CN114480620A - 联合检测人smn1和smn2基因的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒及其应用，所述试剂盒包括扩增17个基因座的特异性引物。与现有技术相比，本发明具有以下优点：克服MLPA检测平台操作复杂、耗时长、检测成本高；qPCR检测平台检测通量小、单拷贝鉴定不够准确等问题，本发明选用多重荧光PCR平台结合拷贝数校准内标并结合毛细管电泳的技术平台，建立了可同时检测SMN1、SMN2全部外显子及5处“2+0”型携带者相关性SNP位点的准确区分SMA健康人群、携带者及患者的检测方法。为SMA的诊断提供更加便捷、准确、高性价比的选择方案。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种可应用于SMA患者、携带者及健康人群的SMN基因拷贝数的准确测定，为后续选择治疗方案、指导优生优育提供可靠的参考资料；具体为联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒及其应用。
背景技术
脊髓性肌肉萎缩症(Spinal Muscular Atrophy,SMA)又称脊肌萎缩症，是一类由脊髓前角运动神经元变性导致肌无力、肌萎缩的疾病。属常染色体(5q13.2)隐性遗传病，临床分为SMA-Ⅰ型(婴儿型)、SMA-Ⅱ型(中间型)、SMA-Ⅲ型(青少年型)、SMA-Ⅳ型(成人型)。
Ⅰ型患者在出生时或在6个月之内发病，不能独立坐或走，通常在两年内死于呼吸功能不全；Ⅱ型患者在6个月之后发病，可独力坐，但在没有辅助设备帮助的情况下无法行走，寿命会大幅缩短；Ⅲ型患者通常在1岁半后发病，能够独立坐或走，但在青春期或成人后行走能力有所减退，需要依靠轮椅行动；Ⅳ型患者多为青年后发病，共同特点是脊髓前角细胞变性，临床表现为进行性、对称性、肢体近端为主的广泛性弛缓性麻痹与肌萎缩。各型区别根据起病年龄、病情进展速度、肌无力程度及存活时间长短而定，智力发育及感觉均正常。
遗传学研究已经确定SMA与5号染色体上高度同源的SMN1和SMN2基因密切相关。一般健康个体有2拷贝的SMN1基因与2拷贝的SMN2基因。若某一个体2拷贝的SMN1基因都失去功能的就会患病，只有1拷贝SMN1基因起作用的个体为携带者。在SMN1基因都失去功能的情况下个体被判定为患者，此时SMN2基因拷贝数数目会影响患者的发病时间与病情严重程度。拷贝数越多，越晚发病且病程发展越缓慢。明确的致病机理为核酸筛查提供了有力的技术保障。
2018年5月11日，国家卫生健康委员会等5部门联合制定了《第一批罕见病目录》，脊髓性肌萎缩症(人群中的携带率1/35～1/50，发病率1/6000～1/10000)因其高致死性、高携带率、低发病率的特点被收录其中。
SMA早期症状不明显一旦发病无有效治疗手段，给患者家庭带来心理和经济上沉重的双重打击。目前仅3种药物(Spinraza、Zolgensma、Risdiplam)有对部分特定SMA患者有缓解病程或治疗的作用，但是均价格昂贵且有极高的治疗风险，其中全球最贵药物Zolgensma(由诺华制药Novartis开发，单剂次超210万美元)就在其中。而在国内获批上市的Spinraza、Risdiplam也需要患者终身服药，每年也需要金额不小的费用。
故针对SMA致病基因进行检测可以说是性价比最高且最有效的防治手段，即从婚前、孕前、家族病史患者等层面进行SMA携带者及患者筛查，可以指导优生优育，进行孕前干预，从根源上降低患儿的出生率，进而减少社会及患者家庭的创伤和压力。
目前诊断SMA的“金标准”是荷兰MRC-Holland公司使用MLPA技术平台的P021和P460(产品编号)，不光检测位点多、覆盖信息全面；而且可以进行准确的拷贝数测定。同时也获得了全球最广泛的认可及使用，P021拥有欧盟认证CE、以色列认证IL及摩洛哥认证MA；P460拥有欧盟认证CE。但MLPA检测平台也存在操作复杂、检测耗时长、检测成本高等缺点。
qPCR检测平台以其便捷的操作及检测模式成为备选检测平台之一，但是qPCR的弱势也十分明显——检测通量少，故赛默飞世尔科技、上海五色石医学研究股份有限公司、贝瑞基因等国内外厂家依托该平台开发的产品检测位点仅有SMN1基因的外显子7(赛默飞世尔科技、贝瑞基因)，或SMN1基因的外显子7和8(上海五色石医学研究股份有限公司)。单次检测获得的遗传信息少且受检测平台自身设计的限制，可以准确测定SMN1基因0拷贝患者但无法准确测定单拷贝的携带者。
多重PCR+CE检测平台是目前主流技术平台中性价比最高的，阅微基因、天昊生物就选择了该平台。检测通量高、仪器覆盖广、检测成本及耗时短，目前的不足是缺少针对2+0型的携带者检测。
第三代PCR技术——数字PCR检测平台也是备选热门，新羿生物就是其中代表。可以做到绝对定量的dPCR其准确性毋需质疑，但是目前仍受限制于昂贵的检测及推广成本。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，克服MLPA检测平台操作复杂、耗时长、检测成本高；qPCR检测平台检测通量小、单拷贝鉴定不够准确等问题，本发明选用多重荧光PCR平台结合拷贝数校准内标并结合毛细管电泳的技术平台，建立了可同时检测SMN1、SMN2全部外显子及5处“2+0”型携带者相关性SNP位点的准确区分SMA健康人群、携带者及患者的检测方法。为SMA的诊断提供更加便捷、准确、高性价比的选择方案。
技术方案：联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒，所述试剂盒包括扩增17个基因座的特异性引物，其中基因座为同时检测SMN1和SMN2基因同源的外显子1至外显子6的以下7个基因座：Exon1、Exon2a、Exon2b、Exon3、Exon4、Exon5、Exon6；和特异性检测SMN1基因外显子7和8的以下2个基因座：SMN1-Exon7、SMN1-Exon8；和特异性检测SMN2基因外显子7和8的以下2个基因座：SMN2-Exon7、SMN2-Exon8；和检测“2+0型”携带者相关性SNP的以下5个基因座：g.11678G>T、g.22804G>A、g.26190A>G、g.27134T>G、g.27706-27707del AT；以及检测内参基因ACTB。通常健康人群每条染色体上含1拷贝SMN1基因和1拷贝SMN2基因，即每个个体含2拷贝SMN1基因和2拷贝SMN2基因。“2+0型”携带者表示2拷贝的SMN1基因都位于一条染色体上，另一条染色体的SMN1基因丢失。在检测拷贝数时健康人群和“2+0型”群体都呈现2拷贝SMN1基因，故“2+0型”群体容易被当作假阴性。
优选的，所述扩增17个基因座的特异性引物的序列如下：Exon1、SEQ ID NO.1-2；Exon2a、SEQ ID NO.3-4；Exon2b、SEQ ID NO.5-6；Exon3、SEQ ID NO.7-8；Exon4、SEQ IDNO.9-10；Exon5、SEQ ID NO.11-12；Exon6、SEQ ID NO.13-14；SMN1-Exon7、SEQ ID NO.15-16；SMN2-Exon7、SEQ ID NO.17-18；SMN1-Exon8、SEQ ID NO.19-20；SMN2-Exon8、SEQ IDNO.21-22；ACTB、SEQ ID NO.23-24；g.11678G>T、SEQ ID NO.25-27；g.22804G>A、SEQ IDNO.28-30；g.26190A>G、SEQ ID NO.31-33；g.27134T>G、SEQ ID NO.34-37；g.27706-27707delAT、SEQ ID NO.38-39；其中SMN1-Exon8、SMN2-Exon8及g.27706-27707 delAT共用下游引物，g.27134T与SMN1-Exon7共用下游引物，g.27134G与SMN2-Exon7共用下游引物。
优选的，所述扩增17个基因座的特异性引物的浓度如下：SEQ ID NO.1-2、0.15μM；SEQ ID NO.3-4、0.18μM；SEQ ID NO.5-6、0.18μM；SEQ ID NO.7-8、0.25μM；SEQ ID NO.9-10、0.20μM；SEQ ID NO.11-12、0.35μM；SEQ ID NO.13-14、0.20μM；SEQ ID NO.15、0.30μM；SEQ ID NO.16、0.40μM；SEQ ID NO.17、0.25μM；SEQ ID NO.18、0.36μM；SEQ ID NO.19、0.18μM；SEQ ID NO.20、0.35μM；SEQ ID NO.21、0.18μM；SEQ ID NO.22、0.35μM；SEQ ID NO.23-24、0.15μM；SEQ ID NO.25-27、0.20μM；SEQ ID NO.28-30、0.20μM；SEQ ID NO.31-33、0.20μM；SEQ ID NO.34、0.20μM；SEQ ID NO.35、0.40μM；SEQ ID NO.36、0.20μM；SEQ ID NO.37、0.36μM；SEQ ID NO.38、0.10μM；SEQ ID NO.39、0.35μM。特异性引物具体信息如下表所示：
优选的，所述特异性引物的5’端采用以下荧光染料标记：FAM、HEX、TET、TAMRA、ROX、VIC、NED、ATTO系列或CY系列。
优选的，所述试剂盒包括一套拷贝数校准质粒，每个外显子基因座及内参基因ACTB均有对应的拷贝数校准质粒。
优选的，所述拷贝数校准质粒序列如下：I-SMN1-Exon8、SEQ ID NO.40；I-SMN2-Exon8、SEQ ID NO.41；I-Exon1、SEQ ID NO.42；I-ACTB、SEQ ID NO.43；I-Exon6、SEQ IDNO.44；I-Exon2a、SEQ ID NO.45；I-Exon4、SEQ ID NO.46；I-Exon2b、SEQ ID NO.47；I-Exon5、SEQ ID NO.48；I-SMN1-Exon7、SEQ ID NO.49；I-SMN2-Exon7、SEQ ID NO.50；I-Exon3、SEQ ID NO.51。
优选的，所述拷贝数校准质粒扩增子片段长度如下：I-SMN1-Exon8、82bp；I-SMN2-Exon8、90bp；I-Exon1、97bp；I-ACTB、110bp；I-Exon6、122bp；I-Exon2a、149bp；I-Exon4、164bp；I-Exon2b、176bp；I-Exon5、192bp；I-SMN1-Exon7、205bp；I-SMN2-Exon7、212bp；I-Exon3、217bp。具体信息如下表所示：
其中：下划线部分是与对应检测位点共用引物结合区。
优选的，所述试剂盒包括多重荧光PCR反应缓冲液，其组份及各组份反应浓度为：50mM Tris-HCl；40mM KCl；1.8mM MgCl2；0.22mM dUTP；dATP/dGTP/dCTP/dTTP各0.18mM；甘油8.0％；1.8mg/mL BSA；10mM TC；UNG酶0.04U/μL；热启动DNA-Taq酶0.80U/μL。
以上任一所述联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒在检测脊髓性肌肉萎缩症中的应用。
优选的，检测的样本包括外周血、whatman唾液卡或whatman血卡。
有益效果：(1)本发明所述试剂盒匹配性价比高、性能稳定、推广程度广、检测通量高的多重PCR+CE检测平台，在保证检测位点覆盖全面的基础上增加了筛选“2+0”型携带者相关SNP指示位点的检测；(2)所述试剂盒检测样品来源广泛，检测结果准确，为后续选择治疗方案、指导优生优育提供可靠的参考资料。
附图说明
图1是本发明试剂盒的基因座排布图；
图2是实际样本3500遗传分析仪检测图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1基因座及其特异性扩增引物、拷贝数校准质粒混合物的构建
联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒，所述试剂盒包括扩增17个基因座的特异性引物，其中基因座为同时检测SMN1和SMN2基因同源的外显子1至外显子6的以下7个基因座：Exon1、Exon2a、Exon2b、Exon3、Exon4、Exon5、Exon6；和特异性检测SMN1基因外显子7和8的以下2个基因座：SMN1-Exon7、SMN1-Exon8；和特异性检测SMN2基因外显子7和8的以下2个基因座：SMN2-Exon7、SMN2-Exon8；和检测“2+0型”携带者相关性SNP的以下5个基因座：g.11678G>T、g.22804G>A、g.26190A>G、g.27134T>G、g.27706-27707del AT；以及检测内参基因ACTB。以上基因座排布方式如图1所示。
所述扩增17个基因座的特异性引物的序列如下：Exon1、SEQ ID NO.1-2；Exon2a、SEQ ID NO.3-4；Exon2b、SEQ ID NO.5-6；Exon3、SEQ ID NO.7-8；Exon4、SEQ ID NO.9-10；Exon5、SEQ ID NO.11-12；Exon6、SEQ ID NO.13-14；SMN1-Exon7、SEQ ID NO.15-16；SMN2-Exon7、SEQ ID NO.17-18；SMN1-Exon8、SEQ ID NO.19-20；SMN2-Exon8、SEQ ID NO.21-22；ACTB、SEQ ID NO.23-24；g.11678G>T、SEQ ID NO.25-27；g.22804G>A、SEQ ID NO.28-30；g.26190A>G、SEQ ID NO.31-33；g.27134T>G、SEQ ID NO.34-37；g.27706-27707 delAT、SEQID NO.38-39；其中SMN1-Exon8、SMN2-Exon8及g.27706-27707 delAT共用下游引物，g.27134T与SMN1-Exon7共用下游引物，g.27134G与SMN2-Exon7共用下游引物。
所述扩增17个基因座的特异性引物的浓度如下：SEQ ID NO.1-2、0.15μM；SEQ IDNO.3-4、0.18μM；SEQ ID NO.5-6、0.18μM；SEQ ID NO.7-8、0.25μM；SEQ ID NO.9-10、0.20μM；SEQ ID NO.11-12、0.35μM；SEQ ID NO.13-14、0.20μM；SEQ ID NO.15、0.30μM；SEQ IDNO.16、0.40μM；SEQ ID NO.17、0.25μM；SEQ ID NO.18、0.36μM；SEQ ID NO.19、0.18μM；SEQID NO.20、0.35μM；SEQ ID NO.21、0.18μM；SEQ ID NO.22、0.35μM；SEQ ID NO.23-24、0.15μM；SEQ ID NO.25-27、0.20μM；SEQ ID NO.28-30、0.20μM；SEQ ID NO.31-33、0.20μM；SEQ IDNO.34、0.20μM；SEQ ID NO.35、0.40μM；SEQ ID NO.36、0.20μM；SEQ ID NO.37、0.36μM；SEQID NO.38、0.10μM；SEQ ID NO.39、0.35μM。特异性引物具体信息如下表所示：
所述特异性引物的5’端采用以下荧光染料标记：FAM、HEX、TET、TAMRA、ROX、VIC、NED、ATTO系列或CY系列。
拷贝数校准质粒的作用主要是消除横向对比的各个检测位点间引物扩增效率差异对于扩增峰高的影响，通过检测位点峰高与该位点拷贝数校准质粒峰高的比值，获得更准确的外显子拷贝数。
本发明的12个拷贝数校准质粒混合物其构建需符合一定要求。以ACTB内参为基准，首先按标准品(反应终浓度10ng/μL Forensic Control DNA 9947A)调节I ACTB质粒的加量，使ACTB峰高/I ACTB峰高值处于1±0.2之内。然后以确定加量的I ACTB质粒拷贝数为基准(设定Ct值为a)，对全部12个拷贝数校准质粒进行定量检测(qPCR法)以确定它们各自的稀释倍数，使稀释后12个拷贝数校准质粒的Ct值都在a±0.2范围内。最后将稀释好的拷贝数校准质粒等比例混合即为拷贝数校准质粒混合物。
设待测位点峰高值为H，其相应的拷贝数校准质粒峰高值为I，两者的比值为R，即R＝H/I。R值与拷贝数的换算关系如下表。
所述试剂盒包括一套拷贝数校准质粒，每个外显子基因座及内参基因ACTB均有对应的拷贝数校准质粒。所述拷贝数校准质粒序列如下：I-SMN1-Exon8、SEQ ID NO.40；I-SMN2-Exon8、SEQ ID NO.41；I-Exon1、SEQ ID NO.42；I-ACTB、SEQ ID NO.43；I-Exon6、SEQID NO.44；I-Exon2a、SEQ ID NO.45；I-Exon4、SEQ ID NO.46；I-Exon2b、SEQ ID NO.47；I-Exon5、SEQ ID NO.48；I-SMN1-Exon7、SEQ ID NO.49；I-SMN2-Exon7、SEQ ID NO.50；I-Exon3、SEQ ID NO.51。
所述拷贝数校准质粒扩增子片段长度如下：I-SMN1-Exon8、82bp；I-SMN2-Exon8、90bp；I-Exon1、97bp；I-ACTB、110bp；I-Exon6、122bp；I-Exon2a、149bp；I-Exon4、164bp；I-Exon2b、176bp；I-Exon5、192bp；I-SMN1-Exon7、205bp；I-SMN2-Exon7、212bp；I-Exon3、217bp。具体信息如下表所示：
其中：下划线部分是与对应检测位点共用引物结合区。
实施例2反应缓冲液中各组份及其浓度的确定
PCR反应缓冲液中包含各种离子、扩增反应原料、反应保护剂以及预混的两种酶。为了平衡复合扩增反应的特异性、效率以及抗抑制能力，需要确定上述组份的加量配置。
两种酶的用量梯度测试，Taq聚合酶加量设置10.0U、15.0U、20.0U、25.0U、30.0U共5梯度，最适加量20.0U；UNG酶加量设置3.0U、2.5U、2.0U、1.0U、0.5U共5梯度，最适加量1.0U。Tris-HCl(pH 8.4)分别测试30mM、40mM、50mM、60mM共4梯度，最适浓度为50mM。KCl分别测试30mM、40mM、50mM、60mM、70mM共5梯度，最适浓度为40mM。TC分别测试10mM、20mM、30mM、40mM共4梯度，最适浓度为10mM。甘油分别测试2.0％、4.0％、6.0％、8.0％、10.0％共5梯度，最适用量8.0％。polyoxyethylene分别测试0.5％、1.0％、1.5％、2.0％共4梯度，最适用量1.0％。BSA分别测试0.6mg/mL、1.2mg/mL、1.8mg/mL、2.4mg/mL共4梯度，最适用量为1.8mg/mL。Mg2+和脱氧单核苷酸加量设置正交实验，Mg2+设置4个梯度测试1.6mM、1.8mM、2.0mM、2.2mM，脱氧单核苷酸设置5个梯度测试0.16mM、0.18mM、0.20mM、0.22mM、0.24mM，最终Mg2+最适浓度1.8mM、dUTP最适浓度0.22mM、dATP/dGTP/dCTP/dTTP最适浓度0.18mM。最终各反应体系组份及浓度如下表。
实施例3扩增程序优化
本发明的初始程序见表1，其间经历Taq酶和UNG酶的品种及加量筛选；反应缓冲液组份加量优化测试；引物特异性优化测试；峰型优化测试；循环数测试最终成为本发明的最终程序见表2。
表1
表2
实施例4实际样本检测
采用本发明所述试剂盒对实际样本进行检测：
1、待测样本处理。待测样本类型包括且不限于外周血、whatman唾液卡、whatman血卡等。其中血液样本需要进行核酸提取，所用方法包括但不限于使用核酸提取试剂盒、磁珠法等，提取后的核酸样本需进行浓度(大于2ng/μL)及纯度(OD260/OD280≈1.8)测试，样本合格后进行下步操作。
2、检测体系配置。需同步设计空白对照、阴性对照、阳性对照。
3、体系扩增程序如下，PCR仪包含但不限于ProFlex、柏恒等，需调节升降温速率为4℃/秒。
4、遗传分析仪跑样。扩增产物3000rpm离心5分钟，取1.0μL产物、0.5μL DNAMarker SIZ-600与13.5μL去离子甲酰胺混合，95℃变性3分钟后冰浴2分钟，最后上机(3500xL)电泳检测。
结果如图2所示，待测样本为健康人群，具体检测值如下表所示。
序列表
<110> 无锡中德美联生物技术有限公司
<120> 联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒及其应用
<160> 51
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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attatttgta tccttacctc ttgagcat 28
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagtttgatc caccgaggca tta 23
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cagatttggg cttgatgtta tctgatt 27
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gttttgagtc ctttttattc ctatcatatt ga 32
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
actctttttt acttactggt ggtccagaa 29
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
attctccaga taattccccc acca 24
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acttaccata taatagccag tatgatagc 29
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aacttccttt attttcctta cagggtttc 29
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
attgattgtt ttacattaac ctttcaactt tt 32
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtaacttcct ttattttcct tacagggttt t 31
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
attgattgtt ttacattaac ctttcaactt tc 32
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tttgaaaaac catctgtaaa agactgg 27
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atccacattc aaattttctc aactgcc 27
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tctttgaaaa accatctgta aaagactga 29
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
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<400> 22
atccacattc aaattttctc aactgcc 27
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<211> 23
<212> DNA
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agtgtgacat ggtgtatctc tgc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
attttacggc cagaggcgta cagggata 28
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ctgttgggtt tttttttttt taggggg 27
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gactgttggg tttttttttt ttttggggt 29
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gaagttgagg atgcagtgtg tgg 23
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
attaagtgat ccacctgcct cttcc 25
<210> 29
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atattaagtg atccacctgc ctcaact 27
<210> 30
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
attggcagga aaattgcttt aatctggg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ttatttttta gagaccaggt ctcactcta 29
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ttttattttt tagagaccag gtctcacttt g 31
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gccaggtgca gtggcatt 18
<210> 34
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
atgtttgtgg aaaacaaatg tttttgaaca t 31
<210> 35
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
attgattgtt ttacattaac ctttcaactt tt 32
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gtttgtggaa aacaaatgtt tttgaacag 29
<210> 37
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
attgattgtt ttacattaac ctttcaactt tc 32
<210> 38
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
atgcaatgtg aaatatttta ctggactct 29
<210> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
atccacattc aaattttctc aactgcc 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tttgaaaaac catctgtaaa agaccggcgc cctcctgctt ccccgtcctg gagctggcag 60
ttgagaaaat ttgaatgtgg at 82
<210> 41
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tctttgaaaa accatctgta aaagaccgat cgccctcctg cttccccgtc ctcgagctat 60
cccggcagtt gagaaaattt gaatgtggat 90
<210> 42
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cgtagaaagc gtgagaagtt aagccttgcc cccactccag aactaggcgg acgttgaccc 60
ccaggcggcg gcgacccagt cgtcactctt aagaagg 97
<210> 43
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
agtgtgacat ggtgtatctc tgctcaagcc ttgcccccac tccagaacta ggcggatgtg 60
gaccaccaac aggcatccac cctatccctg tacgcctctg gccgtaaaat 110
<210> 44
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
attctccaga taattccccc accacctcct gcttcccctt cctttagcta tccaatcaaa 60
caacctaaac acaatactca caatagcctt attgctatca tactggctat tatatggtaa 120
gt 122
<210> 46
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
acatttggga tgatacagca ctgatccttc tttatagcac aaatttttac ccattatacg 60
taatcattgg atctactttc cttattgttt gcttcctacg ccaattaaaa ttccacttaa 120
catacgataa agtgttaaag tacatgtta 149
<210> 46
<211> 164
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cagtttgatc caccgaggca ttaattattt ctttacgtat ctatctattg atgaggttcc 60
tagttatttt agtattaaca agtacaactg acttccaatc gattagttgc ggtataccct 120
gaaaaagaac aataaacaat cagataacat caagcccaaa tctg 164
<210> 47
<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
atgtcgtgac ttttattctg tgcaccaagt attaacaatg acaatcgact tccaatacgt 60
tatctgaggt ataccccgaa aaagaacaat aaaccttcta ctaacactac taacaaacac 120
aacactagcc ctattactcg tattcatcgc aaagaagaat actgcagctt ccttac 176
<210> 48
<211> 192
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gttttgagtc ctttttattc ctatcatatt gatactaaca ctactaacaa acacaacact 60
agccctatta ctcgtattca tcgccttctg actcccccaa ctaaacgtat acgcagaaaa 120
aacaagccca tacgagtgcg gattcgaccc tataggatca gctttctgga ccaccagtaa 180
gtaaaaaaga gt 192
<210> 49
<211> 205
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
aacttccttt attttcctta cagggtttcg ttgtatgatt atttctttac gtatctatct 60
attgatgagg ttcctagttc ttttagtatt aacaagtaca atcgacttcc aatcagttag 120
tttcggtata cccttaaaga acaataatac ttctaataac actactaaca aacaaaagtt 180
gaaaggttaa tgtaaaacaa tcaat 205
<210> 50
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gtaacttcct ttattttcct tacagggttt tacgttgtat gattatttct ttacgtatct 60
atctattgat gaggttccta gttcttttag tattaacaag tacaatcgac ttccaatcag 120
ttagtttcgg tatacccgtt aaagaacaat aatacttcta ataacactac taacaaacac 180
gaaagttgaa aggttaatgt aaaacaatca at 212
<210> 51
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
agtggaaagt tggggacaaa taacgatgag gttcctagta tttttagtat taacaagtac 60
aatcgacttc caatcagtta gttctggtat accccgaaaa agaacaataa accttctact 120
aacactacta acaaacacaa cactagccct attactcgta ttcatcgcct tctgactccc 180
ccaactaaga tgctcaagag gtaaggatac aaataat 217
Claims (10)
1.联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括扩增17个基因座的特异性引物，其中基因座为同时检测SMN1和SMN2基因同源的外显子1至外显子6的以下7个基因座：Exon1、Exon2a、Exon2b、Exon3、Exon4、Exon5、Exon6；和特异性检测SMN1基因外显子7和8的以下2个基因座：SMN1-Exon7、SMN1-Exon8；和特异性检测SMN2基因外显子7和8的以下2个基因座：SMN2-Exon7、SMN2-Exon8；和检测“2+0型”携带者相关性SNP的以下5个基因座：g.11678G>T、g.22804G>A、g.26190A>G、g.27134T>G、g.27706-27707del AT；以及检测内参基因ACTB。
2.根据权利要求1所述的联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒，其特征在于，所述扩增17个基因座的特异性引物的序列如下：Exon1、SEQ ID NO.1-2；Exon2a、SEQ ID NO.3-4；Exon2b、SEQ ID NO.5-6；Exon3、SEQ ID NO.7-8；Exon4、SEQ ID NO.9-10；Exon5、SEQ IDNO.11-12；Exon6、SEQ ID NO.13-14；SMN1-Exon7、SEQ ID NO.15-16；SMN2-Exon7、SEQ IDNO.17-18；SMN1-Exon8、SEQ ID NO.19-20；SMN2-Exon8、SEQ ID NO.21-22；ACTB、SEQ IDNO.23-24；g.11678G>T、SEQ ID NO.25-27；g.22804G>A、SEQ ID NO.28-30；g.26190A>G、SEQID NO.31-33；g.27134T>G、SEQ ID NO.34-37；g.27706-27707delAT、SEQ ID NO.38-39；其中SMN1-Exon8、SMN2-Exon8及g.27706-27707delAT共用下游引物，g.27134T与SMN1-Exon7共用下游引物，g.27134G与SMN2-Exon7共用下游引物。
3.根据权利要求1所述的联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒，其特征在于，所述扩增17个基因座的特异性引物的浓度如下：SEQ ID NO.1-2、0.15μM；SEQ ID NO.3-4、0.18μM；SEQ ID NO.5-6、0.18μM；SEQ ID NO.7-8、0.25μM；SEQ ID NO.9-10、0.20μM；SEQ ID NO.11-12、0.35μM；SEQ ID NO.13-14、0.20μM；SEQ ID NO.15、0.30μM；SEQ ID NO.16、0.40μM；SEQID NO.17、0.25μM；SEQ ID NO.18、0.36μM；SEQ ID NO.19、0.18μM；SEQ ID NO.20、0.35μM；SEQ ID NO.21、0.18μM；SEQ ID NO.22、0.35μM；SEQ ID NO.23-24、0.15μM；SEQ ID NO.25-27、0.20μM；SEQ ID NO.28-30、0.20μM；SEQ ID NO.31-33、0.20μM；SEQ ID NO.34、0.20μM；SEQ ID NO.35、0.40μM；SEQ ID NO.36、0.20μM；SEQ ID NO.37、0.36μM；SEQ ID NO.38、0.10μM；SEQ ID NO.39、0.35μM。
4.根据权利要求1所述的联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物的5’端采用以下荧光染料标记：FAM、HEX、TET、TAMRA、ROX、VIC、NED、ATTO系列或CY系列。
5.根据权利要求1所述的联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一套拷贝数校准质粒，每个外显子基因座及内参基因ACTB均有对应的拷贝数校准质粒。
6.根据权利要求5所述的联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒，其特征在于，所述拷贝数校准质粒序列如下：I-SMN1-Exon8、SEQ ID NO.40；I-SMN2-Exon8、SEQ ID NO.41；I-Exon1、SEQ ID NO.42；I-ACTB、SEQ ID NO.43；I-Exon6、SEQ ID NO.44；I-Exon2a、SEQ IDNO.45；I-Exon4、SEQ ID NO.46；I-Exon2b、SEQ ID NO.47；I-Exon5、SEQ ID NO.48；I-SMN1-Exon7、SEQ ID NO.49；I-SMN2-Exon7、SEQ ID NO.50；I-Exon3、SEQ ID NO.51。
7.根据权利要求5所述的联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒，其特征在于，所述拷贝数校准质粒扩增子片段长度如下：I-SMN1-Exon8、82bp；I-SMN2-Exon8、90bp；I-Exon1、97bp；I-ACTB、110bp；I-Exon6、122bp；I-Exon2a、149bp；I-Exon4、164bp；I-Exon2b、176bp；I-Exon5、192bp；I-SMN1-Exon7、205bp；I-SMN2-Exon7、212bp；I-Exon3、217bp。
8.根据权利要求1所述的联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括多重荧光PCR反应缓冲液，其组份及各组份反应浓度为：50mM Tris-HCl；40mM KCl；1.8mM MgCl2；0.22mM dUTP；dATP/dGTP/dCTP/dTTP各0.18mM；甘油8.0％；1.8mg/mL BSA；10mM TC；UNG酶0.04U/μL；热启动DNA-Taq酶0.80U/μL。
9.权利要求1-8任一所述联合检测人SMN1和SMN2基因的试剂盒在检测脊髓性肌肉萎缩症中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，检测的样本包括外周血、whatman唾液卡或whatman血卡。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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