tgtaaaagac cgg 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
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tccagataat tcccccacca cct 23
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
agccactcat gtaccatgaa at 22
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
atatgtccag attctcttga tgatgctgat 30
<210> 19
<211> 1645
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ggatcctata aactcatttt aagtctcctc taaagatgaa aagtcttgtg ttgaaattct 60
cagggtattt tatgagaaat aaatgaaatt taatttctct gtttttcccc ttttgtagga 120
agtcaccaaa gcagtacagc ctctcttact gggaagaatc atagcttcct atgacccgga 180
taacaaggag gaacgctcta tcgcgattta tctaggcata ggcttatgcc ttctctttat 240
tgtgaggaca ctgctcctac acccagccat ttttggcctt catcacattg gaatgcagat 300
gagaatagct atgtttagtt tgatttataa gaaggtaata cttccttgca caggccccat 360
ggcacatata ttctgtatcg tacatgtttt aatgtcataa attaggtagt gagctggtac 420
aagtaaggga taaatgctga aaaatgtctt gtgaaacaaa atgcttttta acatccatat 480
aaagctatct atatatagct atctatgtct atatagctat tttttttaac ttcctttatt 540
ttccttacag ggtttcagac aaaatcaaaa agaaggaagg tgctcacatt ccttaaatta 600
aggagtaagt ctgccagcat tatgaaagtg aatcttactt ttgtaaaact ttatggtttg 660
tggaaaacaa atgtttttga acatttaaaa agttcagatg ttaaaaagtt gaaaggttaa 720
tgtaaaacaa tcaatattaa agaattttga tgccaaaact attagataaa aggttaatct 780
acatcctcga gtaactggcc tcatttcttc aaaatatcaa gtgttgggaa agaaaaaagg 840
aagtggaatg ggtaactctt cttgattaaa agttatgtaa taaccaaatg caatgtgaaa 900
tattttactg gactctattt tgaaaaacca tctgtaaaag actggggtgg gggtgggagg 960
ccagcacggt ggtgaggcag ttgagaaaat ttgaatgtgg attagatttt gaatgatatt 1020
ggataattat tggtaatttt atgagctgtg agaagggtgt tgtagtttat aaaagactgt 1080
cttaatttgc atacttaagc atttaggaat gaagtgttag agtgtcttaa aatgtttcaa 1140
atggtttaac aaaatgtatg tgaggcgtat gtggcaaaat gttacagaat ctaactggtg 1200
gacattataa actcatttta agtctcctct aaagatgaaa agtcttgtgt tgaaattctc 1260
agggtatttt atgagaaata aatgaaattt aatttctctg tttttcccct tttgtaggaa 1320
gtcaccaaag cagtacagcc tctcttactg ggaagaatca tagcttccta tgacccggat 1380
aacaaggagg aacgctctat cgcgatttat ctaggcatag gcttatgcct tctctttatt 1440
gtgaggacac tgctcctaca cccagccatt tttggccttc atcacattgg aatgcagatg 1500
agaatagcta tgtttagttt gatttataag aaggtaatac ttccttgcac aggccccatg 1560
gcacatatat tctgtatcgt acatgtttta atgtcataaa ttaggtagtg agctggtaca 1620
agtaagggat aaatgctgaa agctt 1645
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ggatcctata aactcatttt aagtctcctc taaagatgaa aagtcttgtg ttgaaattct 60
cagggtattt tatgagaaat aaatgaaatt taatttctct gtttttcccc ttttgtagga 120
agtcaccaaa gcagtacagc ctctcttact gggaagaatc atagcttcct atgacccgga 180
taacaaggag gaacgctcta tcgcgattta tctaggcata ggcttatgcc ttctctttat 240
tgtgaggaca ctgctcctac acccagccat ttttggcctt catcacattg gaatgcagat 300
gagaatagct atgtttagtt tgatttataa gaaggtaata cttccttgca caggccccat 360
ggcacatata ttctgtatcg tacatgtttt aatgtcataa attaggtagt gagctggtac 420
aagtaaggga taaatgctga aaaatgtctt gtgaaacaaa atgcttttta acatccatat 480
aaagctatct atatatagct atctatatct atatagctat tttttttaac ttcctttatt 540
ttccttacag ggttttagac aaaatcaaaa agaaggaagg tgctcacatt ccttaaatta 600
aggagtaagt ctgccagcat tatgaaagtg aatcttactt ttgtaaaact ttatggtttg 660
tggaaaacaa atgtttttga acatttaaaa agttcagatg ttagaaagtt gaaaggttaa 720
tgtaaaacaa tcaatattaa agaattttga tgccaaaact attagataaa aggttaatct 780
acatcctcga gtaactggcc tcatttcttc aaaatatcaa gtgttgggaa agaaaaaagg 840
aagtggaatg ggtaactctt cttgattaaa agttatgtaa taaccaaatg caatgtgaaa 900
tattttactg gactctattt tgaaaaacca tctgtaaaag actgaggtgg gggtgggagg 960
ccagcacggt ggtgaggcag ttgagaaaat ttgaatgtgg attagatttt gaatgatatt 1020
ggataattat tggtaatttt atgagctgtg agaagggtgt tgtagtttat aaaagactgt 1080
cttaatttgc atacttaagc atttaggaat gaagtgttag agtgtcttaa aatgtttcaa 1140
atggtttaac aaaatgtatg tgaggcgtat gtggcaaaat gttacagaat ctaactggtg 1200
gacattataa actcatttta agtctcctct aaagatgaaa agtcttgtgt tgaaattctc 1260
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ggatcctata aactcatttt aagtctcctc taaagatgaa aagtcttgtg ttgaaattct 60
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agtcaccaaa gcagtacagc ctctcttact gggaagaatc atagcttcct atgacccgga 180
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gtttactgga tataaacaat atctttttct gtctccagat aattccccca ccacctccca 720
tatgtccaga ttctcttgat gatgctgatg ctttgggaag tatgttaatt tcatggtaca 780
tgagtggcta tcatactggc tattatatgg taagtaatca ctcagcatct tttcctgaca 840
atttttttgt agttatgtga ctttgttttg taaatttata aaatactact tgcttctctc 900
tttatattac taaaaaataa aaataaaaaa atacaactgt ctgaggctta aattactctt 960
gcattgtccc taagtataat tttagttaat tttaaaaagc tttcatgcta ttgttagatt 1020
attttgatta tacacttttg aattgaaatt atacctcgag tataaactca ttttaagtct 1080
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tactgggaag aatcatagct tcctatgacc cggataacaa ggaggaacgc tctatcgcga 1260
tttatctagg cataggctta tgccttctct ttattgtgag gacactgctc ctacacccag 1320
ccatttttgg ccttcatcac attggaatgc agatgagaat agctatgttt agtttgattt 1380
ataagaaggt aatacttcct tgcacaggcc ccatggcaca tatattctgt atcgtacatg 1440
ttttaatgtc ataaattagg tagtgagctg gtacaagtaa gggataaatg ctgaaagctt 1500

Claims (8)

1.一种用于检测人运动神经元存活基因拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含: 用于在检测样本内测量SMN1基因第7外显子、SMN1基因第8外显子、SMN2基因第7外显子、SMN2基因第8外显子及SMN基因第6外显子的表达水平的试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包含:
第一反应液，包含：
SMN1基因第7外显子特异性上游引物Ex7-1F，序列如SEQ ID No.4所示；SMN基因第7外显子公用下游引物Ex7-R与探针Ex7-D，序列如SEQ ID No.5-6所示；SMN2基因第7外显子封闭引物Ex7-2B，序列如SEQ ID No.7所示； SMN1基因第8外显子特异性上游引物Ex8-1F，序列如SEQ ID No.8所示；SMN基因第8外显子公用下游引物Ex8-R与探针Ex8-D，序列如SEQ IDNo.9-10所示；SMN2基因第8外显子封闭引物Ex8-2B，序列如SEQ ID No.11所示；内参照CFTR上游引物P1、下游引物P2及探针P3，序列如SEQ ID No.1-3所示；及
第二反应液，包含：
SMN2基因第7外显子特异性上游引物Ex7-2F，序列如SEQ ID No.12所示；SMN基因第7外显子公用下游引物Ex7-R与探针Ex7-D，序列如SEQ ID No.5-6所示；SMN1基因第7外显子封闭引物Ex7-1B，序列如SEQ ID No.13所示；SMN2基因第8外显子特异性上游Ex8-2F引物，序列如SEQ ID No.14所示；SMN基因第8外显子公用下游引物Ex8-R与探针Ex8-D，序列如SEQID No.9-10所示；SMN1基因第8外显子封闭引物Ex8-1B，序列如SEQ ID No.15所示；内参照CFTR上游引物P1、下游引物P2及探针P3，序列如SEQ ID No.1-3所示；及
第三反应液，包含：
SMN基因第6外显子保留区域之上游引物Ex6-F，序列如SEQ ID No.16所示；下游引物Ex6-R及探针Ex6-D，序列如SEQ ID No.17-18所示；内参照CFTR上游引物P1、下游引物P2及探针P3，序列如SEQ ID No.1-3所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：第一反应液包含以下：50~100mM KCl、10~20mM Tris-HCl、1.0~2.0mM MgCl2、100~300nmol/L dATP、100~300nmol/L dCTP、100~300nmol/L dGTP、300~600nmol/L dUTP，SMN1基因第7外显子特异性上游引物Ex7-1F100~300nmol/L，第7外显子公用下游引物Ex7-R100~300nmol/L，第7外显子公用探针Ex7-D150~250nM，SMN2基因第7外显子封闭引物Ex7-2B200~400nmol/L，SMN1基因第8外显子特异性上游引物Ex8-1F为500~700nmol/L，第8外显子公用下游引物Ex8-R500~700nmol/L，第8外显子公用探针Ex8-D 200~300nM，SMN2基因第8外显子封闭引物Ex8-2B 300~600nmol/L，内参照CFTR上游引物P1100~300nmol/L，内参照CFTR下游引物P2100~300nmol/L，内参照CFTR探针P3 100~200nM。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：第二反应液包含以下：50~100mM KCl、10~20mM Tris-HCl、1.0~2.0mM MgCl2、100~300nmol/L dATP、100~300nmol/L dCTP、100~300nmol/L dGTP、300~600nmol/L dUTP，SMN2基因第7外显子特异性上游引物Ex7-2F100~300nmol/L，第7外显子公用下游引物Ex7-R100~300nmol/L，第7外显子公用探针Ex7-D150~250nM，SMN1基因第7外显子封闭引物Ex7-1B 200~400nmol/L，SMN2基因第8外显子特异性上游引物Ex8-2F为500~700nmol/L，第8外显子公用下游引物Ex8-R 500~700nmol/L，第8外显子公用探针Ex8-1B200~300nM，SMN1基因第8外显子封闭引物 300~600nmol/L，内参照CFTR上游引物P1 100~300nmol/L，内参照CFTR下游引物P2 100~300nmol/L，内参照CFTR探针P3100~200nM。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：第三反应液包含以下：50~100mM KCl、10~20mM Tris-HCl、1.0~2.0mM MgCl2、100~300nmol/L dATP、100~300nmol/L dCTP、100~300nmol/L dGTP、300~600nmol/L dUTP，SMN基因第6外显子保留区域之上游引物Ex6-F100~300nmol/L，SMN基因第6外显子下游引物Ex6-R 100~300nmol/L，SMN基因第6外显子探针Ex6-D 200~300nM，内参照CFTR上游引物P1 100~300nmol/L，内参照CFTR下游引物P2 100~300nmol/L，内参照CFTR探针P3 100~200nM。
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括热启动Taq酶1U/µL及UNG酶1U/µL，以3:2的比例配制而成的酶混合液。
7.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含：
第一对照，包含特异性质粒及TE水，其特异性质粒核苷酸序列为SEQ ID No.19；
第二对照，包含特异性质粒及TE水，其特异性质粒核苷酸序列为SEQ ID No.20；
第三对照，包含特异性质粒及TE水，其特异性质粒核苷酸序列为SEQ ID No.21；及第四对照，包含TE水。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：
第一对照中的特异性质粒为SMN1基因第7外显子、SMN1基因第8外显子与内参照CFTR基因的人工合成DNA序列，其拷贝数比为1:1:2；第二对照中的特异性质粒为SMN2基因第7外显子、SMN2基因第8外显子与内参照CFTR基因的人工合成DNA序列，其拷贝数比为1:1:2；第三对照的特异性质粒为SMN基因第6与内参照CFTR基因的人工合成DNA序列，其拷贝数比为1:2。
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