BRPI0814482B1 - conjugado polímero-proteína, composto e método de preparação de um conjugado polímero-proteína - Google Patents
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Abstract
CONJUGADO SUBSTANCIALMENTE PURO QUE COMPREENDE PELO MENOS UMA PORÇÃO DE POLÍMERO, UMA PORÇÃO DE PROTEÍNA E UM LIGANTE, CONJUGADO DE PROTEÍNA E POLÍMERO, COMPOSTO, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UM CONJUGADO DE PROTEÍNA E POLÍMERO, MÉTODO DE TRATAMENTO DE INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C OU INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE B E MÉTODO DE TRATAMENTO DE INFECÇÕES POR VÍRUS DA HEPATITE C OU INFECÇÕES POR VÍRUS DA HEPATITE B A presente invenção refere-se a conjugados de proteína e polímero descritos no relatório descritivo. Também são descritos um método de preparação de um conjugado de proteína e polímero e seu uso no tratamento de infecções por vírus da hepatite B ou vírus da hepatite C.
Description
Avanços na biologia celular e tecnologias de proteínas recombinantes geraram o desenvolvimento de produtos terapêuticos de proteína.
Ainda existem, entretanto, obstáculos importantes.
A maior parte das proteínas é susceptível a degradação proteolítica e, portanto, possui meia vida curta no sistema circulatório. Outras desvantagens incluem baixa solubilidade em água e a indução de anticorpos neutralizantes.
A ligação de um polímero, tal como polietileno glicol (PEG), a uma proteína obstrui o acesso de enzimas proteolíticas à cadeia principal de proteína, o que resulta em aumento da estabilidade da proteína. Além disso, ela pode também aumentar a solubilidade em água e minimizar a imunogenicidade. Existe a necessidade de métodos eficazes de ligação de polímero a proteínas.
Um aspecto da presente invenção refere-se a um conjugado substancialmente puro (à 80% de pureza) que contém uma ou mais porções de polímeros, uma porção de proteína e um ligante. No conjugado, a (s) porção(ões) de polímero é (são) ligada(s) ao ligante; o átomo de nitrogênio do terminal N da porção de proteína é ligado ao ligante; o ligante é uma ligação cova lente, alquileno C1-10, alquenileno ou alquinileno C2-10; e a porção de proteína é uma porção de interferon α, uma porção de hormônio do crescimento humano ou uma porção de eritropoietina. Preferencialmente, o conjugado possui uma pureza de 90% ou mais. Este conjugado possui uma meia-vida in vivo inesperadamente longa. Um outro aspecto da presente invenção refere-se à conjugados de proteína e polímero da Fórmula I:
em que cada um dentre Rlz R2, R3, R4 e R5, independentemente, é H, alquila Ci-5/ alquenila C2.5, alquinila C2-5, arila, heteroarila, cicloalquila C3.8 ouheterocicloalquila C3_8; cada um dentre Ai e A2, independentemente, é uma porção de polímero; cada um dentre Gi, G2 e G3, independentemente, é uma ligação ou um grupo funcional de ligação; P é uma porção de proteína; m é 0 ou umnúmero inteiro de 1 a 10; e n é um número-inteiro de 1 a 10.
Com referência à fórmula acima, o conjugado de proteína e polímero pode possuir uma ou mais das características a seguir: G3 é uma ligação e P é uma porção de proteína na qual o grupo amino no terminal N é ligado a G3; Ai e A2 são porções de óxido de polialquileno que possuemum peso molecular de 2 a 100 kD (preferencialmente 10 a 30 kD) , cada um dentre Gi e G2 é
(em que O é ligado a Ai ou A2 e NH é ligado a um átomo de carbono conforme exibido na Fórmula I) ou cada um dentre Gx e G2 é ureia, sulfonamida ou amida (em que N é ligado a um átomo de carbono conforme exibido na Fórmula I); m é 4, n é 2 e cada um dentre Ri, R2, R3, R4 e R5 é H; e P é uma porção interferon ou uma porção interferon modificada que contém de um a quatro resíduos de aminoácidos adicionais.
O termo "alquila"designa um radical hidrocarbonetode cadeia linear ou ramificado monovalente. Exemplos de grupos alquila incluem metila, etila, n-propila, isopropila, terc-butila e n-pentila. De forma similar, o termo "alquenila" ou "alquinila" designa um radical hidrocarboneto 10 de cadeia linear ou ramificado monovalente que contém uma ou mais ligações duplas C=C ou uma ou mais ligações triplas C=C.
O termo "alquileno" designa um radical hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificado bivalente. De í forma similar, o termo "alquenileno" ou "alquinileno" designa um radical hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificado bivalente que contém uma ou mais ligações duplas C=C ou uma ou mais ligações triplas C=C.
O termo "arila" designa um sistema de anéis hidrocarbonetos (monocíclicos ou bicíclicos) que contém pelo 20 menos um anel aromático. Exemplos' dè porções arila incluem, mas sem limitar-se a fenila, naftila e pirenila.
O termo "heteroarila" designa um sistema de anéis hidrocarbonetos (monocíclicos ou bicíclicos) que contém pelo menos um anel aromático que contém pelo menos um heteroátomo „ 25 tal como O, N ou S como parte do sistema de anéis e o restante é carbono. Exemplos de porções heteroarila incluem, * mas sem limitar-se a furila, pirrolila, tienila, oxazolila, imidazolila, tiazolila, piridinila, pirimidinila, quinazolinila e indolila.
O termo "cicloalquila" designa um sistema de anéismonocíclicos ou bicíclicos parcial ou totalmente saturados que contém apenas átomos de anéis de carbono. Exemplos incluem, mas sem limitações, ciclopropanila, ciclopentanila e ciclo-hexanila.
O termo "heterocicloalquila" designa um sistema de anéis monocíclicos ou bicíclicos parcial ou totalmente saturados que contém, além de carbono, um ou mais fc, 5 heteroátomos (tais como O, N ou S) como átomos de anéis. Exemplos incluem, mas sem limitar-se a piperidina, piperazina, morfolina, tiomorfolina e 1,4-oxazepano.
Alquila, alquenila, alquinila, arila,heteroarila, cicloalquila e heterocicloalquila mencionados 10 no presente incluem porções substituídas e não substituídas. Exemplos de substituintes incluem alquila Çi- Cio, alquenila C2-Ci0, alquinila C2-Ci0, cicloalquila C3-C8, cicloalquenila C5-C8, alcóxi Ci-C10, arila, arilóxi, 5 heteroarila, heteroarilóxi, amino, alquilamino CÍ-CIQ, dialquilamino Ci-C20, arilamino, diarilamino, hidroxiamino, alcoxiamino, alquilsulfonamida Ci-Ci0, arilsulfonamida, hidróxi, halogênio, tio, alquiltio Ci-Ci0, ariltio, ciano, nitro, acila, acilóxi, carboxila e éster carboxílico.
A expressão "porção de óxido de polialquileno"_ designa um radical monovalente derivado de óxido de polialquileno linear, ramificado ou estrelado. O peso molecular de uma porção de óxido de polialquileno pode ser de 2 a 100 kD. A porção de óxido de polialquileno é saturada ou insaturada. Exemplos de uma porção de óxido de polialquileno .25 incluem, mas sem limitar-se a óxido de polietileno, polietileno glicol, óxido de póli-isopropileno, óxido de* polibutenileno e seus copolímeros. Outros polímeros tais como dextran, álcoois polivinílicos, poliacrilamidas ou polímeros com base em carbo-hidratos podem também ser utilizados para 3 0 substituir a porção de óxido de polialquileno, desde que não sejam antigênicas, tóxicas nem gerem reação imunológica. A porção de óxido de polialquileno é substituída ou não substituída. Ela pode ser, por exemplo, polietileno glicol tampado com metóxi (mPEG).
A expressão "porção de proteína" designa um radical monovalente derivado de uma proteína de ocorrência natural ou uma proteína modificada. A proteína de ocorrência natural pode ser interferon α, interferon β, hormônio do crescimento humano, eritropoietina e fator estimulante do cólon granulócito, ou anticorpo. A proteína modificada pode ser, por exemplo, uma proteína que contenha interferon OÍ e de um a quatro resíduos de aminoácidos adicionais no terminal N da interferon. Um exemplo desse interferon modificado é
, em que IFN representa uma porção interferon α2t, cujo grupo amino no terminal N é ligado ao grupo carbonila.
A expressão "interferon oc" designa uma família de proteínas específicas de espécies altamente homólogas que inibem a reprodução virai e a proliferação celular e modulam reação imunológica. Vide Bonnem et al, J. Biol. Response Mod.,1984, 3 (6): 580-598; e Finter, J. Hepatol. , 1986, 3 Supl. 2: S157-160. ~ ~
Muitos tipos de proteínas interferon α são disponíveis comercialmente, incluindo interferon Intron-A fornecida pela Schering Corporation, Kenilworth, NJ, interferon Roferon fornecida pela Hoffmann-La Roche, Nutley NJ, alfa 2 interferon Berofor fornecida pela Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefield, Conn., Sumiferon fornecida pela Sumitomo, Japão, e interferon alfa-nl (INS) Wellferon fornecida pela Glaxo-Wellcome Ltd., Londres, Reino Unido.
Encontram-se relacionadas abaixo sequências de aminoácidos de cinco exemplos de proteínas interferon α humano, em forma precursora ou em forma madura: maltfallva llvlsckssc svgcdlpqth slgsrrtlml laqmrrislf sclkdrhdfg fpqeefgnqf qkaetipvlh emiqqifnlf stkdssaawd etlldkfyte lyqqlndlea cviqgvgvte tplmkedsil avrkyfqrit lylkekkysp cawewraei mrsfslstnl qeslrske (Vide Krasagakis et al, Cancer Invest.26 (6), 562- t 5 568, 2008) cdlpqthslg srrtlmllaq mrkislfscl kdrhdfgfpq eefgnqfqka etipvlhemi qqifnlfstk dssaawdetl Idkfytelyqqlndleacvi qgvgvtetpl mkedsilavr kyfqritlyl kekkyspcaw evvraeimrs fslstnlqes Irske 10 (Vide Klaus, et al, J. Mol. Biol. 274 (4), 661-675,1997)mcdlpqthsl gsrrtlmlla qmrrislfsc Ikdrhdfgfpqeefgnqfqk aetipvlhem iqqifnlfst kdssaawdet lldkfytelyqqlndleacv iqgvgvtetp Imkedsilav rkyfqritly Ikekkyspca wewraeimr sfslstnlqe slrske (Vide Acesso GenBank Número AAP20099, versão 30-APR-2003) mallfpllaa Ivmtsyspvg slgcdlpqnh gllsrntlvlIhqmrrispf Iclkdrrdfr fpqemvkgsq Iqkahvmsvl hemlqqifsl fhterssaaw nmtlldqlht elhqqlqhle tcllqvvgeg esagaisspa Itlrryfqgi rvylkekkys dcawevvrme imkslflstn mqerlrskdr dlgss (Vide Capon et al, J. Mol. Cell. Biol.5 (4): 768- 779, 1985)Isyksicslg cdlpqthslg nrralillaq mgrispfscl . 25 kdrhdfglpq eefdgnqfqk tqaisvlhem iqqtfnlfst edssaáweqsllekfstely qqlnnleacv iqevgmeetp Imnedsilav rkyfqritly Itekkyspca wewraeimr slsfstnlqk rlrrkd (Vide Lund et al, J. Interferon Res.5 (2), 229- 238, 1985) 30 Em um exemplo, a proteína interferon ot utilizada na fabricação do conjugado conforme a presente invenção contém uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% (tal como 85%, 90%, 95% ou 99%) idêntica a uma das sequências de aminoácidos relacionadas acima ou ao seu fragmento que corresponde a um interferon alfa madura.
A expressão "hormônio do crescimento humano" designa o hormônio do crescimento humano de ocorrência 5 natural, seja em forma precursora ou madura, e suas variantes funcionais, ou seja, que contêm uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% (tal como 85%, 90%, 95% ou 99%) idêntica ao hormônio do crescimento humano de ocorrência natural e que possui a mesma atividade fisiológica daquele hormônio do 10 crescimento humano. As sequências de aminoácidos do hormônio do crescimento humano de ocorrência natural (em forma precursora e madura) são exibidas abaixo: matgsrtsll lafgllclpw yipkeqkysf IqegsafptiIqnpqtslcf plsrlfdnam sesiptpsnr Irahrlhqla fdtyqefeea eetqqksnle llrisllliq swlepvqflr svfanslvyg asdsnvydll kdleegiqtl mgrledgspr tgqifkqtys kfdtnshndd allknyglly cfrkdmdkve tflrivqcrs vegscgf (precursor) fptiplsrlf dnamlrahrl hqlafdtyqe feeayipkeq kysfIqnpqt slcfsesipt psnreetqqk snlellrisl lliqswlepv qf Irsvfans Ivygasdsnv ydllkdleeg iqtlmgrled gsprtgqífk qtyskfdtns hnddallkny gllycfrkdm dkvetflriv qcrsvegscg f(forma madura)
Eritropoietina (EPO), produzida pelo fígado ou rim, é um hormônio de glicoproteína que controla a eritropoiese ou ,25 produção de glóbulos vermelhos do sangue. Vide a Patente Norte-Americana n° 5.621.080. As sequências de aminoácidos de ■í EPO humana (em forma precursora e madura) são exibidas abaixo: mgvhecpawl wlllsllslp Iglpvlgapp rlicdsrvle 30 rylleakeae nittgcaehc slnenitvpd tkvnfyawkr mevgqqavev wqglallsea vlrgqallvn ssqpweplql hvdkavsglr slttllralg aqkeaisppd aasaaplrti tadtfrklfr vysnflrgkl klytgeacrt gdr (precursor) apprlicdsr vlerylleak eaekittgca ehcslnekit vpdtkvnfya wkrmevgqqa vevwqglall seavlrgqal Ivkssqpwep Iqlhvdkavs glrslttllr algaqkeais ppdaasaapl rtitadtfrk Ifrvysnflr gklklytgea crtgdr (forma madura)
Uma proteína de eritropoietina utilizada paraelaborar o conjugado conforme a presente invenção pode ser uma proteína EPO, seja em forma precursora ou madura, produzida por uma espécie apropriada, tal como humana, murina, suína e bovina. Em um exemplo, a proteína de 10 eritropoietina contém uma sequência de aminoácidos pelo menos 80% (tal como 85%, 90%, 95% ou 99%) idêntica às sequências de aminoácidos exibidas acima.
O "percentual de identidade" de duas sequências de aminoácidos é determinado utilizando o algoritmo de Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 87: 2264-68, 1990, modificado como em Karlin e Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., 90: 5873-77, 1993. Esse algoritmo é incorporado aos programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990. Pesquisas de proteínas BLAST podem ser realizadas com o programa XBIASTT avaliação = 50, comprimento de palavra = 3, para obter sequências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína conforme a presente invenção. Quando existirem lacunas entre duas sequências, pode-se utilizar BLAST com lacunas conforme ,25 descrito em Altschul et al, Nucleic Acids Res.25 (17): 3389- 3402, 1997. Ao utilizar-se os programas BLAST e BLAST com ■ lacunas, podem ser utilizados os parâmetros padrão dos programas correspondentes (tais como XBLAST e NBLAST).
A expressão "grupo funcional de ligação" designa um 30 grupo funcional bivalente, em que uma extremidade é conectada à porção de polímero e a outra extremidade é conectada à porção de proteína. Exemplos incluem, mas sem limitar-se a grupo -O-, -S-, éster carboxílico, carbonila, carbonato, amida, carbamato, ureia, sulfonila, sulfinila, amino, imino, hidroxiamino, fosfonato ou fosfato.
O conjugado de proteína e polímero descrito acima pode apresentar-se na forma livre ou na forma de sal, se 5 aplicável. Um sal pode ser formado, por exemplo, entre um ânion e um grupo com carga positiva (tal como amino) sobre um conjugado de proteína e polímero conforme a presente invenção. Ânions apropriados incluem cloreto, brometo, iodeto, sulfato, nitrato, fosfato, citrato, metanossulfonato, 10 trifluoroacetato e acetato. De forma similar, pode-se também formar um sal entre um cátion e um grupo com carga negativa (tal como carboxilato) sobre um conjugado de proteína e polímero conforme a presente invenção. Os cátions apropriados incluem íon de sódio, íon de potássio, íon de magnésio, íon 15 de cálcio e um cátion de amónio tal como íon de tetrametilamônio.
Além disso, o conjugado de proteína e polímero pode conter uma ou mais ligações duplas ou um ou mais centros assimétricos. Esse conjugado pode ocorrer na forma de 2CT racemato, mistura racêmica, enantiômero isolado, diaestereômero individual, mistura diaestereomérica e formas isoméricas de ligação dupla cis, trans, E ou Z.
Um exemplo do conjugado de proteína e polímero conforme a presente invenção é exibido abaixo:
em que mPEG possui um peso molecular de 20 kD e IFN é uma porção interferon α2b-
Ainda outro aspecto da presente invenção refere-se a compostos que são úteis para a preparação de conjugados de proteína e polímero. Os compostos possuem a Fórmula II:
em que X é um grupo reativo; cada um dentre A3 e A2, independentemente, é uma porção de polímero ou um dentre Ai e A2 é uma porção de polímero e o outro é um grupo reativo; cada um dentre Gi, G2 e G3, independentemente, é uma ligação ou um grupo funcional de ligação; cada um dentre Ri, R2, R3, R4 e R5, independentemente, é H, alquila C1-5,alquenila C2_5, alquinila C2_5, arila, heteroarila, cicloalquila C3_8, heterocicloalquila C3.8 ou -G4-Xz , em que G4 é uma ligação ou um grupo funcional de ligação e X' é um grupo reativo; cada m e n, independentemente, é 0 ou um número inteiro de 1 a 10; desde que, se -G3-X para -CO(O)-N- succinimidila, n é um número inteiro de 1 a 10.
Em uma realização, X, X', Alz A2, Gx, G2, G3, G4, Rlz R2, R3Z R4Z R5 e m são definidos acima e n é um número inteiro de 1 a 10.
Certos compostos da Fórmula II possuem uma ou mais das características a seguir: a porção de polímero pode possuir um ou mais grupos reativos; G3 é uma ligação e P é uma porção de proteína na qual o grupo amina no terminal N é ligado a G3; A3 e A2 são porções de óxido de polialquileno que possuem peso molecular de 2 a 100 kD (preferencialmente 12 a 30 kD), cada um dentre Gi e G2 é
, em que O é ligado a Ai ou A2 e NH é ligado a um átomo de carbono conforme exibido na Fórmula I; m é 4; n é 1 ; cada um dentre Rlz R2, R3, R4 e R5 é H; e X é CH(=O) ou X é um grupo residual (tal como succinimidila ou p-nitrofenóxi).
A expressão "grupo reativo" designa um grupo funcional que pode reagir com um outro grupo funcional, de forma que seja substituído pelo outro grupo funcional ou seja 5 ligado ao outro grupo funcional. Um grupo reativo pode ser um grupo residual, um grupo nucleofílico, um aldeído ou um receptor Michael.
A expressão "grupo residual" designa um grupo funcional que pode separar-se, mediante deslocamento direto 10 ou ionização, com o par de elétrons de uma de suas ligações covalentes (vide, por exemplo, F. A. Carey e R. J. Sunberg, Advanced Organic Chemistry,terceira edição, Plenum Press, 1990) . Exemplos de um grupo residual incluem, mas sem limitações, metanossulfonato, triflato, p-toluenossulfonato, 15 iodo, brometo, cloreto, trifluoroacetato, succinimidila ("Su"), p-nitrofenóxi e piridin-2-ilóxi.
A expressão "grupo nucleofílico" designa um grupo funcional rico em elétrons, que reage com um grupo receptor de elétrons, tal como eletrófilo, doando um par de elétrons.
A expressão "grupo eletrofílico" designa um grupofuncional pobre em elétrons, que reage com um grupo doador de elétrons, tal como um nucleof ilo, aceitando um par de elétrons. Receptores de Michael são um subconjunto de grupos eletrofílicos. Mediante contato com um nucleofilo, eles .25 sofrem reação de Michael. Um receptor de Michael típico contém uma porção de cetona OÍ,β-insaturada.
Exemplos de compostos da Fórmula II são exibidosabaixoPEG Molecules For Coupling With Proteins
Em ainda outro aspecto, a presenteinvençãoapresenta um método de preparação de conjugados de proteína e polímero da Fórmula I, em que o grupo amino no terminal N da porção de proteína P é ligado ao grupo funcional de ligaçãoG3. O método inclui o acoplamento de uma proteína H-P livre de terminal N com uma molécula ramificada de dipolímero com uma fórmula idêntica à Fórmula II exibida acima, exceto pelo fato de que X é um grupo residual. A proteína H-P livre determinal N designa uma proteína na qual o átomo de nitrogênio no grupo terminal amino da parte de proteína P é ligado ao átomo de hidrogênio H. Em outras palavras, H-P contém um grupo terminal amino primário ou secundário.Alternativamente, o método inclui (1) acoplamento da proteínaH-P livre de terminal N mencionada acima a uma molécula ramificada dipolimérica com uma fórmula idêntica à Fórmula II exibida acima, exceto pelo fato de que G3 é uma ligação, n é 0 ou um número inteiro de 1 a 9 e X é CHO; e (2) redução doproduto de acoplamento para formar um conjugado de proteína e polímero.
Interferon é uma medicação imunomoduladora para o tratamento de infecções por vírus da hepatite B (HBV) ou 5 vírus da hepatite C (HCV) . Além disso, interferon (tal como interferon OÍ) pode ser utilizada para o tratamento de linfoma não de Hodgkin, leucemia de células Hairy, leucemia mielogênica crônica, sarcoma de Kaposis relativo à AIDS, linfoma folicular, melanoma maligno e condiloma acuminata. 10 Desta forma, um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método de tratamento de qualquer dos distúrbios mencionados acima por um conjugado de interferon e polímero descrito no presente.
Também se encontra dentro do escopo da presente 15 invenção uma composição que contém o conjugado de interferon e polímero para uso em qualquer dos distúrbios mencionados acima, bem como o seu uso terapêutico e o uso do conjugado para a fabricação de um medicamento para tratar um desses distúrbios.
Os detalhes de uma ôu Inais realizações da presenteinvenção são apresentados na descrição a seguir. Outras características, objetos e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir do relatório descritivo e das reivindicações.
Conjugados de proteína e polímero conforme a presente invenção podem ser preparados por meio de métodos sintéticos bem conhecidos na técnica química. Pode-se ligar, por exemplo, uma molécula de ligação, simultânea ou 30 separadamente, a duas moléculas de polímero e ligar em seguida uma molécula de proteína à molécula de ligação para formar um conjugado de proteína e polímero conforme a presente invenção.
Também se encontram dentro do escopo da presente invenção os compostos da Fórmula (II) . Esses compostos são úteis na elaboração dos conjugados de proteína e polímero descritos acima. Eles podem ser preparados por meio de métodos sintéticos bem conhecidos na técnica química. São fornecidos abaixo um esquema sintético ilustrativo e um exemplo real.
O Esquema 1 exibe um exemplo de preparação de conjugados de proteína e polímero conforme a presente invenção. O composto de diamina 1, que contém um grupo acetal, reage com carbonato de N-hidroxissuccinimidila mPEG (ou seja, composto 2) para formar composto diPEGilado 3, que é convertido em seguida em aldeído 4. Este composto de aldeído reage com proteína que contém um grupo amino livre por meio de alquilação redutiva para gerar um conjugado de proteína e polímero conforme a presente invenção.
Um conjugado de proteína e polímero sintetizado desta forma pode ser adicionalmente purificado por meio de um método tal como cromatografia de troca de íons, cromatografia de filtragem de gel, eletroforese, diálise, ultrafiltragem ou ultracentrifugação.
As reações químicas descritas acima incluem o uso de solventes, reagentes, catalisadores, reagentes de grupos 5 protetores e grupos desprotetores e certas condições de reação. Elas podem incluir adicionalmente etapas, antes ou depois das etapas descritas especificamente no presente, para adicionar ou remover grupos protetores apropriados a fim de permitir, por fim, a síntese de um conjugado de proteína e 10 polímero. Além disso, podem ser realizadas diversas etapas sintéticas em uma sequência ou ordem alternada para gerar os conjugados de proteína e polímero desejados. Transformações químicas sintéticas e metodologias de grupos de proteção (proteção e desproteção) úteis na síntese de conjugados de 15 proteína e polímero aplicáveis são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, as descritas em R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene e P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis,segunda edição, John Wiley and Sons (1991); L.
Fieser e M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994) ; e L. Paquette, ed. , Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) e suas edições subsequentes.
O conjugado conforme a presente invenção possui uma 25 pureza muito alta. Nomeadamente, em 80% ou mais das moléculas conjugadas, a porção de polímero é ligada ao mesmo átomo de nitrogênio do terminal N da mesma porção de proteína. Em outras palavras, em pelo menos 80% das moléculas conjugadas, a porção de proteína é idêntica em todos os aspectos, 3 0 incluindo a sua sequência e a sua posição de ligação à porção de polímero.
O conjugado conforme a presente invenção pode ser farmaceuticamente ativo na forma de conjugado.
Alternativamente, ele pode liberar uma proteína f armaceuticamente ativa in vivo (tal como por meio de hidrólise) por divisão enzimática da ligação entre a porção de proteína e a porção de polímero. Exemplos de enzimas 5 envolvidas em ligações de divisão in vivo incluem enzimas oxidativas (tais como peroxidases, amino oxidases oudesidrogenases), enzimas redutivas (tais como ceto reductases) e enzimas hidrolíticas (tais como proteases, esterases, sulfatases ou fosfatases).
Desta forma, um aspecto da presente invençãorefere-se a um método de administração de uma quantidadeeficaz de um ou mais dos conjugados de proteína e polímerodescritos acima para o tratamento de doenças (tais comoinfecções por HBV ou HCV) . Especificamente, uma doença pode ser tratada por meio da administração a um paciente de um ou mais dos conjugados de proteína e polímero em uma quantidade eficaz. Esse paciente pode ser identificado por um profissional de assistência médica com base em resultados de qualquer método de diagnóstico apropriado. Da forma utilizada no presente, o termo"tratamento" é definido como a aplicação ou administração de uma composição que inclui um conjugado de proteína e polímero a um paciente (humano ou animal) que possui um distúrbio, um sintoma do distúrbio, uma doença ou distúrbio secundário ao .25 distúrbio ou uma pré-disposição para o distúrbio, com o propósito de curar, aliviar, reduzir, remediar ou melhorar o distúrbio, o sintoma do distúrbio, a doença ou distúrbio secundário ao distúrbio ou a pré-disposição para o distúrbio. "Quantidade eficaz" designa a quantidade de um conjugado deproteína e polímero que confere um efeito terapêutico sobre o paciente tratado. O efeito terapêutico pode ser objetivo (ou seja, mensurável por meio de alguns testes ou marcadores) ou subjetivo (ou seja, um paciente fornece uma indicação ou sente um efeito).
Também se encontra dentro do escopo da presente invenção uma composição farmacêutica que contém uma quantidade eficaz de pelo menos um dos conjugados de proteína 5 e polímero descritos acima e um veículo farmaceuticamente aceitável. Além disso, a presente invenção fornece um método de administração de uma quantidade eficaz de um ou mais dos conjugados de proteína e polímero a um paciente com uma ou mais doenças. As doses eficazes variarão, conforme 10 reconhecido pelos técnicos no assunto, dependendo, por exemplo, da taxa de hidrólise de um conjugado de proteína e polímero, dos tipos de doenças a serem tratados, da via de administração, do uso de excipientes e da possibilidade de uso em conjunto com outro tratamento terapêutico.
Para a prática do método conforme a presenteinvenção, uma composição que contém um ou mais dos compostos mencionados acima pode ser administrada por via parenteral, oral, nasal, retal, tópica ou bucal. O termo "parenteral", da forma utilizada no presente, designa injeção subcutânea, 20 intracutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-arterial, intrassinovial, intraesternal, intratecal, intralesional, intraperitoneal, intratraqueal ou intracraniana, bem como qualquer método de infusão apropriado.
Uma composição injetável estéril pode ser umasolução ou suspensão em um solvente ou diluenteparenteralmente aceitável não tóxico, tal como solução em 1,3-butanediol. Dentre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados, encontram-se manitol, água, solução de 30 Ringer e solução de cloreto de sódio isotônico. Além disso, os óleos fixos são empregados convencionalmente como um solvente ou meio de suspensão (tal como mono ou diglicérides sintéticas). Ácidos graxos, tais como ácido oleico e seus derivados de glicérides, são úteis na preparação de injetáveis, bem como óleos farmaceuticamente aceitáveis naturais, tais como óleo de oliva ou óleo de mamona, especialmente nas suas versões polioxietiladas. Estas 5 suspensões ou soluções em óleo podem também conter um dispersante ou diluente álcool de cadeia longa, carboximetil celulose ou agentes dispersantes similares. Outros tensoativos comumente utilizados, tais como Tweens, Spans ou outros agentes emulsificantes similares, ou aprimoradores da 10 biodisponibilidade que são comumente utilizados na fabricação de formas de dosagem sólidas, líquidas ou outras farmaceuticamente aceitáveis podem também ser empregados com o propósito de formulação.
Uma composição para administração oral pode ser 15 qualquer forma de dosagem aceitável para uso oral, incluindo cápsulas, pastilhas, emulsões e suspensões, dispersões e soluções aquosas. No caso de pastilhas, os veículos comumente utilizados incluem lactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, também são 20 tipicamente adicionados. Para administração oral em forma de cápsulas, os diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Ao administrar-se oralmente suspensões ou emulsões aquosas, o ingrediente ativo pode ser suspenso ou dissolvido em uma fase de óleo combinada com agentes emulsificantes ou «25 formadores de suspensão. Se desejado, podem ser adicionados certos agentes adoçantes, aromatizantes ou corantes.s Pode-se preparar uma composição inalatória ou deaerossol nasal conforme métodos bem conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Essa composição pode ser preparada, 30 por exemplo, na forma de solução salina, empregando álcool benzílico ou outros conservantes apropriados, promotores da absorção para aumentar a biodisponibilidade, fluorocarbonos e/ou outros agentes solubilizantes ou dispersantes conhecidos na técnica. Uma composição que contém um ou mais dos compostos descritos acima pode também ser administrada na forma de supositórios para administração retal.
Um veículo farmaceuticamente aceitável é utilizado rotineiramente com um ou mais compostos ativos mencionados acima. O veículo na composição farmacêutica deve ser "aceitável" no sentido de que é compatível com o ingrediente ativo da composição (e, preferencialmente, capaz de estabilizar o ingrediente ativo) e não prejudicial para o paciente a ser tratado. Um ou mais agentes solubilizantes podem ser utilizados como excipientes farmacêuticos para o fornecimento de um composto mencionado acima. Exemplos de outros veículos incluem óxido de silício coloidal, estearato de magnésio, celulose, lauril sulfato de sódio e Amarelo D&C n° 10.
Podem ser utilizados testes in vitroapropriados para avaliar preliminarmente a eficácia dos conjugados descritos acima na inibição do vírus da hepatite B ou vírus da hepatite C. Os conjugados podem ser adicionalmente examinados pára determinar a süa eficácia no tratamento de infecções por vírus da hepatite B ou da hepatite C por meio de testes in vivo. Eles podem ser administrados, por exemplo, a um animal (tal como um modelo de camundongo) ou um ser humano que possui infecções por vírus da hepatite B ou hepatite C e os seus efeitos terapêuticos são testados em seguida. Com base nos resultados, podem também ser determinadas as faixas de dosagem e vias de administração.
O exemplo abaixo deve ser considerado meramente ilustrativo e não limitador do restante do relatório descritivo de nenhuma forma. Sem elaboração adicional, acredita-se que os técnicos no assunto, com base no presente relatório descritivo, utilizem a presente invenção ao máximo possível. Todas as publicações mencionadas no presente são integralmente incorporadas ao presente como referência. Preparação de di-PEG aldeído
20 kD de PEGO(C=O)OSu foram preparados a partir de 20 kD de mPEGOH adquirido da SunBio Inc., CA, Estados Unidos) conforme o método descrito em Bioconjugate Chem. 1993, 4, 568-569.
Uma solução de 6-(1,3-dioxolan-2-il)hexano-1,5- diamina em diclorometano (11,97 g da solução que contém 9,03 mg de diamina, 47,8 μmol) foi adicionada a um frasco contendo 20 kD de PEGO(C=O)OSu (1,72 g, 86,0 μmol). Após a dissolução completa de PEGO(C=O)OSu, adicionou-se N,N-di- isopropiletilamina (79 μl, 478 μmol) . A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 24 horas e, em seguida, adicionou-se metil t-butil éter (200 ml) em gotas com agitação. O precipitado resultante foi recolhido e seco a vácuo para gerar di-PEG acetal (1,69 g, 98%) na forma de sólido branco. NMR TH (400 MHz, d6-DMSO) δ 7,16 (t, J = 5,2 Hz, 1 H) , 7,06 (d, J = 8,8 Hz, 1 H) , 4,76 (t, J = 4,8 Hz, 1 H) , 4,10-3,95 (m, 4 H) , 1,80-1,65 (m, 1 H) , 1,65-1,50 (m, 1 H) , 1,48-1,10 (m, 6 H).
Di-PEG acetal (4,0 g, 0,2 mmol) foi suspenso em tampão com pH 2,0 (ácido cítrico, 40 ml) . A mistura de reação foi agitada a 3 5 °C por 24 horas e extraída em seguida com diclorometano (3 x 50 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de magnésio, concentradas e novamente dissolvidas em seguida em diclorometano (20 ml) . A solução foi adicionada em gotas a metil t-butil éter (400 ml) mediante agitação. O precipitado resultante foi recolhido e seco sob pressão reduzida para gerar di-PEG aldeído (3,8 g, 95%) na forma de sólido branco. NMR 1H (400 MHz, d6-DMSO) δ 9,60 (s, 1 H) , 7,24 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 7,16 (t, J = 5,2 Hz, 1 H), 4,10-3,95 (m, 4 H) , 3,95-3,80 (m, 1 H) , 3,00-2,85 (m, 2 H) , 2,58-2,36 (m, 2 H) , 1,46-1,15 (m, 6 H) .
Preparação de interferon modificada O^/IFN
Uma interferon α2b humana recombinante modificada foi clonada por meio de um método de PCR utilizando DNA genômico humano como modelo. Os oligonucleotídeos foram sintetizados com base nas sequências laterais de interferon o<2b humana (Acesso GenBank n° J00207, oito de janeiro de 2008). Os produtos de PCR derivados foram subclonados em vetor pGEM-T (Promega). A variante IFN foi novamente amplificada por PCR por meio dos clones de pGEM-T e subclonada em seguida em vetor de expressão de proteína pET- 24a (Novagen) , um vetor dirigido por promotor de T7 RNA polimerase, utilizando Ndel/BamHI como os locais de clonagem. O vetor pET-24a foi transformado em seguida em linhagem BL21- CodonPlus (DE 3)-RIL de E. coli (Stratagene) . Os clones com alta expressão foram selecionados mantendo-se o BL21- CodonPlus (DE 3)-RIL de E. coli transformado na presença de caramicina (50 μg/ml) e cloranfenical (50 μg/ml).
Meio de caldo Terrific (BD, 200 ml) foi empregado para a propagação de BL21-CodonPlus (DE 3)-RIL com gene Pro- IFN em um frasco de 1000 ml. O frasco foi agitado a 37 °C sob 230 rpm por dezesseis horas. Fermentações em bateladas e bateladas alimentadas foram realizadas em um fermentador de jarra de cinco litros (Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co. , Edison NJ) . A fermentação de bateladas utilizou 150 ml 5 de um inoculado de cultivo prévio por uma noite e três litros do meio de caldo Terrific com caramicina (50 μg/ml), cloranfenical (50 ug/ml), 0,4% de glicerol e 0,5% (v/v) de elementos de traço (10 g/1 de FeSO4-7H2O, 2,25 g/1 de ZnSO4-7H2O, 1 g/1 de CuSO4-5H2O, 0,5 g/1 de MnSO4-H2O, 0,3 g/1 de H3BO3, 2 g/1 de CaCl2-2H2O, 0,1 g/1 de (NH4) 6Mo7024, 0,84 g/1de EDTA, 50 ml/1 de HC1) . A concentração de oxigênio dissolvida foi controlada a 35% e o pH foi mantido em 7,2 adicionando-se uma solução aquosa de 5 N NaOH. Foi preparada uma solução de alimentação que contém 600 g/1 de glicose e 20 15 g/1 de MgSO4-7H2O. Quando o pH subiu até um valor maior que oponto definido, adicionou-se um volume apropriado da solução de alimentação para aumentar a concentração de glicose no caldo de cultivo. A expressão do gene Pro-IFN foi induzida por meio da adição de IPTG até uma concentração final de 1 mM 2 0 e o caldo de cultivo foi colhido após incubação por três horas.
A pelota celular recolhida foi novamente suspensa com tampão TEN (50 mM de Tris-HCl (pH 8,0) , 1 mM de EDTA, 100 mM de NaCl) em uma razão aproximada de 1:10 (peso úmido em 25 g/ml), rompida por um microfluidificador e centrifugada em seguida a 10.000 rpm por vinte minutos. A pelota que contém corpo de inclusão (IB) foi lavada duas vezes com tampão TEN e centrifugada conforme descrito acima. A pelota que contém IB foi suspensa em seguida em 150 ml de uma solução aquosa de 4 30 M HC1 guanidínio (GuHCl) e centrifugada a 20.000 rpm por quinze minutos. O IB foi solubilizado em seguida em 50 ml de solução de 6 M de GuHCl. O material solubilizado com GuHCl foi centrifugado a 20.000 rpm por vinte minutos. A nova dobra foi iniciada por meio de diluição de IB desnaturado em 1,5 1 de um tampão de nova dobra recém preparado (100 mM de Tris- HC1 (pH 8,0), 0,5 M de 1-arginina e 2 mM de EDTA) que foi agitada apenas durante a adição. A mistura de reação em nova dobra foi mantida em incubação por 48 horas sem agitação. A interferon α2b humana recombinante dobrada novamente (ou seja, Pro-IFN) sofreu diálise contra 20 mM de tampão Tris (com 2 mM de EDTA e 0,1 M de ureia, pH 7,0) para purificação adicional por meio de cromatografia de coluna Sepharose Q.
A proteína humana recombinante dobrada novamente Pro-IFN foi carregada sobre uma coluna de Sepharose Q (GE Amersham Pharmacia, Pittsburgh PA) . A coluna foi equilibrada previamente e lavada com 20 mM de tampão Tris-HCl (pH 7,0) . O produto foi eluído com uma mistura de 2 0 mM de tampão Tris- HCl (pH 7,0) e 200 mM de NaCl. As frações que contêm Pro-IFN foram recolhidas com base na sua absorção a 28 0 nm. A concentração de Pro-IFN foi determinada por meio de um kit de teste de proteínas utilizando õ método Bradford (Pierce, Rockford IL).
Preparação de conjugado de proteína e polímero
A uma solução de di-PEG aldeído preparada acima (1,2 g, 0,03 mmol) em água (72 ml), adicionou-se 2 M de tampão de fosfato de sódio (pH 4,0, 5 ml) e Pro-IFN (2 00 mg em 22,2 ml de tampão com pH 7,0 que contém 2 0 mM de Tris-HCl e 0,2 M de NaCl, 0,01 mmol) . A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por dez minutos; adicionou-se em seguida solução aquosa de cianoboro-hidreto de sódio (400 mM, 1,25 ml, 0,5 mmol). A mistura de reação foi agitada no escuro por dezesseis horas e purificada por meio de cromatografia de Sepharose SP XL. Frações que contêm o conjugado de polímero e proteína desejado foram recolhidas com base no seu tempo de retenção e absorção a 280 nm. A concentração do conjugado foi determinada por meio de um kit de teste de proteínas utilizando o método Bradford (Pierce, Rockford IL). O rendimento isolado do conjugado foi de cerca de 40% ou mais.
Todas as características descritas no presente relatório descritivo podem ser combinadas de qualquer forma. Cada característica descrita no presente relatório descritivo pode ser substituída por uma característica alternativa que atenda ao mesmo propósito, equivalente ou similar. Desta forma, a menos que indicado expressamente em contrário, cada característica descrita é apenas um exemplo de uma série genérica de características equivalentes ou similares.
A partir da descrição acima, os técnicos no assunto podem determinar facilmente as características essenciais da presente invenção e, sem abandonar o seu espírito e escopo, podem realizar várias alterações e modificações da presente invenção para adaptá-la aos vários usos e condições. Desta forma, outras realizações também se encontram dentro do escopo das reivindicações a seguir.
Claims (3)
1. CONJUGADO POLÍMERO-PROTEÍNA, caracterizado peloconjugado compreender:
em que mPEG possui um peso molecular de 20 kD e IFNé uma porção interferon «2b.
2. COMPOSTO DA FÓRMULA II:
caracterizado por: X ser um grupo reativo; cada um dentre A1 e A2 independentemente ser umaporção de polímero; ou um dentre A1 e A2 é uma porção depolímero e o outro é um grupo reativo; cada um dentre Gl, G2 e G3, independentemente, ser uma ligação ou um grupo funcional de ligação; cada um dentre R1, R2, R3, R4 e R5, independentemente, ser H, alquila C1-5, alquenila C2-5, alquinila C2-5, arila, heteroarila, cicloalquila C3-8, heterocicloalquila C3-8 ou —G4- X'; em que G4 é uma ligação ou um grupo funcional de ligação e X' é um grupo reativo; e cada m e n ser independentemente 0 ou um número inteiro de 1 a 10; desde que, se -G3-X for -CO(O)-N- succinimidila, então, n é um número inteiro de 1 a 10, em que cada um dentre A1 e A2, independentemente, é uma porção mPEG que possui peso molecular de 20 kD; cada um dentre R1, R2, R3, R4 e R5, independentemente, é H; X é CH(=O); G3 é uma ligação; e cada um de G1 e G2 é
em que O é ligado a A1 ou A2, e NH é ligado a um átomo de carbono como mostrado na fórmula I; e n é 2 e m é 4.
3. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UM CONJUGADO POLÍMERO- PROTEÍNA DE FÓRMULA I:
em que cada um dentre R1, R2, R3, R4 e R5,independentemente, é H; cada um dentre A1 e A2, independentemente, é umaporção mPEG que possui peso molecular de 20 kD; cada um dentre Gl e G2 é 
em que O éligado a A1 ou A2 e NH é ligado a um átomo de carbono comomostrado na fórmula I e G3 é uma ligação; P é 
, IFN sendo uma porção interferon-a.2b, emque o grupo amino no terminal N é ligado a G3; m é 4; e n é 2; caracterizado pelo mencionado método compreender: o acoplamento de uma proteína H-P livre de terminalN, em que P é uma porção de proteína com uma molécula ramificada de dipolímero da Fórmula II:
em que R1, R2, R3, R4, R5, A1, A2, G1, G2, G3, m e n sãoconforme definidos acima, e X é CHO; e redução em seguida doproduto de acoplamento para formar o conjugado polímeroproteína.
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