CN101367872A - 蛋白质-聚合物缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及说明书中描述的蛋白质－聚合物缀合物。本发明还公开了制备蛋白质－聚合物缀合物的方法及其在治疗乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质-聚合物缀合物，更具体而言涉及含有一个或多个聚合物部分、蛋白质部分以及连接子的缀合物。本发明还涉及用于制备所述蛋白质-聚合物缀合物的方法以及其在治疗乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染中的用途。
背景技术
在细胞生物学和重组蛋白质技术方面的进展导致了蛋白质治疗剂的开发。
然而，仍存在着较大障碍。大多数蛋白质易受蛋白水解降解的影响并因此在循环系统中的半衰期短。其它的缺点包括低水溶性和诱发中和抗体。
聚合物(例如聚乙二醇(PEG))与蛋白质的连接阻碍了蛋白水解酶与蛋白质骨架的接近，导致蛋白质稳定性的增加。此外，它还可以增加水溶性并使免疫原性减至最小。需要有将聚合物连接到蛋白质上的有效方法。
发明内容
本发明的一方面涉及包含一种或多种聚合物部分、蛋白质部分和连接子的基本上纯的(纯度≥80％)缀合物。在所述缀合物中，所述聚合物部分与所述连接子相连接，所述蛋白质部分N末端的氮原子与所述连接子相键合；所述连接子是共价键、C1-10亚烷基、C2-10亚烯基或C2-10亚炔基；所述蛋白质部分是α干扰素部分、人生长激素部分或促红细胞生成素部分。优选地，所述缀合物纯度为90％或更高。此缀合物具有出乎意料地长的体内半衰期。
本发明的另一个方面涉及式I的蛋白质-聚合物缀合物：
式I
其中R1、R2、R3、R4和R5各自独立地是H、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、芳基、杂芳基、C3-8环烷基或C3-8杂环烷基；A1和A2各自独立地是聚合物部分；G1、G2和G3各自独立地是键或连接性官能团；P是蛋白质部分；m是0或1-10的整数；n是1-10的整数。
参照上式，所述蛋白质-聚合物缀合物可具有一个或多个以下特征：G3是键，P是蛋白质部分，其中N末端的氨基与G3相连；A1和A2是分子量为2-100kD(优选10-30kD)的聚环氧烷部分，G1和G2各自是(其中O与A1或A2相连，NH与式I中所示的碳原子相连)，或者G1和G2各自为脲、磺酰胺或酰胺(其中N与式I中所示的碳原子相连)；m是4，n是2，R1、R2、R3、R4和R5各自为H；P是包含1-4个其它氨基酸残基的干扰素部分或被修饰的干扰素部分。
术语“烷基”指单价的直链或支链烃基。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基和正戊基。相似地，术语“烯基”或“炔基”指包含一个或多个C＝C双键或一个或多个C≡C叁键的单价的直链或支链烃基。
术语“亚烷基”指二价的直链或支链烃基。相似地，术语“亚烯基”或“亚炔基”指包含一个或多个C＝C双键或一个或多个C≡C叁键的二价的直链或支链烃基。
术语“芳基”指具有至少一个芳环的烃环系(单环或双环)。芳基部分的实例包括但不限于苯基、萘基和芘基。
术语“杂芳基”指具有至少一个芳环的烃环系(单环或双环)，其中所述芳环包含至少一个作为环系部分的杂原子如O、N或S，并且其余部分是碳。杂芳基部分的实例包括但不限于呋喃基、吡咯基、噻吩基、噁唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、喹唑啉基和吲哚基。
术语“环烷基”指仅具有碳环原子的部分饱和或完全饱和的单环或双环环系。实例包括但不限于环丙基、环戊基和环己基。
术语“杂环烷基”指除碳原子外还具有一个或多个杂原子(例如O、N或S)作为环原子的部分饱和或完全饱和的单环或双环环系。实例包括但不限于哌啶、哌嗪、吗啉、硫代吗啉和1，4-氧氮杂环庚烷(1，4-oxazepane)。
本文中提及的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基包括取代的和未取代的部分。取代基的实例包括C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C8环烷基、C5-C8环烯基、C1-C10烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳基氧基、氨基、C1-C10烷基氨基、C1-C20二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基、羟基氨基、烷氧基氨基、C1-C10烷基磺酰胺基、芳基磺酰胺基、羟基、卤素、硫代、C1-C10烷硫基、芳硫基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、羧基和羧酸酯。
术语“聚环氧烷部分”指源自线形、分枝或星形聚环氧烷的单价基团。聚环氧烷部分的分子量可以是2-100kD。聚环氧烷部分是饱和或不饱和的。聚环氧烷部分的实例包括但不限于聚氧乙烯、聚乙二醇、聚氧异丙烯、聚氧丁烯及其共聚物。其它的聚合物比如葡聚糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺或基于碳水化合物的聚合物也可用于替代所述聚环氧烷部分，只要它们不是抗原性的、毒性的或诱发免疫应答的。所述聚环氧烷部分是取代的或未取代的。例如，其可以是甲氧基封端的聚乙二醇(mPEG)。
术语“蛋白质部分”指源自天然存在的蛋白质或被修饰的蛋白质的单价基团。所述天然存在的蛋白质可以是α-干扰素、β-干扰素、人生长激素、促红细胞生成素和粒细胞集落刺激因子或抗体。所述被修饰的蛋白质可以是例如含有α-干扰素和位于所述干扰素N末端的1-4个其它氨基酸残基的蛋白质。如此被修饰的干扰素的实例是
IFN表示干扰素α2b部分，其N末端的氨基与所述羰基键合。
术语“α-干扰素”指抑制病毒复制和细胞增殖并调节免疫应答的一个高度同源的物种特异性蛋白质家族。参见Bonnem等J.Biol.ResponseMod.，1984，3(6)：580-598和Finter，J.Hepatol.，1986，3 Suppl2：S157-160。
很多类型的α干扰素蛋白质是可商购的，包括由ScheringCorporation，Kenilworth，N.J.提供的Intron-A干扰素、Hoffmann-LaRoche，Nutley，N.J.提供的Roferon干扰素、Boehringer IngelheimPharmaceutical，Inc.，Ridgefield，Conn.提供的Berofor α2-干扰素、Sumitomo，Japan提供的Sumiferon和Glaxo-Wellcome Ltd.，London，Great Britain提供的Wellferon α-n1干扰素(I NS)。
以下列出五种示例性的人α干扰素蛋白质的氨基酸序列，其为前体形式或成熟形式：
maltfallva llvlsckssc svgcdlpqth slgsrrtlml laqmrrislfsclkdrhdfg fpqeefgnqf qkaetipvlh emiqqifnlf stkdssaawdetlldkfyte lyqqlndlea cviqgvgvte tplmkedsil avrkyfqritlylkekkysp cawevvraei mrsfslstnl qeslrske
(参见Krasagakis等，Cancer Invest.26(6)，562-568，2008)
cdlpqthslg srrtlmllaq mrkislfscl kdrhdfgfpq eefgnqfqkaetipvlhemi qqifnlfstk dssaawdetl ldkfytelyq qlndleacviqgvgvtetpl mkedsilavr kyfqritlyl kekkyspcaw evvraeimrsfslstnlqes irske
(参见Klaus，等，J.Mol.Biol.274(4)，661-675，1997)
mcdlpqthsl gsrrtlmlla qmrrislfsc lkdrhdfgfp qeefgnqfqkaetipvlhem iqqifnlfst kdssaawdet lldkfytely qqlndleacviqgvgvtetp lmkedsilav rkyfqritly lkekkyspca wevvraeimrsfslstnlqe slrske
(参见GenBank录入号AAP20099，2003年4月30日版本)
mallfpllaa lvmtsyspvg slgcdlpqnh gllsrntlvl lhqrrrispflclkdrrdfr fpqemvkgsq lqkahvmsvl hemlqqifsl fhterssaawnmtlldqlht elhqqlqhle tcllqvvgeg esagaisspa ltlrryfqgirvylkekkys dcawevvrme imkslflstn mqerlrskdr dlgss
(参见Capon等，J.Mol.Cell.Biol.5(4)：768-779，1985)
lsyksicslg cdlpqthslg nrralillaq mgrispfscl kdrhdfglpqeefdgnqfqk tqaisvlhem iqqtfnlfst edssaaweqsllekfstelyqqlnnleacv iqevgmeetplmnedsilav rkyfqritly ltekkyspcawevvraeimr slsfstnlqk rlrrkd
(参见Lund等，J.Interferon Res.5(2)，229-238，1985)
在一个实例中，用于制备本发明缀合物的α干扰素蛋白质具有与以上列出的氨基酸序列之一或其相当于成熟的α-干扰素的片段至少80％(例如85％、90％、95％或99％)相同的氨基酸序列。
术语“人生长激素”指天然存在的人生长激素(其为前体形式或成熟形式)及其功能性变体，即具有与天然存在的人生长激素至少80％(例如85％、90％、95％或99％)相同的氨基酸序列并具有与人生长激素相同的的生理活性。天然存在的人生长激素(前体形式和成熟形式)的氨基酸序列显示如下：
matgsrtsll lafgllclpw lqegsafpti plsrlfdnam lrahrlhqlafdtyqefeea yipkeqkysf lqnpqtslcf sesiptpsnr eetqqksnlellrisllliq swlepvqflr svfanslvyg asdsnvydll kdleegiqtlmgrledgspr tgqifkqtys kfdtnshndd allknyglly cfrkdmdkvetflrivqcrs vegscgf
(前体)
fptiplsrlf dnamlrahrl hqlafdtyqe feeayipkeq kysflqnpqtslcfsesipt psnreetqqk snlellrisllliqswlepv qflrsvfanslvygasdsnv ydllkdleeg iqtlmgrled gsprtgqifk qtyskfdtnshnddallkny gllycfrkdm dkvetflriv qcrsvegscg f
(成熟形式)
由肝脏或肾脏产生的促红细胞生成素(EPO)是一种调节红细胞生成或血液红细胞产生的糖蛋白激素。参见美国专利5,621,080。人EPO的氨基酸序列(前体形式和成熟形式)显示如下：
mgvhecpawl wlllsllslp lglpvlgapp rlicdsrvle rylleakeaenittgcaehc slnenitvpd tkvnfyawkr mevgqqavev wqglallseavlrgqallvn ssqpweplql hvdkavsglr slttllralg aqkeaisppdaasaaplrti tadtfrklfr vysnflrgkl klytgeacrt gdr
(前体)
apprlicdsr vlerylleak eaekittgca ehcslnekit vpdtkvnfyawkrmevgqqa vevwqglall seavlrgqal lvkssqpwep lqlhvdkavsglrslttllr algaqkeais ppdaasaapl rtitadtfrk lfrvysnflrgklklytgea crtgdr
(成熟形式)
用于制备本发明缀合物的促红细胞生成素蛋白质可以是由合适的物种(例如人、鼠、猪和牛)产生的EPO蛋白质，其或为前体形式或为成熟形式。在一个实例中，所述促红细胞生成素蛋白质具有与上述氨基酸序列之一至少80％(例如85％、90％、95％或99％)相同的氨基酸序列。
两个氨基酸序列的“相同性百分数”可利用Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68，1990)的算法确定，其修正方法如Karlin和Altschul的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-77，1993。将这样的算法引入Altschul等的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)中(J.Mol.Biol.215：403-10，1990)。可利用XBLAST程序(得分＝50，字符宽度＝3)进行BLAST蛋白质搜索以获取与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。在两个序列间存在缺口的情况下，可利用Altschul等Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402，1997中描述的缺口化BLAST(Gapped BLAST)。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各自程序的默认参数(例如XBLAST和NBLAST)。
术语“连接性官能团”指二价官能团，其一端与聚合物部分连接而另一端与蛋白质部分连接。实例包括但不限于-O-、-S-、羧酸酯、羰基、碳酸酯、酰胺、氨基甲酸酯、脲、磺酰基、亚硫酰基、氨基、亚氨基、羟基氨基、膦酸酯、或磷酸酯基团。
上述蛋白质-聚合物缀合物可以为游离形式或盐的形式(如果适用的话)。例如盐可以在阴离子和本发明蛋白质-聚合物缀合物上的带正电荷的基团(例如氨基)之间形成。合适的阴离子包括氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、三氟乙酸盐和乙酸盐。同样，盐也可以在阳离子和本发明蛋白质-聚合物缀合物上的带负电荷的基团(例如羧酸盐)之间形成。合适的阳离子包括钠离子、钾离子、镁离子、钙离子和铵离子如四甲基铵离子。
此外，所述蛋白质-聚合物缀合物可具有一个或多个双键或者一个或多个不对称中心。这样的缀合物可作为外消旋体、外消旋混合物、单一对映体、单个非对映体、非对映体混合物、以及顺式或反式或者E式或z式的双键异构形式而存在。
本发明的蛋白质-聚合物缀合物的实例显示如下：
其中mPEG的分子量是20kD，IFN是干扰素α2b部分。
本发明的另一方面涉及可用于制备蛋白质-聚合物缀合物的化合物。所述化合物具有式II：
式II
其中X是反应基团；A1和A2各自独立地是聚合物部分，或者A1和A2中的一个是聚合物部分，另一个是反应基团；G1、G2和G3各自独立地是键或连接性官能团；R1、R2、R3、R4和R5各自独立地是H、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、芳基、杂芳基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基或-G4-X’，G4是键或连接性官能团，X’是反应基团；m和n各自独立地是0或1-10的整数；前提条件是如果-G3-X是-CO(O)-N-琥珀酰亚胺基，则n是1-10的整数。
在一个实施方案中，X、X’、A1、A2、G1、G2、G3、G4、R1、R2、R3、R4、R5和m如上所定义，n是1-10的整数。
某些式II化合物具有一项或多项以下特征：聚合物部分可具有一个或多个反应基团；G3是键并且P是蛋白质部分，其中N末端的氨基与G3相连；A1和A2是分子量为2-100kD(优选12-30kD)的聚环氧烷部分，G1和G2各自是
其中O与A1或A2相连，NH与式I中所示的碳原子相连；m是4；n是1；R1、R2、R3、R4和R5是H；X是CH(＝O)或者X是离去基团(例如琥珀酰亚胺基或对硝基苯氧基)。
术语“反应基团”指能与另一个官能团反应使得其被所述另一个官能团取代或者与所述另一个官能团相连的官能团。反应基团可以是离去基团、亲核基团、醛或Michael受体。
术语“离去基团”指当直接取代或离子化时能带着电子对从其共价键中之一离去的官能团(参见例如F.A.Carey和R.J.Sunberg，AdvancedOrganic Chemistry，3rd Ed.Plenum Press，1990)。离去基团的实例包括但不限于甲磺酸酯、三氟甲磺酸酯、对甲苯磺酸酯、碘、溴化物、氯化物、三氟乙酸酯、琥珀酰亚胺基(“Su”)、对硝基苯氧基和吡啶-2-基氧基。
术语“亲核基团”指通过给出电子对而与接受电子的基团(比如亲核试剂)反应的富电子官能团。
术语“亲电基团”指通过接受电子对而与给电子基团(比如亲核试剂)反应的缺电子官能团。Michael受体是亲电性基团的亚类。当接触亲核试剂时，其经历Michael反应。典型的Michael受体包含α，β-不饱和酮部分。
式II的示例性化合物显示如下：
在另一方面，本发明涉及制备式I的蛋白质-聚合物缀合物的方法，其中蛋白质部分P的N末端的氨基与连接性官能团G3相连。所述方法包括使N末端游离的蛋白质H-P与具有和上述式II相同(只是X为离去基团)的式的二聚合物分支分子偶联。所述N末端游离的蛋白质H-P指其中蛋白质部分P的末端氨基的氮原子与氢原子H键合的蛋白质。换言之，H-P具有末端伯氨基或仲氨基。作为替代，所述方法包括(1)使上述N末端游离蛋白质H-P与具有和上述式I<相同(只是G3是键，n是0或1-9的整数并且X是CHO)的式的二聚合物分支分子偶联；和(2)还原所述偶联产物以形成蛋白质-聚合物缀合物。
干扰素是一种用于治疗乙型肝炎病毒(HBV)感染或丙型肝炎病毒(HCV)感染的免疫调节药物。此外，干扰素(例如α干扰素)可用于治疗非霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、慢性髓性白血病、AIDS相关的卡波西肉瘤、滤泡性淋巴瘤、恶性黑素瘤和尖锐湿疣。因此，本发明的另一方面涉及利用本文中所述的干扰素-聚合物缀合物治疗任何上述病症的方法。
本发明还涉及包含用于任何上述病症的干扰素-聚合物缀合物的组合物、以及此治疗用途和所述缀合物在制备用于治疗这些病症中之一的药物中的用途。
本发明的一个或多个实施方案的详细描述在以下的说明书中进行阐明。基于本申请的说明书和权利要求书，本发明的其它特征、目的和优点将显而易见。
具体实施方式
可通过化学领域中众所周知的合成方法制备本发明的蛋白质-聚合物缀合物。例如，可使连接子分子同时或分别与两个聚合物分子键合并随后使蛋白质分子与所述连接子分子键合以形成本发明的蛋白质-聚合物缀合物。
本发明还涉及式(II)的化合物。这些化合物可用于制备上述蛋白质-聚合物缀合物。它们可通过化学领域内众所周知的合成方法制备。以下给出了示例性的合成方案和实际实施例。
方案1表明了制备本发明的蛋白质-聚合物缀合物的实施例。使包含缩醛基团的二胺化合物1与碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯mPEG(即化合物2)反应而形成二PEG化的化合物3，然后将化合物3转化为醛4。使此醛化合物与具有游离氨基的化合物反应通过还原性烷基化而得到本发明的蛋白质-聚合物缀合物。
方案1
由此合成的蛋白质-聚合物缀合物可通过诸如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、电泳、透析、超滤或超离心的方法而进一步纯化。
上述化学反应包括使用溶剂、试剂、催化剂、保护基团和脱保护基团的试剂、以及某些反应条件。它们还可包括在本文中所具体描述的步骤之前或之后添加或除去合适保护基团的步骤，以最终实现蛋白质-聚合物缀合物的合成。另外，可以以可选的顺序或次序进行各种合成步骤以得到所期望的蛋白质-聚合物缀合物。可用于合成可适用的蛋白质-聚合物缀合物的合成化学转化和保护基团方法(保护和脱保护)是本领域中已知的，包括例如R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCH Publishers(1989)、T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groupsin Organic Synthesis，2d.Ed.，John Wiley和Sons(1991)、L.Fieser和M.Fieser，Fieser and Fieser′s Reagents for Organic Synthesis，JohnWiley and Sons(1994)、以及L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagentsfor OrganicSynthesis，John Wiley and Sons(1995)及其后来的版本中所述的那些。
本发明的缀合物具有非常高的纯度。即在80％或更多的缀合物分子中，聚合物部分与同一蛋白质部分N末端的同一氮原子相连。换言之，在至少80％的缀合物分子中，所述蛋白质部分在所有方面都是相同的，包括其序列和其与所述聚合物部分的键合位置。
本发明的缀合物在缀合物的形式中可以是药物活性的。或者，其可通过酶促裂解所述蛋白质部分和所述聚合物部分间的连键而在体内释放药物活性的蛋白质(例如通过水解)。体内裂解连键所涉及的酶的实例包括氧化酶(例如过氧化物酶、胺氧化酶或脱氢酶)、还原酶(例如酮还原酶)和水解酶(例如蛋白酶、酯酶、硫酸酯酶或磷酸酯酶)。
因此，本发明的一个方面涉及施用有效量的一种或多种上述蛋白质-聚合物缀合物用于治疗疾病(例如HBV或HCV感染)的方法。具体地说，可通过给对象以有效量施用一种或多种所述蛋白质-聚合物缀合物而治疗疾病。这样的对象可通过医护人员基于来自任何合适的诊断方法的结果而确认。
本文所用的术语“治疗”被定义为出于治愈、缓解、减轻、治疗或改善病症、所述病症的症状、所述病症的继发疾病或病症、或所述病症的易患病体质的目的而给具有所述病症、所述病症的症状、所述病症的继发疾病或病症、或所述病症的易患病体质的对象(人或动物)应用或施用包含蛋白质-聚合物缀合物的组合物。“有效量”指对所治疗对象发挥治疗作用的蛋白质-聚合物缀合物的量。所述治疗作用可以是客观的(即可通过某些试验或指标衡量的)或主观的(即对象表现出来的效果的指征或感觉到效果)。
本发明还涉及一种药物组合物，其包含有效量的至少一种上述蛋白质-聚合物缀合物和可药用载体。另外，本发明包括给患有一种或多种疾病的患者施用有效量的一种或多种所述蛋白质-聚合物缀合物的方法。本领域技术人员公认，根据例如蛋白质-聚合物缀合物的水解速率、待治疗疾病的类型、施用途径、赋形剂的使用以及与其它治疗剂联用的可能性，有效剂量可以变化。
为实施本发明的方法，可以胃肠外、口服、经鼻、直肠、局部或口含施用具有一种或多种上述化合物的组合物。本文中使用的术语“胃肠外”指皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内、腹膜内、气管内或颅内注射，以及任何合适的输注技术。
无菌注射组合物可以是在无毒的胃肠外可接受稀释剂或溶剂中的溶液或混悬液，如在1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的载体和溶剂中，可应用的有甘露醇、水、林格氏液(Ringer’s solution)和氯化钠等渗溶液。此外，不挥发油是作为溶剂或混悬介质(例如合成的甘油单酯或甘油二酯)而常规施用的。脂肪酸(比如油酸及其甘油酯衍生物)可用于制备注射剂，天然的可药用油，比如橄榄油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙基化的形式同样地可以。这些油溶液或混悬液还可包含长链醇稀释剂或分散剂，或羧甲基纤维素或类似的分散剂。其它常用的表面活性剂(比如吐温类或司盘类)或其它类似的乳化剂或常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的生物利用度增强剂也可用于制剂的目的。
口服施用的组合物可以是任何口服可接受的剂型，包括胶囊、片剂、乳剂和含水的混悬液、分散剂和溶液。在片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还可以加入润滑剂，比如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用而言，可用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服施用含水混悬液或乳液时，活性成分可被混悬在或溶解在与乳化剂或助悬剂相合并的油相中。如果需要，可加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
可根据药物制剂领域中众所周知的技术制备鼻气雾剂或吸入剂组合物。例如，利用苄醇或其它合适的防腐剂、用于增加生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或本领域中公知的其它增溶剂或分散剂，将这样的组合物制备成在盐水中的溶液。也可以以用于直肠施用的栓剂的形式施用含有一种或多种上述化合物的组合物。
可药用载体通常与一种或多种上述活性化合物使用。药物组合物中的载体必须是“可接受的”，其意为它与所述组合物的活性成分相兼容(并且优选地能稳定所述活性成分)并且对所待治疗的对象无害。一种或多种增溶剂可用作药物赋形剂用于递送上述化合物。其它载体的实例包括胶体二氧化硅、硬脂酸镁、纤维素、月桂基硫酸钠和D&C黄#10。
可使用合适的体外方法来初步评价上述缀合物在抑制乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒中的效力。还可通过体内方法检验所述缀合物在治疗乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染中的效力。例如，可将其施用给患有乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染的动物(例如小鼠模型)或人，然后评价其疗效。基于这些结果，还可以确定剂量范围和施用途径。
以下实施例仅被解释为举例说明的，无论如何都不以任何方式限制本公开内容的其余部分。相信本领域技术人员在本文说明书的基础上，不需要进一步的努力即可最大程度地利用本发明。本文中引用的全部公开文献以整体通过引用并入本文中。
二PEG醛的制备
Su＝琥珀酰亚胺基
根据Bioconjugate Chem.1993，4，568-569中描述的方法，由购自SunBio Inc.，CA，USA的20 kD mPEGOH制备20kD的PEGO(C＝O)OSu。
向含有20kD PEGO(C＝O)OSu(1.72g，86.0μmol)的烧瓶中加入6-(1，3-二氧戊环-2-基)己烷-1，5-二胺在二氯甲烷中的溶液(11.97g溶液含有9.03mg二胺，47.8μmol)。在PEGO(C＝O)OSu完全溶解后，加入N，N-二异丙基乙胺(79μL，478μmol)。在室温下搅拌反应混合物24小时，然后在搅拌下滴加甲基叔丁基醚(200mL)。收集所得的沉淀物并在真空下干燥而得到白色固体的二PEG缩醛(1.69g，98％)。
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ7.16(t，J＝5.2Hz，1H)，7.06(d，J＝8.8Hz，1H)，4.76(t，J＝4.8Hz，1H)，4.10-3.95(m，4H)，1.80-1.65(m，1H)，1.65-1.50(m，1H)，1.48-1.10(m，6H)。
将二PEG缩醛(4.0g，0.2mmol)混悬于pH2.0的缓冲液(柠檬酸，40mL)中。在35℃搅拌反应混合物24小时，然后以二氯甲烷萃取(3×50mL)。将合并的有机层通过硫酸镁干燥、浓缩，然后重新溶解在二氯甲烷(20mL)中。在搅拌下将所述溶液滴加至甲基叔丁基醚(400mL)中。收集所得的沉淀物并减压干燥而得到白色固体的二PEG醛(3.8g，95％)。
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ9.60(s，1H)，7.24(d，J＝8.4Hz，1H)，7.16(t，J＝5.2Hz，1H)，4.10-3.95(m，4H)，3.95-3.80(m，1H)，3.00-2.85(m，2H)，2.58-2.36(m，2H)，1.46-1.15(m，6H)。
被修饰的干扰素的制备
通过PCR方法，利用人基因组DNA作为模板克隆被修饰的重组人α2b干扰素。基于人α2b干扰素(GenBank Accession # J00207，2008年1月8号)的侧翼序列合成寡核苷酸。将得到的PCR产物亚克隆进pGEM-T载体(Promega)中。通过pGEM-T克隆而再次PCR扩增IFN变体，随后利用NdeI/BamHI作为克隆位点，将其亚克隆进蛋白质表达载体pET-24a(Novagen)中，所述pET-24a为一种T7RNA聚合酶启动子驱动的载体。然后将载体pET-24a转化到大肠杆菌(E.coli)BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(Stratagene)菌株中。通过在卡那霉素(50μg/mL)和氯霉素(50lμg/mL)存在下维持所述转化的大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL而选择高表达的克隆。
利用Terrific肉汤培养基(BD，200mL)在1000mL烧瓶中增殖具有Pro-IFN基因的BL21-CodonPlus(DE 3)-RIL。在37℃下230rpm摇动烧瓶16小时。在5升的发酵罐(Bioflo 3000；New BrunswickScientific Co.，Edison，NJ)中进行分批发酵和补料分批发酵。分批发酵使用150mL过夜预培养接种物和3L添加有以下物质的Terrific肉汤培养基：卡那霉素(50μg/mL)、氯霉素(50μg/mL)、0.4％甘油、和0.5％(v/v)的痕量元素(10g/L的FeSO4·7H2O、2.25g/L的ZnSO4·7H2O、1g/L的CuSO4·5H2O、0.5g/L的MnSO4·H2O、0.3g/L of H3BO3、2g/L的CaCl2·2H2O、0.1g/L的(NH4)6Mo7O24、0.84g/L EDTA、50ml/LHCl)。溶解氧的浓度控制在35％，通过加入5N NaOH水溶液将pH保持在7.2。制备含有600g/L葡萄糖和20g/L MgSO4·7H2O的补加溶液。当pH上升到大于所述设定点的值时，加入合适体积的补加溶液以增加培养基肉汤中的葡萄糖浓度。通过加入IPTG至1mM的最终浓度而诱导Pro-IFN基因的表达，孵育3小时后收获所述培养基肉汤。
用TEN缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、100mMNaCl)以合适的1:10(湿重g/mL)的比例重新混悬所收集到的细胞团块并通过微射流均质机(microfluidizer)将其破坏，然后在10,000rpm下离心20分钟。用TEN缓冲液洗涤所述含有包涵体(IB)的团块两次并如上所述进行离心。然后将所述含有IB的团块混悬于150mL 4M的盐酸胍(GuHCl)水溶液中并在20,000rpm下离心15分钟。然后使IB溶解在50mL 6M的GuHCl溶液中。将GuHCl溶解的物质在20,000rpm下离心20分钟。通过将变性的IB在1.5L新鲜制备的重折叠缓冲液(refolding buffer)(100mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5M L-精氨酸、2mM EDTA)中稀释而启动重折叠，所述重折叠缓冲液仅在添加期间搅拌。然后在不搅拌的条件下孵育所述重折叠反应混合物48小时。被重折叠的重组人α2b干扰素(即Pro-IFN)通过20mM Tris缓冲液(含有2mM EDTA和0.1M脲，pH7.0)进行透析以通过Q-琼脂糖凝胶柱色谱而进一步纯化。
将所述被重折叠的重组人蛋白质Pro-IFN上样到Q-琼脂糖凝胶柱(GE Amersham Pharmacia，Pittsburgh，PA)上。所述柱被预先平衡并用20mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)洗涤。用20mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.0)和200mM NaCl的混合物洗脱产物。基于其在280nm的吸光度，收集含有Pro-IFN的级分。利用Bradford方法(Pierce，Rockford，IL)，通过蛋白质测定试剂盒测定Pro-IFN的浓度。
蛋白质-聚合物缀合物的制备
向上述制备的二PEG醛(1.2g，0.03mmol)在水(72mL)中的溶液中加入2M磷酸钠缓冲液(pH 4.0，5mL)和Pro-IFN(200mg，在22.2mL pH 7.0的含有20mM Tris-HCl和0.2M NaCl的缓冲液中，0.01mmol)。在室温下搅拌反应混合物10分钟，然后加入氰基硼氢化钠的水溶液(400mM，1.25mL，0.5mmol)。在黑暗处搅拌反应混合物16小时并通过SP XL琼脂糖凝胶色谱纯化。基于保留时间和在280nm的吸光度收集含有所期望的聚合物-蛋白质缀合物的级分。利用Bradford方法(Pierce，Rockford，IL)，通过蛋白质测定试剂盒测定所述缀合物的浓度。所述缀合物的分离产率是约40％或更高。
其它实施方案
本说明书中公开的所有特征均可以任何组合进行结合。本说明书中公开的每个特征均可被实现同样、等价或相似目的的可替代特征所替换。因此，除非另外明确说明，所公开的每个特征仅是等价或相似特征的一般系列中的实例。
基于以上说明书，本领域技术人员可容易地确定本发明的必要特征，而不脱离其精神和范围，可以作出本发明的各种变化和改变以使其适应各种应用和条件。因此，其它的实施方案也在以下权利要求的范围内。
Claims (23)
1.一种包含至少一个聚合物部分、蛋白质部分和连接子的基本上纯的缀合物，其中所述至少一种聚合物部分与所述连接子连接；所述蛋白质部分N末端的氮原子与所述连接子键合；所述连接子是共价键、C1-10亚烷基、C2-10亚烯基或C2-10亚炔基；所述蛋白质部分是α干扰素部分、人生长激素部分或促红细胞生成素部分。
2.权利要求1的缀合物，其中所述蛋白质部分是在N末端含有1-4个其它氨基酸残基的被修饰的干扰素α2b部分。
3.权利要求2的缀合物，其中所述缀合物的纯度是90％或更高。
4.式I的蛋白质-聚合物缀合物：
式I
其中
R1、R2、R3、R4和R5中每一个各自独立地是H、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、芳基、杂芳基、C3-8环烷基或C3-8杂环烷基；
A1和A2各自独立地是聚合物部分；
G1、G2和G3各自独立地是键或连接性官能团；
P是蛋白质部分；
m是0或1-10的整数；和
n是1-10的整数。
5.权利要求4的缀合物，其中G3是键，P是蛋白质部分，其中N末端的氨基与G3键合。
6.权利要求5的缀合物，其中A1和A2各自是分子量为10-30kD的mPEG部分。
7.权利要求6的缀合物，其中G1和G2各自是
其中O与A1或A2相连，NH与式I中所示的碳原子相连。
8.权利要求7的缀合物，其中P是在N末端包含1-4个其它氨基酸残基的被修饰的干扰素部分。
9.权利要求8的缀合物，其中n是2。
10.权利要求9的缀合物，其中所述缀合物是
其中mPEG的分子量为20kD，IFN为干扰素α2b部分。
11.式II的化合物
式II
其中
X是反应基团；
A1和A2各自独立地是聚合物部分；或者A1和A2中的一个是聚合物部分，另一个是反应基团；
G1、G2和G3各自独立地是键或连接性官能团；
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地是H、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、芳基、杂芳基、C3-8环烷基、C3-8杂环烷基或-G4-X’，G4是键或连接性官能团，X’是反应基团；和
m和n各自独立地是0或1-10的整数；
前提条件是如果-G3-X是-CO(O)-N-琥珀酰亚胺基，则n是1-10的整数。
12.权利要求11的化合物，其中A1和A2各自独立地是聚合物部分；R1、R2、R3、R4和R5各自独立地是H、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、芳基、杂芳基、C3-8环烷基或C3-8杂环烷基；X是CH(＝O)或离去基团。
13.权利要求12的化合物，其中X是CH(＝O)且G3是键。
14.权利要求13的化合物，其中A1和A2各自是分子量为12-30kD的mPEG部分。
15.权利要求11的化合物，其中G1和G2各自是
其中O与A1或A2相连，NH与式I中所示的碳原子相连，并且n是1-10的整数。
16.一种制备式I的蛋白质-聚合物缀合物的方法：
式I
其中R1、R2、R3、R4和R5各自独立地是H、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、芳基、杂芳基、C3-8环烷基或C3-8杂环烷基；
A1和A2各自独立地是聚合物部分；
G1、G2和G3各自独立地是键或连接性官能团；
P是蛋白质部分，其中N-末端氨基与G3相连；
m是0或1-10的整数；和
n是1-10的整数；
所述方法包括：
使N末端游离的蛋白质H-P与式II的二聚合物分支分子偶联，其中P是蛋白质部分：
式II
其中R1、R2、R3、R4、R5、A1、A2、G1、G2、G3、m和n如上所定义，X为离去基团；
或者
使N末端游离的蛋白质H-P与式II的二聚合物分支分子反应，其中P是蛋白质部分：
式II
其中R1、R2、R3、R4、R5、A1、A2、G1、G2和m如上所定义，G3是键，n是0或1-9的整数，X是CHO；然后还原所述偶联产物以形成所述蛋白质-聚合物缀合物。
17.权利要求16的方法，其中A1和A2各自是分子量为20kD的mPEG部分。
18.权利要求17的方法，其中G1和G2各自是
其中O与A1或A2相连，NH与式I中所示的碳原子相连。
19.权利要求18的方法，其中P是在N末端包含1-4个其它氨基酸残基的被修饰的干扰素部分。
20.权利要求19的方法，其中P是
IFN是干扰素α2b部分，其N末端与所述羰基键合。
21.权利要求20的方法，其中G3是键且X是CH(＝O)。
22.一种治疗丙型肝炎病毒感染或乙型肝炎病毒感染的方法，其包括给有此需要的对象施用有效量的式I的蛋白质-聚合物缀合物：
式I
其中
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地是H、C1-5烷基、C2-5烯基、C2-5炔基、芳基、杂芳基、C3-8环烷基或C3-8杂环烷基；
A1和A2各自独立地是聚合物部分；
G1、G2和G3各自独立地是键或连接性官能团；
P是干扰素部分；
m是0或1-10的整数；和
n是1-10的整数。
23.一种治疗丙型肝炎病毒感染或乙型肝炎病毒感染的方法，其包括给有此需要的对象施用有效量的基本上纯的缀合物，所述缀合物包含至少一个聚合物部分、蛋白质部分和连接子，其中所述至少一个聚合物部分与所述连接子连接；所述蛋白质部分N末端的氮原子与所述连接子键合；所述连接子是共价键、亚烷基、亚烯基或亚炔基；所述蛋白质部分是干扰素α2b部分。
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