CN109799357B - 一种金纳米粒子比色检测抗生素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种金纳米粒子比色检测抗生素的方法。本发明是以带负电的柠檬酸修饰的金纳米粒子(citrate‑AuNPs)和带正电的聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰的金纳米粒子(PDDA‑AuNPs)的混合液作为探针，适配体作为保护剂防止两种不同电荷的金纳米粒子聚集。在检测抗生素过程中，适配体易与抗生素特异性结合并发生构型转变，同时失去对金纳米粒子的保护能力，使两种不同电荷的金纳米粒子在正负电荷相互吸引的过程中聚集在一起，利用金纳米粒子表面等离子体共振的性质，可以通过溶液颜色由红变蓝来指示水溶液中抗生素的存在。本发明灵敏度高、选择性好、不需要大型仪器、可实现原位快速检测，检测结果直观，可以通过裸眼观察，并且操作简单，造价低，所用试剂和操作过程无毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及比色法检测技术，具体涉及一种金纳米粒子比色检测抗生素的方法。
背景技术
现有技术检测抗生素的方法包括色谱分析法、酶免疫分析方法、毛细管电泳法和放射免疫测定法。但这些方法存在仪器昂贵、操作繁琐、需要专业的分析操作人员、样品处理复杂、成本高的缺点。近年来，以金纳米粒子为代表发展了一系列比色检测抗生素的方法(Y.Jiao et al.,Microchimica Acta,2017,184,59-63；Y.S.Kim et al.,Biosensors andBioelectronics,2010,26,1644-1649.)它们成本低，不需要繁琐的预处理步骤，但是在这些金纳米粒子比色检测方法中，盐溶液都是其中的一个重要因素，它可以诱导或加速金纳米的聚集，但如何找到最佳盐浓度是比较困难的，所以开发一种除盐的比色检测抗生素的新方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、检测限低、检测范围宽的除盐的金纳米粒子比色检测抗生素的方法。
为实现上述目的，本发明以带负电的柠檬酸修饰的金纳米粒子(citrate-AuNPs)和带正电的聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰的金纳米粒子(PDDA-AuNPs)的混合液作为探针，适配体作为保护剂防止两种不同电荷的AuNPs聚集。在检测抗生素过程中，适配体易与抗生素特异性结合并发生构型转变，同时失去对AuNPs的保护能力，使两种不同电荷的AuNPs在正负电荷相互吸引的过程中聚集在一起，利用AuNPs表面等离子体共振的性质，可以通过溶液颜色由红变蓝来指示水溶液中抗生素的存在。
本发明提供的一种金纳米粒子比色检测抗生素的方法，具体步骤包括：
(1)制备并配置浓度3-10nM的citrate-AuNPs，(citrate-AuNPs制备见J.W.Liu etal.,Nat.Protoc.,2006,1,246-252.)；
(2)制备并配置浓度2-5nM的PDDA-AuNPs，(PDDA-AuNPs制备见H.J.Chen et al.,Polymer,2006,47,763-766.)；
(3)配置浓度10-50nM的抗生素适配体；
(3)按体积比50-200:50-200:1将上述浓度的citrate-AuNPs与抗生素适配体和PDDA-AuNPs，混合均匀，得到检测抗生素的探针标准溶液；
(4)将待测溶液加入步骤(3)得到的标准溶液中，通过溶液颜色由红变蓝的变化实现抗生素检测。
所述抗生素为四环素类抗生素、磺胺类抗生素或喹诺酮类抗生素。
所述待测溶液可为含抗生素的溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明提供的标准溶液中PDDA-AuNPs的加入，避免了盐的加入，使得探针灵敏度高、检出范围宽、选择性好，检出限1.0fM，比现有方法的检出限低至少三个数量级，检出浓度范围跨8个数量级，为5×10-14M到5×10-6M；可以实现水中抗生素的超灵敏检测；
(2)不需要大型仪器，通过裸眼观察或比色光谱，即可识别检测结果；
(3)本发明所用试剂和操作过程均无毒副作用；
(4)本发明方法简单、快速、易操作，可进行现场原位快速检测。
附图说明
图1为本发明制备的探针标准溶液随citrate-AuNPs与PDDA-AuNPs比例变化其UV-Vis吸收在650nm和520nm处的光谱比值(A650/A520)的变化。
图2为本发明制备的探针标准溶液随适配体浓度的变化其UV-Vis吸收光谱比值A650/A520的变化。
图3为本发明制备的探针标准溶液随孵育时间的变化其UV-Vis吸收光谱比值A650/A520的变化
图4为本发明制备的探针标准溶液随四环素浓度的变化其UV-Vis吸收光谱的变化
图5为本发明制备的探针标准溶液与不同浓度四环素溶液之间的线性关系
具体实施方式
下面通过具体实施例结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1
探针标准溶液的制备：
(1)将100mL 1mM氯金酸溶液加入带有回流装置的烧瓶中，搅拌，加热到沸腾，然后快速加入10mL38.8mM柠檬酸钠溶液，回流直到溶液变为酒红色；将烧瓶移出热源，继续搅拌，冷却至室温得到citrate-AuNPs；
(2)将250μL PDDA，40mLddH2O，200μL 0.5M NaOH和100μL 10mg/mL HAuCl4混合均匀，100℃搅拌一定时间至溶液颜色变为红色且不再改变为止，冷却至室温得到PDDA-AuNPs；
(3)将99.6μL 5nM citrate-AuNPs与99.6μL 20nM四环素适配体室温孵育30min，加入0.8μL 2.5nM PDDA-AuNPs，混合均匀得到可视化纳米探针标准溶液。
实施例2
Citrate-AuNPs和PDDA-AuNPs的不同比例对对UV-Vis吸收光谱比值A650/A520的影响：
改变实施例1制备的可视化纳米探针标准溶液中citrate-AuNPs与PDDA-AuNPs的比例，检测不同比例下对UV-Vis吸收光谱比值A650/A520的影响。
不同比例对可视化纳米探针标准溶液UV-Vis吸收光谱比值A650/A522的影响见图1：在不同比例下，吸收光谱比值A650/A520均为常数；随着比例不断增加，常数数值在R＝249时出现峰值，说明本发明制备的可视化纳米探针标准溶液最佳citrate-AuNPs与PDDA-AuNPs的比例为249。
实施例3
改变实施例1制备的可视化纳米探针标准溶液中适配体与citrate-AuNPs的比例。检测在不同适配体浓度下，可视化纳米探针标准溶液的UV-Vis吸收光谱的变化。
不同浓度的适配体溶液对可视化纳米探针标准溶液的UV-Vis吸收光谱的影响见图2：逐渐增加适配体的浓度，可视化纳米探针标准溶液A650/A520常数值不断降低。当R＝4时，出现拐点，说明本发明制备的可视化纳米探针标准溶液的最佳适配体与citrate-AuNPs的比例为4。
实施例4
孵育时间对四环素与实施例1制备的可视化纳米探针标准溶液反应的影响：
取200μL实施例1制备的可视化纳米探针标准溶液，向其中加入10μL 5pM四环素，将溶液分别每隔2分钟测一次UV-vis谱，检测不同时间下对UV-Vis吸收光谱比值A650/A520的影响。
不同时间对可视化纳米探针标准溶液UV-Vis吸收光谱比值A650/A520的影响见图3：在不同反应时间下，吸收光谱比值A650/A520均为常数；随着时间不断延长，常数数值不断升高直至出现平台，说明本发明制备的可视化纳米探针标准溶液与四环素的反应在18min内即可完成。
实施例5
向实施例1制备的可视化纳米探针标准溶液中加入不同浓度的四环素溶液UV-Vis吸收谱图随四环素浓度的变化实验：
取实施例1制备的可视化纳米探针标准溶液200μL，逐渐向溶液中加入四环素，检测在不同四环素浓度下，可视化纳米探针标准溶液的UV-Vis吸收光谱的变化。
不同浓度的四环素溶液对可视化纳米探针标准溶液的UV-Vis吸收光谱的影响见图4：逐渐增加四环素的浓度，可视化纳米探探针标准溶液在522nm处的吸收峰逐渐降低，650nm处的吸收峰逐渐升高。说明本发明制备的可视化纳米探针标准溶液能够实现对不同四环素浓度的检测。
此外，本发明制备的可视化纳米探探针标准溶液的UV-Vis吸收光谱比值A650/A520的变化与四环素浓度的对数溶液呈线性关系，如图5所示，随着四环素浓度的增长，吸收光谱比值A650/A520逐渐增强，线性方程的R2＝0.993。
实施例6
实施例1制备的可视化纳米探针标准溶液用于饮用水样品中四环素的检测实验：
如表1所示，采用标准加入法，向饮用水中加入四环素。用实施例1制备的可视化纳米探针标准溶液检四环素的含量，测得的相对标准偏差均小于5％，说明本发明制备的可视化纳米探针标准溶液可以用于检测实际样品中的四环素。
表1为本发明制备的可视化纳米探针标准溶液用于饮用水中四环素的检测
Claims (2)
1.一种金纳米粒子比色检测抗生素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备并配置浓度3-10nM的citrate-AuNPs；
(2)制备并配置浓度2-5nM的PDDA-AuNPs；
(3)配置浓度10-50nM的抗生素适配体；
(3)按体积比50-200:50-200:1将上述浓度的citrate-AuNPs与抗生素适配体和PDDA-AuNPs，混合均匀，得到检测抗生素的探针标准溶液；
(4)将待测溶液加入步骤(3)得到的探针标准溶液中，通过溶液颜色由红变蓝的变化实现抗生素检测。
2.如权利要求1所述的一种金纳米粒子比色检测抗生素的方法，其特征在于，所述抗生素为四环素类抗生素、磺胺类抗生素或喹诺酮类抗生素。
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