KR101588465B1 - 단백질-중합체 컨쥬게이트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 명세서에 기술된 단백질-중합체 컨쥬게이트와 관한 것이다. 또한 단백질-중합체를 제조하는 방법과 단백질-중합체로 간염 B 바이러스 감염 또는 간염 C 바이러스 감염 치료 용도가 개시된다.

Description

단백질-중합체 컨쥬게이트{PROTEIN-POLYMER CONJUGATES}
본 출원은 2007년 8월16일에 출원된 미국 가출원 번호 60/956,273 호의 우선권을 주장한다. 상기 출원의 내용은 본 명세서에 그대로 참고로 포함된다.
세포 생물학 및 단백질 재조합 기술의 발전은 단백질 치료제의 발전을 이끌고 있다.
그러나, 주요한 난점은 여전히 존재한다. 대부분의 단백질은 단백질 가수분해에 취약하여 순환시스템에서 짧은 반감기를 가진다. 다른 단점들은 낮은 수용해도와 항체 중화의 유도를 포함한다.
중합체의 부착, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 단백질에 부착시키면 단백질 가수분해 효소의 단백질 골격에의 접근을 방해하여 단백질의 안정성을 높인다. 게다가, 상기로 인해 수용해도를 개선시키고 면역원성을 최소화시킬 수 있다. 중합체를 단백질에 부착시키는 효과적인 방법들에 대한 요구가 존재한다.
본 발명의 일 태양은 하나 이상의 중합체 모이어티(moiety), 단백질 모이어티, 및 링커를 포함하는 실질적으로 순수한(80% 이상 순도) 컨쥬게이트에 관한 것이다. 상기 컨쥬게이트에서, 상기 고분자 모이어티 또는 모이어티들은 상기 링커에 부착된다; 상기 단백질 모이어티의 N-말단 질소 원자는 상기 링커에 결합된다; 상기 링커는 공유 결합, C1 -10 알킬렌, C2 -10 알케닐렌, 또는 C2 -10 알키닐렌이고; 그리고 상기 단백질 모이어티는 인터페론-알파 모이어티, 인간 성장 호르몬 모이어티, 또는 에이스로포이에틴(erythropoietin) 모이어티이다. 바람직하게는 상기 컨쥬게이트는 90% 이상의 순도를 갖는다. 이 컨쥬게이트는 예상치 못한 긴 생체내 반감기를 가진다.
본 발명의 다른 태양은 식I의 단백질-중합체 컨쥬게이트에 관한 것이다.
식 I:
Figure 112010016223515-pct00001
식 I
상기 R1 , R2, R3, R4, 및 R5 의 각각은 독립적으로 H, C1 -5 알킬, C2 -5 알케닐, C2 -5 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3 -8 사이클로알킬, 또는 C3 -8 헤테로사이클로알킬이며; A1 과 A2의 각각은 독립적으로 중합체 모이어티이며; G1, G2, 및 G3의 각각은 독립적으로 결합체 또는 연결성 작용기이며; P는 단백질 모이어티이며; m은 0 또는 1 내지 10 사이의 정수이며; 그리고 n은 1 내지 10 사이의 정수.
상기 식에 대해 언급하면, 상기 단백질-중합체 컨쥬게이트는 하기의 특징들을 하나 이상 가진다: G3는 결합체(bond)이고 P는 N말단의 아미노기가 G3에 결합되는 단백질 모이어티; A1 및 A2의 각각은 2 내지 100kD의 분자량을 갖는(바람직하게는 10 내지 30kD의 분자량을 갖는) 폴리알킬렌 옥사이드 모이어티이며, G1 및 G2의 각각은
Figure 112010016223515-pct00002
이되, (상기 O는 A1 또는 A2에 부착되며, NH는 식 I에 도시된 바와 같이 탄소 원자에 부착), 또는 G1 및 G2의 각각은 요소, 술폰아미드, 또는 아미드(상기 N은 식 I에 도시된 바와 같이 탄소 원자에 부착); m은 4, n은 2이고, R1, R2, R3, R4, 및 R5 각각은 H이며; 그리고 P는 인터페론 모이어티 또는 1 내지 4개의 아미노산 잔기를 포함하는 변형된 인터페론 모이어티이다.
"알킬"이라는 용어는 1가 직쇄 또는 분지된 탄화수소 라디칼을 말한다. 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 3차 부틸, 및 n-펜틸을 포함한다. 유사하게는 "알케닐" 또는 "알키닐"이라는 용어는 하나 이상의 C=C 이중 결합 또는 하나 이상의 C≡C 삼중 결합을 포함하는 1가 직쇄 또는 분지된 탄화수소 라디칼을 말한다.
"알킬렌"이라는 용어는 2가 직쇄 또는 분지된 탄화수소 라디칼을 말한다. 유사하게는 "알케닐렌" 또는 "알키닐렌"이라는 용어는 하나 이상의 C=C 이중 결합 또는 하나 이상의 C≡C 3중 결합을 포함하는 2가 직쇄 또는 분지된 탄화수소 라디칼을 말한다.
"아릴"이라는 용어는 적어도 하나의 방향족 고리를 갖는 탄화수소 고리 시스템 (모노-사이클릭 또는 바이-사이클릭)을 말한다. 아릴 모이어티의 예로는 페닐, 나프틸, 및 피레닐을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
"헤테로아릴"이라는 용어는 적어도 하나의 O, N, 또는 S와 같은 헤테로원자를 고리 시스템 부분으로 하고 나머지 부분은 탄소 원자로 된 방향족 고리를 적어도 하나 포함하는 적어도 하나의 방향족 고리를 갖는 탄화수소 고리 시스템(모노-사이클릭 또는 바이-사이클릭)을 말한다. 헤테로아릴 모이어티의 예로는 푸릴, 피롤릴, 티에닐, 옥사졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 피리디닐, 피리미디닐, 퀴나졸리닐, 및 인돌릴을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
"사이클로알킬"이라는 용어는 탄소 고리 원자들만 갖는 부분적이거나 전체가 포화된 모노-사이클릭 또는 바이-사이클릭 고리 시스템을 말한다. 사이클로알킬의 예로는 사이클로프로파닐, 사이클로펜타닐, 및 사이클로헥사닐을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
"헤테로사이클로알킬"이라는 용어는 탄소원자에 하나 이상의 헤테로원자(예; O, N, 또는 S)를 고리원자로 갖는 부분적이거나 전체가 포화된 모노-사이클릭 또는 바이-사이클릭 고리 시스템을 말한다. 헤테로사이클로알킬의 예로는 피페리딘, 피페라진, 모르폴린, 티오모르폴린, 및 1,4-옥사제판을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
여기에 언급된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 및 헤테로사이클로알킬은 치환 및 비치환된 모이어티들(moieties)을 포함한다. 치환기의 예로는 C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, C3-C8 사이클로알킬, C5-C8 사이클로알케닐, C1-C10 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 아미노, C1-C10 알킬아미노, C1-C20 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노,히드록시아미노, 알콕시아미노, C1-C10 알킬설폰아미드, 아릴설폰아미드, 히드록시, 할로겐, 티오, C1-C10 알킬티오, 아릴티오, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 카르복실, 카르복실산 에스테르를 포함한다.
"폴리알킬렌 옥사이드 모이어티(moiety)"라는 용어는 선형, 분지형, 또는 별모양의 폴리알킬렌 옥사이드로부터 유래된 1가 라디칼을 말한다. 폴리알킬렌 옥사이드 모이어티 분자량은 2 내지 100kD일 수 있다. 폴리알킬렌 옥사이드 모이어티는 포화되거나 불포화되어 있다. 폴리알킬렌 옥사이드 모이어티 예로는 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리이소프로필렌 옥사이드, 폴리부테닐렌 옥사이드, 및 이들의 공중합체들을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 덱스트란, 폴리비닐알콜, 폴리아크릴아미드, 또는 탄수화물계 중합체와 같은 다른 중합체들은 항원이 아니고 독성이 없거나 면역반응을 도출하지 않는 한 폴리알킬렌 옥사이드 모이어티를 대체하는데 사용될 수 있다. 상기 폴리알킬렌 옥사이드 모이어티는 치환되있거나 비치환되어 있다. 예를 들면, 그것은 메톡시-캡핑된 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)일 수 있다.
"단백질 모이어티"라는 용어는 자연적으로 발생한 단백질 또는 변형된 단백질로부터 유래된 1가 라디칼을 말한다. 자연적으로 발생한 단백질은 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인간성장호르몬, 에리트로포이에틴 및 과립구 집락 자극 인자, 또는 항체 일 수 있다. 상기 변형된 단백질은 예컨대, 인터페론-알파 및 인터페론 N-말단에 1 내지 4개의 아미노산 잔기를 더 포함하는 단백질일 수 있다.
상기 변형된 인터페론의 예로는
Figure 112010016223515-pct00003
이고, IFN은 인터페론-알파2b 모이어티를 나타내고, 상기의 N-말단 아미노기는 카보닐기에 결합된다.
"인터페론-알파"라는 용어는 바이러스 복제와 세포 증식을 억제시키고 면역반응을 조절하는 고도로 상동인 종 특이적 단백질 계열을 말한다. Bonnem et al.,J. Biol. Response Mod., 1984, 3(6): 580-598; and Finter, J.Hepatol., 1986,3 Suppl 2: S157-160 참조.
많은 유형의 인터페론-알파 단백질은, Schering Corporation, Kenilworth, N.J.,가 제공하는 인트론A 인터페론, Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J., 가 제공하는 로페론(Roferon) 인터페론, Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc,. Ridgefield, Conn., 가 제공하는 Berofor 알파2 인터페론, Sumitomo, Japan이 제공하는 수미페론(Sumiferon), 및 Glaxo-Wellcome Ltd., London, Great Britain 이 제공하는 Wellferon 인터페론 알파-n1(INS)을 포함하여 상업적으로 이용 가능하다.
전구체 형태이거나 성숙된 형태인 5가지 예시적인 인간 인터페론-알파 단백질의 아미노산 서열이 하기에 수록되어 있다:
maltfallva llvlsckssc svgcdlpqth slgsrrtlml laqmrrislf sclkdrhdfg fpqeefgnqf qkaetipvlh emiqqifnlf stkdssaawd etlldkfyte lyqqlndlea cviqgvgvte tplmkedsil avrkyfqrit lylkekkysp cawevvraei mrsfslstnl qeslrske
(Krasagakis et al., Cancer Invest. 26 (6), 562-568, 2008 참조)
cdlpqthslg srrtlmllaq mrkislfscl kdrhdfgfpq eefgnqfqka etipvlhemi qqifnlfstk dssaawdetl ldkfytelyq qlndleacvi qgvgvtetpl mkedsilavr kyfqritlyl kekkyspcaw evvraeimrs fslstnlqes lrske
(Klaus, et al., J. Mol. Biol. 274 (4), 661-675, 1997 참조)
mcdlpqthsl gsrrtlmlla qmrrislfsc lkdrhdfgfp qeefgnqfqk aetipvlhem iqqifnlfst kdssaawdet lldkfytely qqlndleacv iqgvgvtetp lmkedsilav rkyfqritly lkekkyspca wevvraeimr sfslstnlqe slrske
(GenBank 승인 번호 AAP20099, the 30-APR-2003 version 참조)
mallfpllaa lvmtsyspvg slgcdlpqnh gllsrntlvl lhqmrrispf lclkdrrdfr fpqemvkgsq lqkahvmsvl hemlqqifsl fhterssaaw nmtlldqlht elhqqlqhle tcllqvvgeg esagaisspa ltlrryfqgi rvylkekkys dcawevvrme imkslflstn mqerlrskdr dlgss
(Capon et al., J. Mol. Cell. Biol. 5 (4):768-779, 1985 참조)
lsyksicslg cdlpqthslg nrralillaq mgrispfscl kdrhdfglpq eefdgnqfqk tqaisvlhem iqqtfnlfst edssaaweqs llekfstely qqlnnleacv iqevgmeetp lmnedsilav rkyfqritly ltekkyspca wevvraeimr slsfstnlqk rlrrkd
(Lund et al., J. Interferon Res. 5 (2), 229-238, 1985 참조)
일 예에서, 본 발명의 컨쥬게이트의 제조에 사용되는 인터페론-알파 단백질은 상기에 수록된 아미노산 서열 중 하나와 또는 성숙된 인터페론 알파에 해당하는 상기의 절편과 적어도 80%(예, 85%, 90%, 95% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
"인간 성장 호르몬"이라는 용어는 전구체 형태이거나 성숙한 형태의 자연적으로 발생한 인간 성장 호르몬 및 그 기능적인 변형물들, 즉, 자연적으로 발생한 인간 성장 호르몬과 적어도 80%(예.,85%, 90%, 95%, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 가지고 상기 인간 성장 호르몬과 같은 생리적 활성을 갖는 기능적인 변형물들을 말한다. 상기 자연적으로 발생한 인간 성장 호르몬의 아미노산 서열 (전구체 및 성숙된 형태)은 하기에 도시되어 있다:
matgsrtsll lafgllclpw lqegsafpti plsrlfdnam lrahrlhqla fdtyqefeea yipkeqkysf lqnpqtslcf sesiptpsnr eetqqksnle llrisllliq swlepvqflr svfanslvyg asdsnvydll kdleegiqtl mgrledgspr tgqifkqtys kfdtnshndd allknyglly cfrkdmdkve tflrivqcrs vegscgf (전구체)
fptiplsrlf dnamlrahrl hqlafdtyqe feeayipkeq kysflqnpqt slcfsesipt psnreetqqk snlellrisl lliqswlepv qflrsvfans lvygasdsnv ydllkdleeg iqtlmgrled gsprtgqifk qtyskfdtns hnddallkny gllycfrkdm dkvetflriv qcrsvegscg f (성숙된 형태)
간 또는 신장에서 생성된 에리트로포이에틴(EPO)은 조혈작용(erythropoiesis) 또는 적혈구 생성을 조절하는 당단백질 호르몬이다. 미국 특허 번호 5,621,080호 참조. 인간 EPO 아미노산 서열(전구체 및 성숙된 형태)은 하기에 도시되어 있다:
mgvhecpawl wlllsllslp lglpvlgapp rlicdsrvle rylleakeae nittgcaehc slnenitvpd tkvnfyawkr mevgqqavev wqglallsea vlrgqallvn ssqpweplql hvdkavsglr slttllralg aqkeaisppd aasaaplrti tadtfrklfr vysnflrgkl klytgeacrt gdr
(전구체)
apprlicdsr vlerylleak eaekittgca ehcslnekit vpdtkvnfya wkrmevgqqa vevwqglall seavlrgqal lvkssqpwep lqlhvdkavs glrslttllr algaqkeais ppdaasaapl rtitadtfrk lfrvysnflr gklklytgea crtgdr (성숙된 형태)
본 발명의 컨쥬게이트를 제조하는데 사용된 에리트로포이에틴 단백질은 예컨대, 인간, 쥐, 돼지, 및 소의 적당한 종에 의하여 생산된 전구체 또는 성숙된 형태의 EPO 단백질일 수 있다. 일 실시예에서, 에리트로포이에틴 단백질은 상기에 도시된 아미노산 서열중의 하나와 적어도 80%(예, 85%, 90%, 95% 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
두 개의 아미노산 서열들의 "퍼센트 동일"은 Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993,에서 수정된 Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-8, 1990,의 알고리즘을 사용하여 측정된다. 상기 알고리즘은 Altschul, et al.J. Mol. Biol.215: 403-10,1990의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버젼 2.0)에 포함되어 있다. BLAST 단백질 검색은 점수(score)=50, 단어길이(wordlength)=3인 XBLAST 프로그램으로 수행하여 본 발명의 단백질 분자에 상동인 염기 서열을 얻을 수 있다. 두 서열간에 갭이 존재하는 곳에, Grapped BLAST는 Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997. 에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램(예, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트(default) 변수들이 사용될 수 있다.
"연결성 작용기"라는 용어는 일 말단은 중합체 모이어티에 연결되고 타단은 단백질 모이어티에 연결된 2가 작용기를 말한다. 이 예들은 -O-, -S-, 카르복실산 에스테르, 카르보닐, 카보네이트, 아미드, 카바메이트, 우레아, 설포닐, 설피닐, 아미노, 이미노, 히드록시아미노, 포스포네이트 또는 포스페이트기를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
상기 기술된 단백질-중합체 컨쥬게이트는 가능하다면 자유 형태이거나 염 형태일 수 있다. 염은, 예를 들면, 본 발명의 단백질-중합체 컨쥬게이트에서 음이온 및 양으로 대전된 기(예: 아미노)사이에서 형성될 수 있다. 이에 적당한 음이온은 클로라이드(chloride), 브로마이드(bromide), 아이오다이드(iodide), 설페이트(sulfate), 나이트레이트(nitrate), 포스페이트(phosphate), 시트레이트(citrate), 메탄설포네이트(methanesulfonate),트리플루오르아세테이트(trifluoroacetate), 및 아세테이트(acetate)를 포함한다. 마찬가지로 염은 또한 본 발명의 단백질-중합체에서 양이온과 음으로 대전된 기(예: 카르복실레이트)사이에서 형성될 수 있다. 이에 적당한 양이온은 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 및 테트라메틸암모늄 이온과 같은 암모늄 양이온을 포함한다.
또한, 단백질-중합체 컨쥬게이트는 하나 이상의 이중 결합 또는 하나 이상의 비대칭 중심을 가질 수 있다. 상기 컨쥬게이트는 라세메이트, 라세믹 혼합물, 단일 거울상 이성질체, 개별적인 부분 입체 이성질체, 부분 입체 이성질체 혼합물, 및 시스- 또는 트랜스- 또는 E- 또는 Z- 의 이중 결합 동질 이성질체로 발생될 수 있다.
본 발명의 단백질-중합체 컨쥬게이트의 예는 하기에 도시되어 있다:
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상기에서 mPEG는 20kD의 분자량을 가지고 IFN은 인터페론-알파2 b 모이어티이다.
본 발명의 다른 또 다른 태양은 단백질-중합체 컨쥬게이트를 제조하는 데 유용한 화합물에 관한 것이다. 상기 화합물은 식 II를 갖는다:
Figure 112010016223515-pct00005
식 II
상기 화학식에서 X는 반응기; A1 및 A2의 각각은 독립적으로 중합체 모이어티이며; 또는 A1 및 A2 중 하나는 중합체 모이어티이고 다른 하나는 반응기이다; G1, G2, 및 G3의 각각은 독립적으로 결합체 또는 연결성 작용기이며; R1, R2, R3, R4, 및 R5의 각각은 독립적으로 H, C1 -5 알킬, C2 -5 알케닐, C2 -5 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3 -8 사이클로알킬, 또는 C3 -8 헤테로사이클로알킬, 또는 -G4-X'이고, G4는 결합체 또는 연결성 작용기이고 X'는 반응기이다; m 및 n은 각각 독립적으로 0 또는 1 내지 10 사이의 정수; -G3-X 가 -CO(O)-N-숙신이미딜이면 n은 1 내지 10 사이 정수이다.
일 실시예에서, X, X', A1, A2, G1, G2, G3, G4, R1, R2, R3, R4, R5 및 m은 상기에 정의된 바와 같으며, n은 1 내지 10 사이의 정수이다.
식II의 특정 화합물들은 하기의 특징들을 하나 이상 갖는다: 중합체 모이어티는 하나 이상의 반응기들을 가질 수 있고; G3는 결합체이고 P는 N-말단의 아미노기가 G3에 부착된 단백질 모이어티이다; A1 및 A2는 2 내지 100kD의 분자량(바람직하게는 12 내지 30kD)를 갖는 폴리알킬렌 옥사이드 모이어티들이고, G1 및 G2의 각각은
Figure 112010016223515-pct00006
이고, 상기에서 O는 A1 또는 A2에 부착되고, 그리고 NH는 식 I에 도시된 탄소 원자에 부착된다; m은 4이고; n은 1이고; R1, R2, R3, R4, 및 R5의 각각은 H이고; X는 CH(=O)이거나, X는 이탈기(예; 숙신이미딜 또는 p-니트로페녹시)이다.
"반응기"라는 용어는 다른 작용기와 반응하여 다른 작용기에 의해 대체되거나 다른 작용기에 연결될 수 있는 작용기를 말한다. 반응기는 이탈기, 전자친화기, 알데하이드, 또는 마이클(Michael) 수용기일 수 있다.
"이탈기"라는 용어는 전자쌍과 직접 치환 또는 이온화 하는 경우에 그 공유 결합중 하나로부터 떨어져 나갈 수 있는 작용기를 말한다(예, F.A. Carey and R.J. Sunberg, Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed. Plenum Press, 1990 참조). 이탈기의 예로는 메탄설포네이트, 트리플레이트, p-톨루이설포네이트, 아이오다인, 브로마이드, 클로라이드, 트리플루오르아세테이트, 숙신이미딜("Su"), p-니트로페녹시, 및 피리딘-2-일-옥시를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.
"핵친화기(nucleophilic group)"라는 용어는 전자쌍을 제공함으로써 전자친화체(electrophile)와 같은 전자수용기와 반응하는 전자가 풍부한 작용기를 말한다.
"전자친화기(electrophile group)"라는 용어는 전자쌍을 받음으로써 핵친화체(nucleophile)와 같은 전자제공기와 반응하는 전자가 부족한 작용기를 말한다. 마이클 수용기들은 전자친화기의 서브셋(subset) 이다. 마이클 수용기들은 핵친화기와 접촉하면 마이클 반응을 거치게 된다. 통상적인 마이클반응기는 a,β-불포화 케톤 모이어티를 포함한다.
예시적인 식 II 화학물들은 하기에 도시되어 있다:
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또 다른 태양에서, 본 발명은 식 I의 단백질-중합체 컨쥬게이트를 제조하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법에서 단백질 모이어티 P의 N-말단 아미노기는 연결성 작용기 G3에 부착된다. 상기 방법은 X가 이탈기라는 것을 제외하고는 N-말단 자유 단백질 H-P를 상기에서 도시된 식 II와 같은 분자식의 분지된 이중합체와 커플링하는 단계를 포함한다. 상기 N-말단 자유단백질 H-P는 상기 단백질 모이어티 P의 말단 아미노기의 질소 원자가 수소 원자와 결합되는 단백질을 말한다. 다시 말하면, H-P는 말단의 1차 또는 2차 아미노기를 갖는다. 또한, 상기 방법은 (1) G3는 결합체이고, n은 0 또는 1 내지 9의 정수이며, X는 CHO인 것을 제외하고, 상기 언급된 N-말단 자유 단백질 H-P를, 상기에서 도시된 식 II와 같은 식의 분지된 이중합체 분자와 커플링하는 단계; 및 (2) 상기 커플링된 생성물을 환원시켜 단백질-중합체 컨쥬게이트를 형성하는 단계를 포함한다.
인터페론은 간염 B 바이러스(HBV) 감염 또는 간염 C 바이러스 (HCV) 감염 치료용 면역조절 약제이다. 또한, 인터페론(예: 인터페론-알파)은 비호킨즈(non-Hodgkin's) 림프종, 헤어리(Hairy) 세포 백혈병, 만성 골수 백혈병, 에이즈 관련 카포시스(Kaposis) 육종, 모낭 림프종, 악성 흑색종, 및 첨규형 콘딜롬(condyloma accuminata)을 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 태양은 여기에서 언급된 인터페론-중합체 컨쥬게이트로 상기에 기술한 장애들 중 임의의 것을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또한, 이러한 치료 용도와 상기 장애들 중 하나의 치료용 약제 제조하기 위한 컨쥬게이트 용도뿐만 아니라 상기 언급된 장애중 임의의 것에 사용되기 위한 인터페론 중합체 컨쥬게이트를 함유하는 조성물은 본 발명의 범위에 있다.
본 발명의 하나 이상의 실시예의 상세사항은 하기에 기술되어 있다. 본 발명의 다른 특징들, 목적들, 및 장점들은 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 명확해질 것이다.
본 발명의 단백질-중합체 컨쥬게이트는 화학 업계에 공지된 합성방법으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 링커 분자를 중합체 분자 두 개와 동시에 또는 별도로 결합시키고, 이후 단백질 분자를 상기 링커 분자에 결합시켜 본 발명의 컨쥬게이트 단백질-중합체를 형성할 수 있다.
또한, 식 II의 화합물들은 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 화합물들은 기술된 단백질-중합체 컨쥬게이트를 제조하는데 유용하다. 이러한 화합물들은 화학 업계에 공지된 합성방법으로 제조될 수 있다. 예시적인 합성 계획 및 실례는 하기에 제시되어 있다.
계획 I은 본 발명의 단백질-중합체 컨쥬게이트 제조예를 도시한다. 아세탈기를 포함하는 디아민 화합물 1은 N-히드록시숙신이미딜 카보네이트 mPEG(즉, 화합물(2))와 반응하여 di-PEGylated 화합물(3)를 생성하고, 이후 알데히드(4)로 전환된다. 상기 알데히드 화합물은 자유 아미노기를 갖는 단백질과 반응하고 환원성 알킬화 반응을 거쳐 본 발명의 단백질-중합체 컨쥬게이트를 제공한다.
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계획I
이렇게 합성된 단백질-중합체 컨쥬게이트는 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 전기영동, 투석, 한외여과, 또는 초원심분리 같은 방법으로 더 정제될 수 있다.
상기 기술된 화학 반응들은 용매, 시약, 촉매, 보호기 및 탈보호기 시약, 그리고 특정 반응 조건들의 사용을 포함한다. 상기 화학 반응들은 궁극적으로 단백질-중합체 컨쥬게이트를 합성하기 위해 적당한 보호기를 첨가하거나 제거하는 단계들을 여기에서 특이적으로 기술된 단계들 전후에 더 포함컨쥬게이트할 수 있다. 또한, 다양한 합성 단계들을 교대 서열 또는 순서로 수행하여 소기의 단백질-중합체 컨쥬게이트를 얻을 수 있다. 적용가능한 단백질-중합체 컨쥬게이트를 합성하는 데 유용한 합성 화학 변환 및 보호기 방법들(보호 및 탈보호)은 화학 업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); and L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) 및 그 후속판에 기술된 것들을 포함한다.
본 발명의 컨쥬게이트는 매우 높은 순도를 갖는다. 즉, 80% 이상의 컨쥬게이트 분자들에서, 중합체 모이어티는 동일한 단백질 모이어티의 N-말단의 동일한 질소 원자에 연결된다. 다시 말해서, 적어도 80%의 컨쥬게이트 분자들에서, 단백질 모이어티는 단백질 모이어티의 서열 및 결합 위치를 포함하여 모든 면에서 중합체 모이어티와 동일하다.
본 발명의 컨쥬게이트는 콘쥬제이트 형태에서 약학적으로 활성일 수 있다. 또한, 컨쥬게이트는 단백질 모이어티 및 중합체 모이어티 사이의 연결을 효소처리로 절단하여(예: 가수분해를 통해서) 생체내 약학적으로 활성인 단백질을 방출할 수 있다. 생체내 연결을 절단하는 것과 관련된 효소의 예들은 산화효소(예, 퍼옥시다아제(peroxidases), 아민 옥시다제(amine oxidases),또는 디하이드로게나아제(dehydrogenases)), 환원효소(예, 케토 리덕타아제(keto reductases)), 및 가수분해 효소(예, 프로테아제(proteases), 에스터라제(esterases), 설파타제(sulfatases), 또는 포스파타제(phosphatases))를 포함한다.
따라서, 본 발명의 일 태양은 질병(예: HBV 또는 HCV감염) 치료용으로 상기에서 언급된 하나 이상의 단백질-중합체 컨쥬게이트의 유효량을 투여하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 질병은 피검자에게 하나 이상의 단백질-중합체 컨쥬게이트의 유효량을 투여하여 치료될 수 있다. 상기 피검자는 임의의 적당한 진단 방법으로부터 나온 결과에 기초하여 건강 관리 전문인에 의하여 확인될 수 있다.
여기에서 사용된 "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 단백질-중합체 컨쥬게이트를 함유하는 조성물을 장애, 장애증상, 장애에 부차적인 질병 또는 장애, 또는 장애에 대한 소인을 가진 피검자 (인간 또는 동물)에게 상기 장애, 장애증상, 장애에 부차적인 질병 또는 장애, 또는 장애에 대한 소인을 치료, 완화, 치유, 또는 개선을 목적으로 도포 또는 투여로 정의된다. "유효량"은 상기 치료되는 피검자에게 치료 효과를 부여하는 단백질-중합체의 양을 말한다. 상기 치료 효과는 객관적(즉, 시험 또는 표지에 의해 측정가능한) 또는 주관적(즉, 피검자가 효과의 징조를 보이거나 효과를 느낌)일 수 있다.
또한, 상기 기재된 적어도 하나 이상의 단백질-중합체 컨쥬게이트의 유효량 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물도 본 발명의 범위에 있다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 병이 있는 환자에게 하나 이상의 단백질-중합체 컨쥬게이트의 유효량을 투여하는 방법을 포함한다. 유효 복용량은 당업자가 인식하는 바와 같이 단백질-중합체 컨쥬게이트의 가수분해 속도, 치료되는 병의 유형, 투여 경로, 부형제 용법, 및 다른 치료제와의 병용 가능성에 따라서 다양해질 것이다.
본 발명의 방법을 실시하기 위해, 하나 이상의 상기 언급된 화합물을 갖는 조성물은 비경구, 경구, 비강, 직장, 국소, 또는 협측(bucally)으로 투여될 수 있다. 여기에서 사용된 "비경구"라는 용어는 임의의 적당한 주입 기술뿐만 아니라 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활액내, 흉골내, 척수내, 병변내, 복막내, 기도내 또는 두개내 주사를 말한다.
살균 주사제 조성물은 1,3-부탄디올 용액과 같이 무독성의 비경구적으로 허용가능한 희석액 또는 용매의 용액 또는 현탁액일 수 있다. 마니톨, 물, 링거 용액, 및 등장상의 염화나트륨 용액은 사용할 수 있는 허용가능한 매개체 및 용매에 속한다. 또한, 고정유는 용매 또는 현탁 매질(예. 합성 모노 글리세리드 또는 디 글리세리드)로 종래 사용된다.. 올레산과 같은 지방산 및 그 글리세리드 유도체는 올리브 기름 또는 피마자 기름와 같은 천연 약학적으로 허용가능한 기름으로 특히, 그 폴리옥시에틸화된 형태의 주사제의 제조에 유용하다. 또한, 이러한 기름 용액들 또는 현탁액들은 긴 사슬의 알콜 희석액 또는 분산제, 또는 카르복시메틸 셀루로우즈 또는 유사한 분산 시약을 함유할 수 있다. 트윈즈(Tweens) 또는 스판즈(Spans)과 같은 흔히 사용되는 다른 계면활성제 또는 다른 유사한 유화 시약들 또는 약학적으로 수용가능한 고체, 액체 또는 다른 투여 형태의 제조에 흔히 사용되는 생체이용도 증강제도 제제 목적으로 사용될 수 있다.
구강 투여용 조성물은 캡슐, 정제, 에멀젼, 수성 현탁액, 분산액 및 용액을 포함하는 임의의 경구로 허용가능한 투여 형태일 수 있다. 정제의 경우에는 일반적으로 사용되는 담체는 락토오스 및 옥수수 전분을 포함한다. 마그네슘 스테아르산염 같은 윤활제 시약도 통상적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 구강 투여를 위해, 유용한 희석액은 락토오스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁액 또는 에멀젼이 구강으로 투여되는 경우, 활성 성분은 유화 시약이나 현탁 시약과 결합된 유성상에서 현탁되거나 용해될 수 있다. 필요하다면, 특정 감미제, 풍미제 또는 착색제를 첨가할 수 있다.
비강 에어로졸 또는 흡입용 조성물은 약학 제제 업계에 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 벤질알콜 또는 다른 적당한 보존액, 생체이용도를 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 탄화플루오린, 및/또는 업계에 공지된 다른 안정화제 또는 분산제를 사용하여 식염수 용액으로 제조될 수 있다. 또한, 상기 기술된 화합물 중 하나 이상을 갖는 조성물은 직장 투여용 좌약 형태로 투여될 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 상기 조성물의 활성 성분과 융합가능하고, (바람직하게는 상기 활성 성분을 안정화시킬 수 있으며) 치료받는 피검자에게 유해하지 않는다는 의미에서 "허용가능" 하여야 한다. 하나 이상의 안정화제는 상기 언급된 화합물의 전달용 약학적 부형제로 사용될 수 있다. 다른 담체의 예들은 콜로이드성 실리콘 옥사이드, 마그네슘 스테아르산염, 셀루로우즈, 소듐라우릴설페이트(sodium lauryl sulfate), 및 D&C Yellow #10을 포함한다.
적당한 체외 분석을 이용하여 상기 기술된 컨쥬게이트들이 간염 B 바이러스 또는 간염 C 바이러스 억제 효능을 예비적으로 평가할 수 있다. 상기 컨쥬게이트는 체외 분석에 의하여 간염 B 바이러스 또는 간염 C 바이러스 감염 치료의 효능 여부에 대하여 더 검사될 수 있다. 예를 들면, 컨쥬게이트들은 간염 B 바이러스나 간염 C 바이러스를 갖는 동물(예: 마우스 모델) 또는 인간에게 투여되어 치유 효과를 평가할 수 있다. 그 결과에 기초하여, 용량 범위 및 투여 경로도 결정될 수 있다.
하기 예들은 예시적으로만 해석되어야 하며, 본 개시물의 나머지 부분을 임의로 한정 해석하여서는 안 된다. 더 수고하지 않으면서, 당업자는 본 명세서의 상세한 설명에 기초하여 본 발명을 최대한도로 이용할 수 있을 것으로 여겨진다. 본 명세서에 인용된 모든 공개물은 여기에 그대로 참고로 포함된다.
di - PEG 알데하이드 제조
Figure 112010016223515-pct00025
Su=succinimidyl
Bioconjugate Chem. 1993, 4, 568-569.에 기술된 방법에 따라 (SunBio Inc., CA, USA) 에서 구입한 20 kD mPEGOH로 20 kD PEGO(C=O)OSu를 제조하였다.
디클로로메탄에 6-(1,3-디옥솔란-2-일)헥산-1,5-디아민 용액(디아민 9.03 ㎎을 함유하는 용액 11.97 g, 47.8 μmol) 을 20 kD PEGO(C=O)OSu(1.72 g, 86.0 μmol) 를 함유하는 플라스크에 첨가하였다. PEGO(C=O)OSu가 완전히 용해된 후, N, N-디이소프로필에틸아민(79 ㎕, 478 μmol)이 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 24시간 동안 상온에서 교반되고, 이후 메틸 t-부틸 에테르(200 ㎖)는 교반하면서 용액을 한방울씩 첨가되었다. 이로 인하여 생성한 침전물은 수거되고 진공에서 건조시켜 하얀 고체상태의 di-PEG 아세탈(1.69 g, 98%) 을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 7.16 (t, J = 5.2 Hz, 1 H), 7.06 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 4.76 (t, J = 4.8 Hz, 1 H), 4.10-3.95 (m, 4 H), 1.80-1.65 (m, 1 H), 1.65-1.50 (m, 1 H), 1.48-1.10 (m, 6　H).
Figure 112010016223515-pct00026

Di-PEG 아세탈(4.0 g, 0.2 mmol)은 pH2.0 완충액(시트르산, 40 ㎖)에 현탁되었다. 반응혼합물은 35℃에서 24시간 동안 교반되었고 이후 디클로로메탄(3 x 50 ㎖)으로 추출되었다. 혼합된 유기층은 마그네슘 설페이트 상에서 건조되고, 농축한 후, 디클로로메탄(20 ㎖)에 재용해되었다. 상기 용액은 메틸 t-부틸 에테르(400 ㎖)에 교반하면서 한방울씩 첨가시켰다. 이로 인하여 생성한 침전물은 수거되고 감압하에서 건조되어 하얀 고체상태의 di-PEG 아세탈(3.8 g, 95%)을 수득하였다.
*1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 9.60 (s, 1 H), 7.24 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.16 (t, J = 5.2 Hz, 1 H), 4.10-3.95 (m, 4 H), 3.95-3.80 (m, 1 H), 3.00-2.85 (m, 2 H), 2.58-2.36 (m, 2 H), 1.46-1.15 (m, 6 H).
변형된 인터페론 제조
Figure 112010016223515-pct00027

변형된 재조합 인간 인터페론-알파2 b는 인간 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR방법으로 클로닝되었다. 올리고뉴클레오티드들은 인간 인터페론-알파2 b(GenBank 승인 # J00207, January 8, 2008)의 프랭킹(flanking) 서열에 기초하여 합성되었다.. 유도된 PCR 생성물은 pGEM-T벡터(Promega) 로 서브클로닝되었다. IFN 변형체는 pGEM-T 클론을 통하여 다시 PCR 증폭되고, 이후 단백질발현 벡터 pET-24a(Novagen)으로 서브클로닝되고, 클로닝 사이트(sites)로 NdeI/BamHI를 사용하는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 추진 벡터로 서브클로닝되었다. 이후 벡터 pET-24a는 E. coli BL21-CodonPlus (DE　3)-RIL (Stratagene) 균주로 형질전환되었다. 카라마이신(karamycin: 50 ㎍/㎖) 및 클로람페니컬(chloramphenical: 50 ㎍/㎖)의 존재하에 상기 형질전환된 E. coli BL21-CodonPlus (DE 3)-RIL을 유지하여 고도 발현 클론들이 선택되었다.
Pro-IFN 유전자를 갖는 BL21CodonPlus (DE 3)-RIL를 1000 ㎖ 플라스크에서 증식시키기 위해 테러픽 브로스 배지(Terrific broth medium: BD, 200 ㎖)이 사용되었다. 상기 플라스크는 37℃ 230 rpm에서 16 시간 동안 진동하였다. 배치(Batch) 및 페드-배치(fed-batch) 발효는 5 리터 발효병 (Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ)에서 수행되었다. 상기 배치 발효는 150mL의 하룻밤 동안의 예비 배양 종균 150 ㎖ 및 카라마이신(50 ㎍/㎖), 클로람페니컬(50 mg/mL), 0.4% 글리세롤 및 0.5%(v/v) 미량 원소들(10 g/L FeSO4 ˙7H2O, 2.25 g/L ZnSO4 ˙7H2O, 1 g/L CuSO4 ˙5H2O, 0.5 g/L MnSO4 ˙H2O, 0.3　g/L H3BO3, 2 g/L CaCl2 ˙2H2O, 0.1　g/L (NH4)6Mo7O24, 0.84 g/L EDTA, 50 ml/L HCl)로 보충된 테러픽 브로스 배지 3 L를 사용하였다. 용해된 산소 농도는 35%로 조절되고 5N NaOH 수용액을 첨가하여 pH는 7.2로 유지되었다. 600 g/L 글루코스 및 20 g/L MgSO4 ˙7H2O를 함유하는 공급(feeding) 용액이 제조되었다. pH가 설정점보다 상승하는 경우에, 적당한 부피의 상기 공급 용액이 첨가되어 배양액 브로스에서의 글루코스 농도를 증가시켰다. 상기 Pro-IFN 유전자의 발현은 IPTG를 1mM의 최후 농도에 첨가하여 유도되었으며 상기 배양 브로스를 3시간 동안 배양한 후 수거하였다.
수집된 세포 펠렛은 대략 1:10의 비율로 TEN 완충액(50 mM Tris-HCl (pH　8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl)에서 재현탁되었고, 마이크로플루이다이저로 분쇄하고 이후, 10,000rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 인클루젼 바디(inclusion body)를 함유하는 펠렛은 TEN완충액으로 2회 세척하고 상기 기술된 바와 같이 원심분리하였다. IB를 함유하는 펠렛은 150mL의 4M 구아니디움 HCl(GuHCl) 수용액에 현탁되고 20,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 이후 상기 IB는 50mL의 6M GuHCl 용액에 용해되었다. 상기 용해된 GuHCl 물질은 20,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하였다. 변성된 IB를 첨가하는 동안만 교반되는 1.5 L의 갓 제조된 재접힘(refolding) 완충액(100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M L-아르기닌, 2 mM EDTA)에 희석시켜 재접힘을 개시하였다. 재접힘 반응 혼합물은 교반 없이 48시간 동안 배양하도록 하였다. 상기 재접힘 재조합 인간 인터페론-알파2 b는(즉, Pro-IFN) 20mM 트리스(tris) 완충액(2 mM EDTA 및 0.1M 우레아로 보충됨, pH 7.0)에 Q-세파로우스 칼럼 크로마토그래피로 더 정제하기 위하여 투석하였다.
상기 재접힘 재조합 인간 단백질 Pro-IFN은 Q-세파로우스 칼럼 (GE Amersham Pharmacia, Pittsburgh, PA)에 적재되었다. 상기 칼럼은 사전에 평형을 유지시키고 20 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.0)으로 세척하였다. 생성물은 20 mM Tris-HCl(pH 7.0) 및 200 mM NaCl의 혼합물로 용리되었다. Pro-IFN을 함유하는 분획들은 280 nm에서의 흡광도에 기초하여 수거되었다. Pro-IFN의 농도는 Bradford법을 사용하는 단백질 검정 키트로 측정하였다 (Pierce, Rockford, IL).
단백질-중합체 컨쥬게이트 제조
Figure 112010016223515-pct00028
상기 제조된 di-PEG 알데히드(12 g, 0.03 mmol)의 물(72mL)에 용해한 용액에 2M의 인산나트륨 완충액(pH 4.0, 5 ㎖) 및 Pro-IFN (200 mg pH 7.0 buffer containing 20 mM Tris-HCl 및 0.2M NaCl를 함유하는 pH 7.0 완충액 22.2 ㎖에 200 ㎎, 0.01 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물은 상온에서 10분 동안 교반되었다; 이후 소듐 시아노보로하이드라이드 수용액(400 mM, 1.25 ㎖, 0.5 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물은 암실에서 16 시간 동안 교반되고 SP XL 세파로우스 크로마토그래피로 정제되었다. 소기의 중합체-단백질 컨쥬게이트를 함유하는 분획들은 체류 시간 및 280 nm에서의 흡광도에 기초하여 수거되었다. 컨쥬게이트의 농도는 Bradford법(Pierce, Rockford, IL) 을 사용한 단백질 검정 키트로 측정하였다. 상기 컨쥬게이트의 분리 수율은 대략 40% 이상이다.
다른 실시예
본 명세서에 개시된 특징들 모두는 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특징은 동일하거나, 균등하거나, 유사한 목적을 충족시키는 다른 특징에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급된 것이 없다면 개시된 각 특징은 균등하거나 유사한 특징들의 일반적 연속의 유일한 예이다.
상기 상세한 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 핵심적 특징들을 용이하게 확신할 수 있고, 본 발명의 사상과 범위에서 이탈하지 않고 본 발명을 다양하게 변경 및 변형하여 다양한 용도 및 조건에 적응할 수 있다. 따라서, 다른 실시예도 하기의 청구 범위 내에 있다.

Claims (23)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 식 I의 단백질-중합체 컨쥬게이트에 있어서:
    Figure 112015014623859-pct00029

    식 I
    상기 R1, R2, R3, R4, 및 R5 의 각각은 독립적으로 H, C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 아릴(누락), 헤테로아릴, C3-8 사이클로알킬, 또는 C3-8 헤테로사이클로알킬이며;
    A1 과 A2의 각각은 독립적으로 중합체 모이어티이며;
    G1, G2, 및 G3의 각각은 독립적으로 결합체 또는 연결성 작용기이며;
    P는 단백질 모이어티이며;
    m은 0 또는 1 내지 10 사이의 정수이며; 그리고
    n은 1 내지 10 사이의 정수이며,
    상기 G3는 결합체(bond)이고 P는 N말단의 아미노기가 G3에 결합되는 단백질 모이어티인 것을 특징으로 하는 식I의 단백질-중합체 컨쥬게이트.
  5. 삭제
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 A1 및 A2의 각각은 10 내지 30kD의 분자량을 갖는 mPEG 모이어티인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 G1 및 G2의 각각은
    Figure 112010016223515-pct00030
    이되,
    상기 O는 A1 또는 A2에 부착되며,
    NH는 식 I에 도시된 바와 같이 탄소 원자에 부착되는 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 P는 N-말단에 1 내지 4 개의 아미노산 잔기를 더 포함하는 변형된 인터페론 모이어티인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 n은 2인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 컨쥬게이트는
    Figure 112010016223515-pct00031
    이되,
    상기 m-PEG는 20kD의 분자량을 가지며 IFN은 인터페론-알파2 b인 것을 특징으로 하는 컨쥬게이트.
  11. 식II의 화합물
    Figure 112015014623859-pct00032
    에 있어서,
    식 II
    상기 식에서
    X는 CH(=O)이며;
    A1 및 A2의 각각은 독립적으로 중합체 모이어티이며;
    G1, G2 각각은 독립적으로 결합체 또는 연결성 작용기이며;
    G3 는 결합체이며;
    R1, R2, R3, R4, 및 R5의 각각은 독립적으로 H, C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-8 사이클로알킬, 또는 C3-8 헤테로사이클로알킬이며; 그리고 m 및 n은 각각 독립적으로 0이거나 1 내지 10 사이의 정수인 것을 특징으로 하는 식 II의 화합물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제 11항에 있어서,
    상기 A1 및 A2의 각각은 12 내지 30kD의 분자량을 갖는 mPEG 모이어티인 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 제 11항에 있어서,
    상기 G1 및 G2의 각각은
    Figure 112010016223515-pct00033
    이되,
    O는 A1 또는 A2에 부착되고, NH는 식 I에 도시된 바와 같이 탄소 원자에 부착되며; 그리고 n은 1 내지 10 사이의 정수인 것을 특징으로 하는 화합물.
  16. 식 I의 단백질-중합체 컨쥬게이트 제조 방법에 있어서:
    Figure 112015014623859-pct00034

    식 I
    상기 R1, R2, R3, R4, 및 R5의 각각은 독립적으로 H, C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-8 사이클로알킬, 또는 C3-8 헤테로사이클로알킬이며;
    A1 및 A2의 각각은 독립적으로 중합체 모이어티이며;
    G1, G2, 및 G3의 각각은 독립적으로 결합체 또는 연결성 작용기이며;
    P는 N-말단 아미노기가 G3에 부착되는 단백질 부분이며;
    m은 0이거나 1 내지 10 사이의 정수이며;
    n은 1 내지 10 사이의 정수이며;
    상기 방법은 P가 단백질 모이어티인 N-말단 자유 단백질 H-P를 식 II의 분지된 이중합체 분자와 커플링하는 단계:
    Figure 112015014623859-pct00036

    식 II
    상기 R1, R2, R3, R4, R5, A1, A2, G1, G2, G3, m 및 n은 상기에서 정의된 바와 같고, G3는 결합체이고, n은 0 또는 1 내지 9 사이의 정수이고, X는 CHO이다:
    그리고 이후 커플링 생성물을 환원시켜 상기 단백질-중합체 컨쥬게이트를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식 I의 단백질-중합체 컨쥬게이트 제조 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 A1 및 A2의 각각은 20kD의 분자량을 갖는 mPEG 모이어티인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 G1 및 G2의 각각은
    Figure 112010016223515-pct00037
    이되,
    O는 A1 또는 A2에 부착되고, NH는 식 I에 도시된 바와 같이 탄소 원자에 부착되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 P는 N-말단에 1 내지 4 개의 아미노산 잔기를 더 포함하는 변형된 인터페론 모이어티인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 P는
    Figure 112010016223515-pct00038
    , IFN은 인터페론-알파2 b 모이어티이고, 상기 N-말단은 카보닐기에 결합되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  21. 삭제
  22. 식I의 단백질-중합체 컨쥬게이트를 포함하는 간염 C 바이러스 감염 또는 간염 B바이러스 감염 치료용 약제학적 조성물에 있어서;
    Figure 112015014623859-pct00039

    식 I
    R1, R2, R3, R4, 및 R5의 각각은 독립적으로 H, C1-5 알킬, C2-5 알케닐, C2-5 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, C3-8 사이클로알킬, 또는 C3-8 헤테로사이클로알킬;
    A1 및 A2의 각각은 독립적으로 중합체 모이어티이며;
    G1, G2, 및 G3의 각각은 독립적으로 결합체 또는 연결성 작용기이며;
    P는 인터페론 모이어티이며;
    m은 0 또는 1 내지 10 사이의 정수이며; 그리고
    n은 1-10 사이의 정수인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  23. 삭제
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